CN112795534A - 用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，首先在无菌条件下将腹部皮下正常脂肪组织清除结缔组织、小血管、脂肪滴、脂肪粒，得到脂肪小块；进而将脂肪小块在完全培养液中培养，经过胰蛋白酶消化、离心处理后得到脂肪源干细胞，最后将脂肪源干细胞于完全培养液和抗凋亡保护剂中进行传代培养，其中抗凋亡保护剂不仅具有促进动物造血干细胞增殖、分化的功能，而且还在脂肪源干细胞培养过程中发挥抗凋亡保护作用，提高脂肪源干细胞的成活率以及后期诱导分化成功率，本发明采用组织块培养法操作简单，体外扩增能力强，增殖时间短，具有多向分化的潜能，通过诱导分化培育能够成为软骨细胞，有助于治疗退行性关节炎。

Description

用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法

技术领域

本发明属于干细胞制备技术领域，具体地，涉及用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法。

背景技术

退行性关节炎又称骨关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎，主要症状为关节疼痛，常为休息痛，表现为休息后出现疼痛，活动片刻即缓解，但活动过多后，疼痛又加剧，另一症状是关节僵硬，常出现在早晨起床时或白天关节长时间保持一定体位后，检查受累关节可见关节肿胀、压痛，活动时有摩擦感或“咔嗒”声，病情严重者可能有肌肉萎缩及关节畸形。

脂肪源干细胞是一类可以自我更新、繁殖的干细胞，具有一般干细胞的多向分化潜能和稳定的体外多代谢增值能力，不仅能够在不同诱导因子的作用下分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞，而且还能分泌作用于成纤维细胞，促进分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，可发挥抗炎、抗氧化、抗衰老、损伤修复等作用。

利用脂肪源干细胞进行体外培养能够改善治疗退行性关节炎，但是其提取困难，因此，提供一种快速高效的脂肪源干细胞的提取方法是目前需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法。

本发明需要解决的技术问题为：

现有技术中，脂肪源干细胞提取多用胰酶消化，提取干细胞过程繁琐，纯度不高，影响干细胞后期的增殖分化甚至其诱导形成过程，因此提供一种干细胞纯度高、提供方法简单、细胞活性高的提取方法是目前需要解决的技术问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入1-3mL血清并将其摇晃铺匀，将25-35块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔4-6mm，然后向无菌培养皿中加入3-4mL的完全培养液，静置培养3-5min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数3-5％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入2-4mL完全培养液，之后每2-3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部80-90％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1-2次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1-2mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1200-1500r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

进一步地，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1±0.1mm³。

进一步地，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

进一步地，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:1-2。

进一步地，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。

本发明的有益效果：

本发明利用腹下脂肪为初始组织，将其在PBS缓冲液中用灭菌眼科剪去除血管、结缔组织、痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块，进而将脂肪小块在完全培养液中培养，经过胰蛋白酶消化、离心处理后得到脂肪源干细胞，最后将脂肪源干细胞于完全培养液和抗凋亡保护剂中进行传代培养，得到用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞，其中抗凋亡保护剂为地黄低聚糖和胎牛培养液混合而成，地黄低聚糖是从地黄提取的地黄多糖中进一步分离提取得到的有效成分，其中四糖含量60％、三糖含量20％，不含蛋白质等其他活性物质，不仅具有促进动物造血干细胞增殖、分化的功能，而且还在脂肪源干细胞培养过程中发挥抗凋亡保护作用，提高脂肪源干细胞的成活率以及后期诱导分化成功率，本发明采用组织块培养法操作简单，培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，具有多向分化的潜能，通过诱导分化培育能够成为软骨细胞，有助于治疗退行性关节炎。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗3遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入1mL血清并将其摇晃铺匀，将25块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔4mm，然后向无菌培养皿中加入3mL的完全培养液，静置培养3min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数3％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入2mL完全培养液，之后每2天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部80％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1200r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

其中，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至0.9mm³。

其中，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

其中，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:1。

其中，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。

实施例2

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗4遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入2mL血清并将其摇晃铺匀，将30块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔5mm，然后向无菌培养皿中加入3mL的完全培养液，静置培养4min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数4％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入3mL完全培养液，之后每3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部85％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化2min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1300r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

其中，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1mm³。

其中，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

其中，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:2。

其中，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。

实施例3

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗4遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入2.5mL血清并将其摇晃铺匀，将28块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔5mm，然后向无菌培养皿中加入3.5mL的完全培养液，静置培养4min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数4％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入3mL完全培养液，之后每2.5天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部88％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1.5mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化2min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1400r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

其中，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1.1mm³。

其中，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

其中，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:1-2。

其中，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。

实施例4

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗5遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入3mL血清并将其摇晃铺匀，将35块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔6mm，然后向无菌培养皿中加入4mL的完全培养液，静置培养5min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数5％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入4mL完全培养液，之后每3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部90％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部2次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入2mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化3min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1500r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

其中，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1.1mm³。

其中，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

其中，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:2。

其中，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。

以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入1-3mL血清并将其摇晃铺匀，将25-35块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔4-6mm，然后向无菌培养皿中加入3-4mL的完全培养液，静置培养3-5min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数3-5％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入2-4mL完全培养液，之后每2-3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部80-90％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1-2次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1-2mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1200-1500r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

2.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1±0.1mm³。

3.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

4.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:1-2。

5.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。