CN109837262A - 一种人脐带华通胶组织消化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人脐带华通胶组织消化酶及其制备方法，其制备方法是，将透明质酸酶、DNA酶、胶原酶混合后溶于DMEM，并用0.22μm滤器过滤，再加入庆大霉素，取1mg、1ml为1单位，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，于‑20℃冰箱冻存。通过上述方式，本发明能够对脐带华通胶组织进行高效酶解，快速得到脐带华通胶间充质干细胞，且能够有效的防止细胞污染，生物学效应显著，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，特别是涉及一种一种人脐带华通胶组织消化酶及其制备方法。
背景技术
间充质干细胞是来源于中胚层的干细胞，是一种非造血来源的多向分化潜能的干细胞。由于其免疫源性弱，并能向多种组织增殖分化，因此，已经成为组织工程技术领域及细胞移植治疗中理想的种子细胞来源。华通胶间充质干细胞，来源于新生儿脐带，属于医疗废弃组织，相比于骨髓间充质干细胞，对供者不产生困苦和损伤，且来源广泛，因此更容易得到推广应用于临床。华通胶组织是脐带动静脉之间的胶冻样间质，含有较多胶原纤维，胶原酶能够水解华通胶组织的胶原纤维结构，但不会对华通胶间充质干细胞造成损伤。
目前，从脐带中分离获得脐带华通胶间充质干细胞的方法主要有组织贴壁法和酶消化法两类，酶消化法包括单酶法(胶原酶)、双酶法(胶原酶、胰蛋白酶)以及三酶法(胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶)消化法。
组织贴壁法操作简单，但存在以下弊端：不利于华通胶间充质干细胞游离，造成脐带组织的浪费；获取的细胞不纯净，常含有多种细胞；华通胶、破碎细胞的DNA增加了培养基的黏度；细胞贴壁缓慢，影响培养周期；容易造成细菌污染。
酶消化法在酶的种类和数量的选择与消化时间上尚无统一标准，主要存在以下问题：组织块彻底消化时间长；消化酶种类单一，不能彻底消化透明质酸、胶原纤维；单纯增加酶的剂量，会破坏游离出的细胞表面蛋白如粘附因子，使细胞活力与贴壁能力受到影响。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种人脐带华通胶组织消化酶，能够减少消化过程中消化不彻底，降低对间充质干细胞的损伤，控制细胞流失，避免细胞不纯净及细菌污染问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
提供一种人脐带华通胶组织消化酶，按照1mg、1ml为1单位，其成分包括透明质酸酶、DNA酶、胶原酶、DMEM、庆大霉素，各成分所占比例为，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5。
一种人脐带华通胶组织消化酶，其制备方法的步骤如下：
S1、取透明质酸酶，DNA酶，溶解于DMEM中，透明质酸酶：DNA酶：DMEM＝100：1：5，于-80℃保存。
S2、取S1混合液，添加胶原酶，然后再溶于DMEM，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM＝100:1:150:155:5
S3、取S2混合液，以0.22μm滤器过滤，再加入庆大霉素，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，于-20℃冰箱冻存。
本发明的有益效果是：本发明成本低廉，制备简单，作用高效，保存运输方便。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种人脐带组织消化酶，包括按照如下组份：透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，透明质酸酶100mg，DNA酶1mg，胶原酶20mg，DMEM200ml，庆大霉素5ml。方法步骤如下：
S1：在无菌安全超净台内称取透明质酸酶100mg和DNA酶1mg，加入DMEM培养基40ml中；
S2：称取胶原酶20mg加入S1制得的混合液中；
S3：向S2制得的混合液中加入160mlDMEM；
S4：将S3制得的混合液经过0.22μm的滤网过滤，并加入5ml庆大霉素，放置于-20℃备用。
实施例2
一种人脐带组织消化酶，包括按照如下组份：透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，透明质酸酶1000mg，DNA酶10mg，胶原酶200mg，DMEM2000ml，庆大霉素50ml。
制备方法步骤如实施例1。
实施例3
一种人脐带组织消化酶，包括按照如下组份：透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，透明质酸酶5000mg，DNA酶50mg，胶原酶1000mg，DMEM10000ml，庆大霉素250ml。
制备方法同实施例1。
实施例4
取足月产健康新生儿脐带约30cm，无菌储存于D-Hanks液中，2-6℃保存；在超净台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，用手术剪将脐带剪成4cm大小节段，取每一节段，手术剪纵行剪开脐带外膜，仔细游离2条脐带动脉和1条脐带静脉并丢弃，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约1mm3大小碎块，平衡盐溶液冲洗后，浸于人脐带组织消化酶中，置37℃恒温消化1.5h-2h；
观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10min，弃掉上层上清，剩余粘稠状液体再用0.25％胰蛋白酶37℃恒温消化10min-15min；
消化后2000rpm离心10min，弃上清，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20％，于37℃，5％CO2条件培养；
细胞于第2天开始贴壁生长，第4天用脐带干细胞培养基进行换液；
以后每2到3天换液一次，待细胞融合达到80-90％时，进行传代培养；
弃上清，PBS洗细胞，0.25％胰蛋白酶消化5min，1000rpm离心，进行细胞传代；
传代后用脐带干细胞培养基进行培养，每3天进行换液。
使用该组织消化酶可以使华通胶组织碎块消化较为彻底，组织酶混合液黏稠度较低，而一般的消化酶会使组织酶混合液黏稠度较高，不易于过滤，过滤同样体积的混合液可能需要过多的过滤器，容易造成浪费。而且细胞也很容易与组织粘液在一起不容易过滤出来。组织消化酶过滤后细胞成单个分散在培养基中，容易贴壁，而且细胞贴壁后很快进行分裂增殖，普通的消化液会有大量的粘液，阻止细胞贴壁以及细胞的分裂。
Claims (5)
1.一种人脐带华通胶组织消化酶，其特征在于，按照1mg或者1ml为1单位，其成分包括透明质酸酶、DNA酶、胶原酶、DMEM、庆大霉素，各成分所占比例为，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5。
2.根据权利要求1所述的人脐带华通胶组织消化酶的制备方法，其特征在于，将透明质酸酶、DNA酶、DMEM按适当比例混合后，于-80℃保存，使用时可取适量原混合液，与胶原酶混合后溶于DMEM，并用0.22μm滤器过滤，再加入庆大霉素，于-20℃冰箱冻存。
3.根据权利要求2所述的人脐带华通胶组织消化酶的制备方法，其特征在于，取透明质酸酶，DNA酶，溶解于DMEM中，取1mg、1ml为1单位，透明质酸酶：DNA酶：DMEM＝100：1：5，于-80℃保存。
4.根据权利要求3所述的人脐带华通胶组织消化酶的制备方法，其特征在于，取权利要求3制备的混合液，添加胶原酶，然后再溶于DMEM，以0.22μm滤器过滤，再添加庆大霉素，透明质酸酶：DNA酶：胶原酶：DMEM:庆大霉素＝100:1:150:155:5，然后于-20℃冰箱冻存备用。
5.根据权利要求2所述的人脐带华通胶组织消化酶的制备方法，其特征在于，所有操作工序均在无菌环境下操作。
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