CN106867981A - 一种人脐带组织消化酶及其制备方法 - Google Patents

一种人脐带组织消化酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30‑50份、透明质酸酶20‑40份、DNA酶0.1‑0.8份、青霉素4‑10份、链霉素15‑23份。本发明提出的一种人脐带组织消化酶性质温和，对细胞损伤小；该组织消化酶的酶解速率高，缩短了脐带组织的消化时间，分离得到的间充质干细胞具有更加优良的增殖活性和分化能力；此外本发明的组织消化酶中还添加青霉素和链霉素，可有效防止样本在采集过程中的污染以及运输过程中细菌的滋生。

Description

一种人脐带组织消化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，尤其涉及了一种人脐带组织消化酶及其制备方法。
背景技术
脐带间充质干细胞(Mesnchymal Stem Cells，MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，具有广阔的临床应用前景。快速准确地分离高活力的脐带间充质干细胞是研发脐带间充质干细胞各项功能的前提。
目前，从脐带中分离MSCs常用的方法有组织贴壁法、单酶法(胶原酶)、双酶法(胶原酶、胰蛋白酶)以及三酶法(胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶)消化法。
组织贴壁法操作简单，但存在以下几种问题：不利于MSCs游离，造成脐带组织的浪费；华通氏胶、破碎细胞的DNA增加了培养基的黏度；细胞贴壁缓慢，影响培养周期。
酶消化法在酶的选择与消化时间上没有统一的标准，存在的问题主要有：组织块彻底消化时间长；消化酶种类单一，不能彻底消化透明质酸、胶原纤维；单纯增加酶的剂量，会破坏游离出的细胞表面蛋白如粘附因子，使细胞活力与贴壁能力受到影响。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于分离脐带间充质干细胞的组织消化酶，该消化酶中除了胶原酶、透明质酸酶以外，还增加了DNA酶，大大缩短了消化时间，使消化粘稠度降低，添加青霉素和链霉素可有效防止样本在采集的过程中污染以及运输过程中细菌的滋生。
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30-50份、透明质酸酶20-40份。
优选的，所述组织消化酶还包括DNA酶0.1-0.8份。
优选的，组织消化酶还包括抗生素。
优选的，所述抗生素包括青霉素4-10份、链霉素15-23份。
优选的，所述组织消化酶包括胶原酶40份、透明质酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
一种人脐带组织消化酶的制备方法，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取透明质酸酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取DNA酶加入S2制得的培养基中；
S4：称取青霉素和链霉素加入S3制得的培养基中；
S5：将S4制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
进一步的，所述DMEM培养基为低糖型。
一种人脐带组织消化酶可应用于分离脐带间充质干细胞。
脐带是由卵黄囊和尿囊所构成，通常是由2条较细的脐动脉与1条较粗的脐静脉所组成，我们在制备的过程中会剔除动脉和静脉，但是脐带外围由一层柔软的胶状物包裹着，称为华通氏胶，用以保护脐带内的血管。华通氏胶为构成脐带的凝胶状物质，主要成份是黏多糖，也含有成纤维细胞和巨噬细胞，是一种黏膜组织。透明质酸酶为一种能水解透明质酸的酶(透明质酸为组织基质中具有限制水分及其它细胞外物质扩散作用的成分)，用于暂时降低细胞间质的粘性。
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质。在脐带消化酶中添加胶原酶就是为了特异性的水解脐带组织中的蛋白质，使间充质干细胞充分的暴露出来。在胶原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分离细胞时，细胞黏附聚集。
抗生素是青霉素与链霉素。自然环境下(不考虑人为产生的抗药性)，对青霉素不敏感的微生物绝大多数对链霉素敏感，反之亦然。两种抗生素搭配可以控制几乎全部常见细菌。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
本发明提出的一种人脐带组织消化酶包括胶原酶、透明质酸酶和DNA酶，该消化酶组合物性质温和，可有效降低消化粘稠度，对细胞损伤小；该组织消化酶的酶解速率高，缩短了脐带组织的消化时间，分离得到的间充质干细胞具有更加优良的增殖活性和分化能力；此外本发明的组织消化酶中还添加青霉素和链霉素，可有效防止样本在采集过程中的污染以及运输过程中细菌的滋生。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30份、透明质酸酶40份、DNA酶0.1份、青霉素4份、链霉素23份。
一种人脐带组织消化酶的制备方法，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取透明质酸酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取DNA酶加入S2制得的培养基中；
S4：称取青霉素和链霉素加入S3制得的培养基中；
S5：将S4制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
实施例2
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶50份、透明质酸酶25份、DNA酶0.3份、青霉素7份、链霉素15份。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶40份、透明质酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶35份、透明质酸酶35份、DNA酶0.8份、青霉素8份、链霉素17份。
制备方法同实施例1。
实施例5
一种人脐带组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶45份、透明质酸酶30份、DNA酶0.6份、青霉素10份、链霉素22份。
制备方法同实施例1。
实施例6
一种人脐带组织消化酶在分离脐带间充质干细胞中的应用。
S1：在无菌安全柜内称量40mg胶原酶融入40mL 1xDMEM低糖培养基中，终浓度为1mg/mL；
S2：称量20mg透明质酸酶，加入S1制得的培养基中，终浓度为0.5mg/mL。
S3：称量0.4mg DNA酶，加入S2制得的培养基中，终浓度0.01为mg/ml。
S4：称量6mg青霉素，20mg链霉素加入S3制得的培养基中。
S5：将S4制得的培养基用0.22um滤器，保证无菌，即得所需要的人脐带组织消化酶。
将所得人脐带组织消化酶加入到剪碎的脐带组织中，在37℃恒温振荡培养箱中，200转、消化2h，观看没有大的脐带块后，加含有EDTA 0.05％Trypsin-EDTA(1x)phenolRed30mL，消化10min，离心2000rpm，10min即可。
加入30ml DMEM培养基清洗一次，离心(2000r*5min)去上清；沉淀可以直接接种或冻存，接种密度由组织量决定，约10mL组织接种一个15cm BD培养皿，5mL组织接种一个T75培养瓶；
接种的细胞放入培养箱中静置培养三天，三天后全量换液去除杂物，之后每3天半量或全量换液，细胞长至90％时传代或冻存；
原代细胞冻存，清洗后的沉淀可以直接加入适量冻存液，分装冻存，冻存密度可以根据组织量决定，5mL组织冻存一支，复苏时可以直接接种一个T75培养瓶，根据上述培养方法培养原代细胞。
使用该组织消化酶可以使脐带组织和华通氏胶消化基本完全，消化完成之后组织过滤比较容易，组织酶混合液不会过于黏稠，一般的消化酶会使组织酶混合液过于黏稠，过滤的时候不容易过滤，过滤同样体积的混合液可能需要过多的过滤器，这样产生了不必要的浪费。而且细胞也很容易与组织粘液在一起不容易过滤出来。组织消化酶过滤后细胞成单个分散在培养基中，容易贴壁，而且细胞贴壁后很快进行分裂增殖，普通的消化液会有大量的粘液，阻止细胞贴壁以及细胞的分裂。
细胞活力测试
实验方法：采用MTT法。
1)细胞培养：采用实施例1-5所得的人脐带组织消化酶分离脐带间充质干细胞；
2)用96孔板培养，每组设4个平行样本取均值，收获细胞前4h。
3)每孔加入10μL配好的MTT，4h后用吸引器弃培养液，并加入100μL的DMSO，采用排枪加，保证反应的一致性，振荡8min。
4)看到紫色结晶物充分溶解后，置酶标仪(要提前开机预热半小时左右)上测各孔光吸收值(OD)，以空白孔调零，滤过的波长是570nm。
5)利用测出的OD值求细胞存活率，常以存活率为纵轴、时间为横轴绘制其生存曲线。
细胞存活率(％)＝实验组OD/对照组OD×100％。
实验结果：
表一 细胞存活率结果
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
存活率 99.1％ 98.7％ 98.9％ 99.6％ 99.5％
实验结论：通过表一结果可知，本发明所制得的人脐带组织消化酶能够保证脐带间充质干细胞的存活率在98％以上，使脐带间充质干细胞具有优良的增殖活性和分化能力。
二、细胞表面抗原的流式检测
实验方法：
1)采用实施例3所制得的人脐带组织消化酶进行组织消化所获得的细胞。
2)在每个流式检测管中加入50uL的稀释后的一抗；在空白管或同型对照管中加入50uL缓冲液，细胞浓度范围2-0.03ug/106细胞。
3)在各管中分别加入50uL细胞悬液，并轻轻混匀。
4)避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分钟。
5)孵育完成后，加入缓冲液(每流式检测管中加2mL)，4℃下400g离心5分钟，并弃去上清。
6)重复洗涤过程3次。
7)重悬细胞后上流式仪检测。
8)使用直接标记一抗，用500uL缓冲液重悬细胞后上机检测。
实验结果：
脐带间充质干细胞表型：应该表达的一种表面标记CD73、CD90和CD105必须为阳性，阳性率不低于95％；同时为了保证消化酶获得的干细胞中没有混杂其它细胞，选取一组已知的间充质干细胞不表达的表型作为辅助，证实我们方法的优越性。CD34、CD45、CD14、HLA-DR、IgGPE、IgGECD、IgGFITC，阳性率不得超过2％。
表1本发明的方法得到的细胞表面抗原的阳性率
表面抗原 CD34 CD45 CD14 HLA-DR IgGPE IgGECD IgGFITC CD73 CD90 CD105
阳性率 0.2％ 0.3％ 0.2％ 0.3％ 0.1％ 0.2％ 0.5％ 99.82％ 99.91％ 99.67％
表2为用文献的方法得到的细胞表面抗原的阳性率
表面抗原 CD34 CD45 CD14 HLA-DR IgGPE IgGECD IgGFITC CD73 CD90 CD105
阳性率 1.7％ 1.1％ 0.7％ 0.6％ 0.2％ 0.7％ 0.6％ 68.83％ 90.47％ 78.46％
实验结论：说明本发明所制得的消化酶，用于消化得到的细胞纯度更高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人脐带组织消化酶，其特征在于，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30-50份、透明质酸酶20-40份。
2.根据权利要求1所述的一种人脐带组织消化酶，其特征在于，所述组织消化酶还包括DNA酶0.1-0.8份。
3.根据权利要求1所述的一种人脐带组织消化酶，其特征在于，所述组织消化酶还包括抗生素。
4.根据权利要求3所述的一种人脐带组织消化酶，其特征在于，所述抗生素包括青霉素4-10份、链霉素15-23份。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种人脐带组织消化酶，其特征在于，所述组织消化酶包括胶原酶40份、透明质酸酶20份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
6.根据权利要求1-4任一项所述的一种人脐带组织消化酶的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取透明质酸酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取DNA酶加入S2制得的培养基中；
S4：称取青霉素和链霉素加入S3制得的培养基中；
S5：将S4制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
7.根据权利要求6所述的一种人脐带组织消化酶的制备方法，其特征在于，所述DMEM培养基为低糖型。
8.根据权利要求1-4任一项所述的一种人脐带组织消化酶可应用于分离脐带间充质干细胞。
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