CN106834259A - 一种人脂肪组织消化酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30‑50份、DNA酶0.1‑0.8份、青霉素4‑10份、链霉素15‑23份。本发明提出的一种人脂肪组织消化酶，在胶原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分离细胞时细胞黏附聚集，可有效降低消化粘稠度，缩短了脂肪组织的消化时间，分离得到的脂肪干细胞具有优良的增殖活性和分化能力；此外本发明的组织消化酶中还添加青霉素和链霉素，可有效防止样本采集过程中会污染，抑制细菌滋生。

Description

一种人脂肪组织消化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞分离技术领域，尤其涉及了一种人脂肪组织消化酶及其制备方法。
背景技术
人脂肪干细胞是可以进行细胞再生的多能成人干细胞，它们被称作“神奇的种子”，具有治疗疾病、使器官再生、甚至延年益寿的潜力，这对当前的行医方式有着很大的改变，如何快速、准确的分离高活力的脂肪干细胞是研发脂肪干细胞各项功能的前提。
目前普遍采用消化的方法进行人脂肪干细胞的分离、提取，但现有技术在操作过程中脂肪组织总是粘在一起，震荡时脂肪组织也会黏成团，即使移液器吹打不开；上清分离后放到培养瓶中在显微镜下观察，视野中会出现大量的组织碎片，仅有少量的细胞存在。
为了解决上述问题，人们通过改变消化酶配方或者消化方法来获取更优质的人脂肪干细胞。中国专利，公开号CN 102719396 A，公开了一种人体脂肪干细胞快速提取方法，该方法使用了专用的人脂肪组织消化剂，其成分包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDT复合体、抗胰蛋白酶和二甲基亚砜，从而可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，最终获得充分游离且存活率高的人脂肪干细胞。中国专利，公开号CN 104357387 A，公开了一种人体脂肪干细胞的分离方法，使用含有低分子肝素钙的生理盐水清洗人脂肪组织，可很好的去处杂质，从而分离出纯度更高的人脂肪干细胞。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种用于临床级别分离脂肪干细胞的组织消化酶，该消化酶中包括胶原酶和DNA酶，大大缩短了消化时间，使消化粘稠度降低，添加青霉素可有效防止样本在采集的过程中污染以及运输过程中细菌的滋生。
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30-50份、DNA酶0.1-0.8份。
优选的，所述组织消化酶还包括抗生素。
优选的，所述抗生素包括青霉素4-10份、链霉素15-23份。
优选的，所述组织消化酶包括胶原酶40份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
一种人脂肪组织消化酶的制备方法，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取DNA酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取青霉素和链霉素加入S2制得的培养基中；
S4：将S3制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
进一步的，所述DMEM培养基为低糖型。
一种人脂肪组织消化酶可应用于分离脂肪干细胞。
脂肪组织中含有血管和纤维组织以及大量的干细胞。胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase)，它能在生理pH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其它蛋白质和组织。胶原酶的化学本质是一种蛋白质。在脐带消化酶中添加胶原酶就是为了特异性的水解脐带组织中的蛋白质，使间充质干细胞充分的暴露出来。在胶原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分离细胞时，细胞黏附聚集。
抗生素是青霉素与链霉素，自然环境下(不考虑人为产生的抗药性)，对青霉素不敏感的微生物绝大多数对链霉素敏感，反之亦然。两种抗生素搭配可以控制几乎全部常见细菌。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
本发明提出的一种人脂肪组织消化酶，在胶原酶中添加了DNA酶，DNA酶防止分离细胞时细胞黏附聚集，可有效降低消化粘稠度，缩短了脂肪组织的消化时间，分离得到的脂肪干细胞具有优良的增殖活性和分化能力；此外本发明的组织消化酶中还添加青霉素，可有效防止样本采集过程中会污染，抑制细菌滋生。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30份、DNA酶0.8份、青霉素4份、链霉素23份。
一种人脂肪组织消化酶的制备方法，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取DNA酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取青霉素和链霉素加入S2制得的培养基中；
S4：将S3制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
实施例2
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶50份、DNA酶0.1份、青霉素10份、链霉素15份。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶40份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶35份、DNA酶0.3份、青霉素8份、链霉素19份。
制备方法同实施例1。
实施例5
一种人脂肪组织消化酶，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶45份、DNA酶0.6份、青霉素5份、链霉素21份。
制备方法同实施例1。
实施例6
一种人脂肪组织消化酶在分离脂肪干细胞中的应用。
S1：在无菌安全柜内称量40mg胶原酶融入40mL 1xDMEM低糖培养基中；
S2：称量0.4mg DNA酶，加入S1制得的培养基中。
S3：称量6mg青霉素加入S2制得的培养基中。
S4：将S3制得的培养基用0.22um滤器，保证无菌，即得所需要的人脂肪组织消化酶。
将所得人脂肪组织消化酶加入到30mL的脂肪组织中，在37℃恒温振荡培养箱中200r消化60min，观察没有大的脂肪块后，用30mLDMEM终止消化，离心1100rpm，5min。再加入30mL DMEM培养基将沉淀悬起，清洗一次，离心(1100r*5min)去上清；沉淀可以直接接种或冻存，接种密度由组织量决定，10mL组织接种一个15cmBD培养皿，5mL组织接种一个T75培养瓶；
接种的细胞放入培养箱中静置培养三天，三天后全量换液去除杂物，之后每3天半量或全量换液，细胞长至90％时传代或冻存；
原代细胞冻存，清洗后的沉淀可以直接加入适量冻存液，分装冻存，冻存密度可以根据组织量决定，5mL组织冻存一支，复苏时可以直接接种一个T75培养瓶，根据上述培养方法培养原代细胞。
一、细胞活力测试
实验方法：采用MTT法。
1)细胞培养：采用实施例1-5所得的人脂肪组织消化酶分离脂肪干细胞；
2)用96孔板培养，每组设4个平行样本取均值，收获细胞前4h。
3)每孔加入10μL配好的MTT，4h后用吸引器弃培养液，并加入100μL的DMSO，采用排枪加，保证反应的一致性，振荡8min。
4)看到紫色结晶物充分溶解后，置酶标仪(要提前开机预热半小时左右)上测各孔光吸收值(OD)，以空白孔调零，滤过的波长是570nm。
5)利用测出的OD值求细胞存活率，常以存活率为纵轴、时间为横轴绘制其生存曲线。
细胞存活率(％)＝实验组OD/对照组OD×100％。
实验结果：
表一 细胞存活率结果
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
存活率 98.6％ 99.1％ 98.9％ 99.3％ 99.6％
实验结论：通过表一结果可知，本发明所制得的人脂肪组织消化酶能够保证脂肪干细胞的存活率在98％以上，使脂肪干细胞具有优良的增殖活性和分化能力。
二、细胞表面抗原的流式检测
实验方法：
1)采用实施例4所制得的人脂肪组织消化酶进行组织消化所获得的细胞。
2)在每个流式检测管中加入50uL的稀释后的一抗；在空白管或同型对照管中加入50uL缓冲液，细胞浓度范围2-0.03ug/106细胞。
3)在各管中分别加入50uL细胞悬液，并轻轻混匀。
4)避光冰浴或在4℃冰箱中孵育20分钟。
5)孵育完成后，加入缓冲液(每流式检测管中加2mL)，4℃下400g离心5分钟，并弃去上清。
6)重复洗涤过程3次。
7)重悬细胞后上流式仪检测。
8)使用直接标记一抗，用500uL缓冲液重悬细胞后上机检测。
实验结果：
人脂肪干细胞表型：应该表达的一种表面标记CD73、CD90和CD105必须为阳性，阳性率不低于95％；同时为了保证消化酶获得的干细胞中没有混杂其它细胞，选取一组已知的间充质干细胞不表达的表型作为辅助。CD34、CD45、CD14、HLA-DR、IgGPE、IgGECD、IgGFITC，阳性率不得超过2％。
表1为本发明的方法得到的细胞表面抗原的阳性率
表面抗原 CD34 CD45 CD14 HLA-DR IgGPE IgGECD IgGFITC CD73 CD90 CD105
阳性率 0.2％ 0.3％ 0.1％ 0.6％ 0.2％ 0.3％ 0.3％ 99.96％ 99.92％ 99.89％
表2为用文献的方法得到的细胞表面抗原的阳性率
表面抗原 CD34 CD45 CD14 HLA-DR IgGPE IgGECD IgGFITC CD73 CD90 CD105
阳性率 0.7％ 1.4％ 1.0％ 1.1％ 0.6％ 0.7％ 0.9％ 98.97％ 87.45％ 77.53％
实验结论：说明本发明所制得的消化酶，用于消化得到的细胞纯度更高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种人脂肪组织消化酶，其特征在于，包括按照重量份计的如下组份：胶原酶30-50份、DNA酶0.1-0.8份。
2.根据权利要求1所述的一种人脂肪组织消化酶，其特征在于，所述组织消化酶还包括抗生素。
3.根据权利要求3所述的一种人脂肪组织消化酶，其特征在于，所述抗生素包括青霉素4-10份、链霉素15-23份。
4.根据权利要求1-3任一项所述的一种人脂肪组织消化酶，其特征在于，所述组织消化酶包括胶原酶40份、DNA酶0.4份、青霉素6份、链霉素20份。
5.根据权利要求1-4任一项所述的一种人脂肪组织消化酶的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：在无菌安全柜内称取胶原酶，加入DMEM培养基中；
S2：称取DNA酶加入S1制得的培养基中；
S3：称取青霉素和链霉素加入S2制得的培养基中；
S4：将S3制得的培养基经过0.22μm的滤网过滤，放置于4℃备用。
6.根据权利要求5所述的一种人脂肪组织消化酶的制备方法，其特征在于，所述DMEM培养基为低糖型。
7.根据权利要求1-3任一项所述的一种人脂肪组织消化酶可应用于分离脂肪干细胞。
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