CN104911106B - 一种嗜松青霉菌株及其该菌株制备右旋糖酐酶的方法 - Google Patents

一种嗜松青霉菌株及其该菌株制备右旋糖酐酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株高酶活的右旋糖酐酶产生菌及用该菌株制备右旋糖酐酶的方法，其特征在于该菌株是从土壤中分离得到的嗜松青霉H6(Penicillium pinophilum)，该菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9260。本发明成功的利用嗜松青霉H6发酵制备右旋糖酐酶，并且能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，同时产生的右旋糖酐酶为胞外酶。利用嗜松青霉H6发酵法制备右旋糖酐酶的特征在于其最适作用温度为40℃到50℃，最适pH为5.0到6.0，稳定pH为3.0到10.0。嗜松青霉H6发酵产右旋糖酐酶的水平为345U/ml。

Description

一种嗜松青霉菌株及其该菌株制备右旋糖酐酶的方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术和发酵工程领域，具体地说是一种产右旋糖酐酶的嗜松青霉菌株的分离，以及利用该菌株制备高酶活性的右旋糖酐酶的工艺。
背景技术：
右旋糖酐(Dextran)是若干葡聚糖脱水形成的聚合物，主要由葡萄糖α-1,6糖苷键连接而成，由肠膜明串珠菌(Leuconstoc mesenteriodes)产生的右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase；E.C.2.4.1.5)合成的右旋糖酐含有95％的α-1,6糖苷键，同时含有少量其它糖苷键的分支结构。根据分子量的不同，右旋糖酐可分为以下几种类型：(1)微分子右旋糖酐(右旋糖酐10，平均分子量1.0万以下)；(2)小分子右旋糖酐(右旋糖酐20，平均分子量1.0万-2.5万)；(3)低分子右旋糖酐(右旋糖酐40，平均分子量2.5万-5.0万)；(4)中分子右旋糖酐(右旋糖酐70，平均分子量5.0万-9.0万)；(5)大分子右旋糖酐(平均分子量9.0万以上)。在医药工业中，分子量为70kDa、40kDa、20kDa的右旋糖酐是目前公认的优良血浆代用品之一，有增加血容量、改善微循环、防止弥散性血管内凝血作用，临床主要用于治疗失血性休克等。小分子右旋糖酐近来被发现，可以避免由于右旋糖酐70及40而引起的人体自身免疫的变态反应。偏低分子量的右旋糖酐通常是衍生化的优良材料，右旋糖酐铁可以治疗缺铁性贫血，增强核磁共振成像技术；而低分子量右旋糖酐的硫酸酯(硫酸葡聚糖)具有类似于肝素(一种天然的硫酸多糖)的抗凝血特性，对核苷酸的结合位点具有亲和性，是核糖核酸酶的一种强抑制剂，近来硫酸葡聚糖还被用于抗病毒研究，发现硫酸葡聚糖有可能成为抗HIV药物。分子量更小的低聚异麦芽糖则被用于益生元。目前我国90％以上的右旋糖酐制造企业多采用盐酸水解高分子右旋糖酐的工艺，先利用右旋糖酐蔗糖酶合成高分子右旋糖酐，再利用盐酸进行水解得到不同分子量的药用级右旋糖酐，由于此工艺生产的药用级右旋糖酐含有大量的氯化物及氮化物而严重影响了产品的质量，产品在临床使用过程中常出现过敏反应，可引起皮肤反应、严重的呼吸和循环衰竭，甚至导致死亡。同时由于利用盐酸水解需要高温高酸等恶劣条件，不利于环保、低碳。如果采用本发明的嗜松青霉产生的右旋糖酐酶催化水解高分子右旋糖酐，通过控制反应条件调控催化水解的右旋糖酐分子量，就能减少氯化物对产品质量的不良影响，同时由于本发明制备的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐时，能够优先降解大分子量的右旋糖酐，然后再进一步降解中小分子量的右旋糖酐，如此便能够得到分子量分布较集中的高品质右旋糖酐。目前国内外的右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum)和细丽毛壳属(Chaetomium sp.)等菌株培养得到，而上述菌株产生的右旋糖酐酶在水解高分子右旋糖酐时不具备优先降解大分子糖酐的能力，得到的产品分子量分布不集中，同时上述两种菌株制备的右旋糖酐酶酶活力较低，且制备成本高，目前尚未有大量利用右旋糖酐酶水解高分子糖酐制备药用级右旋糖酐的报道。
在制糖工业中，右旋糖酐的存在会增加制糖过程困难，主要体现在糖液粘度增加、过滤困难、能耗增加等，同时还会直接造成糖分的损失和品质的下降。因此这些问题是我国糖业界一个急需解决的问题。利用本发明制备的右旋糖酐酶能够催化水解右旋糖酐的α-1,6糖苷键，并释放出异麦芽糖和低聚异麦芽糖，最终的水解产物为异麦芽三糖、异麦芽四糖和异麦芽五糖。目前国内外的右旋糖酐酶主要是从薄青霉(Penicillium lilacinum)和细丽毛壳属(Chaetomium sp.)等菌株培养得到，由于制备得到的右旋糖酐酶酶活力较低、制备成本高，因此未有大量应用于制糖工业的报道。因此本发明的高酶活性的右旋糖酐酶对制糖行业的清洁生产、技术进步具有显著的积极意义。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术存在的不足之处，提供一种从土壤中筛选出的高产右旋糖酐酶的嗜松青霉菌株以用于制备高酶活性的右旋糖酐酶。
本发明解决技术问题采用如下方案：
本发明提供一种从土壤中筛选出的高产右旋糖酐酶的嗜松青霉(Penicilliumpinophilum)菌株，该菌株保藏名称为：嗜松青霉(Penicillium pinophilum)H6，分类命名及拉丁文名为Penicillium pinophilum，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年6月3日，保藏号为CGMCC No.9260，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的微生物H6菌株具有下述性质：
形态特征：
菌株H6在PDA培养基(配方：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.8g)上28℃恒温培养2-3d后肉眼可看到清晰的菌丝体，菌丝较粗而长。生长速度较快，培养5-6d菌落较大，生长没有局限性，菌落可以扩展到整个培养皿。分生孢子面为青色，反面略带红色，菌落呈现绒毛状和棉絮，菌落与培养基的连接紧密。在显微镜下观察菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，且单独直立或集合成菌丝束，无足细胞，顶端生有扫帚状的分枝，帚状枝轮生或单生。
ITS rDNA基因序列：
利用ITS rDNA特异引物对菌株进行PCR扩增得到568bp的目的DNA片段，利用Blast软件将测序结果与GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中的相关序列进行同源性比较，结果显示菌株H6的568bp的目的DNA序列与嗜松青霉的基因序列相似性最高，同源性高达100％。同时将得到的菌株H6的568bp的目的DNA片段序列提交到GenBank上，获得GenBank登录号为KF751644。
本发明还提供了嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6在制备高酶活性的右旋糖酐酶中的应用。
本发明的微生物H6菌株的分离方法是：
在99ml无菌水中加入1g土样(土样分别取自安徽合肥、安徽蚌埠、四川成都)制备土壤稀释液，在PDA培养基内加入青霉素溶液(100ml加入50μl)，倒入培养皿中，静止冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于28℃恒温培养箱中培养，待菌长出后，用接种针将菌株挑取到另一灭菌的筛选培养基(配方：Dextran70kDa 1g，NaNO30.2g，蛋白胨0.4g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O 0.001g，琼脂1.6g，水100ml，pH5.0-5.5)上进行划线分离，然后将能够在筛选培养基上生长的单菌落挑取下来，转接到发酵培养基(配方：Dextran 7kDa 1.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，水100ml，pH3.0-3.5)中，于33℃、200r/min恒温继续发酵培养8d。将发酵液用于平板透明圈法。
经过平板透明圈法，将菌株发酵后的上清液经过纤维素酯微孔滤膜(规格φ25mm，孔径0.22μm)无菌过滤处理。在右旋糖酐琼脂平板上打孔，将筛选菌株的培养液150μl加入孔中，同时在每一块检测板中，以无菌水(150μl)做为阴性对照，以商业右旋糖酐酶液(150μl)做阳性对照。在28℃条件下放置24h后，观察孔周围产生的透明圈大小，透明圈越大表明培养液所含的右旋糖酐酶活力越高。选择产生较大透明圈的菌株进行DNS比色法复筛。
将初筛得到的活性菌株的发酵培养液用DNS比色法检测酶活力大小。在酶反应体系中加入待测液测定酶活，右旋糖酐酶的活力测定为将4ml 0.02mol/L pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制的3％右旋糖酐70kDa溶液置于45℃保温10min，再加入适当稀释的酶液1ml保温1h后，利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以在上述条件下每小时产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。最后筛选出能产生较高右旋糖酐酶酶活性的菌株。
通过初筛及复筛分离纯化得到单菌落纯培养嗜松青霉H6。
本发明的微生物H6菌株的培养方法是：
先采用固体PDA培养基，所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；将上述菌株在试管斜面培养基上接种后，与28℃-30℃下活化培养，2d后再采用液体PDA培养基培养，液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g；将试管斜面活化的菌株接种在锥形瓶PDA液体培养基中33℃、200r/min恒温培养7d。
利用本发明的微生物液体发酵制备右旋糖酐酶的方法以下步骤进行：
1)菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将H6菌株接种在试管培养基上，32℃-34℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
2)菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran 7kDa 1.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，将步骤1)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养48-72h作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3)发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 7kDa1.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按1％的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养7d得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
4)右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后选择适当的超滤膜截留，先用80kDa分子量的超滤膜截留除去80kDa以上的杂质，再利用50kDa分子量的超滤膜截留，得到较纯的右旋糖酐酶，浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉。
与现有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明嗜松青霉H6能够产生高酶活性的右旋糖酐酶，并且产生的右旋糖酐酶为胞外酶。利用嗜松青霉H6发酵法制备的右旋糖酐酶的特征在于它的最适作用温度为40℃到50℃，较高的反应温度有利于降低高分子右旋糖酐的粘度、增加其流动性，有利于底物与酶接触，提高催化反应的效率；最适pH为5.0到6.0，稳定pH为3.0到10.0；热稳定性良好，在45℃保温1h后剩余活力仍为原酶活的90％以上，在45℃半衰期为16d。本发明嗜松青霉H6较高的最适作用温度、较宽的pH稳定范围、良好的热稳定性均有利于降解制糖过程中的右旋糖酐，从而大大消除右旋糖酐对制糖工业的一系列不良影响。另一方面，嗜松青霉H6发酵产右旋糖酐酶的水平为345U/ml，利用H6菌株发酵制备得到高酶活性的右旋糖酐酶，可用于工业制备右旋糖酐，在提高中、小分子右旋糖酐的质量的同时，由于用酶法制备右旋糖酐反应条件温和、能耗低，从而可实现中、小分子右旋糖酐生产工艺的绿色、环保、低碳的目标。
本发明能够用于酶法制备药用级右旋糖酐，实现节能降耗、提升产品质量，提升右旋糖酐在市场上的竞争力。同时该酶还可用于消除葡聚糖对制糖行业造成的不良影响，对制糖行业的清洁生产和促进产业发展具有显著的积极意义。
本发明制备的右旋糖酐酶酶活力高，能够高效催化水解葡聚糖，成本较低，从而能快速将右旋糖酐转化为小分子寡糖，降低粘度、使产品的分子量分布更集中，从而提高糖的品质，同时增加蔗糖的收率等。
保藏信息
菌株名称：嗜松青霉(Penicillium pinophilum)H6
保藏日期：2014年6月3日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.9260。
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
图1最适温度对嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶活的影响
图2温度稳定性对嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶活的影响
图3热稳定性对嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶活的影响
图4最适pH对嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶活的影响
图5pH稳定性对嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶活的影响
具体实施方式：
下面将结合实例对本发明作进一步详细的说明：
酶活定义为：一个酶活力单位(U)表示在pH6.0，温度45℃下，每小时分解右旋糖酐70kDa所产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量。
实施例1
一株产右旋糖酐酶高酶活性菌株H6的分离方法，其包括如下步骤：
在99ml无菌水中加入1g土样(土样分别取自安徽合肥、安徽蚌埠、四川成都)制备土壤稀释液，在PDA培养基内加入青霉素溶液(100ml加入50μl)，倒入培养皿中，静止冷却成平板。采用稀释涂布法将稀释后的土壤溶液分别涂布于平板上，然后倒置于28℃恒温培养箱中培养，待菌长出后，用接种针将菌株挑取到另一灭菌的筛选培养基(配方：DextranT20001g，NaNO30.3g，K2HPO4·3H2O 0.4g，MgSO4·7H2O 0.02g，KCl 0.02g，FeSO4·7H2O0.001g，琼脂1.6g，水100ml，pH3.0-3.5)上进行划线分离，然后将能够在筛选培养基上生长的单菌落挑取下来，转接到发酵培养基(配方：Dextran 7kDa 1.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，水100ml，pH3.0-3.5)中，于33℃、200r/min恒温继续发酵培养7d。将发酵液用于平板透明圈法。
经过平板透明圈法，将菌株发酵后的上清液经过纤维素酯微孔滤膜(规格φ25mm，孔径0.22μm)无菌过滤处理。在右旋糖酐琼脂平板上打孔，将筛选菌株的培养液150μl加入孔中，同时在每一块检测板中，以无菌水(150μl)做为阴性对照，以商业右旋糖酐酶液(150μl)做阳性对照。在28℃条件下放置24h后，观察孔周围产生的透明圈大小，透明圈越大表明培养液所含的右旋糖酐酶活力越高。同时选择产生较大透明圈的菌株进行DNS比色法复筛。
将初筛得到的活性菌株的发酵培养液用DNS比色法检测酶活力大小。在酶反应体系中加入待测液，测定酶活，右旋糖酐酶的活力测定为将4ml 0.02mol/L pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制的3％右旋糖酐70kDa溶液置于45℃保温10min，再加入适当稀释的酶液1ml保温60min后，利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。以在上述条件下每小时产生1mg还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。最后筛选出能产生较高右旋糖酐酶酶活性的菌株。
通过初筛及复筛分离纯化得到单菌落纯培养嗜松青霉H6。
实施例2
上述菌株H6的培养方法，其包括如下步骤：
先采用固体PDA培养基，所述固体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；将上述菌株在试管斜面培养基上接种后，与28℃-30℃下活化培养，2d后再采用液体PDA培养基培养，液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g；将试管斜面活化的菌株接种在锥形瓶PDA液体培养基中32-34℃、200r/min恒温培养7d。
实施例3
一种利用本发明的微生物液体发酵制备右旋糖酐酶的工艺，其包括如下步骤进行：
1)菌株活化：采用灭菌固体PDA培养基，将H6菌株接种在试管培养基上，28℃-30℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
2)菌株种子发酵培养：种子培养基组分为每100ml水中含有Dextran 7kDa 1.5g，KNO3 2.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，将步骤1)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养48-72h作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3)发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 7kDa4.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按1％的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养7d得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，测得发酵液中右旋糖酐酶酶活力为345U/ml，然后将发酵液用于分离纯化；
4)右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后选择适当的超滤膜截留，先用80kDa分子量的超滤膜截留除去80kDa以上的杂质，再利用50kDa分子量的超滤膜截留，得到较纯的右旋糖酐酶，浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉(测得右旋糖酐酶酶活力为80000U/mg)。
嗜松青霉H6右旋糖酐酶的酶活力测定：将4mL 0.02mol/L pH 6.0的醋酸盐缓冲液配制的3％右旋糖酐70kDa溶液置于45℃保温10min，再加入适当稀释的酶液1mL保温1h后，利用3,5二硝基水杨酸(DNS)法测定生成的还原糖。反应完成后取样500μL加入DNS试剂375μL，沸水浴中加热准确煮沸5min，然后取出将其冷却至室温，加入蒸馏水定容至最终体积为5.375ml。以灭活酶液为空白对照，用分光光度计在波长540nm处测量光密度值，根据葡萄糖的标准曲线计算还原糖量，最终计算出酶活力。以在上述条件下每分钟产生1μmol还原糖(葡萄糖当量)所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。
嗜松青霉H6右旋糖酐酶的最适温度、温度稳定性及热稳定性：在0.02mol/L pH＝5.4醋酸盐缓冲液条件下，将酶液在不同温度下测定酶活，考察酶的最适反应温度，以酶活最高者为100％，计算相对活力，结果如图1所示。将粗酶液分别在0.02mol/L pH 5.0醋酸盐缓冲液中于不同温度(20℃～75℃)保温1h后，在最适温度(45℃)下测定其相应的剩余酶活力，考察酶的温度稳定性，结果如图2所示。取嗜松青霉发酵液低温离心后分离上清液与菌体，为使菌体尽量去除完全用滤纸将离心后的上清液进行抽滤，将混合均匀的右旋糖酐酶粗酶液分装封口，分别置于45℃、4℃和-18℃下保藏，分别按时跟踪取并按照DNS法测定右旋糖酐酶活力，结果如图3所示。
嗜松青霉H6右旋糖酐酶的最适pH及pH稳定性：将嗜松青霉粗酶液在不同pH(3～10)的0.02mol/L醋酸盐缓冲液于35℃反应1h测定酶活，研究酶促反应的最适pH，以酶活最高者为100％，计算相对活力，结果如图4所示。将嗜松青霉酶液分别置于不同pH(3～10)的0.02mol/L醋酸盐缓冲溶液体系中于4℃放置1h后，研究酶的pH稳定性，结果如图5所示。实施例4
嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶粉在制备低分子右旋糖酐中的应用，其过程包括如下步骤：
1)取适量嗜松青霉H6右旋糖酐酶酶粉溶解于pH6.00.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液，以适当稀释倍数的酶液在45℃下测定其右旋糖酐酶活力(以相同稀释倍数的灭活酶液为空白对照)；
2)在电动机械搅拌装置和45℃水浴控温的烧杯中加入60g的高分子右旋糖酐与1000mL的pH6.00.02mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液，搅拌充分溶解后，加入相当于5000U的上述右旋糖酐酶酶液，搅拌反应4h，然后将水浴温度升至80℃保温1h灭活右旋糖酐酶，纱布过滤变性酶蛋白后再置于沸水浴中20min灭活残留酶，再经真空过滤得到清澈透明的滤液，即为低分子右旋糖酐溶液。
该溶液经70℃旋蒸浓缩去除部分水分，浓缩至原体积一半后进行分级醇沉，得到总收率为73.9％的三种分子量的右旋糖酐，分别为11.8％24038Da，44.2％12566Da，17.9％10894Da，三种产品的分子量分布宽度指数分别为1.27，1.14，1.15。

Claims (4)

1.一种从土壤中筛选得到的嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6，其保藏号为CGMCC No.9260。
2.权利要求1所述的一种嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6在制备高酶活性的右旋糖酐酶中的应用。
3.一种权利要求1所述嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6的培养方法，其特征在于，先采用固体PDA培养基，将嗜松青霉菌株在试管斜面培养基上接种后，32℃到34℃下活化培养，2d后再接种到液体PDA培养基中33℃、200r/min恒温培养6d；所述PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g，琼脂1.6g；所述液体PDA培养基组分为：每100ml水中含有马铃薯20g，蔗糖2g。
4.利用权利要求1所述的嗜松青霉(Penicillium pinophilum)菌株H6制备右旋糖酐酶的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
1)菌种活化：采用灭菌固体PDA培养基，将H6菌株接种在试管斜面培养基上，32-34℃下培养48-60h，然后用于菌株种子液制备；
2)菌株种子发酵培养：种子培养基成分为每100ml水中含有Dextran 7kDa 1.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，将步骤1)中的菌株接种到所述的种子培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养48-72h作为种子液，然后将种子液用于发酵制备右旋糖酐酶；
3)发酵制备右旋糖酐酶：发酵培养基组分为每100ml水中含有Dextran 7kDa 4.5g，KNO32.5g，K2HPO4·3H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，pH3.0-3.5，利用灭菌后发酵培养基，将步骤2)中的种子液按1％的比例接入液体发酵培养基中，置于恒温摇床上32-34℃，转速200r/min下培养8d得到相应的右旋糖酐酶的发酵液，然后将发酵液用于分离纯化；
4)右旋糖酐酶的分离纯化：将步骤3)中得到的右旋糖酐酶的发酵液通过过滤、离心分离菌体，然后超滤膜截留，得到较纯的右旋糖酐酶，浓缩发酵液，再进行低压冷冻干燥，得到右旋糖酐酶酶粉。
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