CN103451170A - 内切葡聚糖酶ppce和含有该内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的新型内切葡聚糖酶PPCE和含有所述内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物，以及利用它们处理含纤维素纤维的方法。上述内切葡聚糖酶PPCE对纤维具有高活性，最适温度为低温，且最适pH为强酸性。

Description

内切葡聚糖酶PPCE和含有该内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物
本申请是申请日为2007年3月12日、申请号为200880007844.1、发明名称为“内切葡聚糖酶PPCE和含有该内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及内切葡聚糖酶PPCE(Endoglucanase PPCE)和含有所述内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物，以及利用它们处理含纤维素纤维的方法。
背景技术
迄今为止，为赋予纤维所期望的特性，对含有纤维素的纤维采用纤维素酶进行处理。例如，在纤维产业中，为改善含纤维素纤维的触感和外观，或者为使染色后的含纤维素纤维具有颜色局部性变化的“石磨”外观，采用纤维素酶进行处理[专利文献1]。
作为用于上述用途的纤维素酶，可列举出属于家族45的内切葡聚糖酶或属于家族5的内切葡聚糖酶、属于家族12的内切葡聚糖酶。在相关领域中，通常将上述内切葡聚糖酶按照如下特征进行区分，分别使用：例如，最适pH、最适温度、对纤维手感的改善效果、对纤维强度的影响等。属于家族45的内切葡聚糖酶主要用于中性区域，属于家族12的内切葡聚糖酶多用于酸性-中性区域，属于家族5的内切葡聚糖酶多用于酸性区域使用。作为属于家族45的内切葡聚糖酶的一个实例，可列举出源自腐质霉属(Humicola)的纯化43kD内切葡聚糖酶成分[专利文献2]和源自腐质霉属的内切葡聚糖酶NCE5[专利文献3]、源自根霉属(Rhizopus)的内切葡聚糖酶RCEI[专利文献4]等。
另外，作为属于家族5的内切葡聚糖酶的一个实例，可列举出源自木霉属(Trichoderma)的SCE3[专利文献5]等。作为属于家族12的内切葡聚糖酶的一个实例，可列举出源自木霉属(Trichoderma)的EGIII[非专利文献1]或源自曲霉属(Aspergillus)的FI-CMCase[非专利文献2]。另外，已知青霉属(Penicillium)细菌也可生产出分子量为25kD的内切葡聚糖酶[非专利文献3]。
当使用上述酶进行纤维加工时，通常在其各自的最适条件下进行反应。迄今为止已报道的上述酶的最适温度为中温区域(intermediate temperature range)(例如40℃-60℃)，最适pH为酸性-中性(例如pH4.0-8.0)附近。在相关领域中，在具有最适条件为低温(例如不足40℃)或强酸性(例如不足pH4.0)的酶中，尚无实现工业化并被经常使用的例子。另一方面，在工业上含纤维素纤维的处理中，多数情况下提供含有大量高活性内切葡聚糖酶的配制物作为纤维素酶配制物。就其制备方法而言，已知采用基因重组技术在宿主细胞中大量表达目标高活性内切葡聚糖酶成分的方法[专利文献6、专利文献7]。
作为上述方法中优选的宿主细胞可列举出属于不完全菌类的丝状菌，例如曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)等的丝状菌等。此外，当生产用于在酸性或强酸性下进行纤维加工的纤维素酶时，由于可期待与源自宿主的纤维素酶之间的协同作用，所以与生产中性纤维素酶的曲霉属(Aspergillus)或腐质霉属(Humicola)丝状菌相比，生产酸性纤维素酶的木霉属(Trichoderma)丝状菌更适于作为宿主。尤其当考虑到工业水平下酶的生产时，生产性高的木霉属(Trichoderma)丝状菌是非常优良的宿主(专利文献8)。然而，将异源基因在木霉属(Trichoderma)丝状菌中表达时，因其碱基序列上的特性差异(基因密码子使用频率不同)等原因，表达常常受到抑制。因而，有必要对异源基因进行修饰操作。例如，为使属于接合菌类的源自根霉属的内切葡聚糖酶RCEI在特异腐质霉(Humicola insolens)中大量表达，必须将编码RCEI的基因适应宿主细胞的密码子使用频率而最适化[专利文献9]。但是，尽管这样进行了最适化，仍可以预见：通常难以得到和同源基因同等程度的表达量。并且，还可以预见：实际上，由宿主表达异源基因而产生的目的酶在培养过程中被培养液中的蛋白酶等分解，因而获得分解物或部分分解物。
专利文献1：欧洲专利第307,564号
专利文献2：国际公开第98/03640号
专利文献3：国际公开第01/090375号
专利文献4：国际公开第00/24879号
专利文献5：国际公开第98/54332号
专利文献6：国际公开第91/17243号
专利文献7：国际公开第98/03667号
专利文献8：国际公开第05/054475号
专利文献9：国际公开第00/24879号
非专利文献1：Okada，H.et.al.，“Appl.Environ.Microbiol”64，1998年，第555-563页。
非专利文献2：Ooi，T.et.al.，“Nucleic Acids Research”18，1990年，第5884页。
非专利文献3：K.Mahalingeshwara et.al.，“CarbohydrateResearch”190，1989年，第279-297页。
发明内容
发明所需解决的课题
以往，为用于纤维加工用途，从腐质霉属(Humicola)、木霉属(Trichoderma)、根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)、圆孢霉属(Staphylotrichum)等多种丝状菌分离纤维素酶，再分离出编码这些纤维素酶的基因。特别是属于纤维素酶家族5、家族12、家族45的源自丝状菌的酶类集合由于在纤维加工处理中表现出优异的效果，所以在相关领域被广泛应用。然而，上述一系列酶类集合是最适温度为中温、最适pH为酸性至中性的酶，而并不是低温酶或强酸性酶。在相关领域强烈需求对纤维具有高活性、最适温度为低温的酶或最适pH为强酸性的酶。此外，为使具有这样特殊参数的酶实用化，有必要实现使基因在作为优良宿主的木霉属等丝状菌中大量表达，以提供廉价、高活性的纤维素酶配制物。如果使这样的纤维素酶配制物实用化，则其产业价值不可估量，然而目前这样的纤维素酶配制物并未实用化，而且尚无与基因重组有关的制备方法的报道。
解决课题的手段
本发明人等此次从嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株(FERM BP-10780株)中发现了具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质及其基因。本发明提供内切葡聚糖酶PPCE(Endoglucanase PPCE)和含有所述内切葡聚糖酶的纤维素酶配制物，以及利用它们处理含纤维素纤维的方法。本发明人发现，从嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株(FERM BP-10780株)中分离的具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质具有以下效果，即非常好的含纤维素纤维的外观改善效果和使染色后的含纤维素纤维具有“石磨”外观的效果。特别是内切葡聚糖酶PPCE(以下简称“PPCE”)与内切葡聚糖酶SCE3(专利文献5)和EGIII(非专利文献1)相比，显著具有更高的纤维处理效果，上述内切葡聚糖酶SCE3和EGIII作为代表性的纤维加工用纤维素酶而主要在酸性条件下广泛使用。此外本发明人还惊讶地发现所述内切葡聚糖酶PPCE的最适pH、最适温度在pH3、30℃左右，显著低于目前已知的纤维加工用纤维素酶。另外，虽然所述内切葡聚糖酶PPCE尚无用作纤维加工的实例，但也显著低于源自嗜松青霉IMI87160ii株的内切葡聚糖酶I的最适温度(50-55℃)、最适pH(4.0-5.0)[非专利文献3]。
本发明人等分离编码源自嗜松青霉PF1365株(FERM BP-10780株)的内切葡聚糖酶PPCE的基因，成功地利用纤维素酶cbhI基因的控制序列[国际公开第98/11239号]在绿色木霉(Trichoderma viride)中实现可工业化程度的大量生产PPCE。因此，本发明提供源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株(FERM BP-10780株)的具有内切葡聚糖酶活性的新型蛋白质及其基因，以及含有上述蛋白质的具有良好特性的纤维素酶配制物。并且，本发明提供通过编码上述蛋白质的基因进行转化的宿主细胞，以及培养上述宿主细胞来收集目的蛋白质的方法。进一步提供采用本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理含纤维素纤维的方法。
即，本发明包含以下发明。
(1)蛋白质，所述蛋白质具有以下(a)、(b)及(c)特性：
(a)源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)；
(b)具有内切葡聚糖酶活性；
(c)N末端的氨基酸序列是(1)以序列编号2表示的序列或(2)在以序列编号2表示的序列中缺失、取代或添加1个氨基酸所得的序列。
(2)上述(1)中的蛋白质，所述蛋白质具有以下(d)特性：
(d)采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的平均分子量为25kD-27kD的蛋白质。
(3)选自以下(e)-(i)的蛋白质：
(e)包含以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的蛋白质；
(f)包含以序列编号4表示的第1位-第236位氨基酸序列的蛋白质；
(g)包含以序列编号30表示的氨基酸序列的蛋白质；
(h)包含如下氨基酸序列且具有内切葡聚糖酶活性的修饰蛋白质：在以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列中缺失、取代、添加和/或修饰1个或多个氨基酸所得的氨基酸序列；
(i)包含如下氨基酸序列且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质：与以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列、或以序列编号30表示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
(4)多核苷酸，所述多核苷酸编码上述(1)-(3)中任一项的蛋白质。
(5)选自以下(j)、(k)的多核苷酸：
(j)包含以序列编号3或28表示的碱基序列、或以序列编号3或28表示的第46位-第834位碱基序列的多核苷酸；
(k)包含如下碱基序列且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸：在以序列编号3或28表示的碱基序列、或以序列编号3或28表示的第46位-第834位碱基序列中缺失、取代和/或添加1个或多个碱基所得的碱基序列。
(6)表达载体，所述表达载体包含上述(4)或(5)中的多核苷酸。
(7)宿主细胞，所述宿主细胞通过(6)中的表达载体进行转化。
(8)上述(7)中的宿主细胞，其中，宿主为酵母或丝状菌。
(9)上述(8)中的宿主细胞，其中，丝状菌是属于木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)或青霉属(Penicillium)的微生物。
(10)上述(9)中的宿主细胞，其中，丝状菌是属于木霉属(Trichoderma)的微生物。
(11)上述(10)中的宿主细胞，其中，丝状菌是绿色木霉(Trichoderma viride)。
(12)蛋白质的制备方法，所述制备方法包括培养上述(7)-(11)中任一项的宿主细胞的步骤，以及由通过上述培养得到的宿主细胞或其培养物收集上述(1)-(3)中任一项的蛋白质的步骤。
(13)蛋白质，所述蛋白质采用上述(12)的方法生产。
(14)纤维素酶配制物，所述配制物含有上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质。
(15)洗涤剂组合物，所述组合物含有上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质或上述(14)中的纤维素酶配制物。
(16)含纤维素纤维的处理方法，所述方法包括使含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(17)以改善含纤维素纤维的触感和外观为目的的减重加工方法，所述方法包括使含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(18)使染色后的含纤维素纤维的颜色局部变化的方法，所述方法包括使染色后的含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(19)使染色后的含纤维素纤维的颜色清澄化的方法，所述方法包括使染色后的含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(20)延缓含纤维素纤维开始起毛的速度或者减少含纤维素纤维起毛的方法，所述方法包括使含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(21)降低含纤维素纤维开始变硬的速度或者减少含纤维素纤维变硬的方法，所述方法包括使含纤维素纤维与上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质、上述(14)中的纤维素酶配制物或上述(15)中的洗涤剂组合物接触的步骤。
(22)上述(16)-(21)中任一项的方法，其中，与洗涤剂组合物接触的步骤通过上述纤维的浸渍、洗涤或洗涮进行。
(23)废纸脱墨的方法，其特征在于：在采用脱墨药品处理废纸以进行脱墨的步骤中，使用上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质或上述(14)中的纤维素酶配制物。
(24)纸浆滤水性的改善方法，所述方法包括将纸浆用上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质或上述(14)中的纤维素酶配制物处理的步骤。
(25)改善动物饲料消化能力的方法，所述方法包括将动物饲料用上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质或上述(14)中的纤维素酶配制物处理的步骤。
(26)将纤维素类物质分解、糖化以制备生物乙醇的方法，所述方法包括将纤维素类物质用上述(1)-(3)及(13)中任一项的蛋白质或上述(14)中的纤维素酶配制物处理的步骤。
发明效果
本发明的蛋白质、内切葡聚糖酶PPCE可用于纤维加工和洗涤用途，可使含纤维素纤维触感和外观改善、颜色局部变化、颜色清澄化、减少起毛、减少变硬等。
实施发明的最佳方式
具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质
在本说明书中，“内切葡聚糖酶”是指具有内切葡聚糖酶活性的酶，即内切-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)，上述酶水解β-1，4-葡聚糖的β-1，4-吡喃葡萄糖苷键。
另外，本说明书的“内切葡聚糖酶活性”指的是CMC酶活性。并且，“CMC酶活性”指的是水解羧甲基纤维素(CMC，东京化成工业株式会社制)的活性，测定将受试蛋白质和CMC溶液温育一定时间后所游离出的还原糖量，将1分钟内生成相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量定义为1个单位。
内切葡聚糖酶活性例如可通过如下程序测定。首先，将0.5mL含有受试蛋白质的溶液添加于溶解有2％CMC的0.5mL50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH6.0)中，于50℃温育30分钟。接着，采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)对得到的反应液中生成的还原糖浓度进行定量。即，在1.0mL反应30分后的反应液中添加3.0mL DNS试剂，在沸腾水浴中温育5分钟后，以8.0mL蒸馏水稀释，测定540nm的吸光度。利用连续稀释的葡萄糖溶液制成标准曲线，通过葡萄糖换算确定酶反应液中生成的还原糖量。以1分钟内生成相当于1μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量作为1个单位，计算出活性。
需说明的是，DNS试剂可依据文献(例如，《生物化学试验法1-还原糖的定量法》，第19-20页，福井作藏著，学会出版中心)中的记载配制，例如可采用如下程序配制。首先，在300mL4.5％氢氧化钠水溶液中，添加880mL1％3，5-二硝基水杨酸溶液以及255g罗氏盐(溶液A)。另外，在22mL1.0％氢氧化钠溶液中添加10g结晶酚，再加水溶解至100mL(溶液B)。在69mL溶液B中添加6.9g碳酸氢钠使其溶解，再注入溶液A，搅拌混合直至罗氏盐充分溶解，放置2天后过滤。
本发明所得蛋白质可从丝状菌类获得，具体而言，从属于青霉属(Penicillium)的微生物、优选嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、更优选嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株(FERM BP-10780株)获得。而且这些还可以是变异株。此外，典型的本发明所得蛋白质的N末端氨基酸序列具有以序列编号2表示的序列。N末端氨基酸序列例如可由后述实施例2所示方法确定。根据本发明，提供源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的具有下列特性的蛋白质：
(A)具有内切葡聚糖酶活性；
(B)N末端的氨基酸序列是(1)以序列编号2表示的序列或(2)在以序列编号2表示的序列中缺失、取代或添加1个氨基酸所得的序列；
(C)由SDS-PAGE测定的平均分子量为25kD-27kD。
此处，由SDS-PAGE测定的平均分子量可由实施例1所示的方法确定。另外，典型的源自嗜松青霉的本发明所得蛋白质包含以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列，其N末端谷氨酰胺(Gln)残基被修饰成焦谷氨酸(pyroGlu)残基(即，包含以序列编号30表示的氨基酸序列)。
本发明的其它实施方式提供包含以序列编号4表示的氨基酸序列(或其部分序列)的蛋白质及其修饰蛋白质或同源蛋白质。“包含以序列编号4表示的氨基酸序列或其部分序列的蛋白质”包括：例如，具有以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的成熟蛋白质；具有添加信号肽(第1位-第15位)的氨基酸序列的前体蛋白质，所述蛋白质含有第1位-第236位氨基酸序列；由如下氨基酸序列构成的蛋白质：所述氨基酸序列通过在具有以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的成熟蛋白质的N末端和/或C末端添加适当序列得到；以及具有以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的成熟蛋白质的N末端和/或C末端氨基酸被修饰后得到的蛋白质。本发明中“氨基酸序列的添加”包括在具有以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的成熟蛋白质N末端添加如下氨基酸：以序列编号4表示的第1位-第15位信号肽的部分或全部。另外，本发明中“氨基酸序列的修饰”包括通过源自宿主的酶修饰具有以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列的成熟蛋白质N末端。本修饰包括将上述成熟蛋白质N末端谷氨酰胺(Gln)残基修饰成焦谷氨酸(pyroGlu)残基。
信号肽是例如以序列编号4表示的第1位-第15位的氨基酸序列，即由如下氨基酸残基构成的氨基酸序列：在以序列编号3表示的碱基序列中，由第1-3位的ATG开始到第43-45位结束的核苷酸序列编码的15个氨基酸残基。本发明中“修饰蛋白质”指的是包含如下氨基酸序列并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列在以序列编号4表示的氨基酸序列(或其部分序列)中缺失、取代、添加和/或修饰1个或多个(优选1个或数个)氨基酸而得到。
此处，与“缺失、取代或添加”等修饰相关的氨基酸的数目为1个或多个(优选1个或数个)，例如1-20个，优选1-10个，更优选1-5个，进一步优选1-3个。此外，该修饰氨基酸中包含含有以下氨基酸序列并具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质：所述氨基酸序列在以序列编号4表示的氨基酸序列中保守取代1个或多个氨基酸残基而得到。
此处，“保守取代”指的是，将1个或多个氨基酸残基以化学上类似的其它氨基酸取代而不实质性地改变蛋白质活性。例如可举出，将某疏水性残基以其它疏水性残基取代的情形，将某极性残基以具有相同电荷的其它极性残基取代的情形等。对于各氨基酸，可进行这种保守性取代的功能类似的氨基酸在相应技术领域都是公知的。具体而言，作为非极性(疏水性)氨基酸，可列举出丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可列举出甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷(碱性)的氨基酸，可列举出精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。
此外，作为负电荷(酸性)的氨基酸，可列举出天冬氨酸、谷氨酸等。本发明的蛋白质例如可按照实施例1中的记载从微生物中分离、纯化获得。另外，也可通过分离、纯化获得以下蛋白质，所述蛋白质通过采用下述基因重组技术将编码本发明蛋白质的多核苷酸在适当的宿主中表达而生产。
作为本发明的同源蛋白质，可列举出含有以下氨基酸序列并具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质，所述氨基酸序列与以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列、或以序列编号30表示的氨基酸序列具有90％以上(优选95％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上)的同源性。在本说明书中，“同源性”是指采用市售基因信息处理软件GENETYX(Genetyx Corporation制)按照同源性检索(homology search)功能的默认条件计算出的同源性。
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编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸
根据本发明，提供编码如下蛋白质的多核苷酸：包含以序列编号4表示的氨基酸序列或其部分序列的蛋白质或修饰蛋白质。如果提供了蛋白质的氨基酸序列，则很容易确定其编码碱基序列，由此可选择编码本发明蛋白质的各种碱基序列。需说明的是，在本发明书中，“多核苷酸”一词包含DNA和RNA两者，优选DNA。
本发明的多核苷酸典型地选自下述的多核苷酸：
(a)包含以序列编号3或28表示的碱基序列(或其部分序列)的多核苷酸；
(b)包含在以序列编号3或28表示的碱基序列(或其部分序列)中缺失、取代和/或添加1个或多个碱基所得的碱基序列，并编码具有内切葡聚糖酶活性蛋白质的多核苷酸。
包含以序列编号3表示的碱基序列或其部分序列的多核苷酸中，包括例如具有以序列编号3表示的第1位-第834位碱基酸序列的多核苷酸或第46位-第834位碱基酸序列的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是天然来源的多核苷酸，也可以是全合成的多核苷酸，此外还可以是利用天然来源的多核苷酸的一部分进行合成得到的多核苷酸。作为本发明多核苷酸的典型获得方法，可以嗜松青霉的基因组DNA为模板通过PCR反应获得。另外，可列举出基因工程学领域常用方法，例如制备基因组DNA文库，使用以部分氨基酸序列信息为基础制成的适当DNA探针，进行筛选的方法等。根据本发明，编码具有内切葡聚糖酶PPCE氨基酸序列的典型碱基序列具有以序列编号3表示的碱基序列。以序列编号3表示的碱基序列含有由第1-3位的ATG开始到第832-834位的TAG结束的开放阅读框和第411-469位、第691-754位的2处内含子。另外，46-48的多核苷酸序列对应于由221个氨基酸残基构成的内切葡聚糖酶PPCE的成熟蛋白质的N末端氨基酸。
表达载体和转化微生物
本发明提供如下表达载体，所述表达载体以可在宿主微生物内复制的状态包含含有序列编号4表示的氨基酸序列或其部分序列的蛋白质或其修饰蛋白质(以下称为“本发明的多核苷酸”)，并且以可表达状态包含其碱基序列所编码的蛋白质。本发明的载体是自我复制载体，即作为染色体外的独立体存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如可基本地构建质粒。此外，本发明的表达载体在被导入宿主微生物时，也被重组到上述宿主微生物的基因组中，所述载体还可和重组后的染色体一起复制。本发明的载体的构建程序和方法可使用基因工程学领域常用的方法。为将本发明的表达载体实际地导入宿主微生物，表达具有期望活性的蛋白质，优选本发明的表达载体除含有上述本发明的多核苷酸外，还含有调控其表达的碱基序列等。作为调控表达的碱基序列，包含启动子、终止子以及编码信号肽的碱基序列等。启动子只要可在宿主微生物中表现转录活性就无特殊限制，可得到调控编码与宿主微生物同种或异种的任意蛋白质的基因之表达的碱基序列。
另外，信号肽只要是在宿主微生物中有助于蛋白质分泌就无特殊限制，可以通过编码与宿主微生物同种或异种的任意蛋白质的基因所衍生的碱基序列获得。
此外，为将本发明的表达载体导入宿主微生物，选择转化体，本发明的表达载体可含有基因标记。本发明的基因标记可以根据转化体的选择方法适当选择，例如可利用编码耐药性的基因、补充营养要求性的基因。
上述基因标记可重组到表达载体和其它载体中，在转化时混合并同时导入(也称共转化(co-transform))。此外，根据本发明，可提供经上述表达载体转化的微生物。上述宿主-载体系统无特殊限制，例如可采用使用了大肠菌、放线菌、酵母、丝状菌等的系统，以及使用了上述系统的与其它蛋白质融合的融合蛋白质表达系统。并且，通过上述表达载体对微生物的转化可按照本领域惯用的方法进行。此外，可用适当的培养基培养上述转化体，从其宿主细胞或培养物分离获得上述本发明的蛋白质。因此，根据本发明的其它实施方式，提供上述本发明的新型蛋白质的制备方法。转化体的培养及其条件可以与所使用的微生物的培养和培养条件实质上等同。
此外，在培养转化体后，回收目的蛋白质的方法可使用在该领域惯用的方法。另外，作为本发明中新型蛋白质的优选制备方法，提供在属于不完全菌类的丝状菌中表达的方法。作为本发明中优选的宿主丝状菌，可列举出属于木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、曲霉属(Aspergillus)、枝顶孢属(Acremonium)或青霉属(Penicillium)的丝状菌，更优选木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)。更具体而言，可列举出绿色木霉(Trichoderma viride)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、フミコ一ラ·サ一モィデァ(Humicola thermoidea)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、纤维素分解枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)或嗜松青霉(Penicillium pinophilum)，更优选绿色木霉(Trichoderma viride)或特异腐质霉(Humicola insolens)。
纤维素酶的用途/纤维素酶配制物
本发明还涉及含有本发明蛋白质(例如，包含以序列编号4表示的氨基酸序列或其部分序列的蛋白质或其修饰蛋白质，或通过培养本发明的宿主细胞而得到的蛋白质)的纤维素酶配制物。
一般而言，除纤维素酶外，纤维素酶配制物还可含有例如赋形剂(例如，乳糖、氯化钠、山梨醇等)、防腐剂和/或非离子表面活性剂等。此外，纤维素酶配制物的形态可以是固态，也可以是液态，具体而言可列举出粉剂、粒剂、颗粒剂、非粉尘化颗粒或液体制剂。本发明的纤维素酶配制物中，除本发明的蛋白质外，也可含有其它纤维素酶，例如纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase)、β-葡萄糖苷酶和/或本发明内切葡聚糖酶以外的内切葡聚糖酶。作为纤维素酶配制物的一种，非粉尘化颗粒(优选无飞散性颗粒状)，可使用通常的干式造粒法制备。即，将粉末状的本发明蛋白质混合到选自无机盐(例如，硫酸钠、氯化钠)、矿物质(例如，膨润土、蒙脱石)和有机物(例如，淀粉或粒状纤维素等)等的1种或多种成分中后，加入1种或多种非离子表面活性剂的粉末或微细悬浊的悬浊液，充分混合或捏合。可如下制得非粉尘化颗粒：根据情况酌情添加使固体粘合的合成高分子(例如，聚乙二醇等)或天然高分子(例如，淀粉等)，进一步捏合后，采用圆盘造粒机等进行挤出成形造粒，将成形物通过球形整粒机制成球状后干燥。1种或多种非离子表面活性剂的添加量无特殊限制，相对于本发明的纤维素酶配制物总量，优选0.1-50％重量，更优选0.1-30％重量，进一步优选1-10％重量。另外，通过用聚合物等对颗粒表面进行包衣，也可控制氧渗透和水分渗透。另一方面，作为纤维素酶配制物的一种，液体制剂(优选，稳定化的液态)可如下配制：在包含本发明蛋白质的溶液中掺混内切葡聚糖酶的稳定剂(例如，合成高分子、天然高分子等)，根据需要添加无机盐类和/或合成防腐剂。
此时，也可掺混1种或多种非离子表面活性剂。1种或多种非离子表面活性剂的添加量无特殊限制，但相对于本发明的纤维素酶配合物总量，优选0.1-50％重量，更优选0.1-30％重量，进一步优选1-10％重量。此外，本发明提供包含本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物的洗涤剂组合物。本发明的洗涤剂组合物也含有表面活性剂(可以是阴离子性、非离子性、阳离子性、两性或双性离子性或其混合物)。另外，本发明的洗涤剂组合物可含有本领域已知的其它洗涤剂成分，例如洗涤添加剂、漂白剂、漂白活性剂、防腐剂、金属离子封闭剂、除污聚合物、香料、其它酶(例如，蛋白酶、脂酶、淀粉酶等)、酶稳定剂、制剂化助剂、荧光增白剂和/或发泡促进剂等。代表性的阴离子性表面活性剂有，直链状烷基苯基磺酸盐(LAS)、烷基硫酸盐(AS)、α-烯基磺酸盐(AOS)、聚氧乙烯烷基醚硫酸盐(AES)、α-磺基脂肪酸酯盐(α-SFMe)以及天然脂肪酸的碱金属盐等。作为非离子表面活性剂的实例，可列举出聚氧乙烯烷基醚(AE)、烷基聚乙二醇醚、壬基酚聚乙二醇醚、乙氧基化脂肪酸甲酯、蔗糖以及葡萄糖的脂肪酸酯、烷基糖苷、聚乙氧基化烷基糖苷的酯等。
本发明的含纤维素纤维的处理方法通过使本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤剂组合物与含纤维素纤维接触来进行。可经过本发明的纤维处理方法改善的含纤维素纤维的性质包含以下几个方面：
(1)减重而带来的纤维触感和外观的改善；
(2)使染色的含纤维素纤维的颜色产生局部变化，即，使染色的含纤维素纤维、尤其是斜纹布具有石磨样外观和风格；
(3)染色的含纤维素纤维的颜色清澄化；
(4)柔软化(硬化开始出现的速度降低、硬化减少)；
(5)绒毛的除去(起毛速度降低、起毛减少)。
具体而言，本发明的纤维处理方法可如下进行：通过在浸渍有纤维或可浸渍纤维的水中，添加本发明的蛋白质、本发明的纤维素酶配制物或本发明的洗涤剂组合物，例如可通过纤维的浸渍步骤、洗涤步骤或洗涮步骤进行。接触温度或本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物的添加量等条件，可参考其它各种条件酌情确定，例如在以改善纤维触感和外观为目的的减重加工时，优选在10-60℃左右的温度下使用蛋白质浓度为0.1-50mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物。此外，在用于提供染色后的含纤维素纤维的颜色局部变化时，优选在20-60℃左右的温度下使用蛋白质浓度为0.1-100mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物。另外，以使染色后的含纤维素纤维的颜色清澄化为目的时，优选在10-60℃左右的温度下使用蛋白质浓度为0.01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物。另外，在降低含纤维素纤维开始变硬的速度或减少含纤维素纤维硬化时，优选在10-60℃左右的温度下使用蛋白质浓度为0.01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物。另外，在降低含纤维素纤维的起毛速度或减少含纤维素纤维的起毛时，优选在10-60℃左右的温度下使用蛋白质浓度为0.01-20mg/L的本发明的蛋白质、纤维素酶配制物或洗涤剂组合物。
此外，本发明涉及废纸脱墨的方法，其特征在于：在由脱墨化学品处理废纸进行脱墨的步骤中，使用本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物。由于本发明的蛋白质或纤维素酶配制物作用于废纸时可提高脱墨效率，因而可用于由废纸制造再生纸的过程。根据上述脱墨方法，由于残留的有墨纤维大量减少，因此可提高废纸的白色度。上述脱墨化学品只要是废纸脱墨中常用的化学品就没有特殊限制，例如可列举出：氢氧化钠、碳酸钠等碱，硅酸钠、过氧化氢、磷酸盐、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或油酸等捕获剂等，作为助剂可列举出：pH稳定剂、络合剂或分散剂等。可适用上述脱墨方法的废纸只要是通常被称为废纸的纸就没有特殊限制，例如可列举出：掺混机械纸浆和化学纸浆的报纸废纸、杂志废纸、低等-中等印刷废纸，由化学纸浆构成的高质废纸，其压膜纸等印刷废纸。此外，也可以是通常被称为废纸的纸以外的纸，只要是带有墨的纸，即可适用上述脱墨方法。
此外，本发明涉及纸浆滤水性的改善方法，上述方法包括以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理纸浆的步骤。根据上述方法，在强度没有显著降低的情况下，纸浆的滤水性显著得到改善。可适用上述方法的纸浆没有特殊限制，例如可列举出：废纸纸浆、再循环板纸纸浆、工艺纸纸浆(craft pulp)、亚硫酸纸浆、加工热处理的其它高收率纸浆等。
此外，本发明涉及改善动物饲料消化能力的方法，包括以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。根据上述方法，由于动物饲料中的葡聚糖被适度低分子化，因此可改善动物饲料的消化能力。此外，通过在动物饲料中使用本发明的蛋白质，可改善饲料中葡聚糖的消化能力。因此，根据本发明，提供改善动物饲料消化能力的方法，所述方法包括以本发明的蛋白质或纤维素酶配制物处理动物饲料的步骤。
此外，本发明涉及生物乙醇的制备方法，包括以本发明的蛋白质或本发明的纤维素酶配制物处理纤维素类物质(包含纤维素纤维)的步骤。根据上述方法，使本发明的蛋白质作用于纤维素类物质，将其分解·糖化，可制备葡萄糖。得到的葡萄糖可通过采用其它微生物(例如酵母等)的发酵技术转换为生物乙醇。
微生物的委托保藏
作为本发明内切葡聚糖酶PPCE来源的嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株在2007年(平成19年)2月7日在于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)国际保藏，国际保藏编号为FERM BP-10780。
本发明的大肠菌(Escherichia coli)JM109/p28FULL18株，所述大肠菌是以在质粒PCR2.1-TOPO中插入PPCE基因得到的质粒p28FULL18进行转化得到的，在2007年(平成19年)2月7日于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：
Figure BDA00002960792900191
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)国际保藏，国际保藏编号为FERM BP-10781。可作为本发明表达载体的宿主的绿色木霉(Trichoderma viride)MC300-1株在1996年(平成8年)9月9日干独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：
Figure BDA00002960792900192
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)(原保藏)国内保藏，自1997年(平成9年)8月11日起转为国际保藏。国际保藏编号(国际保藏编号之后的[]内是国内保藏编号)为FERM BP-6047[FERM P-15842]。
实施例
以下，通过实施例更为具体的说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。
《实施例1：从嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株分离纯化具有除去染色棉绒毛活性的成分》
25℃下将嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株在TS培养基(2.0％可溶性淀粉、1.0％葡萄糖、0.5％聚胨、0.6％小麦胚芽、0.3％酵母提取物、0.2％大豆粕、0.2％碳酸钙、pH7.0)中振荡培养。培养24小时后接种到(N)培养基(5.0％微晶粉末纤维素、2.0％酵母提取物、0.1％聚胨、0.03％硫酸镁、pH6.8)中，在25℃下进一步培养5日。将去除菌体得到的培养上清液作为粗纯化纤维素酶配制液。将上述粗纯化纤维素酶配制液配制成终浓度为1.2mol/L的硫酸铵溶液后，上样于预先以含有1.2mol/L硫酸铵的50mM醋酸钠缓冲液(pH5)平衡的HiTrapTMPhenylHP柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)，在50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5)中，以硫酸铵浓度分别为1.2mol/L、0.96mol/L、0.72mol/L、0.48mol/L、0.24mol/L、0mol/L的梯度洗脱法进行洗脱、分离。其中，在硫酸铵浓度为0.24mol/L时洗脱的成分中发现对染色棉布具有去毛活性。对染色棉布具有去毛活性采用如下方法进行研究。预先在大型洗衣机中使染色的蓝色棉织物坯布起毛。然后，将上述起毛的蓝色棉织物坯布在下列条件下进行去毛处理，目视判断处理后的坯布的去毛情况，研究有无去毛活性。
试验仪器：洗涤牢固度测试仪L-12(大荣科学精器制作所公司制)
温度：40℃
时间：120分钟
反应pH：pH2(5mmol/L枸橼酸缓冲液)
除洗脱液外，处理液中还适当添加不锈钢珠。
接着，采用PD-10脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)，按照操作手册中的条件将0.24mol/L硫酸铵洗脱成分脱盐后，调整为50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)，再上样于预先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)平衡的ResourceMonoS柱(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)。然后，在从50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.0)到50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，相对于1mol/L氯化钠，以梯度间隔0.1mol NaCl的梯度洗脱法进行洗脱、分离。其结果显示，不在柱上吸附地流出的成分对染色棉布具有去毛活性。此外，将流出成分上样于预先以50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)平衡的ResourceMonoQ柱(GEHealthcare Bio-Sciences公司制)。然后，在从50mmol/L醋酸缓冲液(pH4.0)到50mmol/L醋酸缓冲液(pH5.0)中，相对于1mol/L氯化钠，以梯度间隔0.1mol NaCl的梯度洗脱法进行洗脱、分离。其结果显示，不在柱上吸附地流出的成分对染色棉布具有去毛活性。将得到的流出成分用10K超滤膜(Millipore公司制)浓缩，作为PPCE成分。PPCE成分具有CMC酶活性。其次，对粗纯化纤维素酶配制液和各柱纯化步骤中的活性成分进行SDS-PAGE。SDS-PAGE使用SafetyCell Mini STC-808电泳槽(TEFCO公司制)和预制胶12％-SDS-PAGEmini、胶厚1.0mm(TEFCO公司制)，电泳方法遵照产品处理说明书。分子量标记采用SDS电泳用低分子标准品(LMW CalibrationFor SDS Electrophoresis)(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)。电泳后用考马斯亮蓝R250(Nacalai Tesque Inc.制)进行染色、脱色。其结果显示，随着纯化，平均分子量(MW)约26kD的蛋白质被浓缩。特别是，若将粗纯化纤维素酶配制液与PPCE成分比较，则约26kD的蛋白质比例显著增加。由此推测具有去除染色棉布绒毛活性的成分是分子量(MW)约为26kD的蛋白质，进行以下的试验。
《实施例2：源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的PPCE的N末端氨基酸序列的确定》
将实施例1中得到的PPCE成分进行SDS-PAGE后，使用マルチフォ一II(GE Healthcare Bio-Sciences公司制)，电印记于PVDF膜(Millipore公司制)。将其用亮蓝G(东京化成工业社制)染色后，脱色。将分子量约为26kD的蛋白质(PPCE)的印迹部分从该膜切下，供于蛋白测序仪Model492(Applied Biosystems公司制)，尝试N末端氨基酸序列的解析，但无法得到埃德曼降解产生的信号。由此判断N末端氨基酸受到修饰保护。
因此，37℃下将刚刚切下的膜在0.5％聚维酮-40(Sigma公司制)/100mmol/L醋酸溶液中浸渍30分钟，封闭膜上蛋白质未结合的部分后，50℃下用Pfu焦谷氨肽酶(Pyroglutamate Aminopeptidase)(Takara Bio公司制)处理5小时来除去修饰N末端残基，再次进行测序。得到的序列如下所示(Xaa表示不明氨基酸残基)。
序列结果：Gln-Ser-Leu-Xaa-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser(12个残基)(序列编号1)
由于将被保护的N末端氨基酸用Pfu焦谷氨肽酶进行脱保护时得到了信号，所以认为PPCE的N末端氨基酸是焦谷氨酸(pyroGlu)。另外，在本蛋白测序中，由于没有得到半胱氨酸(Cys)的信号，所以可以推测Xaa是半胱氨酸。由此，认为PPCE的N末端氨基酸序列为如下序列。
PPCE的N末端氨基酸序：Gln-Gln-Ser-Leu-Cys-Ser-Gln-Tyr-Ser-Ser-Tyr-Thr-Ser(13个残基；其中，N末端谷氨酸被修饰为焦谷氨酸)(序列编号2)
采用上述N末端氨基酸序列进行同源性检索(GENETYX；Genetyx Corporation制)时，与源自疣孢青霉(Penicillium verruculosum)的内切葡聚糖酶III[俄罗斯公开第2238974号]的氨基酸序列具有同源性。由此表明PPCE是属于家族12的内切葡聚糖酶。
《实施例3：内切葡聚糖酶PPCE基因的PCR扩增》
由于PPCE的N末端氨基酸序列与属于家族12的源自疣孢青霉的内切葡聚糖酶III具有同源性，因此基于俄罗斯公开第2238974号记载的EGIII的碱基序列，尝试采用PCR对源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的内切葡聚糖酶PPCE基因进行扩增。
(1)源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的染色体DNA的分离
28℃下将嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株在TS培养基中培养24小时，通过离心分离回收菌体。采用ISOPLANT(Nippongene公司制)由得到的菌体进行染色体DNA的提取。条件遵照试剂盒中操作手册记载的条件。
(2)采用PCR对源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的家族12内切葡聚糖酶PPCE基因片段的扩增
基于对应于源自疣孢青霉(Penicillium verruculosum)的内切葡聚糖酶III的N末端、C末端氨基酸序列的DNA序列，制备下列序列的合成引物。
MSW-N：
CAACAGAGTCTATGCGCTCAATACTCGAGCTACACCAGT(序列编号5)
MSW-C：CTAATTGACAGCTGCAGACCAA(序列编号6)
采用上述引物(MSW-N、MSW-C)，以实施例3(1)获得的染色体DNA为模板，通过LA PCRTM试剂盒Ver2.1(Takara Bio公司制)进行PCR反应。条件为，在94℃、1分钟后进行(94℃、30秒)·(60℃、30秒)·(72℃、1分钟)的反应20个循环，最后在72℃下处理10分钟，结束反应。将得到的反应液供于琼脂糖凝胶电泳。其结果，由于发现约0.8kbp的基因片段的扩增，因此进行克隆以确定碱基序列。切下通过琼脂糖凝胶电泳分离的约0.8kbp的基因片段，采用Wizard SV凝胶和PCR纯化系统(Wizard SVGel and PCR Clean-UpSystem)(Promega公司制)进行DNA的纯化。条件遵照试剂盒中所附条件。使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制)，将得到的约0.8kbp的纯化DNA克隆到TOPO载体(PCR2.1-TOPO)上。采用常规方法扩增·提取得到的质粒，进行DNA序列的确定。质粒的提取采用QIAfilter质粒试剂盒(Qiagen公司制)，条件遵照试剂盒中所附条件。另外，DNA碱基序列的确定采用dRhodamine Terminator试剂盒(Applied Biosystems公司制)和作为引物的M13通用引物或具有下列序列的Rev引物进行反应。
Rev：CAGGAAACAGCTATGAC(序列编号7)
条件遵照试剂盒中所附条件。将得到的反应液按照试剂盒所附操作手册中记载的条件纯化，采用ABI PRISM310基因分析仪(Genetic Analyzer)(Applied Biosystems公司制)进行分析。其结果表明，通过PCR得到扩增的基因片段是与源自疣孢青霉(Penicillium verruculosum)的内切葡聚糖酶III具有同源性的基因。
《实施例4：采用染色体步移获得源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的家族12内切葡聚糖酶PPCE基因片段》
尝试使用染色体步移试剂盒(Becton Dickinson公司制)对经由PCR扩增的源自嗜松青霉PF1365株的家族12内切葡聚糖酶基因片段进行上·下游的扩增。条件遵照试剂盒中所附条件。使用限制性内切酶PvuII、StuI完全分解由嗜松青霉(Penicillium pmophilum)PF1365株提取的染色体DNA，将分解的染色体DNA与试剂盒中的衔接头相连，制备基因文库。另外，以实施例3得到的序列为基础接着制备具有下列序列的合成引物，用于PCR反应。
24-GSP-R1：CGCCAGAGCTGGAAATGGAGTTGACATAAG(序列编号8)
24-GSP-R2：GTGCACTGGGAGCCAGAGCCACTGCTCTCA(序列编号9)
24-GSP-F1：TTTCGTATGATCTCTTCACGGCAGCGGATA(序列编号10)
24-GSP-F2：ATCAACCATGTTACCTACAGTGGTGACTAT(序列编号11)
以PvuII或StuI基因文库为模板，使用作为引物的24-GSP-R1或F1和试剂盒中所附AP-1，采用ExTaqPremix(Takara Bio公司制)进行PCR反应。条件为，在94℃、2分钟后，进行94℃、2秒·72℃、3分钟的反应7个循环，进行94℃、2秒·67℃、3分钟的反应32个循环，最后在67℃下处理4分钟，结束反应。以去离子水稀释第1次PCR反应液得到的溶液为模板，进行第2次PCR反应。使用作为引物的24-GSP-R2或F2和试剂盒中所附AP-2，采用ExTaqPremix(Takara Bio公司制)，进行PCR反应。条件为，在94℃、2分钟后，进行94℃、2秒·72℃、3分钟的反应5个循环，进行94℃、2秒·67℃、3分钟的反应20个循环，最后在67℃下处理4分钟，结束反应。将得到的反应液供于琼脂糖凝胶电泳。结果，在以PvuII基因文库为模板，以24-GSP-R1和AP-1进行第1次PCR反应和以24-GSP-R2和AP-2进行第2次PCR反应得到的样品中发现约2Kbp的基因片段扩增。另外，在以StuI基因文库为模板，以24-GSP-F1和AP-1进行第1次PCR反应和以24-GSP-F2和AP-2进行第2次PCR反应得到的样品中也发现约2Kbp的基因片段扩增。然后，切下上述约2Kbp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)，进行DNA的纯化。条件遵照试剂盒中所附条件。使用TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen公司制)，将得到的各个约2Kbp的纯化DNA克隆到TOPO载体(PCR2.1-TOPO)上。
通过常规方法扩增·纯化得到的质粒，进行DNA序列的确定。质粒的提取使用QIAPREP MINIPERP试剂盒(Qiagen公司制)，条件遵照试剂盒中所附条件。另外，DNA碱基序列的确定采用dRhodamine Terminator试剂盒(Applied Biosystems公司制)和作为引物的M13通用引物或Rev引物进行反应。条件遵照试剂盒中所附条件。将得到的反应液按照试剂盒操作手册中记载的条件纯化，采用ABI PRISM310Genetic Analyzer(Applied Biosystems公司制)进行分析。
其结果分别为：源自PvuII基因文库的约2Kbp的PCR产物包含实施例3(2)得到的基因的上游区域，源自StuI基因文库的约2Kbp的PCR产物包含实施例3(2)得到的基因的下游区域。因此，通过连接上述PCR产物的碱基序列明确了源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的PPCE基因的全长。得到的PPCE基因的碱基序列(序列编号3)包括和源自疣孢青霉(Penicillium verruculosum)的内切葡聚糖酶III基因的翻译区域相同的区域。然后，采用市售基因信息处理软件GENETYX(Genetyx Corporation制)计算出上述基因的同源性时，结果为82％。此外，以根据DNA片段推测的氨基酸序列(序列编号4)为基础，采用GENETYX(Genetyx Corporation制)计算出同源性时，与源自疣孢青霉(Penicillium verruculosum)的内切葡聚糖酶III具有86％的同源性。另外，以根据DNA片段推测的氨基酸序列(序列编号4)为基础，以公知的数据库(NCBI)进行blastp检索时，与源自棘孢曲霉(Aspergollus aculeatus)的FI-CMCase具有72％的同源性，与源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的EGIII具有53％的同源性。由于它们均是属于家族12的内切葡聚糖酶，所以认为得到的DNA片段是包含源自嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的家族12内切葡聚糖酶基因的翻译区域及其上·下游的基因片段。
《实施例5：PPCE基因在绿色木霉(Trichoderma viride)中的表达》
(1)PPCE表达用基因片段的获取
以在起始密码子的上游序列预先包含StuI、在终止密码子的下游预先包含PstI的形式设计下述诱变用引物，将PPCE基因采用PCR法扩增。
32228-NSTU：
CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTAACTTTTCTCCTG(序列编号12)
32228-CPST：CCCTGCAGCTAATTGACAGAAGCAGACC(序列编号13)
PCR反应以实施例3(1)得到的嗜松青霉(Penicillium pinophilum)PF1365株的染色体DNA为模板，以32228-NSTU和32228-CPST的合成DNA为引物，采用ExTaqPremix(Takara Bio公司制)进行。条件为，在94℃、2分钟后进行94℃、1分钟·50℃、2分钟·72℃、1.5分钟的反应25个循环，最后在72℃下处理3分钟，结束反应。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，切下约800bp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)，进行DNA的纯化。条件遵照试剂盒中所附条件。使用TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen公司制)，将得到的纯化DNA克隆到TOPO载体(PCR2.1-TOPO)上。将得到的质粒作为p28FULL18。采用常规方法扩增·纯化质粒p28FULL18，根据上述方法分析DNA序列。其结果，确认了质粒p28FULL18含有PPCE基因，所述PPCE基因在起始密码子的上游序列具有StuI，在终止密码子的下游具有PstI。由于质粒p28FULL18所含有的PPCE基因的碱基序列与实施例4确定的PPCE翻译区域的序列一致，所以将本基因片段用于以后的表达研究。
(2)PPCE表达质粒的构建
用限制性内切酶StuI和PstI切断质粒p28FULL18，通过琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，切下约800bp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)，进行DNA的纯化。然后，用限制性内切酶StuI和PstI切断质粒pCBI-M2[国际公开第2005/056787号的实施例B1]，通过琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，切下约5.6kbp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)，进行DNA的纯化。将所得基因片断与之前得到的约800bp的基因片断使用TaKaRa DNA连接试剂盒Ver.1(Takara Bio公司制)连接，制备质粒pPPCE-F2。
(3)由质粒pPPCE-F2制备绿色木霉(Trichoderma viride)的转化体
由实施例5(2)得到的质粒pPPCE-F2对绿色木霉(Trichoderma viride)的转化根据国际公开第2005/056787号记载的方法进行。即，以作为尿嘧啶合成基因(pyr4)缺损株的绿色木霉(Trichoderma viride)strain2株作为宿主，通过使用粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的pyr4基因作为选择标记的共转化(co-transformation)法进行转化。首先，根据国际公开第2005/056787号记载的方法配制绿色木霉(Trichoderma viride)strain2的原生质体，将得到的100μL原生质体悬浊液与7μg的质粒pPPCE-F2和3μg的质粒pPYR4(将源自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的pyr4基因亚克隆到LITMUS28得到的质粒)混合。在冰浴下将混合液静置5分钟，添加400μL的PEG溶液(60％聚乙二醇4000、10mmol/L氯化钙、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、pH7.5)，进一步在冰浴下静置20分钟。将经过以上处理的原生质体悬浊液用SUTC缓冲液(0.5mol/L蔗糖、10mmol/L氯化钙、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、pH7.5)洗涤后，与软琼脂同时覆盖含有0.5mol/L蔗糖的基本培养基，28℃下培养5日。培养后将繁殖的菌落再次接种到基本培养基中，将在此繁殖的菌落作为转化体。
(4)由质粒pPPCE-F2得到的绿色木霉(Trichoderma viride)转化体的培养
将实施例5(3)得到的转化体50株接种到PSW培养基(1.0％葡萄糖、4.0％乳糖、2.0％大豆粕、1.0％小麦胚芽、0.2％磷酸二氢钾、0.2％硫酸铵、0.2％磷酸铵、0.2％碳酸钙)中，28℃下培养5日。培养后，通过离心分离除去菌体，将得到的培养上清液作为粗制酶液。将粗制酶液供于SDS-PAGE时，在转化体中特异性地表达约26kD的蛋白质。采用表达量特别多的322F-205株的培养上清液进行以后的洗涤试验。
《实施例6：PPCE基因表达株的去毛活性评价》
(1)表达蛋白质浓度的测定
为评价PPCE基因表达株的去毛活性，根据实施例5在绿色木霉(Trichoderma viride)中表达源自里氏木霉(Trichoderma reesei)的EGIII[非专利文献1]、源自绿色木霉(Trichoderma viride)的内切葡聚糖酶SCE3[专利文献5]和源自棘孢曲霉(Aspergollus aculeatus)的FI-CMCase[非专利文献2]的基因作为对照，同样地配制培养上清液。根据实施例1的方法，采用12％凝胶，将得到的培养上清液和PPCE基因表达株的培养上清液用于SDS-PAGE。电泳后用SYPRO宝石红蛋白凝胶染色剂(Invitrogen公司制)染色，水洗，使用molecularimager FX(Bio-Rad Laboratories公司制)和Quantity One(Bio-RadLaboratories公司制)进行条带分析，测定表达蛋白质占全部蛋白质的比例。然后，以牛γ球蛋白为标准，通过蛋白分析试剂盒(Bio-RadLaboratories公司制)对培养上清液中的总蛋白质浓度进行定量。通过将得到的总蛋白质浓度乘以表达蛋白质比例来求出表达蛋白质浓度。
[表1]
木霉属重组体中的表达蛋白质量
活性主体 总蛋白质浓度 表达比例 表达蛋白质浓度
PPCE(本发明) 13.2μg/mL 6.1％ 0.81μg/mL
EGIII 11.8μg/mL 18.1％ 2.1μg/mL
SCE3 14.7μg/mL 17.9％ 2.6μg/mL
FI-CMCase 13.3μg/mL 9.8％ 1.3μg/mL
(2)染色棉布去毛活性的测定
使用PPCE基因表达株和实施例6(1)得到的对照株的培养上清液，测定去毛活性。首先，在大型洗衣机中使预先染色的茶色棉织物坯布起毛。然后，将上述起毛的茶色棉织物坯布在下列条件下进行去毛处理，目视判断处理后的坯布的去毛情况，研究去毛活性。
试验仪器：洗涤牢固度测试仪L-12(大荣科学精器制作所公司制)
温度：40℃
时间：60分钟
反应液：5mmol/L醋酸缓冲液(pH4)40mL
除培养上清液外，处理液中还适当添加不锈钢珠。
在目视评价下形成的绒毛大约被去除50％所需要的培养上清液量如表2所示。另外，根据实施例6(1)求得的表达蛋白质浓度也可计算出此时使用的表达蛋白质量。结果表明，PPCE可以最少量的蛋白质除去绒毛。
[表2]
PPCE表达株的去毛活性
Figure BDA00002960792900301
《实施例7：PPCE去毛活性的温度、pH参数》
(1)PPCE去毛活性的温度参数
使用实施例6得到的PPCE和EGIII表达株的培养上清液，通过以下洗涤条件研究温度参数。洗涤后通过目视评价绒毛的去除度，计算出目视评价下绒毛大约被去除50％所需要的培养上清液量。根据该液量，以各个样品中去毛最多的温度为100％，求出相对活性。如表3所示，PPCE的最适温度为30℃，EGIII的最适温度为40℃。
试验仪器：洗涤牢固度测试仪L-12(大荣科学精器制作所公司制)
温度：20℃-60℃
时间：60分钟
反应液：5mmol/L醋酸缓冲液(pH4)40mL
除培养上清液外，处理液中还适当添加不锈钢珠。
[表3]
PPCE表达株的温度参数
Figure BDA00002960792900302
(2)PPCE去毛活性的pH参数
使用实施例6得到的PPCE和EGIII表达株的培养上清液，通过以下洗涤条件研究pH参数。洗涤后通过目视评价绒毛的去除度，计算出目视评价下绒毛大约被去除50％所需要的培养上清液量。根据该液量，以各个样品中去毛最多的pH为100％，求出相对活性。如表4所示，PPCE的最适pH为3，EGIII的最适pH为4。
试验仪器：洗涤牢固度测试仪L-12(大荣科学精器制作所公司制)
温度：40℃
时间：60分钟
反应液：5mmol/L枸橼酸或醋酸缓冲液(pH2-6)40mL
除培养上清液外，处理液中还适当添加不锈钢珠。
[表4]
PPCE表达株的pH参数
《实施例8：密码子最优化PPCE基因在绿色木霉(Trichoderma viride)中的表达》
(1)密码子最优化PPCE基因的获取
将仅由木霉属中使用频率高的密码子构建的PPCE基因通过PCR反应合成。
a)PCEM1-2片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-1：
CCAGGCCTGCGCATCATGAAGCTGACCTTCCTGCTGAACCTGGCCGTCGCCGCCAGCGCCCAGCAGAGCCTGTGCAGCCAGTACAGCAGCTACAC(序列编号14)
PCEM-2：
TGGCTGCCGCTGCCGCTGCTCTCGCCCCACAGGTTGTTGTTGACGCTGTACTGGCCGCTGGTGTAGCTGCTGTACTGGCT(序列编号15)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-1、PCEM-2)，采用Primestar MAX DNA聚合酶(Taraka公司制)进行PCR反应。条件为，进行98℃、10秒·55℃、5秒·72℃、30秒的反应30个循环。反应液使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen公司制)进行DNA的纯化，溶出到50μL的TE缓冲液中。条件遵照试剂盒中所附条件。将得到的约150bp的DNA片段作为PCEM1-2。
b)PCEM3-4片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-3：
AGCAGCGGCAGCGGCAGCCAGTGCACCTACGTCAACAGCATCAGCAGCAGCGGCGTCAGCTGGAGCACCACCTGGAACTG(序列编号16)
PCEM-4：
TTGGTCAGGCCGCTCAGCTGGCTGTTGGCGTAGCTCTTGACGCTGGTGCTGCCGCCGCTCCAGTTCCAGGTGGTGCTCCA(序列编号17)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-3、PCEM-4)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约140bp的DNA片段作为PCEM3-4。
c)PCEM5-6片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-5：
CAGCTGAGCGGCCTGACCAAGAAGCTGGTCAGCAACCTGCAGAGCATCCCCACCAGCGTCCAGTGGAGCTACAGCAACAC(序列编号18)
PCEM-6：
GTGACGTGGTTGATGTCGGCGGCGGTGAACAGGTCGTAGCTGACGTCGGCGACGATGTTGGTGTTGCTGTAGCTCCACTG(序列编号19)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-5、PCEM-6)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约140bp的DNA片段作为PCEM5-6。
d)PCEM7-8片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-7：
GCCGACATCAACCACGTCACCTACAGCGGCGACTACGAGCTGATGATCTGGTAAATATGCCCCCGTCGTATTTCAAGTAT(序列编号20)
PCEM-8：
CAGGGGCTGGGCGCCGCCGTACTTGCCCAGCCTGATATCTTGATTAGCGGGAGATGTCTCATACTTGAAATACGACGGGG(序列编号21)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-7、PCEM-8)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约140bp的DNA片段作为PCEM7-8。
e)PCEM9-10片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-9：
ACGGCGGCGCCCAGCCCCTGGGCAGCCAGATCGGCACCGCCAACGTCGGCGGCGCCACCTGGCAGCTGTGGTACGGCGTC(序列编号22)
PCEM-10：
GCCGTTCCAGCTGGTGGTCTGGCTGCTGGCGACGAAGCTGTAGGTCTTCTGGCTGCCGTTGACGCCGTACCACAGCTGCC(序列编号23)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-9、PCEM-10)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约140bp的DNA片段作为PCEM9-10。
f)PCEM11-12片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-11：
AGACCACCAGCTGGAACGGCGACATCCTGCAGTTCTTCAAGTACCTGCAGAGCAACCAGGGCTTCCCCGCCAGCAGCCAG(序列编号24)
PCEM-12：
ATCATGTCAGATACAAGGAGTCTATAGGAACAGAAAGGGTCATGGCTTACCGATCAGGTACTGGCTGCTGGCGGGGAAGC(序列编号25)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-11、PCEM-12)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约140bp的DNA片段作为PCEM11-12。
g)PCEM13-14片段的制备
首先，制备具有下列序列的2条合成寡核苷酸。
PCEM-13：
CTCCTTGTATCTGACATGATTGCTTCGGTATCAGACCTGCAGTTCGGCACCGAGCCCTTCACCGGCAGCCAGACCACCCT(序列编号26)
PCEM-14：
CCCTCGAGCTAGTTGACGCTGGCGCTCCAGTGGTTGACGGTCAGGGTGGTCTGGCTGCCGGT(序列编号27)
在不存在模板的条件下使用20pmol上述引物(PCEM-13、PCEM-14)，按照实施例8(1)a)的方法进行PCR反应、片段的纯化。将得到的约120bp的DNA片段作为PCEM13-14。
h)PCEM1-4片段的制备
以实施例8(1)a)得到的PCEM1-2和实施例8(1)b)得到的PCEM3-4各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-1、PCEM-4)，采用Primestar MAX DNA聚合酶(Taraka公司制)进行第2次PCR反应。条件为，进行98℃、10秒·55℃、5秒·72℃、30秒的反应30个循环。反应液使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen公司制)进行DNA的纯化，溶出到50μL的TE缓冲液中。将得到的约270bp的DNA片段作为PCEM1-4。
i)PCEM5-8片段的制备
以实施例8(1)c)得到的PCEM5-6和实施例8(1)d)得到的PCEM7-8各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-5、PCEM-8)，进行第2次反应。按照上述实施例8(1)h)的方法进行PCR反应、片段的纯化，将得到的约260bp的DNA片段作为PCEM5-8。
j)PCEM9-12片段的制备
以实施例8(1)e)得到的PCEM9-10和实施例8(1)f)得到的PCEM11-12各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-9、PCEM-12)，进行第2次反应。按照上述实施例8(1)h)的方法进行PCR反应、片段的纯化，将得到的约260bp的DNA片段作为PCEM9-12。
k)PCEM1-8片段的制备
以实施例8(1)h)得到的PCEM1-4和实施例8(1)i)得到的PCEM5-8各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-1、PCEM-8)，采用Primestar MAX DNA聚合酶(Taraka公司制)进行第3次PCR反应。条件为，进行98℃、10秒·55℃、5秒·72℃、30秒的反应30个循环。反应液使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen公司制)进行DNA的纯化，溶出到50μL的TE缓冲液中。将得到的约510bp的DNA片段作为PCEM1-8。
l)PCEM9-14片段的制备
以实施例8(1)j)得到的PCEM9-12和实施例8(1)g)得到的PCEM13-14各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-9、PCEM-14)，进行第3次反应。按照上述实施例8(1)k)的方法进行PCR反应、片段的纯化，将得到的约360bp的DNA片段作为PCEM9-14。
m)质粒pCR-PCEm的制备
以实施例8(1)k)得到的PCEM1-8和实施例8(1)l)得到的PCEM9-14各1μL为模板，使用20pmol上述引物(PCEM-1、PCEM-14)，进行第4次PCR反应。条件为，进行98℃、10秒·55℃、5秒·72℃、30秒的反应30个循环。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，切下约800bp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)进行DNA的纯化，溶出到50μL的TE缓冲液中。将dNTP、缓冲液和EXTaq(Takara公司制)加入所得到的纯化DNA，72℃下温育10分钟，加入A碱基后使用TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen公司制)克隆到TOPO载体(PCR2.1-TOPO)上。将得到的质粒作为pCR-PCEm。采用常规方法扩增·纯化质粒pCR-PCEm，按照上述方法分析DNA序列。其结果，可以确认质粒pCR-PCEm除具有密码子最优化PPCE基因的翻译区域(序列编号28)外，在起始密码子的上游还含有限制性内切酶StuI的识别序列，在终止密码子的下游还含有XhoI的识别序列。
(2)密码子最优化PPCE表达质粒的构建
用限制性内切酶StuI和XhoI切断质粒pCR-PCEm，通过琼脂糖凝胶电泳分离反应后的样品，切下约800bp的基因片段，使用QIAQUICK凝胶提取试剂盒(Qiagen公司制)进行DNA的纯化。
然后，与实施例5(2)同样地用限制性内切酶StuI和XhoI切断质粒pCBI-M2，回收、纯化约5.6kbp的基因片段。将所得基因片段与之前得到的约800bp的基因片段使用Ligation High(东洋纺公司制)连接，制备质粒pPPCE-M。
(3)以质粒pPPCE-M制备绿色木霉(Trichoderma viride)的转化体
以实施例8(2)得到的质粒pPPCE-M对绿色木霉(Trichoderma viride)进行转化。转化的方法按照实施例5(3)的方法，以作为尿嘧啶合成基因(pyr4)缺损株的绿色木霉(Trichoderma viride)strain2株作为宿主，通过使用粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的pyr4基因作为选择标记的共转化(co-transformation)法进行转化。使用7μg的质粒pPPCE-M和3μg的质粒pPYR4，对绿色木霉strain2进行转化，得到40株转化体。
(4)由质粒pPPCE-M获得的绿色木霉转化体的培养
将实施例8(3)得到的转化体40株接种到实施例5(4)记载的PSW培养基中，28℃下培养5日。培养后，通过离心分离除去菌体，将得到的培养上清液作为粗制酶液。将粗制酶液供于SDS-PAGE时，在转化体中特异性地表达约26kD的蛋白质。并且，按照实施例7测定上述粗制酶液的去毛活性时(测定条件...温度：30℃，时间：60分钟，反应液：5mmol/L枸橼酸缓冲液pH3.0)，与未进行转化的宿主相比，在转化体中活性特异性地增加。
产业实用性
本发明可用于纤维素的各种处理，例如含纤维素纤维的处理、废纸的脱墨处理、纸浆滤水性的改善、动物饲料消化能力的改善、生物乙醇的制备等用途。
以上虽然按照特定实施方式说明本发明，但对本领域技术人员而言显而易见的变形和改良也包含在本发明范围内。
序列表文本
序列表中序列编号为5-27的各个序列是PCR用引物。序列编号为28的序列是密码子最优化(修饰)基因。序列编号为29的序列是由密码子最优化(修饰)基因推测的氨基酸序列。
Figure IDA00002960793500011
Figure IDA00002960793500031
Figure IDA00002960793500041
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Figure IDA00002960793500161
Figure IDA00002960793500171

Claims (24)

1.选自以下(a)-(i)的蛋白质：
(a) 包含以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质；
(b) 包含以序列编号4表示的第1位-第236位氨基酸序列且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质；
(c) 包含以序列编号30表示的氨基酸序列且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质；
(d) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的修饰蛋白质：在以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列中保守取代1个或多个氨基酸和/或N末端谷氨酰胺残基被修饰成焦谷氨酸残基所得的氨基酸序列；
(e) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的修饰蛋白质：在以序列编号4表示的第16位-第236位氨基酸序列或第1位-第236位氨基酸序列中缺失、取代、添加1个或多个氨基酸和/或N末端谷氨酰胺残基被修饰成焦谷氨酸残基所得的氨基酸序列；
(f) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质：以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位的氨基酸序列、或以序列编号30表示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列；
(g) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的修饰蛋白质：在以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位的氨基酸序列中保守取代1个或多个氨基酸和/或N末端谷氨酰胺残基被修饰成焦谷氨酸残基所得的氨基酸序列；
(h) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的修饰蛋白质：在以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列中缺失、取代、添加1个或多个氨基酸和/或N末端谷氨酰胺残基被修饰成焦谷氨酸残基所得的氨基酸序列；
(i) 由如下氨基酸序列构成且具有内切葡聚糖酶活性的同源蛋白质：与以序列编号4表示的第16位-第236位或第1位-第236位氨基酸序列、或以序列编号30表示的氨基酸序列具有90%以上同源性的氨基酸序列。
2.多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1的蛋白质。
3.选自以下(j)~(l)的多核苷酸：
(j) 包含以序列编号3或28表示的碱基序列或以序列编号3或28表示的第46位-第834位碱基序列且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸；
(k) 由如下碱基序列构成且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸：在以序列编号3或28表示的碱基序列或以序列编号3或28表示的第46位-第834位碱基序列中缺失、取代和/或添加1个或多个碱基所得的碱基序列；
(l) 包含如下碱基序列且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的多核苷酸：在以序列编号3或28表示的碱基序列或以序列编号3或28表示的第46位-第834位碱基序列中缺失、取代和/或添加1个或多个碱基所得的碱基序列。
4.表达载体，所述表达载体包含权利要求2或3的多核苷酸。
5.宿主细胞，所述宿主细胞通过权利要求4的表达载体进行转化。
6.权利要求5的宿主细胞，其中，宿主为酵母或丝状菌。
7.权利要求6的宿主细胞，其中，丝状菌是属于木霉属( Trichoderma )、腐质霉属( Humicola )、曲霉属( Aspergillus )、枝顶孢属( Acremonium )或青霉属( Penicillium )的微生物。
8.权利要求7的宿主细胞，其中，丝状菌是属于木霉属( Trichoderma )的微生物。
9.权利要求8的宿主细胞，其中，丝状菌是绿色木霉( Trichoderma  viride )。
10.蛋白质的制备方法，所述制备方法包括培养权利要求5的宿主细胞的步骤，以及由通过所述培养得到的宿主细胞或其培养物收集权利要求1的蛋白质的步骤。
11.蛋白质，所述蛋白质采用权利要求10的方法生产。
12.纤维素酶配制物，所述配制物含有权利要求1的蛋白质。
13.洗涤剂组合物，所述组合物含有权利要求1蛋白质。
14.含纤维素纤维的处理方法，所述方法包括使含纤维素纤维与权利要求1的蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
15.以改善含纤维素纤维的触感和外观为目的的减重加工方法，所述方法包括使含纤维素纤维与权利要求1的蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
16.使染色后的含纤维素纤维的颜色局部变化的方法，所述方法包括使染色后的含纤维素纤维与权利要求1蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
17.使染色后的含纤维素纤维的颜色清澄化的方法，所述方法包括使染色后的含纤维素纤维与权利要求1的蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
18.延缓含纤维素纤维开始起毛的速度或者减少含纤维素纤维起毛的方法，所述方法包括使含纤维素纤维与权利要求1的蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
19.降低含纤维素纤维开始变硬的速度或者减少含纤维素纤维变硬的方法，所述方法包括使含纤维素纤维与权利要求1的蛋白质、权利要求12的纤维素酶配制物或权利要求13的洗涤剂组合物接触的步骤。
20.权利要求14的方法，其中，与洗涤剂组合物接触的步骤通过所述纤维的浸渍、洗涤或洗涮进行。
21.废纸脱墨的方法，其特征在于：在采用脱墨药品处理废纸进行脱墨的步骤中，使用权利要求1的蛋白质或权利要求12的纤维素酶配制物。
22.纸浆滤水性的改善方法，所述方法包括将纸浆用权利要求1的蛋白质或权利要求12的纤维素酶配制物处理的步骤。
23.改善动物饲料消化能力的方法，所述方法包括将动物饲料用权利要求1的蛋白质或权利要求12的纤维素酶配制物处理的步骤。
24.将纤维素类物质分解、糖化以制备生物乙醇的方法，所述方法包括将纤维素类物质用权利要求1的蛋白质或权利要求12的纤维素酶配制物处理的步骤。
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