CN103740676A

CN103740676A - 一种来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶

Info

Publication number: CN103740676A
Application number: CN201310625065.0A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 张慧丹; 王华明; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-11-29
Filing date: 2013-11-29
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶，并通过将该基因转化入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达该内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达1200U/mL，所产内切葡聚糖酶的最适pH为5.0，最适温度为50℃，在pH4.0-7.0范围内酶活稳定，可广泛应用于纺织加工技术领域。

Description

一种来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶。

背景技术

木质纤维素作为地球上第一大可再生资源，其开发和利用越来越得到各国的重视。木质纤维素的生物降解和转化首先通过纤维素酶系来实现。纤维素酶系广泛存在于多种微生物中，主要由以下三种酶组成：内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，此外还有很高活性的木聚糖酶活性。

纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。

本发明从斜卧青霉（Penicillum decumbens）中克隆得到的一个纤维素酶基因----内切葡聚糖酶（endoglucanaseⅡ，简称EGⅡ），并构建了该基因的重组表达菌株，为工业化生产内切葡聚糖酶提供了有力的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型内切葡聚糖酶及其应用。本发明构建含斜卧青霉内切葡聚糖酶基因的毕赤酵母工程菌株，高效重组表达该酶，从而实现该酶的广泛应用，以弥补现有技术的不足。

本发明的一个方面涉及一种内切葡聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

本发明的一个方面涉及编码内切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明还涉及上述内切葡聚糖酶在纺织领域的应用。

本发明提供了来源于斜卧青霉的新型内切葡聚糖，并将该酶的编码基因转化入毕赤酵母中，构建了高效表达该内切葡聚糖酶的工程菌。摇瓶发酵酶活可达1200U/mL，所产内切葡聚糖酶的最适pH为5.0，最适温度为50℃，在pH4.0-7.0范围内酶活稳定，可广泛应用于纺织加工技术领域，其中在牛仔布起花及除毛方面的应用，除毛干净，起花均匀，花点较小，强力损失小，应用效果显著。

附图说明

图1为毕赤酵母工程菌EG2发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，泳道2中箭头所指处的条带即为重组表达的内切葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 基因克隆

1.1 斜卧青霉总DNA的提取

将斜卧青霉（P. decumbens）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

总RNA的制备

OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，用blast分析表明扩增片段为内切葡聚糖酶基因，其翻译出的内切葡聚糖酶蛋白序列为SEQ ID NO:1。

实施例2 毕赤酵母工程菌构建

以质粒pT- EG2为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃ 4min；94℃ 40s，56℃ 40s，72℃ 1.5min，共30个循环；72℃ 7min。。扩增产物凝胶回收后，先进行Eco RI和Not I双酶切。同样，对表达质粒pPIC9K也进行Eco RI和Not I双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC- EG2。

表达质粒pPIC- EG2用Sal I酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1 mL预冷的电泳缓冲液中(含1mM MgCl₂，10mM HEPES, 250mM 蔗糖, pH 7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇），挑选一个阳性转化子，命名为Pichia pastoris EG2。

实施例3 发酵和酶学性质测定

将毕赤酵母工程菌EG2接种于5ml BMGY ( 1％酵母提取物，2％蛋白陈， 1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，l％甘油）, 30℃ 培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50ml BMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1. 34 % YNB, 4×10^-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇，诱导培养5天，发酵液离心，取上清液，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，泳道2中箭头所指处的条带即为重组表达的内切葡聚糖酶。经测定，该工程菌株发酵上清液的酶活为1200U/mL。

（1）最适pH分析

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度45℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用pH5.0。

（2）最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为50℃。

实施例4 内切葡聚糖酶在牛仔布起花及除毛方面的应用

处理原料：牛仔布；

酶的用量：0.1-3.0g/L（酶活为5000U/g）；

应用条件：45-55℃，处理时间为10-60分钟，pH范围为4.0-7.0；

适用的浴比范围：1:5-1:30；

使用的设备类型：工业水洗机等。

经本发明重组表达的内切葡聚糖酶处理后，牛仔布除毛干净，起花均匀，花点较小，强力损失小，可广泛应用于其他纺织加工领域。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 247

<212> PRT

<213> endoglucanase enzyme sequence

<400> 1

Met Thr Gln Leu Val Asp Glu Pro Val Asp Gly Val Asn Gln Met Arg

1 5 10 15

Pro Phe Val Asn Asp Asp Gly Phe Asn Ile Phe Arg Leu Pro Lys Gly

20 25 30

Trp Gln Phe Leu Glu Lys Asn Asn Leu Gly Gly Ser Leu Asp Ser Lys

35 40 45

Lys Phe Ala Lys Tyr Asp Lys Leu Val Gln Gly Ser Leu Ser Leu Gly

50 55 60

Ala Tyr Cys Ile Val Asn Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly

65 70 75 80

Val Ile Gly Lys Gly Gly Pro Thr Asp Asp Gln Phe Arg Arg Pro Trp

85 90 95

Thr Glu Leu Ala Pro Pro Tyr Lys Gly Glu Ser Lys Ile Ile Phe Gly

100 105 110

Val Met Lys Glu Pro His Asp Leu Asp Ile Asn Arg Trp Ala Thr Thr

115 120 125

Val Gln Lys Ala Val Thr Ala Ile Pro Lys Ala Gly Ala Thr Ser Gln

130 135 140

Met Phe Leu Leu Pro Gly Thr Asp Phe Thr Ser Ala Ala Asn Phe Val

145 150 155 160

Glu Lys Gly Ser Gly Ala Ala Leu Ser Ala Val Thr Asn Leu Asp Gly

165 170 175

Ser Thr Thr Asn Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp

180 185 190

Asn Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Thr Asn Asn Ala Glu Ser Leu

195 200 205

Lys Ser Leu Ala Gln Trp Leu Arg Ala Asn Lys Arg Gln Ala Leu Leu

210 215 220

Thr Glu Thr Gly Gly Gly Lys Val Gln Ser Cys Gly Thr Phe Met Ser

225 230 235 240

Gln Gln Leu Glu Val Leu Lys

245

<210> 2

<211> 744

<212> DNA

<213> endoglucanase gene sequence

<400> 2

atgacccaac ttgtggacga gcccgtcgat ggtgtgaacc agatgcgacc ctttgtcaac 60

gacgacggct tcaacatctt ccgcctcccg aaaggctggc agttcttgga gaaaaacaac 120

ctcggtggct cactggactc gaagaaattt gccaagtacg acaagctggt tcaaggatct 180

ctgtccctgg gagcatactg tatcgtcaat ctccacaatt acgctcgctg gaacggcggc 240

gtcatcggaa aaggcggtcc caccgacgac cagttcagga ggccctggac tgaactggcc 300

cctccctaca agggtgaaag caaaatcatc tttggtgtga tgaaggagcc acacgacttg 360

gacatcaacc gatgggccac caccgtgcaa aaagccgtga cggcgatccc caaggccggc 420

gccacttccc aaatgttcct tcttccaggt accgacttca ccagtgcggc caactttgtc 480

gaaaagggat ccggtgccgc gctctcggcc gtcaccaacc tggacggatc caccaccaac 540

ctgatcttcg acgtgcacaa gtatctcgac tccgataaca gcggcaccca cgccgagtgc 600

gtgaccaaca acgccgaatc tttgaaaagc ctggcccaat ggctccgcgc caacaagcgt 660

caagccttgc tcaccgagac cggtggagga aaagtccaga gctgcggaac attcatgtcc 720

cagcaactgg aagtgctcaa ataa 744

Claims

1.一种内切葡聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

2.编码权利要求1所述内切葡聚糖酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

3.权利要求1所述的内切葡聚糖酶在纺织中的应用。

4.一种酶组合物，所述的酶组合物包含有权利要求1所述的内切葡聚糖酶。