CN103740749B - 一种重组表达内切葡聚糖酶的工程菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体是将来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶转化入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达该内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达1200U/mL，所产内切葡聚糖酶的最适pH为5.0，最适温度为50℃，在pH4.0-7.0范围内酶活稳定，可广泛应用于纺织加工技术领域。

Description

一种重组表达内切葡聚糖酶的工程菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种重组表达内切葡聚糖酶的工程菌株及其应用。

背景技术

木质纤维素作为地球上第一大可再生资源，其开发和利用越来越得到各国的重视。木质纤维素的生物降解和转化首先通过纤维素酶系来实现。纤维素酶系广泛存在于多种微生物中，主要由以下三种酶组成：内切β-葡聚糖酶、外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，此外还有很高活性的木聚糖酶活性。

纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。

本发明从斜卧青霉（Penicillumdecumbens）中克隆得到的一个纤维素酶基因----内切葡聚糖酶（endoglucanaseⅡ，简称EGⅡ），并构建了该基因的重组表达菌株，为工业化生产内切葡聚糖酶提供了有力的技术支持。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组表达内切葡聚糖酶的工程菌株。本发明将来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建得到高效重组表达内切葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明的一个方面提供了一种重组表达载体，其携带有内切葡聚糖酶的DNA片段。

所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。

所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。

本发明另一方面提供了一种工程菌，其携带有上述重组表达载体。

所述工程菌为毕赤酵母EG2(PichiapastorisEG2)。

本发明还提供了毕赤酵母EG2在生产内切葡聚糖酶中的应用。

本发明将来源于斜卧青霉的内切葡聚糖酶基因转化入毕赤酵母中，构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌。所述毕赤酵母工程菌能高效表达该内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达1200U/mL，所产内切葡聚糖酶的最适pH为5.0，最适温度为50℃，在pH4.0-7.0范围内酶活稳定，可广泛应用于纺织加工技术领域。

附图说明

图1为毕赤酵母工程菌EG2发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，泳道2中箭头所指处的条带即为重组表达的内切葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(Singletonetal.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleetal.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。具体而言，宿主菌株优选地是丝状真菌细胞。该宿主细胞可以是野生型丝状真菌宿主细胞或者经遗传修饰的宿主细胞。术语“宿主菌株”或“宿主细胞”指由丝状真菌菌株细胞所产生的细胞核原生质体。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1基因克隆

1.1斜卧青霉总DNA的提取

将斜卧青霉（P.decumbens）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mMEDTA,250mMNaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10MNH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

总RNA的制备

OMEGA公司的E.Z.N.A.FungalRNAKit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；55℃40S，72℃1min30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQIDNO:2，用blast分析表明扩增片段为内切葡聚糖酶基因，其翻译出的内切葡聚糖酶蛋白序列为SEQIDNO:1。

实施例2毕赤酵母工程菌构建

以质粒pT-EG2为模板，设计引物进行PCR扩增，PCR扩增条件是95℃4min；94℃40s，56℃40s，72℃1.5min，共30个循环；72℃7min。。扩增产物凝胶回收后，先进行EcoRI和NotI双酶切。同样，对表达质粒pPIC9K也进行EcoRI和NotI双酶切。用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体4℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌BL21。相应的阳性克隆表达质粒命名为pPIC-EG2。

表达质粒pPIC-EG2用SalI酶切电泳鉴定后，经乙醇沉淀浓缩，测定DNA浓度，以3μg/μL浓度稀释质粒片段保存备用。制备毕赤酵母GS115电转化感受态细胞，最后重悬于1mL预冷的电泳缓冲液中(含1mMMgCl₂，10mMHEPES,250mM蔗糖,pH7.8)。在80μL感受态细胞中加入5μL线性化重组质粒；电转化（条件为1500V、200Ω、25μF）；最后涂布于MM平板（MM培养基组分：1.34%YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇），挑选一个阳性转化子，命名为PichiapastorisEG2。

实施例3发酵和酶学性质测定

将毕赤酵母工程菌EG2接种于5mlBMGY(1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34%YNB,4×10^-5%生物素，l％甘油）,30℃培养过夜，离心收集菌体，把菌体加入50mlBMMY诱导培养基（1％酵母提取物，2％蛋白陈，1.34%YNB,4×10^-5%生物素，0.5％甲醇），每12小时补加50μL甲醇，诱导培养5天，发酵液离心，取上清液，进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，泳道2中箭头所指处的条带即为重组表达的内切葡聚糖酶。经测定，该工程菌株发酵上清液的酶活为1200U/mL。

（1）最适pH分析

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度45℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用pH5.0。

（2）最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为50℃。

实施例4内切葡聚糖酶在牛仔布起花及除毛方面的应用

处理原料：牛仔布；

酶的用量：0.1-3.0g/L（酶活为5000U/g）；

应用条件：45-55℃，处理时间为10-60分钟，pH范围为4.0-7.0；

适用的浴比范围：1:5-1:30；

使用的设备类型：工业水洗机等。

经本发明重组表达的内切葡聚糖酶处理后，牛仔布除毛干净，起花均匀，花点较小，强力损失小，可广泛应用于其他纺织加工领域。

SEQUENCELISTING

<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120>一种重组表达内切葡聚糖酶的工程菌株

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>247

<212>PRT

<213>endoglucanaseenzymesequence

<400>1

MetThrGlnLeuValAspGluProValAspGlyValAsnGlnMetArg

151015

ProPheValAsnAspAspGlyPheAsnIlePheArgLeuProLysGly

202530

TrpGlnPheLeuGluLysAsnAsnLeuGlyGlySerLeuAspSerLys

354045

LysPheAlaLysTyrAspLysLeuValGlnGlySerLeuSerLeuGly

505560

AlaTyrCysIleValAsnLeuHisAsnTyrAlaArgTrpAsnGlyGly

65707580

ValIleGlyLysGlyGlyProThrAspAspGlnPheArgArgProTrp

859095

ThrGluLeuAlaProProTyrLysGlyGluSerLysIleIlePheGly

100105110

ValMetLysGluProHisAspLeuAspIleAsnArgTrpAlaThrThr

115120125

ValGlnLysAlaValThrAlaIleProLysAlaGlyAlaThrSerGln

130135140

MetPheLeuLeuProGlyThrAspPheThrSerAlaAlaAsnPheVal

145150155160

GluLysGlySerGlyAlaAlaLeuSerAlaValThrAsnLeuAspGly

165170175

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180185190

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195200205

LysSerLeuAlaGlnTrpLeuArgAlaAsnLysArgGlnAlaLeuLeu

210215220

ThrGluThrGlyGlyGlyLysValGlnSerCysGlyThrPheMetSer

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245

<210>2

<211>744

<212>DNA

<213>endoglucanasegenesequence

<400>2

atgacccaacttgtggacgagcccgtcgatggtgtgaaccagatgcgaccctttgtcaac60

gacgacggcttcaacatcttccgcctcccgaaaggctggcagttcttggagaaaaacaac120

ctcggtggctcactggactcgaagaaatttgccaagtacgacaagctggttcaaggatct180

ctgtccctgggagcatactgtatcgtcaatctccacaattacgctcgctggaacggcggc240

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cctccctacaagggtgaaagcaaaatcatctttggtgtgatgaaggagccacacgacttg360

gacatcaaccgatgggccaccaccgtgcaaaaagccgtgacggcgatccccaaggccggc420

gccacttcccaaatgttccttcttccaggtaccgacttcaccagtgcggccaactttgtc480

gaaaagggatccggtgccgcgctctcggccgtcaccaacctggacggatccaccaccaac540

ctgatcttcgacgtgcacaagtatctcgactccgataacagcggcacccacgccgagtgc600

gtgaccaacaacgccgaatctttgaaaagcctggcccaatggctccgcgccaacaagcgt660

caagccttgctcaccgagaccggtggaggaaaagtccagagctgcggaacattcatgtcc720

cagcaactggaagtgctcaaataa744

Claims (5)

1.一种重组表达载体，其携带有内切葡聚糖酶的DNA片段，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。

2.如权利要求1所述表达载体，其特征在于，所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。

3.一种工程菌，其携带有权利要求1所述重组表达载体。

4.如权利要求3所述的工程菌，为毕赤酵母EG2(PichiapastorisEG2)。

5.权利要求4所述工程菌在纺织加工领域中的应用。