CN103667085B

CN103667085B - 一种内切葡聚糖酶生产菌株

Info

Publication number: CN103667085B
Application number: CN201310653617.9A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 许丽红; 王华明; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2033-12-04
Also published as: CN103667085A

Abstract

本发明构建了一种黑曲霉工程菌，能高效表达来源于草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工技术领域。

Description

一种内切葡聚糖酶生产菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶生产菌株。

背景技术

纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。

纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。

纤维素酶成本高以及酶活力低已经成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种内切葡聚糖酶生产菌株。本发明通过将草酸青霉（Penicilliumoxalicum）的内切葡聚糖酶基因转化入黑曲霉中，获得高效生产内切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面涉及一种黑曲霉工程菌，其携带有能表达内切葡聚糖酶的重组质粒。

所述重组质粒含有草酸青霉的内切葡聚糖酶基因。

所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。

所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。

本发明的另一方面涉及上述黑曲霉工程菌在生产内切葡聚糖酶中的应用。

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达来源于草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工技术领域，具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。

附图说明

图1为黑曲霉EG-1发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道1为对照组，泳道2为黑曲霉EG-1发酵上清液，箭头所指处即为重组表达的内切葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(Singletonetal.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleetal.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1内切葡聚糖酶基因的克隆

1.1草酸青霉总DNA的提取

将草酸青霉（Penicilliumoxalicum）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100mMTris-HCl,100mMEDTA,250mMNaCl,1%SDS);然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl10MNH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A.FungalRNAKit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

基因克隆

以1.1中提取的草酸青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；55℃40S，72℃1min30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQIDNO:2，用blast分析表明扩增片段为草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，其编码氨基酸序列为为SEQIDNO:1，为一新的等位基因。

实施例2黑曲霉工程菌的构建

2.1表达载体构建

将1.2中得到的PCR产物进行XbaI单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行XbaI单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5α；然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pGAMD-EG1。

原生质体制备

接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约100mLCMA（2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0.1%细菌蛋白胨）的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20mL裂解酶液（SigmaL1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.8MMgSO₄溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min；弃上清，加10mL1.2M山梨醇悬浮，然后3000rpm，离心10min；加适量山梨醇悬浮分装（200μL/管，10⁸个/mL）。

转化与验证

取10μgpGAMD-EG1DNA加入到200μL原生质体中，接着加入50μL25%PEG轻轻混匀，室温静置20min；然后加2mL25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.059%乙酰胺，0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖,21.85%山梨醇,0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板（0.059%乙酰胺,0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖，1%琼脂粉），30℃黑暗培养数天至转化子长出。验证阳性转化子。将获得的一株工程菌命名为黑曲霉EG-1（AspergillusnigerEG-1）。

实施例3发酵与酶活测定

3.1摇瓶表达

将黑曲霉工程菌EG-1接种于50mL黑曲霉发酵培养基(1.2％NaNO3，0.05％KCl，0.15%KH₂PO₄，0.205%MgSO₄·7H₂O，0.35％NaH₂PO₄·H₂O，7%柠檬酸钠，4.5%胰蛋白大豆肉汤，微量元素1mL，4.1%葡萄糖），30℃培养4-5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析。结果如图1所示，在50kDa处有一蛋白条带，即为重组表达的内切葡聚糖酶，重组蛋白大小与预测的一致。

实施例4酶学性质分析

4.1最适作用pH值

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度45℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用pH4.0。

最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为45℃。

实施例4内切葡聚糖酶在针织面料、梭织面料的除毛染色方面的应用

处理原料：针织面料、梭织面料；

酶的用量：0.1-3.0g/L；

处理条件：35-55℃，处理时间为30-150分钟，pH范围为4.0-9.5；

适用的浴比范围：1:5-1:30；

设备类型：溢流染色机，卷染机，水洗机等；

本发明获得的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。

SEQUENCELISTING

<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120>一种内切葡聚糖酶生产菌株

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>477

<212>PRT

<213>endoglucanaseenzymesequence

<400>1

MetSerPheThrArgArgProPheProGluAlaAlaLeuAlaLeuLeu

151015

ProLeuAlaGlnAlaGlnGlnGlnValValAlaLysLeuGluAsnPro

202530

SerProLysThrTyrLysCysSerLysSerGlyGlyCysValValGln

354045

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505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

ValTyrLeuLeuGlyProAspGlyAspTyrValLeuMetLysLeuLeu

130135140

GlyGlnGluLeuThrPheAspValAspLeuSerThrLeuProCysGly

145150155160

GluAsnGlyAlaLeuTyrLeuSerGluMetSerGlySerGlyGlyArg

165170175

AsnAlaAsnAsnLysGlyGlyAlaAlaTyrGlySerGlyTyrCysAsp

180185190

ValLysCysProLeuGluThrTrpLysAsnGlyThrLeuValProGly

195200205

GlyGlnAlaTyrCysCysAsnGluMetAspIleLeuGluGlyAsnSer

210215220

AlaAlaAsnSerTyrThrProHisProCysSerSerAspAspCysAsp

225230235240

LysGlyGlyCysGlyPheAsnProTyrAlaGlnGlyLysThrAsnTyr

245250255

TrpAlaProGlyGlyThrValAspThrSerLysProPheThrIleAsn

260265270

ThrGlnPheIleThrAsnAspGlyThrThrThrGlyIleArgThrGlu

275280285

IleArgArgLysTyrIleGlnAsnGlyAsnValIleAlaAsnAlaLys

290295300

SerSerAlaGlyValAspSerIleLysValAlaTrpSerGluSerVal

305310315320

GluGlyAlaAlaAlaThrPheGlyGlyLeuThrSerMetGlyLysAla

325330335

ProGlyArgGlyIleValLeuIlePheSerIleArgAsnGluValArg

340345350

GlyAsnMetLysSerLeuAspArgGlySerAsnGlyProCysSerSer

355360365

ArgGluGlyAsnProThrLysIleIleAlaGlnAsnProAspThrHis

370375380

ValValPheSerLysMetArgTrpGlyAspIleGlySerThrPheAsn

385390395400

AlaProGlyGlySerGlySerSerSerCysThrThrProSerLysAla

405410415

ThrThrThrValAlaThrThrLysAlaThrSerThrThrThrLysIle

420425430

SerThrThrThrThrAlaGlyGlyAlaThrGlnThrGlnTrpGlyGln

435440445

CysGlyGlyGlnGlyLysProGlyProThrAlaCysValSerGlyThr

450455460

ThrCysLysAlaGlnLysLeuTyrTyrSerGlnCysLeu

465470475

<210>2

<211>1434

<212>DNA

<213>endoglucanasegenesequence

<400>2

atgtctttcacaaggagaccgtttcccgaggcggcattggccctcttgcctctcgcccag

60

gcccagcagcaagtggttgcgaaacttgaaaacccgtccccgaaaacatacaagtgctcc

120

aagtccggaggctgtgttgttcaggacacgtcggttgtgttcgaatggaaatccctctgg

180

attcacaccgccaacggctacgactcgtgcaccacctcgtttgaagtggacccaaccttg

240

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300

tttggagaggccaccagtggtgactcgctcactttgcaccagtacgtgaaaaccgacgga

360

acctacaacaatgcgtctccccgtgtctacctcctcggtcccgacggcgactacgtcctc

420

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480

gagaacggtgcactctatctatccgagatgagtgggagcggtggacgcaatgccaacaac

540

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600

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660

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720

aagggtggatgcggcttcaacccctatgcgcagggtaagaccaactactgggcgcccggc

780

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840

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900

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960

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1020

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1080

ggtagcaacggtccttgcagcagcagggagggcaaccctaccaaaatcattgctcagaac

1140

cccgacactcacgttgtcttctctaaaatgcgctggggtgacattggttccactttcaac

1200

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1260

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1320

gcgactcagacccaatggggccagtgtggaggccagggcaagcccggacctacagcctgc

1380

gtgtccggaactacctgcaaggcgcagaagctttactactctcagtgcctgtga

1434

Claims

1.一种黑曲霉，其携带有能表达内切葡聚糖酶的质粒，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。

2.如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。

3.权利要求1所述的黑曲霉在生产内切葡聚糖酶中的应用。