CN103725660B - 一种内切葡聚糖酶及其应用 - Google Patents

一种内切葡聚糖酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的新型内切葡聚糖酶来源于草酸青霉,构建的黑曲霉工程菌能高效表达该酶,摇瓶发酵酶活可达900U/mL;本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0,最适温度为45℃,在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%,可广泛应用于纺织加工技术领域。在针织面料、梭织面料的除毛染色方面,应用本发明的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净,对织物强力损失小的特点,有利于其推广应用。

Description

一种内切葡聚糖酶及其应用
 技术领域
本发明属于微生物工程技术领域,具体涉及一种内切葡聚糖酶及其应用。
背景技术
纤维素酶是一类能够降解纤维素,使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称,按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料,对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。
纤维素广泛存在于自然界的生物体中,细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌,比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。
纤维素酶成本高以及酶活力低已经成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈,因此构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。
发明内容
本发明提供了一种新型内切葡聚糖酶及其在纺织领域的应用。本发明通过构建含有草酸青霉(Penicillium oxalicum)的内切葡聚糖酶基因的表达质粒,转化入黑曲霉中,获得高效重组表达内切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株,从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面涉及一种内切葡聚糖酶,包括:
(a)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶;
(b)在(a)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的,具有内切葡聚糖酶活性的酶。
编码上述内切葡聚糖酶的基因,其一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。
本发明另一方面涉及上述内切葡聚糖酶在纺织领域中的应用。
本发明提供的新型内切葡聚糖酶来源于草酸青霉,构建的黑曲霉工程菌能高效表达该酶,摇瓶发酵酶活可达900U/mL;本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0,最适温度为45℃,在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%,可广泛应用于纺织加工技术领域。在针织面料、梭织面料的除毛染色方面,应用本发明的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净,对织物强力损失小的特点,有利于其推广应用。
附图说明
图1 为黑曲霉EG-1发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图,其中泳道1为对照组,泳道2为黑曲霉EG-1发酵上清液,箭头所指处即为重组表达的内切葡聚糖酶。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法,例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是,这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂,因为它们可以改变。
除非在本文中另作限定,本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
    下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1 内切葡聚糖酶基因的克隆
1.1  草酸青霉总DNA的提取
将草酸青霉(Penicillium oxalicum)过夜培养,取适量菌体置于离心管中,13000 rpm离心5 min,弃上清;加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠,在珠打仪剧烈振荡2min左右;65℃水浴20min后,加入200μl 10M NH4AC,冰浴10min;13000rpm离心10min,取上清;加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置30min;13000 rpm离心10min,弃上清;用70%乙醇洗涤2次;晾干,加入水溶解,于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA,其制备过程参照试剂盒的操作手册。
1.2 基因克隆
以1.1中提取的草酸青霉基因组总DNA为模板,设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min;94℃ 30S;55℃ 40S,72℃ 1min 30个循环;72℃,7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体,获得克隆载体pMD-EG2,送至北京华大基因研究中心进行测序分析,获得的核苷酸序列为SEQ ID NO:2,用blast分析表明扩增片段为草酸青霉的内切葡聚糖酶基因,其编码氨基酸序列为为SEQ ID NO:1,为一新的等位基因。
实施例2 黑曲霉工程菌的构建
2.1 表达载体构建
将1.2中得到的PCR产物进行Xba I单酶切。同样,对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后,把连接产物导入大肠杆菌DH5α;然后通过PCR验证连接正确与否,最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pGAMD-EG1。
2.2 原生质体制备
接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4 天;切取直径约3cm的菌落置于约100mL CMA(2%麦芽提取物、2%葡萄糖,0.1%细菌蛋白胨)的液体培养基中,30℃,200 rpm振荡培养过夜;多层纱布过滤收集菌丝;将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小时;取出酶解液,加入0.8M MgSO4溶液,轻轻摇晃,倒于三层灭菌擦镜纸过滤,收集滤液,3000 rpm,离心10 min;弃上清,加10 mL 1.2M山梨醇悬浮,然后3000 rpm,离心10 min;加适量山梨醇悬浮分装(200 μL/管,108个/mL)。
2.3 转化与验证
取10μg pGAMD-EG1 DNA加入到200μL原生质体中,接着加入50μL 25%PEG轻轻混匀,室温静置20 min;然后加2mL 25%PEG,轻轻混匀,室温静置5min,把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基(0.059%乙酰胺,0.152%KH2PO4,0.34%CsCl,0.052%KCl,1%葡萄糖, 21.85%山梨醇, 0.35%琼脂糖),轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板(0.059%乙酰胺, 0.152%KH2PO4,0.34%CsCl,0.052%KCl,1%葡萄糖,1%琼脂粉),30℃黑暗培养数天至转化子长出。验证阳性转化子。将获得的一株工程菌命名为黑曲霉EG-1(Aspergillus niger EG-1)。
实施例3 发酵与酶活测定
3.1摇瓶表达
将黑曲霉工程菌EG-1接种于50mL 黑曲霉发酵培养基 (1.2%NaNO3,0.05%KCl,0.15% KH2PO4,0.205% MgSO4·7H2O,0.35%NaH2PO4·H2O,7%柠檬酸钠,4.5%胰蛋白大豆肉汤,微量元素1mL,4.1%葡萄糖),30℃培养4-5天,离心取上清,进行SDS-PAGE检测分析。结果如图1所示,在50kDa处有一蛋白条带,即为重组表达的内切葡聚糖酶,重组蛋白大小与预测的一致。
实施例4 酶学性质分析
4.1最适作用pH值
用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定,在温度45℃条件下测定酶活,以最高酶活为100%,计算相对酶活,做pH-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用pH4.0。
4.2最适作用温度
 分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,pH5.0的条件下测定酶活,以最高酶活为100%,计算相对酶活,做温度-相对酶活曲线。结果显示:本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为45℃。
实施例4 内切葡聚糖酶在针织面料、梭织面料的除毛染色方面的应用
处理原料:针织面料、梭织面料;
酶的用量:0.1-3.0g/L;
处理条件:35-55℃,处理时间为30-150分钟,pH范围为4.0-9.5;
适用的浴比范围:1:5-1:30;
设备类型:溢流染色机,卷染机,水洗机等;
本发明获得的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净,对织物强力损失小的特点,有利于推广应用。
                         SEQUENCE LISTING
 
<110>  青岛蔚蓝生物集团有限公司
 
<120>  一种内切葡聚糖酶及其应用
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  477
<212>  PRT
<213>  endoglucanase  enzyme  sequence
 
<400>  1
 
Met Ser Phe Thr Arg Arg Pro Phe Pro Glu Ala Ala Leu Ala Leu Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Pro Leu Ala Gln Ala Gln Gln Gln Val Val Ala Lys Leu Glu Asn Pro
            20                  25                  30         
 
 
Ser Pro Lys Thr Tyr Lys Cys Ser Lys Ser Gly Gly Cys Val Val Gln
        35                  40                  45             
 
 
Asp Thr Ser Val Val Phe Glu Trp Lys Ser Leu Trp Ile His Thr Ala
    50                  55                  60                 
 
 
Asn Gly Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Ser Phe Glu Val Asp Pro Thr Leu
65                  70                  75                  80 
 
 
Cys Pro Asp Val Thr Thr Trp Ser Lys Asn Cys Val Ile Glu Pro Ala
                85                  90                  95     
 
 
Asn Tyr Thr Ser Phe Gly Glu Ala Thr Ser Gly Asp Ser Leu Thr Leu
            100                 105                 110        
 
 
His Gln Tyr Val Lys Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Asn Ala Ser Pro Arg
        115                 120                 125            
 
 
Val Tyr Leu Leu Gly Pro Asp Gly Asp Tyr Val Leu Met Lys Leu Leu
    130                 135                 140                
 
 
Gly Gln Glu Leu Thr Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Leu Pro Cys Gly
145                 150                 155                 160
 
 
Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Ser Gly Ser Gly Gly Arg
                165                 170                 175    
 
 
Asn Ala Asn Asn Lys Gly Gly Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp
            180                 185                 190        
 
 
Val Lys Cys Pro Leu Glu Thr Trp Lys Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly
        195                 200                 205            
 
 
Gly Gln Ala Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser
    210                 215                 220                 
 
 
Ala Ala Asn Ser Tyr Thr Pro His Pro Cys Ser Ser Asp Asp Cys Asp
225                 230                 235                 240
 
 
Lys Gly Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Ala Gln Gly Lys Thr Asn Tyr
                245                 250                 255    
 
 
Trp Ala Pro Gly Gly Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe Thr Ile Asn
            260                 265                 270        
 
 
Thr Gln Phe Ile Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Gly Ile Arg Thr Glu
        275                 280                 285            
 
 
Ile Arg Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Gly Asn Val Ile Ala Asn Ala Lys
    290                 295                 300                
 
 
Ser Ser Ala Gly Val Asp Ser Ile Lys Val Ala Trp Ser Glu Ser Val
305                 310                 315                 320
 
 
Glu Gly Ala Ala Ala Thr Phe Gly Gly Leu Thr Ser Met Gly Lys Ala
                325                 330                 335    
 
 
Pro Gly Arg Gly Ile Val Leu Ile Phe Ser Ile Arg Asn Glu Val Arg
            340                 345                 350        
 
 
Gly Asn Met Lys Ser Leu Asp Arg Gly Ser Asn Gly Pro Cys Ser Ser
        355                 360                 365            
 
 
Arg Glu Gly Asn Pro Thr Lys Ile Ile Ala Gln Asn Pro Asp Thr His
    370                 375                 380                
 
 
Val Val Phe Ser Lys Met Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Phe Asn
385                 390                 395                 400
 
 
Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Cys Thr Thr Pro Ser Lys Ala
                405                 410                 415    
 
 
Thr Thr Thr Val Ala Thr Thr Lys Ala Thr Ser Thr Thr Thr Lys Ile
            420                 425                 430        
 
 
Ser Thr Thr Thr Thr Ala Gly Gly Ala Thr Gln Thr Gln Trp Gly Gln
        435                 440                 445            
 
 
Cys Gly Gly Gln Gly Lys Pro Gly Pro Thr Ala Cys Val Ser Gly Thr
    450                 455                 460                
 
 
Thr Cys Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
465                 470                 475        
 
 
<210>  2
<211>  1434
<212>  DNA
<213>  endoglucanase  gene  sequence
 
<400>  2
atgtctttca caaggagacc gtttcccgag gcggcattgg ccctcttgcc tctcgcccag   60
 
gcccagcagc aagtggttgc gaaacttgaa aacccgtccc cgaaaacata caagtgctcc  120
 
aagtccggag gctgtgttgt tcaggacacg tcggttgtgt tcgaatggaa atccctctgg    180
 
attcacaccg ccaacggcta cgactcgtgc accacctcgt ttgaagtgga cccaaccttg   240
 
tgccctgatg ttacgacgtg gtccaagaac tgtgtcattg aacctgctaa ctacacctct   300
 
tttggagagg ccaccagtgg tgactcgctc actttgcacc agtacgtgaa aaccgacgga   360
 
acctacaaca atgcgtctcc ccgtgtctac ctcctcggtc ccgacggcga ctacgtcctc     420
 
atgaaactgc tgggccagga gctcaccttt gatgtcgacc tttccaccct gccgtgtggt    480
 
gagaacggtg cactctatct atccgagatg agtgggagcg gtggacgcaa tgccaacaac  540
 
aagggcggtg ccgcgtacgg ttcaggatac tgtgacgtta agtgccccct cgaaacctgg   600
 
aaaaatggca cccttgtgcc cggtggccag gcttactgct gtaacgaaat ggatatcctg    660
 
gagggtaact ccgcagccaa ctcttacaca cctcaccctt gcagctccga tgactgtgac    720
 
aagggtggat gcggcttcaa cccctatgcg cagggtaaga ccaactactg ggcgcccggc  780
 
ggtaccgtgg acacctccaa gcccttcacc atcaacactc agttcatcac caacgatggt    840
 
acaaccaccg gtattcgcac cgagatccgc cggaaataca tccagaatgg caatgttatt    900
 
gccaacgcca agtcttccgc gggagttgac tccatcaagg tggcgtggtc cgaaagcgtg    960
 
gaaggcgccg ccgccacttt cggtggactg acctccatgg gcaaggctcc cggccgcggt    1020
 
attgtgctga tcttcagtat caggaacgaa gttaggggca acatgaaatc cttggacagg    1080
 
ggtagcaacg gtccttgcag cagcagggag ggcaacccta ccaaaatcat tgctcagaac   1140
 
cccgacactc acgttgtctt ctctaaaatg cgctggggtg acattggttc cactttcaac     1200
 
gcccccggtg gctctggatc gagctcgtgt accaccccca gcaaggccac caccaccgtc   1260
 
gctacgacca aggcgacctc caccaccacc aagatttcca ccaccaccac cgccggtggc   1320
 
gcgactcaga cccaatgggg ccagtgtgga ggccagggca agcccggacc tacagcctgc   1380
 
gtgtccggaa ctacctgcaa ggcgcagaag ctttactact ctcagtgcct gtga          1434
 
 
 

Claims (3)

1.一种内切葡聚糖酶,其特征在于,所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
2.一种编码权利要求1所述内切葡聚糖酶的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.权利要求1所述内切葡聚糖酶在纺织领域中的应用。
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"匍枝根霉内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的克隆及表达";张莹莹 等;《安徽工程大学学报》;20130630;第28卷(第2期);第31-34页 *
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