CN103305426B - 产纤维素酶的突变菌株、高效表达目的蛋白的突变菌株及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了产纤维素酶的基因工程菌和高效表达目的蛋白的工程菌及其构建方法与应用。本发明通过改造微生物三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755得双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)和三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，并将其在发酵过程中添加特定诱导物纤维二糖来生产纤维素酶。此外，本发明还以三基因突变菌株BG123为父本，以组氨酸缺陷型纤维二糖水解酶双突变缺失菌株Δ2cbh::Δhis3为母本经杂交得到六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3，并利用其生产目的蛋白。

Description

产纤维素酶的突变菌株、高效表达目的蛋白的突变菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种高效表达生产纤维素酶的方法，主要涉及三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755和这三个基因的系列突变菌株，纤维素酶诱导物及诱导条件的发现及应用，以及利用三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755的系列突变菌株作为基础菌株构建目的蛋白表达系统，涉及表达宿主菌的构建、启动子序列及诱导条件。

背景技术

纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的可再生资源。目前，自然界中纤维素只有一少部分得到了利用，绝大多数纤维素不仅被白白浪费，而且还造成环境污染。纤维素分子是由成千上万个葡萄糖残基通过β-1，4-糖苷键连结而成的链状聚合体，几十个纤维素分子平行排列组成小束，几十个小束则组成小纤维，最后由许多小纤维构成一条植物纤维素。纤维素分子难以直接被利用，需经过降解成小分子糖类物质才可被利用。纤维素可以通过酸、碱及酶处理来降解。酶法降解纤维素由于污染低、能耗低被逐渐认可。

纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，一般将纤维素酶分为三类，外切－纤维二糖水解酶（CBH），内切-葡聚糖酶（EG1、EG2、EG3等）和β-葡萄糖苷酶（BG），这些酶系中的各组分通过协同作用共同降解微晶纤维素。纤维二糖水解酶在纤维素糖链的还原端或非还原端以渐进的方式切割，释放出纤维二糖，是纤维素酶系的主要成分，其外切酶活力对微晶纤维素降解是至关重要的。β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖水解成葡萄糖，从而去除纤维二糖对纤维素酶，特别是外切酶的抑制作用，因而有效提高纤维素的降解效率。

纤维素酶的生产可采用液体发酵、固体发酵两种方式。由于丝状真菌纤维素酶为胞外分泌型，因此液体发酵在无菌控制和产品分离等方面具有明显优势，适合现代发酵技术应用。但是，目前液体发酵纤维素酶还有很多不足，比如需使用槐糖、乳糖、结晶纤维素等作为诱导剂，这些诱导剂比较昂贵，导致其生产成本过高。利用现代生物技术，通过分子改造，提高纤维素酶的发酵水平，是纤维素酶产业化未来必由之路。尽管传统物理诱变方法在过去已经取得了显著进展，但由于诱变造成的突变难以摸清，很难重复，因此对诱变菌株进行分子水平的基因改造更加困难。对菌株的分子改造包括突变或敲除一个或多个基因，改变一个或多个基因表达水平。基因改造通常都要进行遗传转化，但工业纤维素酶真菌通常转化效率低，而且对于没有有性生殖菌种来说（如黑曲霉）要同时突变2个基因非常耗时，如果需要同时突变5个以上基因，难度极大。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种真菌产纤维素酶的方法，是通过改造（敲除、突变等）微生物的β-葡萄糖苷酶基因，得到基因突变菌株，然后利用该基因突变菌株发酵生产纤维素酶，并在发酵过程中添加特定诱导物生产纤维素酶。

围绕该主要目的，本发明的另一目的是提供一种目的蛋白质表达系统，含宿主菌株、表达启动子及表达诱导条件。

因此，第一方面，本发明提供用于生产纤维素酶的双基因突变菌株，能够在纤维二糖诱导条件下表达含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2在内的纤维素酶系；为以下菌株之一：

a.命名为BG13(NCU00130×NCU08755)的双基因突变菌株，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755的微生物菌株；

b.命名为BG12(NCU00130×NCU04952)，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU04952的微生物菌株；

c.命名为BG23(NCU04952×NCU08755)，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU04952和NCU08755的微生物菌株；

所述微生物为脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）或侧孢霉（Sporotrichum）；优选为粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）。

所述β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下：

1）β-葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；β-葡萄糖苷酶基因NCU00130编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO.2所示；

2）β-葡萄糖苷酶基因NCU04952的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示；β-葡萄糖苷酶基因NCU04952编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO.4所示；

3）β-葡萄糖苷酶基因NCU08755的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.5所示；β-葡萄糖苷酶基因NCU08755编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQIDNO.6所示。

以粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）为出发菌株构建的本发明用于生产纤维素酶的双基因(NCU00130×NCU08755)BG13突变株，已于2013年2月28日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7263。

构建上述双基因突变菌株的方法，包括敲除微生物中三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755中任意两个的过程；该过程可以是用对应其中两个基因的β-葡萄糖苷酶单突变体菌株进行杂交。

第二方面，本发明还提供一种用于生产纤维素酶的三基因突变菌株，能够在纤维二糖诱导条件下表达含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2在内的纤维素复合酶系，命名为BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，是敲除β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755的微生物菌株，所述微生物为脉孢菌（Neurospora）、曲霉（Aspergillus）、木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、镰刀霉（Fusarium）或侧孢霉（Sporotrichum）；优选为粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）；所述β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列与前述相同。

以粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）为出发菌株构建的本发明用于生产纤维素酶的三基因(NCU00130×NCU04952×NCU08755)BG123突变株已于2013年2月28日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7264。

所述三基因突变菌株的构建方法，包括敲除微生物中三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755的过程；该过程可以为用前述双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)和NCU04952基因β-葡萄糖苷酶单突变体菌株进行杂交。

此外，以双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)、三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)为基础菌继续改造（敲除、突变等）其它基因，得到的用于生产纤维素酶的工程菌也属于本发明的保护范围；进一步，以所列突变菌株和工程菌在高效表达生产半纤维素酶中的应用也属于本发明的保护范围。

基于以上技术方案，更进一步，本发明所提供的高效表达生产纤维素酶的方法，是发酵上述双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)或三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，得到纤维素酶。以纤维二糖（Cellobiose）为诱导物，发酵上述用于生产纤维素酶的双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)或三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，可得到纤维素酶。

另一方面，本发明基于以上双基因突变菌株（BG13、BG12、BG23）或三基因突变菌株（BG123）继续进行改造，提供一种用于高效表达目的蛋白的六基因突变宿主菌。

该六基因突变菌株，命名为Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3，是敲除了野生微生物菌株中的五个基因和突变了一个组氨酸合成酶基因得到的微生物菌株；所述五个基因为三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及两个纤维二糖水解酶基因cbh1（NCU07340）和cbh2（NCU09680）。所述纤维二糖水解酶基因NCU07340的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.7所示；纤维二糖水解酶基因NCU09680的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。

其中，以粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）为出发菌株构建的六基因突变株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3已于2013年2月28日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7265。其在纤维素或纤维二糖等纤维素酶诱导物的诱导表达条件下，表达的胞外蛋白中没有纤维二糖水解酶CBH1和CBH2。

所述六基因突变菌株的构建方法，包括敲除野生微生物菌株中的五个基因和突变一个组氨酸合成酶基因的过程；该过程可以为：1）先通过纤维二糖水解酶单基因（cbh1和cbh2）敲除菌株△cbh1和△cbh2杂交获得纤维二糖水解酶双突变缺失菌株Δ2cbh；2）再通过组氨酸合成缺陷菌株Δhis3与Δ2cbh杂交获得组氨酸缺陷型纤维二糖水解酶双突变缺失菌株即三突变菌株Δ2cbh::Δhis3；3）将前述β-葡萄糖苷酶三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)和所述三突变菌株Δ2cbh::Δhis3进行杂交得到六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3。

基于以上方案，以六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3为基础菌，继续改造（敲除或突变等）其它基因，得到的用于高效表达生产目的蛋白的改造菌也属于本发明。

本发明进一步提供一种高效表达目的蛋白的方法，是将携带编码蛋白功能片段的基因的重组表达载体导入所述六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3或所述改造菌中形成工程菌，再发酵该工程菌得到目的蛋白。

为提高基因的表达水平，所述工程菌中重组表达载体中目的蛋白基因的上游还携带有NCU07340(纤维二糖水解酶CBH1)、NCU09680(纤维二糖水解酶CBH2)、NCU01418（时钟调控蛋白质6，clock-controlledprotein6）、NCU02003（翻译延长因子eEF-1，translationelongationfactoreEF-1）或NCU08457（疏水蛋白，hydrophobin）开放阅读框上游1-1000碱基的启动子序列，优选为纤维二糖水解酶基因CBH1(NCU07340)和CBH2(NCU09680)的启动子，具体序列为：NCU07340启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.9所示；NCU09680启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.10所示；NCU01418启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.11所示；NCU02003启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.12所示；NCU08457启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.13所示。

该方法中，所述工程菌发酵表达目的蛋白的诱导物为纤维二糖（NCU07340启动子或NCU09680启动子）或阿拉伯糖（NCU08457启动子），或利用持续型启动子（NCU01418启动子NCU02003启动子）无须特定诱导物表达目的蛋白。

用于构建携带编码蛋白功能片段的基因的重组表达载体的出发载体为pMF272（Freitagetal.FungalGeneticsandBiology.2004Oct;41(10):897-910），此外，为便于表达蛋白的鉴定与纯化，所述重组表达载体中自上游至下游还依次携带有TEV基因、HIS6标签编码序列和绿色荧光蛋白GFP基因，以pMF272为出发载体构建的重组表达载体为pMF272-TEV-HIS6-GFP，其结构如图9所示。

以上分别列出了本发明的技术方案。总体而言，本发明采用粗糙脉孢菌（又称脉孢霉）系统，该菌具有较为完善的遗传操作系统和大量的基因突变体库，功能基因组资源及其丰富，而且该菌有性杂交技术简单，便于操作，使得该菌非常易于进行分子改造，是纤维素酶研究的优秀体系。研究表明，本发明利用研究的非常透彻的模式真菌粗糙脉孢菌体系，其生长速度非常快，固体平板上，25度条件下，其菌丝24小时可以达到7厘米，显著快于其他丝状真菌如曲霉、木霉等，而且该菌遗传操作工具成熟，便于分子改造。本发明采用清晰的遗传操作等分子生物学技术，构建了一系列突变体工程菌株，可重复性高，技术路线清晰，并且能够在本发明基础上继续改造提升。本发明构建的菌株能够利用纤维二糖等作为诱导物生产纤维素酶，比目前诱导物(槐糖等)生产成本低。本发明具有以下优点：

1）粗糙脉孢菌（Neurosporacrassa）是研究微生物遗传学和分子生物学的模式真菌，同时又是天然的纤维素快速降解菌，能够利用木糖、纤维二糖、寡糖等组分，并且拥有很好的遗传学研究基础，是利用分子生物学改造构建纤维素酶生产菌株和生产其他目的蛋白的理想菌种，在分子改造方面由于具有完善的有性循环，便于转化，杂交等遗传操作，改造速度大大快于目前里氏木霉等其他纤维素酶生产菌；所以，利用粗糙脉孢菌构建纤维素酶和目标蛋白生产基因工程菌，在基因工程操作上具有明显优势。

2）通过真菌杂交方法构建三个β-葡萄糖苷酶基因（β-glucosidase,NCU00130、NCU04952、NCU08755，即BG1/BG22/BG3）的双突变体和三突变体菌株，该突变体能够以纤维二糖为诱导物表达生产纤维素酶，纤维二糖作为诱导物成本上比现有槐糖诱导物低，纤维二糖是可溶物，诱导纤维素酶表达生产优于晶体纤维素等固体诱导物，比如在纤维素酶和目标蛋白的分离纯化工艺。最后，纤维二糖诱导表达生产纤维素酶，杂带少于晶体纤维素诱导，有利于目标蛋白纯化。

3）由β-葡萄糖苷酶三突变体、组氨酸合成缺陷突变、又进一步缺失了两个纤维二糖水解酶，构建了包括组氨酸合成缺陷的六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3，以该菌株作为表达宿主，可以用纤维二糖为诱导底物诱导产生纤维素酶，同时又能消除纤维二糖水解酶蛋白的背景条带，为粗糙脉孢菌蛋白表达系统的成功构建提供了良好的受体菌株；

4）构建的表达载体带有TEV基因、绿色荧光蛋白GFP和HIS6标签，以便于表达蛋白的鉴定与纯化；

5）发掘并构建了五个强启动子的表达载体，5个启动子有纤维二糖诱导型，阿拉伯糖诱导型和组成型（在葡萄糖、蔗糖等各类碳源条件下均能表达），这样对于目标蛋白的生产有多个条件可以选择比较，采用最好的条件生产，提高生产的灵活性。大大优于目前纤维素酶和目标蛋白表达生产往往只有一种条件可用（特定条件诱导）。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1：WT(FGSC2489)、BG1(NCU00130)、BG2(NCU04952)、BG3(NCU08755)、BG12、BG23、BG13、BG123在2％微晶纤维素（Avicel）培养基上培养3天，取培养液离心浓缩10倍后表达蛋白的SDS-PAGE电泳图

图2：WT(FGSC2489)、BG1(NCU00130)、BG2(NCU04952)、BG3(NCU08755)、BG12、BG23、BG13、BG123在2％纤维二糖（CB）培养基上培养3天，取培养液离心浓缩10倍后表达蛋白的SDS-PAGE电泳图

图3：WT(FGSC2489)、BG13、BG123在2％纤维二糖（CB）培养基上培养3天，取培养液离心浓缩10倍后表达蛋白的SDS-PAGE电泳图

图4：WT(FGSC2489)、BG13、BG123在0.5％葡萄糖培养基培养24h，转到0.1％和0.2％纤维二糖（CB）培养基培养24h，取培养液离心浓缩10倍后表达蛋白的SDS-PAGE电泳图

图5：WT(FGSC2489)、BG13、BG123在0.5％葡萄糖培养基培养24h，转到0.1％和0.2％纤维二糖（CB）培养基培养48h，取培养液离心浓缩10倍后表达蛋白的SDS-PAGE电泳图

图6：WT、BG13、BG123在0.5％葡萄糖培养基培养24h后，转到0.1％和0.2％的CB培养基上培养24h，提取菌丝RNA进行RT-PCR，检测CBH1和BG2在CB诱导后的基因表达情况。图中7340表示CBH1，4952表示BG2。

图7：WT、BG13、BG123在0.5％葡萄糖培养24h后，转到0.1％和0.2％的CB上培养48h，提取菌丝RNA进行RT-PCR，检测CBH1和CBH2、BG2在CB诱导后的基因表达情况。图中7340表示CBH1，9680表示CBH2，4952表示BG2。

图8：重组载体pMF272-TEV-HIS6-GFP中融合标签的构建示意图

图9：携带六个不同启动子的表达载体的物理图谱

图10：携带六个不同启动子的转化子表达目的蛋白的荧光定位图

图11A：实施例5步骤三中上清液进行蛋白含量测定结果

图11B：实施例5步骤三中上清液进行木聚糖酶活力测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecμlarCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecμlarCloning:ALaboratoryManual，3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor）。

所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。

实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例中所采用的原始出发菌株和部分原始单基因敲除菌株均购买于美国真菌遗传资源中心(FungalGeneticsStockCenter，缩写FGSC)真菌菌种保存库，为商业渠道获得。各自FGSC编号为：

β-葡萄糖苷酶单基因突变菌株BG1（NCU00130）,FGSC11822(配型a)和FGSC11823(配型A)；

β-葡萄糖苷酶单基因突变菌株BG2（NCU04952），FGSC13731(配型a)和FGSC13732(配型A)；

β-葡萄糖苷酶单基因突变菌株BG3（NCU08755）,FGSC18387(配型a)和FGSC18388(配型A)；

野生型粗糙脉胞菌WT，FGSC2489；

纤维二糖水解酶单基因敲除菌株△cbh1（NCU07340）,FGSC15630(配型A)；

纤维二糖水解酶单基因敲除菌株△cbh2(NCU09680),FGSC15633(配型a)；

组氨酸合成缺陷菌株Δhis3，FGSC6103(配型A)。

“NCU……”为粗糙脉孢菌的基因位点编号，“FGSC……”为FGSC的保藏编号。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、构建用于生产纤维素酶的双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)及突变菌株的筛选

1、构建β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)

构建方法包括以下步骤：

1.1杂交

1）作为父本的β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG1（NCU00130），FGSC11822(配型a)在MM斜面培养基【50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，组氨酸（50mg/mL）20mL，定容体积到1L，高压灭菌。50×Vogel’s盐（1L）：柠檬酸三钠（1/2H₂O）150g，无水KH₂PO₄250g，无水NH₄NO₃100g，MgSO₄·7H₂O10g，CaCl₂·2H₂O5g，微量元素盐溶液5mL，生物素（0.1mg/mL）2.5mL,定容体积到1L。】上28℃培养7天后待用。

2）作为母本的β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG3（NCU08755），FGSC18388(配型A)在Westergaards平板培养基【4×Westergaards盐溶液250mL，蔗糖15g，琼脂15g，调PH值6.5，定容到1L,高压灭菌，倒平板。4×Westergaards盐溶液（1L）：KNO₃4g，KH₂PO₄4g，MgSO₄·7H₂O2g，微量元素盐溶液4mL，生物素（0.1mg/mL）200μl，定容体积到1L。】上28℃培养10天，在体式显微镜下观察子囊，若有子囊产生，则进行杂交试验，若未产生子囊则继续培养，直至看到大量子囊产生为止。

3）取1mL无菌水洗在MM斜面培养基上培养的BG1（NCU00130）菌株孢子，制成孢子悬液，浓度为1×10⁷，均匀滴到Westergaards平板培养基上，用无菌枪头均匀涂布，尽量涂成规则形状，以便观察是否污染。

3）杂交后的平板28℃培养大约2周后，在体式显微镜下观察培养皿上盖上是否有子囊孢子，若发现喷发出的子囊孢子，则取1mL无菌水冲洗培养皿上盖，收集子囊孢子，4℃或常温保存。

4）取收集的子囊孢子3μl加入30μl无菌水放于60℃水浴热激半小时，杀死子囊孢子里混合的红色分生孢子。

5）采用玻璃珠子法涂BDES（杂交筛选培养基）+hph（潮霉素）平板【配方：BDES平板培养基（1L）：50×Vogel’s盐20mL，琼脂15g,定容到950mL，高压灭菌，再加50mL20×BDES盐溶液，倒平板（潮霉素hph终浓度200ug/mL）】，28℃培养12小时后在显微镜下挑单菌落（挑单菌落过程中，挑取发生菌丝交叉的单菌落），转接到MM+hph斜面培养基【配方：50×Vogel’s盐20mL，蔗糖20g，琼脂15g，组氨酸（50mg/mL）20mL，定容体积到1L，高压灭菌。50XVogel’s盐（1L）：柠檬酸三钠（1/2H₂O）150g，无水KH₂PO₄250g，无水NH₄NO₃100g，MgSO₄·7H₂O10g，CaCl₂·2H₂O5g，微量元素盐溶液5mL，生物素（0.1mg/mL）2.5mL，定容体积到1L。】中28℃培养3天。

6）3天后，将挑取的菌转接到MM斜面培养基上28℃培养3天，然后放于室温下培养7天，提孢子DNA进行PCR验证。

1.2提基因组DNA

采用酚氯仿法从BG1（NCU00130）&BG3（NCU08755）杂交菌产生的孢子中提取基因组DNA，具体包括以下操作：

1）2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠，标号准备下一步用.

2）加1mL的裂解液（lysisbuffer，配方：0.2MTris·HCl(pH7.5)，0.5MNaCl，10mMEDTA，1％SDS(w/v)）于每个斜面培养基试管中，用1mL枪头将孢子轻轻刮下，将孢子溶解。

3)漩涡震荡10s，取400μl孢子悬液预先准备好的DNA提取管中。

4）将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。

5）65℃水浴30分，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。

6）水浴结束后取出，每管加入80μlpH7.5的1M的Tris·HCl中和。

7)加入400μl的酚：氯仿（1:1），13000rpm离心5分钟。

8）取300μl上清液于新的1.5mLEP管中，加入600μl95％的乙醇（DNA级）。

9）冰上孵育一小时，随后4℃、13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。

10）用75％的酒精（DNA级）400μl清洗，4度13000rpm离心，轻轻取出上清液。

11）将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。

12）加入50μlddH₂O溶解DNA，用NanoDrop测DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。

1.3PCR验证突变体

BG1（NCU00130）&BG3（NCU08755）杂交菌中提取基因组DNA（方法见1.2），以提取的基因组DNA为模版进行基因BG1（NCU00130）&BG3（NCU08755）的PCR验证。

1)25μlRCR体系包括：12.5μlDreamTaqPCRMasterMix12.5μl，9.5μl水（nuclease-free），上、下游引物各1μl（上游引物序列hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’，下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU00130基因位点，序列为5’-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’和下游引物NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08755基因位点，序列为5’-GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’），基因组DNA1μl。

2)PCR扩增条件为：先95℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒，52℃退火45秒，72℃延伸2分钟，共34个循环；最后72℃退火10分钟。

3）对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳（110V电压，30分钟），在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，只要两个条带同时电泳可见，则表明两基因（核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1和NO.5所示）敲除成功，。该结果确证已获得了β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株，命名为BG13(NCU00130×NCU08755)(配型a)。

1.4保菌

将筛选到的β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)在30％甘油保菌后放于-80度冰箱保种。

该菌株BG13突变株已于2013年2月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7263。

2、构建β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株BG12(NCU00130×NCU04952)

2.1杂交:以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG1（NCU00130），FGSC11822(配型a)作为父本，以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG2（NCU04952），FGSC13732(配型A)作为母本进行杂交，方法见步骤1.1。

2.2提基因组DNA：方法见步骤1.2。

2.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU00130基因位点，序列为5’-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’；下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952基因位点，序列为5’-AACACACACACACACACTGG-3’。PCR反应体系及反应条件见步骤1。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，只要两个条带同时电泳可见，则表明两基因（核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1和NO.3所示）敲除成功，与预期结果相符，表明获得了β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株，命名为BG12(NCU00130×NCU04952)。

2.4保菌:方法见步骤1.4。

3、构建β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株BG23(NCU04952×NCU08755)

3.1杂交:以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG2（NCU04952）,FGSC13731(配型a)作为父本，以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BG3（NCU08755）,FGSC18388(配型A)作为母本进行杂交，方法见步骤1.1。

3.2提基因组DNA:方法见步骤1.2。

3.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952基因位点，序列为5’-AACACACACACACACACTGG-3’；下游引物NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08755基因位点，序列为5’-GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’。PCR反应体系及反应条件见步骤1。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要两个条带同时电泳可见，则表明两基因（核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.3和NO.5所示）敲除成功，与预期结果相符，表明获得了β-葡萄糖苷酶双基因突变菌株，命名为BG23(NCU04952×NCU08755)。

3.4保菌:方法见步骤1.4。

实施例2、构建用于生产纤维素酶的β-葡萄糖苷酶三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)

1.1杂交:以实施例1中BG13(NCU00130×NCU08755)(配型a)作为母本，以BG2（NCU04952），FGSC13732(配型A)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。

1.2提基因组DNA：方法见实施例1步骤1.2。

1.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU00130基因位点，序列为5’-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’；下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952基因位点，序列为5’-AACACACACACACACACTGG-3’；下游引物NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08755基因位点，序列为5’-GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤1。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要三个条带同时电泳可见，则表明三基因（核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1、NO.3、NO.5所示）敲除成功，与预期结果相符，表明获得了β-葡萄糖苷酶三基因突变菌株，命名为BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)（配型A）。

2.4保菌:方法见步骤1.4。

该菌株BG123突变株已于2013年2月28日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7264。

实施例3、双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)及三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)的功能验证实验

一、突变体产纤维素酶实验

将以上构建得到的双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)、BG12(NCU00130×NCU04952)、BG23(NCU04952×NCU08755)及三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)、野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)及BG1(NCU00130)、BG2(NCU04952)、BG3(NCU08755)分别在2％（2g/100mL）微晶纤维素（Avicel）培养基（配方：50×Vogel’s盐20mL，微晶纤维素20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。）和2％（2g/100mL）纤维二糖（CB）（配方：50×Vogel’s盐20mL，纤维二糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。）培养基上28℃培养3天，取培养基上清离心，浓缩10倍后，进行下述功能验证实验：

1、蛋白质SDS-PAGE实验

用2％微晶纤维素（Avicel）培养基25℃培养3天后，对浓缩10倍的离心上清（含表达蛋白CBH1）进行4-12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图1（上样顺序为1：Maker，2:WT，3：BG1，4：BG2，5:BG3，6：BG12，7：BG23，8：BG13，9:BG123）所示，发现泳道2，3，4，5，6，7，8和9纤维二糖水解酶CBH1（表达蛋白）蛋白条带显著增粗，表明在敲除了BG2基因后纤维二糖水解酶CBH1（表达蛋白）表达量显著提高。

用2％纤维二糖（CB）培养基25℃培养3天后，对浓缩10倍的离心上清（含表达蛋白CBH1和CBH2）进行4-12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图2（上样顺序为1：Maker，2:WT，3：BG1，4：BG2，5:BG3，6：BG12，7：BG23，8：BG13，9:BG123）所示，发现发现泳道8和9纤维二糖水解酶CBH1和CBH2（表达蛋白）蛋白条带显著增粗，表明在突变体BG13和BG123菌株培养液中纤维二糖水解酶CBH1和CBH2（表达蛋白）的表达量明显提高。

用2％纤维二糖（CB）培养基对WT(FGSC2489)、BG13、BG123在25℃培养3天后，对浓缩10倍的离心上清（含表达蛋白CBH1和CBH2）进行4-12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图3（上样顺序为1：Maker，2:WT-1，3：WT-2，4：BG13-1，5:BG13-2，6：BG123-1，7：BG123-2）所示，发现泳道4，5,6和7纤维二糖水解酶CBH1和CBH2（表达蛋白）蛋白条带显著增粗，表明经该重复实验后，突变体BG13和BG123菌株培养液中纤维二糖水解酶CBH1和CBH2的表达量明显提高，说明重复实验非常稳定。

2、纤维二糖（CB）诱导实验

选取野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)、双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)和三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，在0.5％（0.5g/100mL）葡萄糖（G）培养基（配方：50×Vogel’s盐20mL，葡萄糖5g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。）上25℃培养24小时后，然后转入0.1％（g/100mL）和0.2％（g/100mL）的纤维二糖（CB）培养基25℃继续培养24h和48h，取上清液离心，浓缩10倍后进行4-12％SDS-PAGE电泳检测，结果如图4（上样顺序为1：Maker，2:WT-0.5％G，3：WT-0.1％CB，4：WT-0.2％CB，5:BG13-0.5％G，6BG13-0.1％CB，7：BG13-0.2％CB，8：BG123-0.5％G，9:BG123-0.1％CB，10：BG123-0.2％CB），重复实验结果见图5（上样顺序为1：Maker，2:WT-0.5％G，3：WT-0.1％CB，4：WT-0.2％CB，5:BG13-0.5％G，6BG13-0.1％CB，7：BG13-0.2％CB，8：BG123-0.5％G，9:BG123-0.1％CB，10：BG123-0.2％CB）所示，发现泳道9和泳道10纤维二糖水解酶CBH1（表达蛋白）蛋白条带显著增粗，表明BG123菌株在纤维二糖（CB）培养基上培养后，纤维二糖水解酶CBH1表达量明显提高，并且随着纤维二糖浓度的提高，CBH1表达量增大（参见泳道10）；图4和图5表明重复实验非常稳定，确认纤维二糖为粗糙脉胞菌产纤维素酶的诱导物。

3、RT-PCR检测纤维二糖水解酶CBH1和CBH2在CB诱导后的基因表达情况

选取野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)、双基因突变菌株BG13(NCU00130×NCU08755)和三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)，在0.5％葡萄糖培养基上25℃培养24小时后，转入0.1％（g/100mL）和0.2％（g/100mL）的纤维二糖（CB）培养基25℃继续培养24h和48h，抽滤菌丝，液氮冷冻后放入-80℃冰箱保存，取少量菌丝用Trizol法抽提RNA，纯化后先用RTreagentKit(TaKaRa)进行反转录，将其反转录为cDNA，反转录体系为：4μL2×缓冲液、1μL50μMOligodTPrimer、1μL100μMRandom6mersPrimer、1μLRTEnzymeMixI反转录酶和2μL的总RNA，并用双蒸水补足至20μL，反应的程序为：37℃下反转录15min，再85℃下5s失活反转录酶。然后用两步法进行RT-PCR，RT-PCR分析采用PremixExTaq^TMII(TaKaRa)在eprealplex(BioRad)操作完成，RT-PCR体系为：10μL2×PremixExTaq^TMII、1μL10μM检测引物和2μLcDNA，并用双蒸水补足至20μL；扩增程序为：95℃预变性30s后进入40个扩增循环(95℃变性5s，60℃退火34s)；融解曲线为：95℃15s，60℃1min，95℃15s。检测引物对序列为：NCU00130.F：5’-GACGATAACATCCTCCCG-3’和NCU00130.R：5’-CAGTGCCGTAGTCGCTTT-3；NCU04952.F：5’-TGAGTTATTGGGATACGGG-3’和NCU04952.R：5’-TGAGCGGGAGGATGTTAT-3’；NCU08755.F：5’-GACGATAACATCCTCCCG-3’和NCU08755.R：5’-CAGTGCCGTAGTCGCTTT-3’。RT-PCR检测结果如图6（24h）和图7（48h）所示，表明用0.1％和0.2％的纤维二糖诱导24h后，在BG13和BG123菌种中，CBH1（图中标示7340）相对于野生型WT明显表达，并且随着CB浓度增加，CBH1表达量也随之增加；用0.1％和0.2％的纤维二糖诱导48h后，BG123在浓度为0.2％的CB诱导后，CBH1（图中标示7340）表达量显著增加，为WT的50倍左右，CBH2（图中标示9680）表达量也明显增加，约为WT的30多倍。上述检测结果充分说明CB（纤维二糖）为BG13和BG123产纤维素酶的诱导物。

实施例4、构建用于高效表达目的蛋白的六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3

一、组氨酸缺陷型菌株Δhis3购买于美国真菌遗传资源中心(FungalGeneticsStockCenter，FGSC6103)。

二、纤维二糖水解酶双突变缺失菌株获得，通过△cbh1（NCU07340）,FGSC15630(配型A)和△cbh2(NCU09680),FGSC15633(配型a)单基因敲除菌株杂交获得。

2.1杂交:以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株cbh1（NCU07340），FGSC15630(配型A)作为父本，以β-葡萄糖苷酶单突变体菌株cbh2（NCU09680）,FGSC15633(配型a)作为母本进行杂交，方法见实例1步骤1.1。

2.2提基因组DNA：方法见实例1步骤1.2。

2.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU07340r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU07340基因位点，序列为5’-CGTCTGATTTGTCCAGTACC-3’；下游引物NCU09680r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU09680基因位点，序列为5’-AACTTACCACTCACTCCTCC-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤1.3。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU09680r的引导下经PCR扩增获得了1845bp目的条带，该条带表明NCU09680基因（基因序列参考序列表中序列8）已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU07340r的引导下经PCR扩增获得了1950bp目的条带，该条带表明NCU07340基因（基因序列参考序列表中序列7）已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要同源重组的hph基因片段条带同时电泳可见，则表明杂交菌中目的基因（NCU07340基因和NCU09680基因）敲除成功，与预期结果相符，表明获得了双基因突变菌，命名为Δ2cbh(配型a)。

2.4保菌:方法见实例1步骤1.4。

三、构建三突变体Δ2cbh::ΔHis3

通过组氨酸合成缺陷菌株Δhis3(FGSC6103)(配型A)，与纤维二糖水解酶双突变体Δ2cbh(配型a)杂交获得。

3.1杂交:以双突变体Δ2cbh(配型a)作为母本，以Δhis3(FGSC6103)(配型A)作为父本进行杂交，方法见实例1步骤1.1。

3.2提基因组DNA：方法见实例1步骤1.2。

3.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU07340r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU07340基因位点，序列为5’-CGTCTGATTTGTCCAGTACC-3’；下游引物NCU09680r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU09680基因位点，序列为：5’-AACTTACCACTCACTCCTCC-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤1.3。结果杂交菌在上游引物hph5f和下游引物NCU09680r的引导下经PCR扩增获得了1845bp目的条带，该条带表明NCU09680基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU07340r的引导下经PCR扩增获得了1950bp目的条带，该条带表明NCU07340基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要同源重组的hph基因片段条带同时电泳可见，则表明杂交菌中目的基因（NCU07340基因和NCU09680基因）敲除成功。

3.4杂交菌是否为组氨酸突变体可根据其是否能够在MM培养基（配方见1.1）上生长为判断，结果该杂交菌属于营养缺陷型突变体，不能在该简单培养基上生长，需要在简单培养基中添加组氨酸才能生长，用此方法可以验证该菌确存在组氨酸突变。

以上结果与预期结果相符，表明获得了三突变菌，株命名为Δ2cbh::ΔHis3(配型a)。

3.4保菌:方法见实例1步骤1.4。

四、构建六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::ΔHIS3

4.1杂交

以β-葡萄糖苷酶三基因突变菌株BG123(NCU00130×NCU04952×NCU08755)（取得方法参见实施例2，配型A）作为父本，以组氨酸缺陷型纤维二糖水解酶双突变缺失菌株Δ2cbh::Δhis3(配型a)作为母本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。

4.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。

4.3PCR验证筛选突变体

上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5’-TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU00130基因位点，序列为5’-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’；下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952基因位点，序列为5’-AACACACACACACACACTGG-3’；下游引物NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08755基因位点，序列为5’-GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’；下游引物NCU09680r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU09680基因位点，序列为5’-AACTTACCACTCACTCCTCC-3’；下游引物NCU07340，为了验证潮霉素hph基因处在NCU07340基因位点，序列为5’-CGTCTGATTTGTCCAGTACC-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤1.3。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因（基因序列参考序列表中序列1）已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因（基因序列参考序列表中序列3）已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因（基因序列参考序列表中序列5）已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU09680r的引导下经PCR扩增获得了1845bp目的条带，该条带表明NCU09680基因（基因序列参考序列表中序列8）已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU07340r的引导下经PCR扩增获得了1950bp目的条带，该条带表明NCU07340基因（基因序列参考序列表中序列7）已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要同源重组的hph基因片段条带同时电泳可见，则表明目的基因（NCU00130基因、NCU04952基因、NCU08755基因、NCU07340基因和NCU09680基因）敲除成功，与预期结果相符。

4.4杂交菌是否为组氨酸突变体可根据其是否能够在MM培养基（配方见1.1）上生长为判断，结果本步杂交菌属于营养缺陷型突变体，不能在该简单培养基上生长，需要在简单培养基中添加组氨酸才能生长，用此方法可以验证该杂交菌确存在组氨酸突变。

以上结果表明本步杂交菌株中缺失六基因，表明获得了六基因突变菌株，命名为Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3。

4.4保菌：方法见实施例1步骤1.4。

该六基因Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3突变株已于2013年2月28日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7265。

实施例5、目的蛋白的高效表达

用实施例4构建的六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::ΔHIS3作为宿主进行目的蛋白（以木聚糖酶为例，Xylanse）的表达，具体方法包括以下步骤：

一、表达载体的构建

以质粒pMF272（购买于美国真菌遗传资源中心(FungalGeneticsStockCenter)）为模板，在引物5’-CTGCAGGGTACCGGCTCCGGCAGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3’和5’-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCC-3’的引导下PCR扩增GFP基因，将扩增产物连入pMD19-T（simple）载体(T载体，购自TaKaRa)中，测序正确后，用EcoRI和PstI双酶切携带GFP基因的T载体，得到GFP（T载体）基因，然后连入pUC118载体（购自(TaKaRa)）中，得到携带GFP基因的载体，命名为pUC-GFP。

TEV（蛋白质内切酶）基因和HIS6标签编码序列采用融合PCR的方法合成，具体方法为采用基因重叠延伸(SOE)方法，由Hortonetal.1989发明(HortonRM,HuntHD,HoSN,PullenJK,PeaseLR.1989.Engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes:genesplicing-by-overlapextension.Gene77:61-68)。

将测序验证正确的TEV基因和HIS6标签编码序列通过HindIII和PstI酶切得到粘性末端tag，连入经同样酶双酶切的pUC-GFP载体中，得到具有结构pUC-TEV-HIS6-TAA-GFP的重组载体。

用KpnI酶切重组载体pUC-TEV-HIS6-TAA-GFP，获得pUC-TEV-HIS6-GFP，经测序正确后，用PacI和EcoRI双酶切，获得具有粘性末端的TEV-HIS6-GFP基因片段，连入经同样酶PacI和EcoRI双酶切的载体pMF272中，构建得到结构为pMF272-TEV-HIS6-GFP质粒，命名为pMF272-TEV-HIS6-GFP。融合标签即为：TEV（蛋白质内切酶）基因和HIS6标签编码序列构建示意图如图8所示。

以质粒pMF272-TEV-HIS6-GFP为骨架构建表达载体，以野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)的基因组DNA为模版，在引物5’-ATGCAGACCAAGTCCCTCCTCT-3’和5’-GGCAACCCAACGCTTAACACCA-3’的引导下扩增目标表达基因NCU08189（Xylanse，木聚糖酶，扩增木聚糖酶NCU08189其全长序列），进行A-T克隆，所用的载体是pMD19-TSimplevector(TaKaRa)，启动子5'端和3'端分别引入PacI和XbaI酶切位点，测序正确后用PacI和XbaI双酶切克隆质粒，连接入经同样酶双酶切的线性化载体pMF272-TEV-HIS6-GFP，得到携带NCU08189基因的重组载体，命名为pMF272-xyl-TEV-HIS6-GFP。

以野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)的基因组DNA为模版，PCR扩增NCU01418（NCU01418，时钟调控蛋白质6，clock-controlledprotein6，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.9所示；引物为5’-ATGGATTGCTGCTCACGACTGGTTG-3’和5’-TTTGGCTGATTTGTTGGTGAGGATT-3’）、NCU02003（翻译延长因子eEF-1，translationelongationfactoreEF-1，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.10所示；引物为5’-CTAGTCTAGAGTGAAGCTTGTGGGT-3’和5’-TTTGACGGTTGATGTGCTGACTGGC-3’）、NCU09680（纤维二糖水解酶CBH2基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示；引物为5’-AGAAACACAAGGACCTTGAGCAATG-3’和5’-TGTAAGAACTGTTGATGATAAGGGT-3’）、NCU08457（疏水蛋白，hydrophobin，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.11所示；引物为5’-ACCATTGGTTACTTTTCCGAGCTGC-3’和5’-TTTGGCGGTTGGGGGTTTGCTGAAA-3’）、NCU07340（纤维二糖水解酶CBH1基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.7所示；引物为5’-ACCAAACATCACCACTTCGAGAACA-3’和5’-GGTGAAGATGAGGCTGAACGGCGTG-3’）上游1.5kb的启动子，并进行A-T克隆，所用的载体是pMD19-TSimplevector(购自TaKaRa)，启动子5'端和3'端分别引入NotI和XbaI酶切位点，测序正确后用NotI和XbaI酶双酶切克隆质粒，连接进入同样线性化的重组载体pMF272-xyl-TEV-HIS6-GFP，从而获得携带5个不同强启动子的表达载体，表达载体的物理图谱如图9所示。

二、转化表达宿主—六基因突变菌株并筛选出转化子

将步骤一构建的携带5个不同强启动子的表达载体[以携带常用强启动子Pccg1（NCU03753.5，GenBank号：AY598428）的表达载体为对照]分别通过电转化方法进入六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::ΔHIS3。将所得到的全部转化子(终浓度为1×10⁶个孢子/mL)接种在2％（g/100mL）纤维二糖(CB)或2％（g/100mL）阿拉伯糖培养液（添加0.75％(质量浓度)Yeastextract，配方：50×Vogel’s盐20mL，纤维二糖20g或2％阿拉伯糖20g，琼脂15g，定容体积到1L，高压灭菌。）中200rpm、25℃振荡培养3天，对其菌丝进行荧光显微镜观察GFP表达情况，从而筛选出GFP表达最强的转化子。

荧光镜检结果如图10所示，携带纤维二糖水解酶CBH1(NCU07340)、CBH2(NCU09680)、NCU02003（翻译延长因子eEF-1，translationelongationfactoreEF-1）和NCU08457（疏水蛋白，hydrophobin）启动子的转化子的荧光表达最强，即目标基因的表达水平最强，均强于常用的强启动子Pccg1。其中，阿拉伯糖是NCU08457（疏水蛋白，hydrophobin）特异性的诱导物。由此认为这四个基因（NCU07340、NCU09680、NCU02003和NCU08457）的启动子为粗糙脉胞菌表达系统的强启动子，纤维二糖和阿拉伯糖可作为粗糙脉胞菌表达系统的诱导物。

三、转化子菌株的蛋白分泌情况

将野生型粗糙脉胞菌WT(FGSC2489)、六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::ΔHIS3及不同启动子诱导表达的转化菌株在2％纤维二糖（CB）或2％阿拉伯糖（L-Arabinose）培养液培养液（添加0.75％Yeastextract)中200rpm、25℃振荡培养7天，取其培养液进行离心，获得上清液，对其进行蛋白（转化子蛋白）含量和Xylanse（木聚糖酶）酶活力的测定。蛋白含量测定结果如图11A，木聚糖酶活力测定件图11B，如（WT(FGSC2489)、Δ3βG（BG123）、Host（Δ3βG::Δ2cbh::ΔHIS3））所示，纤维二糖水解酶基因CBH1(NCU07340)和CBH2(NCU09680)启动子所表达的转化子蛋白含量和酶活力水平最高，其次为NCU02003的启动子，NCU01418和NCU08457次之。检测结果表明纤维二糖和阿拉伯糖可作为粗糙脉胞菌表达系统的诱导物。

Claims (4)

1.一种高效表达目的蛋白的方法，是将携带编码蛋白功能片段的基因的重组表达载体导入六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3，再发酵该工程菌得到目的蛋白；

所述工程菌中重组表达载体中目的蛋白基因的上游还携带有疏水蛋白NCU08457开放阅读框上游的启动子序列，

NCU08457启动子的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.13所示；

所述六基因突变菌株Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3是敲除了野生微生物菌株中的五个基因和突变了一个组氨酸合成酶基因得到的微生物菌株；所述五个基因为三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及两个纤维二糖水解酶基因NCU07340和NCU09680；

所述野生微生物菌株为粗糙脉孢菌。

2.根据权利要求1所述的表达方法，其特征在于：所述工程菌发酵表达目的蛋白的诱导物为阿拉伯糖。

3.根据权利要求1或2所述的表达方法，其特征在于：用于构建携带编码蛋白功能片段的基因的重组表达载体的出发载体为pMF272，由该出发载体构建自上游至下游依次携带有TEV基因、HIS6标签和绿色荧光蛋白GFP的重组载体，命名为pMF272-TEV-HIS6-GFP。

4.物理图谱如图9所示的重组表达载体，为权利要求3所述重组载体pMF272-TEV-HIS6-GFP携带权利要求1提及的启动子形成的重组表达载体。