CN101469325A - 一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种外切菊粉酶的真核表达方法。其主要步骤是：首先将马克斯克鲁维酵母的外切菊粉酶的核苷酸序列(如SEQ ID No：1所示)通过限制性内切酶位点与毕赤酵母表达质粒pPICZαA连接获得重组表达载体，然后将重组表达载体导入毕赤巴斯德酵母宿主菌X－33或SMD1168中经诱导发酵表达目的蛋白(马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶)。本发明为开发具有工业应用价值的外切菊粉酶奠定了基础。

Description

一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法

技术领域

本发明涉及外切菊粉酶(exoinulinase，exo-D-fructosidase)的表达方法，具体地说是一种马克斯克鲁维酵母的菊粉酶的高效分泌表达方法。

背景技术

菊粉为多聚果糖，自然界中约有30000多种植物均含有菊粉多糖，菊粉的世界年产量可达350000吨，是仅次于淀粉的第二大植物碳水化合物。在工业中以及做为生物质原料应用较多的产菊粉植物为菊苣和菊芋。这些生物质经过物理(加热)、化学(酸水解)和酶学处理生成可被多种微生物利用的果糖和少量的葡萄糖，(Bacon JSD，Edelmen J.The carbohydrates ofthe Jerusalem artichoke and other compositae.J.Biochem.1951，48：114-126；PetersD.Carbohydrates for fermentation.Biotechnol J.2006，1(7-8)：806-814.)。

虽然化学物理方法也可实现生物质多糖的降解，但往往伴随大量抑制微生物生长的副产物，设备条件苛刻，不利于环境保护；而酶转化技术由于其环保、特异等优点则日益受到研究者青睐。酶转化技术的关键是相关酶的开发，类似于木质纤维素类生物质资源转化中涉及的纤维素酶，菊粉酶是菊芋生物质转化过程中最关键的环节。外切菊粉酶催化下述反应(不考虑末端葡萄糖)：

外切菊粉酶的来源主要包括天然产物分离、基因工程表达两个途径。

分泌外切菊粉酶、能利用菊芋为底物进行菌体增殖的微生物在自然界中分布很广泛，丝状真菌、酵母菌和细菌近百种物种。但以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus为首的菊粉酶天然生产菌株一般产量低(≦200U·ml^-1)，产酶成本高(Rouwenhorst RJ，Visser LE，Van Der Baan AA，et al.Production，distribution，and kinetic properties of inulinase in continuouscultures of Kluyveromyces marxianus CBS6556.Appl.Environ.Microbiol.1998，54(5)：1131-1137；Zherebtsov NA，Shelamova SA，Abramova IN.Biosynthesisof inulinases by Bacillus bacteria.Applied Biochim Mikrobiol，2002，38(6)：634-638；Rouwenhorst RJ，Hensing M，Verbakel J，et al，Structure andproperties of the extracellular inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556.Appl.Environ.Microbiol.1990，56(11)：3337-3345；Singh RS，Sooch BS，PuriM.Optimization of medium and process parameters for the producti on ofinulinase from a newly isolated Kluyveromyces marxianus YS-1.BioresourceTechnology 2007，98：2518-2525.)。即使采用高密度细胞发酵方法，菊粉酶天然生产菌株最高菊粉酶产量也仅仅达到288.78U·ml^-1。(王建华，刘艳艳，姚斌，等.高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究.生物工程学报，2000，16(1)：60-64.)，同时，发酵周期较长，成本较高，远远达不到产业化生产的要求。

为寻找菊粉的高产量生产途径，不同物种来源的菊粉酶(包括内切菊粉酶和外切菊粉酶)分别已在酿酒酵母、毕赤酵母等遗传操作系统中进行了异源表达，但表达的重组菊粉酶的活性都低于500U·ml^-1(Zhang LH，Wang J，Ohta Y，et al.Expression of the inulinase gene from Aspergillus niger inPichia pastoris.Process Biochemistry 2003，38：1209-1212；Zhang LH，ZhaoCX，Zhu DC，et al.PuriWcation and characterization of inulinase fromAspergillus niger AF10 expressed in Pichia pastoris.Protein Expression andPurification，2004，35：272-275；祝林，陈晶晶，舒望云，等.克鲁维酵母中外切菊粉酶基因在毕赤酵母中的表达研究.湖北大学学报自然科学版，2006，28(4)：385-388.)；即使重组工程菌株利用高密度细胞发酵，重组菊粉酶产量也仅仅达到577.14U·ml^-1(专利申请号：CN 02124145.7)，仍然满足不了菊芋生物质炼制所需菊粉酶的工业化生产要求。因此，寻求一种重组菊粉酶高效表达且易于纯化的的表达方法，成为本发明需要解决的技术问题。

经过分析发现，以往在酿酒酵母系统或毕赤酵母系统表达外源菊粉酶时，多是表达产物天然N端被封闭(信号肽酶切割后残留有非菊粉酶自身的额外的氨基酸残基)，羧基端残留载体序列表达的氨基酸残基(专利申请号：CN 02124145.7；Zhang LH，Wang J，Ohta Y，et al.Expression of the inulinasegene from Aspergillus niger in Pichia pastoris.Process Biochemistry 2003，38：1209-1212.)，无法形成天然菊粉酶分子，可能会影响重组菊粉酶的生物学活性。

为致力于菊芋为原料的生物质炼制研究，我们钓取了马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556(购自ATCC，编号：ATCC 26548)的外切菊粉酶基因，经过天然N端表达设计，在毕赤巴斯德酵母X-33中进行了分泌表达，获得了具有天然N端和天然C端、高酶活的重组菊粉酶制品。

发明内容

本发明的目的是提供一种马克斯克鲁维酵母的外切菊粉酶的高效表达且易于工业化应用的表达方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种马克斯克鲁维酵母的外切菊粉酶(exoinulinase)的表达方法，其主要步骤是：首先将马克斯克鲁维酵母的外切菊粉酶的核苷酸序列通过限制性内切酶位点与表达载体连接获得重组表达载体，然后将重组表达载体导入宿主菌细胞经诱导发酵表达获得目的蛋白；所述的目的蛋白编码基因是SEQ ID No：1中第15位至第1613位的碱基所构成的核苷酸序列，所述表达载体为毕赤酵母/大肠杆菌穿梭质粒pPICZαA(购自Invitrogen公司)，携带有两个Xho I酶切识别位点，利用第一个Xho I酶切位点，可进行目的蛋白的天然N端表达设计；所述宿主细胞为毕赤巴斯德酵母(Pichiapastoris)X-33或SMD1168(购自Invitrogen公司)。所述的重组质粒导入宿主菌前，先利用Sac I限制性内切酶进行线性化，然后在宿主菌基因组的AOX1基因处整合插入。

本发明以马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556(购自ATCC，编号为ATCC26548)基因组DNA为模板，以引物p1：5’-ATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTGC-3’和p2：5’-TCAAAGGTTAAATTGGG TAACGTT-3’，经过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得带信号肽编码基因序列的菊粉酶基因，TA克隆插入pMD18-T载体(购自TaKaRa)，再以此携带K.marxianus CBS6556菊粉酶全长基因的T载体为模板，利用引物Inu-p1：5’-TCCTC

GATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’(下划线部分为Xho I酶切序列，带框部分为Kex2信号肽酶识别位点的编码序列)和Inu-p2：5’-CTCTCTAGA

AAGGTTAAATTGGGTAACGTT-3’(单下划线部分为Xba I酶切序列，双下划线部分为终止密码子序列)，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出不带信号肽编码序列的菊粉酶成熟肽基因，经测序证明序列正确后，XhoI和Xba I双酶切后定向亚克隆到pPICZαA(购自invitrogen公司)毕赤酵母表达载体α交配因子分泌信号肽编码基因下游，构建重组表达载体pPICZαA-inu12。

在重组表达载体pPICZαA-inu12构建过程中，考虑到毕赤酵母细胞壁中的Kexin信号肽酶对分泌表达的重组菊粉酶的识别和切割作用，通过上游引物Inu-p1在重组表达蛋白的N端引入了毕赤酵母Kexin酶Kex2信号切割(Kex2 signal cleavage)识别位点(Leu Glu Arg三个氨基酸残基)。

参考Invitrogen公司手册(pPICZαA，B，and C，Pichia expression vectorsfor selection on Zeocin and purification of secreted，recombinant proteins，www.invitrogen.com)，将重组表达载体pPICZαA-inu12电击转化宿主菌pichia pastoris X-33(购自invitrogen公司)或SMD1168(购自invitrogen公司)，获得的Zeocin抗性转化子经过菌落PCR鉴定，证实马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556来源的外切菊粉酶成熟肽的编码基因已整合入宿主菌pichia pastoris X-33和SMD1168的染色体中，处于醇氧化酶启动子(pAOX)的下游，重组表达菌株正确构建，命名为X-33/pPICZαA-inu(或SMD1168/pPICZαA-inu)。重组表达菌株X-33/pPICZαA-inu在摇瓶条件下以分泌形式表达，以菊粉为底物测定时，96h发酵上清中的菊粉酶活性可达到3890IU·ml^-1，比酶活达到19500U·mg^-1。通过超滤方法简单、快速获得了重组菊粉酶。

本发明的优点和有益效果：

(1)和天然菊粉酶生产菌株相比，获得的菊粉酶重组菌株分泌表达菊粉酶的发酵周期缩短，小量摇瓶发酵时，96h发酵上清中的菊粉酶活性就可达到3890IU·ml^-1，比酶活达到19500U·mg^-1。

(2)和其它基因工程生产菊粉酶相比，以往在酿酒酵母系统或毕赤酵母系统表达外源菊粉酶时，多是表达产物天然N端被封闭(信号肽酶切割后残留有非菊粉酶自身的额外的氨基酸残基)，羧基端残留载体序列表达的氨基酸残基，不是天然菊粉酶分子形式。本发明中在进行表达设计时，通过上游引物Inu-p1在重组表达蛋白的N端引入了毕赤酵母Kexin酶Kex2信号切割位点，使得重组菊粉酶在毕赤巴斯德酵母中分泌表达时能够正确切割，从而可获得具有天然N端、天然C端和高酶活的菊粉酶分子。

(3)采用毕赤巴斯德酵母表达系统，由于毕赤巴斯德酵母本身分泌到上清中的背景蛋白很少，诱导表达的重组菊粉酶经过简单的超滤除盐，便可获得较高纯度的重组外切菊粉酶制品，具有菊粉酶工业化应用前景，并为菊芋生物炼制研究领域提供了良好的酶学工具。

附图说明

图1为马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus CBS6556来源的不带信号肽菊粉酶成熟肽基因的PCR产物琼脂糖凝胶(1％)电泳结果。产物大小约为1.7kb。1：PCR目的条带；M：DGL2000DNA分子量标准。

图2为重组载体pPICZαA-inu12的XhoI和Xba I双酶切产物的琼脂糖凝胶(1％)电泳结果。经XhoI和Xba I双酶切释放出来的菊粉酶基因片段大小约为1.65kb。；1：重组质粒pPICZαA-inu12(XhoI+Xba I)；2：质粒pPICZαA(XhoI+Xba I)M：1kb DNA分子量标准。

图3为整合了载体pPICZαA-inu12的重组毕赤巴斯德酵母菌株PCR鉴定电泳结果。1-8：阳性克隆PCR结果；M：1kb DNA分子量标准。

图4为重组菊粉酶通过X-33/pPICZαA-inu和SMD1168/pPICZαA-inu重组工程菌，利用甲醇诱导的表达产物SDS-PAGE分析结果。1为X-33/pPICZαA对照菌株诱导96h的表达上清，2-5分别为X-33/pPICZαA-inu重组工程菌诱导24h、48h、72h和96h的表达上清，M为蛋白质标准(购自北京鼎国)。

图5为整合了载体pPICZαA-inu12的重组毕赤巴斯德酵母菌株X-33/pPICZαA-inu在诱导培养基中菌体增长曲线和重组菊粉酶酶活曲线。

图6为pPICZαA-inu12重组表达载体构建示意图。

图7为重组菊粉酶进行成熟肽段天然N端表达的构建策略示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：马克斯克鲁维酵母带信号肽菊粉酶基因的克隆和序列测定

马克斯克鲁维酵母K.marxianus CBS6556基因组DNA的提取参考《精编分子生物学实验指南》(第四版，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)所描述方法制备，V-530紫外/可见光/近红外光谱仪(JASCO)测定其OD₂₆₀/OD₂₈₀值＝1.76，冻存于-20℃备用。以K.marxianus CBS6556的基因组DNA为模板，利用两条特异性引物inu-ORF-p1：5’-ATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTGC-3’和inu-ORF-p2：5’-TCAAAGGTTAAATTGGGTAACGTT-3’，按照常规方法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR体系：10×PCR缓冲液(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l，TaKaRa)1.0μl，inu-ORF-p1引物(10mmol/l)2.0μl，inu-ORF-p2引物(10mmol/l)2.0μl，Taq酶(大连TakaRa)0.5μl，K.marxianus CBS6556的基因组DNA模板1.0μl，ddH₂O 38.5μl；于94℃变性5min，然后于94℃ 30s，57℃ 45s，72℃ 1.5min，35个循环，72℃ 10min，4℃结束反应。得到的PCR产物大小约为1.7kb。PCR产物经胶回收试剂盒(购自北京舟鼎国)回收纯化，TA克隆入pMD18-T载体(大连TakaRa)，送TaKaRa测序。测序结果表明获得了正确的K.marxianus CBS6556带信号肽菊粉酶基因，其DNA序列如下，全长1671bp，其第70位至第1668位的碱基编码菊粉酶成熟肽的氨基酸序列。

   1 ATGAAGTTAG CATACTCCCT CTTGCTTCCA TTGGCAGGAG TCAGTGCTTC AGTTATCAAT

  61 TACAAGAGAG ATGGTGACAG CAAGGCCATC ACTAACACCA TTTTCAGTTT GAACAGACCT

 121 TCTGTGCATT TCACTCCATC CCATGGTTGG ATGAACGATC CAAATGGTTT GTGGTACGAT

 181 GCCAAGGAAG AAGACTGGCA TTTGTACTAC CAGTACAACC CAGCAGCCAC GATCTGGGGT

 241 ACTCCATTGT ACTGGGGTCA CGCTGTTTCC AAGGATTTGA CTTCTTGGAC AGATTACGGT

 301 GCTTCTTTGG GCCCAGGTTC CGACGACGCT GGTGCGTTCA GTGGTAGTAT GGTTATCGAT

 361 TATAACAATA CTTCTGGTTT CTTCAACAGC TCTGTGGACC CAAGACAAAG AGCAGTTGCA

 421 GTCTGGACCT TGTCTAAGGG CCCAAGCCAA GCCCAGCACA TCAGTTACTC GTTGGACGGT

 481 GGTTACACCT TCCAACACTA TTCCGACAAC GCCGTGTTGG ACATCAACAG CTCCAACTTC

 541 AGAGACCCTA AGGTGTTCTG GCACGAGGGC GAGAACGGCG AAGATGGTCG TTGGATCATG

 601 GCCGTTGCTG AATCGCAAGT GTTCTCTGTG TTGTTCTACT CTTCTCCAAA CTTGAAAAAC

 661 TGGACCTTGG AATCCAACTT CACCCACCAC GGCTGGACTG GTACCCAATA CGAATGCCCA

 721 GGTCTAGTTA AGGTTCCATA CGACAGTGTT GCTGACTCTT CTTCGAACTC CTCCGACTCC

 781 AAGCCAGACT CCGCATGGGT CTTGTTTGTC TCCATCAACC CTGGTGGTCC ATTGGGTGGT

 841 TCCGTTACCC AATACTTTGT TGGTGACTTC AACGGTACTC ACTTCACTCC AATCGACGAC

 901 CAAACCAGAT TCCTAGACAT GGGTAAGGAC TACTACGCAC TACAAACTTT CTTCAACACT

 961 CCAAACGAGA AGGACGTCTA CGGTATCGCA TGGGCTTCTA ACTGGCAATA CGCCCAACAA

1021 GCCCCAACTG ACCCATGGCG TTCATCTATG AGTTTGGTTA GACAATTCAC ATTGAAAGAC

1081 TTCAGCACAA ACCCTAACTC CGCCGATGTC GTCTTGAACA GTCAACCAGT CTTGAACTAT

1141 GATGCTTTGA GAAAGAACGG TACCACTTAC AGCATCACAA ACTACACCGT CACCTCCGAA

1201 AACGGCAAGA AGATCAAGCT AGACAACCCA TCCGGTTCTC TTGAATTCCA TCTTGAATAC

1261 GTGTTTAACG GCTCCCCAGA TATCAAGAGC AACGTGTTCG CTGATCTTTC CTTGTACTTC

1321 AAGGGTAACA ACGACGACAA CGAATACTTG AGATTGGGTT ACGAAACCAA CGGTGGTGCC

1381 TTCTTCTTGG ACCGTGGCCA CACCAAGATT CCTTTCGTGA AGGAGAACTT GTTCTTCAAC

1441 CACCAATTGG CAGTTACCAA CCCAGTTTCC AACTACACCA CAAACGTCTT CGACGTTTAC

1501 GGTGTCATTG ACAAGAACAT CATCGAATTG TACTTCGACA ACGGTAACGT CGTCTCCACC

1561 AACACTTTCT TCTTCTCTAC CAACAACGTT ATTGGTGAAA TTGACATCAA GTCACCATAC

1621 GACAAGGCTT ACACCATTAA CTCATTTAAC GTTACCCAAT TTAACCTTTG A

实施例2：重组毕赤酵母表达载体pPICZαA-inu12的构建

根据K.marxianus CBS6556菊粉酶基因编码的成熟蛋白两端序列和毕赤酵母表达载体pPICZαA(购自Invitrogen公司)的多克隆酶切位点序列信息，设计1对特异性引物，序列如下：

Inu-p1：5’-TCCTC

GATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’(下划线部分为XhoI酶切序列，带框部分为Kex2信号肽酶识别位点的编码序列)

Inu-p2：5’-CTCTCTAGA

AAGGTTAAATTGGGTAACGTT-3’(单下划线部分为Xba I酶切序列，双下划线部分为终止密码子序列)

以实施例1中获得的携带K.marxianus CBS6556菊粉酶基因的T载体为模板，利用引物Inu-p1和Inu-p2，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增菊粉酶成熟肽的编码基因序列。PCR体系：10×PCR缓冲液(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l，TaKaRa)1.0μl，inu-p1引物(10mmol/l)2.0μl，inu-p2引物(10mmol/l)2.0μl，Taq酶(大连TakaRa)0.5μl，模板1.0μl，ddH₂O 38.5μl；于94℃变性5min，然后于94℃ 30s，59℃ 45s，72℃ 1.5min，30个循环，72℃ 10min，4℃结束反应。PCR产物(图1)经胶回收试剂盒(购自北京舟鼎国)回收纯化，TA克隆入pMD18-T载体(大连TakaRa)，送TaKaRa测序，测得的马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶成熟肽基因的DNA序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，该基因长度为1625bp。

序列号：1

序列长度：1625bp

序列来源：人工序列

序列类型：DNA序列

序列特征：

表示特征的记号：修饰性标记

决定位置：限制性酶切位点、Kex2识别位点编码序列

决定特征的方法：实验

存在位置：Xho I限制性酶切位点，3-8位；Kex2识别位点编码序列，6-14位；第15位至第1613位的碱基编码菊粉酶成熟肽的氨基酸序列；TGA，1614-1616位；XbaI限制性酶切位点，1617-1622位；上游引物Inu-p1，1-43位；下游引物Inu-p2，1593-1625位。

  1 TCCTCGAGAA AAGAGATGGT GACAGCAAGG CCATCACTAA CACCATTTTC AGTTTGAACA

 61 GACCTTCTGT GCATTTCACT CCATCCCATG GTTGGATGAA CGATCCAAAT GGTTTGTGGT

121 ACGATGCCAA GGAAGAAGAC TGGCATTTGT ACTACCAGTA CAACCCAGCA GCCACGATCT

181 GGGGTACTCC ATTGTACTGG GGTCACGCTG TTTCCAAGGA TTTGACTTCT TGGACAGATT

241 ACGGTGCTTC TTTGGGCCCA GGTTCCGACG ACGCTGGTGC GTTCAGTGGT AGTATGGTTA

301 TCGATTATAA CAATACTTCT GGTTTCTTCA ACAGCTCTGT GGACCCAAGA CAAAGAGCAG

361 TTGCAGTCTG GACCTTGTCT AAGGGCCCAA GCCAAGCCCA GCACATCAGT TACTCGTTGG

421 ACGGTGGTTA CACCTTCCAA CACTATTCCG ACAACGCCGT GTTGGACATC AACAGCTCCA

481 ACTTCAGAGA CCCTAAGGTG TTCTGGCACG AGGGCGAGAA CGGCGAAGAT GGTCGTTGGA

541 TCATGGCCGT TGCTGAATCG CAAGTGTTCT CTGTGTTGTT CTACTCTTCT CCAAACTTGA

601 AAAACTGGAC CTTGGAATCC AACTTCACCC ACCACGGCTG GACTGGTACC CAATACGAAT

661 GCCCAGGTCT AGTTAAGGTT CCATACGACA GTGTTGCTGA CTCTTCTTCG AACTCCTCCG

721 ACTCCAAGCC AGACTCCGCA TGGGTCTTGT TTGTCTCCAT CAACCCTGGT GGTCCATTGG

781 GTGGTTCCGT TACCCAATAC TTTGTTGGTG ACTTCAACGG TACTCACTTC ACTCCAATCG

841 ACGACCAAAC CAGATTCCTA GACATGGGTA AGGACTACTA CGCACTACAA ACTTTCTTCA

 901 ACACTCCAAA CGAGAAGGAC GTCTACGGTA TCGCATGGGC TTCTAACTGG CAATACGCCC

 961 AACAAGCCCC AACTGACCCA TGGCGTTCAT CTATGAGTTT GGTTAGACAA TTCACATTGA

1021 AAGACTTCAG CACAAACCCT AACTCCGCCG ATGTCGTCTT GAACAGTCAA CCAGTCTTGA

1081 ACTATGATGC TTTGAGAAAG AACGGTACCA CTTACAGCAT CACAAACTAC ACCGTCACCT

1141 CCGAAAACGG CAAGAAGATC AAGCTAGACA ACCCATCCGG TTCTCTTGAA TTCCATCTTG

1201 AATACGTGTT TAACGGCTCC CCAGATATCA AGAGCAACGT GTTCGCTGAT CTTTCCTTGT

1261 ACTTCAAGGG TAACAACGAC GACAACGAAT ACTTGAGATT GGGTTACGAA ACCAACGGTG

1321 GTGCCTTCTT CTTGGACCGT GGCCACACCA AGATTCCTTT CGTGAAGGAG AACTTGTTCT

1381 TCAACCACCA ATTGGCAGTT ACCAACCCAG TTTCCAACTA CACCACAAAC GTCTTCGACG

1441 TTTACGGTGT CATTGACAAG AACATCATCG AATTGTACTT CGACAACGGT AACGTCGTCT

1501 CCACCAACAC TTTCTTCTTC TCTACCAACA ACGTTATTGG TGAAATTGAC ATCAAGTCAC

1561 CATACGACAA GGCTTACACC ATTAACTCAT TTAACGTTAC CCAATTTAAC CTTTGATCTA

1621 GAGAG

序列号：2

序列长度：536AA

序列类型：氨基酸序列

序列来源：人工序列

序列特征：

表示特征的记号：蛋白质修饰和结构域

决定位置：糖基化位点、酶活性中心、结构域

决定特征的方法：实验

存在位置：1-3，Kex2识别位点；4-536位，成熟肽；糖基水解酶家族32的N端结构域，23-344位；糖基水解酶家族32的C端结构域，418-495位；潜在的N-糖基化修饰位点(N X T/S)，共14个：12位，102位，103位，109位，156位，200位，206位，236位，271位，366位，374位，403位，471位，530位。

  1 EKRDGDSKAI TNTTFSLNRP SVHFTPSHGW MNDPNGLWYD AKEEDWHLYY QYNPAATIWG

 61 TPLYWGHAVS KDLTSWTDYG ASLGPGSDDA GAFSGSMVID YNNTSGFFNS SVDPRQRAVA

121 VWTLSKGPSQ AQHISYSLDG GYTFQHYSDN AVLDINSSNF RDPKVFWHEG ENGEDGRWIM

181 AVAESQVFSV LFYSSPNLKN WTLESNFTHH GWTGTQYECP GLVKVPYDSV ADSSSNSSDS

241 KPDSAWVLFV SINPGGPLGG SVTQYFVGDF NGTHFTPIDD QTRFLDMGKD YYALQTFFNT

301 PNEKDVYGIA WASNWQYAQQ APTDPWRSSM SLVRQFTLKD FSTNPNSADV VLNSQPVLNY

361 DALRKNGTTY SITNYTVTSE NGKKIKLDNP SGSLEFHLEY VFNGSPDIKS NVFADLSLYF

421 KGNNDDNEYL RLGYETNGGA FFLDRGHTKI PFVKENLFFN HQLAVTNPVS NYTTNVFDVY

481 GVIDKNIIEL YFDNGNVVST NTFFFSTNNV IGEIDIKSPY DKAYTINSFN VTQFNL

考虑到毕赤巴斯德酵母细胞壁中的Kexin信号肽酶对分泌表达的重组菊粉酶的识别和切割作用(Gluschankof P，Fuller RS.Structural and enzymaticcharacterization of a purified prohormone-processing enzyme：secreted，solubleKex2 protease.EMBO J.1994，3(10)：2280-2288.)，通过上游引物Inu-p1在重组表达蛋白的N端引入了毕赤酵母Kexin酶Kex2信号切割位点(Kex2signal cleavage)Leu Glu Arg三个氨基酸残基。重组菊粉酶进行成熟肽段天然N端表达的构建策略示意图见图7。

携带马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶信号肽基因的T载体利用XhoI和XbaI双酶切释放目的基因片段，亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA相应的酶切位点，获得重组表达载体pPICZαA-inu12；酶切体系：10×Basalbuffer(Bgl II)(大连TakaRa)10μl，XhoI(大连TakaRa)3μl，XbaI(大连TakaRa)3μl，载体DNA(900ng/μl)20μl，ddH₂O加至100μl。37℃3h；连接、转化为分子生物学标准方法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)；构建过程见图6。重组载体经XhoI和Xba I双酶切鉴定(酶切鉴定体系：10×Basal buffer(BglII，大连TakaRa)2μl，XhoI(大连TakaRa)1μl，Xba I(大连TakaRa)1μl，质粒7μl，ddH₂O加至20μl，37℃ 3h。取10μl酶切产物进行0.8％琼脂糖糖凝胶电泳。结果见图2)和测序分析，测序引物分别为alpha-fac-p1：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’和AOX-p2：5’-CAAATGGCATTCTGACATCCT-3’，测序结果表明，菊粉酶基因以正确的阅读框架插入到α交配因子分泌信号肽Kex2信号肽酶裂解位点之后，能够进行天然菊粉酶的分泌表达。

实施例3：毕赤氏巴斯德酵母菌株的转化及阳性克隆的筛选

重组表达质粒菊粉酶用sac I(大连TakaRa)单酶切线性化，经过酚：氯仿：异戊醇抽提去除蛋白质，加入1/10体积3mol/l醋酸钠溶液(pH5.2)和2倍体积无水乙醇，沉淀回收线性化载体，纯化后的线性载体经V-530mol/l紫外/可见光/近红外光谱仪(JASCO)测定其浓度为995ng/μl。取10μl纯化后的线性载体，采用电击法转化毕赤巴斯德酵母X-33(购自Invitrogen公司)，同时转化线性化处理的pPICZαA空载体作为对照。电击转化参数：电击参数：0℃，1.5kv，200Ω，25μF，电击时间：4.5-10ms，感受态细胞的制备详见操作过程说明(Invitrogen公司手册：pPICZα A，B，and C，Pichia expression vectors for selection on Zeocin and purification ofsecreted，recombinant proteins，www.invitrogen.com)。200μl电击转化液涂布含200μg/ml Zeocin的YPD平板(葡萄糖20g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20.0g/l，Zeocin 200μg/ml)，30℃培养2-3天，转化子出现。选择Zeocin抗性酵母转化子分别接种含200μg/ml Zeocin的YPD液体培养基，培养12-24h后，参考Invitrogen公司推荐方法进行菌落PCR鉴定，所用引物分别为alpha-fac-p1：和AOX-p2(序列同实施例2)，PCR产物进行琼脂糖凝胶(1％)电泳(图3)，结果显示，获得了预期1.9kb大小的目的片段(1.63kb+0.3kb)，说明菊粉酶基因已整合到α交配因子前导肽编码基因的3’端。PCR鉴定阳性的转化子克隆命名为X-33/pPICZαA-inu，转接于新的Zeocin-YPD(Zeocin，200μg/ml)，30℃培养2-3天，取出平板，4℃保存。实施例4：重组菊粉酶的小量表达与表达产物的SDS-PAGE分析

从含200μg/ml Zeocin的YPD平板上挑取重组酵母菌X-33/pPICZαA-inu菌落，接种在25ml BMGY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液，pH＝6.0，1.34％ YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)中，30℃，200rpm，培养至OD＝2.0-6.0，4000rpm离心5min收集菌体，菌体重悬于100ml BMMY培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mmol/l磷酸钾缓冲液，pH＝6.0，1.34％ YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)中以诱导蛋白表达，28℃、250rpm条件下培养4d，每24h间隔取样10ml以分析菌体增长和重组菊粉酶表达的规律，同时补加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，4d后离心收集上清，取少量进行12％的SDS-PAGE分析，结果如图4所示。

实施例5：重组酵母菌生长规律分析和蛋白浓度测定

重组酵母菌X-33/pPICZαA-inu诱导表达培养物每24h间隔取样10ml，15000g×10min离心，收集菌体沉淀称取菌体湿重，并绘制菌体生长曲线(见图5)；上清中的蛋白质浓度用考马斯亮蓝G-250法(精编分子生物学实验指南第四版，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)测定，以牛血清蛋白(BSA)为标样，以空载体pPICZαA转化X-33产生的重组酵母菌X-33/pPICZαA 96h的表达上清做参考，调零。考马斯亮蓝G-250法测得重组工程菌X-33/pPICZαA-inu诱导表达上清中的蛋白浓度在96h(发酵终点)达到最高，蛋白浓度为200μg/ml(图5)。

实施例6：重组菊粉酶的酶活测定

菊粉酶活性测定采用DNS法(3，5-二硝基水杨酸比色法)。

pH4.6 HOAc-NaOAc缓冲液：1)2mol/l NaOAc母液：称取16.4g无水乙酸钠溶于适量蒸馏水中，定容至100ml；2)2mol/l HOAc母液：称取12.1g乙酸，溶于适量蒸馏水中，定容至100ml；3)取24.5ml 2mol/l NaOAc溶液和25.5ml 2mol/l HOAc溶液混合，定容至1000ml，即得pH4.6的0.1mol/l HOAc-NaOAc缓冲液。

5％菊粉溶液的配制：精密称取5.00g菊粉(伊利产品来自大连理工大学)于适量pH4.6 HAc-NaOAc缓冲液，定容至100ml容量瓶中。

酶活单位定义：反应体系中每毫升每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量即为1个酶活单位。

菊粉酶活性测定条件：取100μl发酵上清液，用0.1mol/l HOAc-NaOAc(pH4.6)缓冲液稀释10倍，取50μl稀释液加入450μl 5％菊粉溶液(用0.1mol/l HOAc-NaOAc，pH4.6缓冲液溶解，菊粉来源：伊利产品)，混匀，60℃水浴反应10min(精确计时)，立即取出沸水浴5min(精确计时)灭活，冷水浴冷却，从反应液中取出50μl，用0.1mol/l HOAc-NaOAc(pH4.6)缓冲液稀释到500μl，加入0.5ml DNS试剂，混匀，沸水浴中5min(精确计时)，冷水浴冷却，定容至5ml，测OD₅₂₀。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)。

对照设置：发酵上清稀释液，沸水5min灭活，取50ul加入450ul 5％菊粉溶液，混匀，60℃水浴反应10min(精确计时)，立即取出沸水浴5min(精确计时)灭活，冷水浴冷却，从反应液中取出50ul，用0.1mol/lHOAc-NaOAc(pH4.6)缓冲液稀释到500μl，加入0.5ml DNS试剂，混匀，沸水浴中5min(精确计时)，冷水浴冷却，用容量瓶定容至5ml，测OD₅₂₀。对应果糖标准曲线计算得样品反应液中的含糖量A(mg)作为对照，调零。

酶活计算：

每毫升发酵上清液中菊粉酶活为：

根据每24h间隔取样的分析结果绘制而成的重组菊粉酶酶活增长曲线见图5。重组酵母菌X-33/pPICZαA-inu诱导96h时发酵上清中重组菊粉酶的活性为3890U/ml，比酶活达到19500U·mg^-1。

实施例4和实施例6的结果显示，所获得重组菊粉酶的SDS-PAGE分析结果和外切菊粉酶天然生产菌株K.marxianus CBS6556来源的外切菊粉酶相同，酶学性质相似，所不同是只是重组菊粉酶酶活更高，发酵时间缩短(Rouwenhorst RJ，Visser LE，Van Der Baan AA，et al.Production，distribution，and kinetic properties of inulinase in continuous cultures ofKluyveromyces marxianus CBS6556，Appl.Environ.Microbiol.1998，54(5)：1131-1137；Rouwenhorst RJ，Hensing M，Verbakel J，et al.Structure andproperties of the extracellular inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556.Appl.Environ.Microbiol.1990，56(11)：3337-3345)，由此可以判定，经过以上实施例操作获得的重组蛋白就是外切菊粉酶。

利用毕赤巴斯德酵母宿主菌SMD1168，经过和实施例3—6同样的实验操作，构建的另一重组菌株SMD1168/pPICZαA-inu诱导96h时发酵上清中重组菊粉酶的活性较低(1227U/ml)，可能是由于SMD1168本身蛋白酶缺陷，生长缓慢所致，用此菌株可能需要更长的诱导表达时间，将为增加经济成本。

实施例7：重组菊粉酶的纯化

由于毕赤酵母本身分泌蛋白背景很低，表达上清中的重组菊粉酶可以简单通过超滤的方法获得纯化。X-33/pPICZαA-inu重组工程菌株进行500ml摇瓶发酵，操作为实施例4中X-33/pPICZαA-inu重组工程菌株的放大培养。诱导表达96h后15000g×10min收集表达上清液，取180ml诱导表达96h的上清液，利用截流分子量10000Da的超滤膜(搅拌式超滤器，美国Millipore公司)进行分批超滤浓缩(浓缩到18ml)，加入9倍体积的0.1mol/l HOAc-NaOAc(pH4.6)缓冲液，再次浓缩至18ml，同时去除上清液中的磷酸钾成分。纯化好的重组菊粉酶利用实施例5中的方法进行酶活测定和蛋白质，酶活可达43320.4U·ml^-1，比酶活达到20500U·mg^-1。

实施例8：重组菊粉酶的应用(菊粉酶降解菊粉制备果糖浆)

外切菊粉酶催化菊粉水解生成果糖的反应(不考虑末端葡萄糖)：

利用实施例7中纯化的重组菊粉酶，进行了菊粉的水解实验，重组菊粉酶粗制品1ml(酶活可达43320.4U·ml^-1)加入100ml加热溶解的15％菊粉溶液(溶解于0.1mol/l HOAc-NaOAc(pH4.6)缓冲液)，降解条件：60℃，20-30h，降解率达到96％以上。

提示所获得的重组菊粉酶可用于高果糖浆的制备，及以菊芋块茎为生物质原材料的菊芋同步糖化油脂发酵的生物转化过程。

外切菊粉酶

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1625

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(15)..(1613)

<223>

<400>1

<210>2

<211>533

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

<210>3

<211>1671

<212>DNA

<213>马克斯克鲁维酵母

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1671)

<223>

<400>3

Claims (6)

1.一种马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的分泌表达方法，首先将马克斯克鲁维酵母外切菊粉酶的编码基因通过限制性内切酶位点与表达载体连接获得重组表达载体，然后将重组表达载体导入宿主菌细胞经诱导表达获得目的蛋白，其特征在于：所述的目的蛋白编码基因是SEQ ID No：1中第15位至第1613位的碱基所构成的核苷酸序列，所述表达载体为毕赤酵母/大肠杆菌穿梭质粒pPICZαA，所述宿主细胞为毕赤氏巴斯德酵母X-33或SMD1168；

所述的重组质粒导入宿主菌前，先将重组质粒利用Sac I限制性内切酶进行线性化，然后在宿主菌基因组的AOX1基因处整合插入。

2.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：其中马克斯克鲁维酵母的外切菊粉酶基因与表达载体pPICZαA重组的引物序列为：Inu-p1：5’-TCCTCGAGAAAAGAGATGGTGACAGCAAGGCCAT-3’和Inu-p2：5’-CTCTCTAGATCAAAGGTTAAATTGGGTAACGTT-3’，以及分别与这两条引物具有60％以上同源性，用于重组菊粉酶表达的引物序列。

3.如权利要求2所述的表达方法，其特征在于：通过上游引物Inu-p1在重组表达蛋白的N端引入了毕赤酵母Kexin酶Kex2信号切割位点LeuGlu Arg三个氨基酸残基。

4.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：构建表达载体所采用的限制性内切酶位点为Xho I、EcoR I、Pml I、Sfi I、BsmB I、Kpn I、Sac II、Not I和Xba I中的任何一个或任何两个限制性内切酶位点。

5.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：重组表达载体导入宿主菌细胞的方法为电击转化法或锂盐转化法。

6.如权利要求1所述的表达方法，其特征在于：诱导表达获得重组菊粉酶的方法为，诱导表达时甲醇的终浓度范围为0.5％-2％，诱导表达时的培养温度为26-30℃。

Images