CN108048473B

CN108048473B - 一种阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制备方法和用途

Info

Publication number: CN108048473B
Application number: CN201711086961.9A
Authority: CN
Inventors: 吕红; 刘洋; 周峻岗; 余垚
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: CN108048473A

Abstract

本发明提供了一种阿魏酸酯酶基因，其来源于中国牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还提供了含有该基因的马克斯克鲁维酵母重组表达载体及基因工程菌株，并提供了制备阿魏酸酯酶的方法和制得的阿魏酸酯酶的用途。将阿魏酸酯酶在马克斯克鲁维酵母表达系统中重组表达，经高密度发酵48小时后胞内和胞外的阿魏酸酯酶的活力分别为686.35U/mL和346.34U/mL。马克斯克鲁维酵母重组表达的阿魏酸酯酶可释放玉米麸皮中的阿魏酸。利用本发明获得的阿魏酸酯酶，可用于食品加工、饲料添加、生物医药、纤维素物质生物转化、生物能源等领域。

Description

一种阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制备方法和用途

技术领域

本发明属生物工程领域，具体涉及一种阿魏酸酯酶基因、含有该基因的马克斯克鲁维酵母重组表达载体和基因工程菌株以及阿魏酸酯酶的制备方法和用途。

背景技术

阿魏酸(ferulic acid)的化学名称为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，广泛存在于植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间形成交接。阿魏酸是天然抗氧化剂，能清除体内的过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基，能调节生理机能、抑制产生自由基的酶、增加清除自由基酶的活性，具有抗菌消炎以及抗突变和防癌作用。阿魏酸广泛存在于食品原料中，麦麸中的阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，有顺式和反式2种构象，反式阿魏酸在美国、日本已被允许用作食品添加剂，在医药、食品和化妆品工业中也被广泛应用。阿魏酸的生产方法有化学合成法、碱法和酶法，近年来酶解法制备阿魏酸受到广泛关注。目前已有文献报道利用阿魏酸酯酶从麦麸、玉米麸皮、啤酒糟、谷物纤维、甜菜渣、燕麦壳和苹果渣等原材料中提取阿魏酸(张璟等，食品科学，2003，24：63-68；薛枫等，粮食与饲料工业，2006：17-19)。

阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73，Feruloyl esterase，FAE)又称肉桂酸酯酶，属于水解酶类的羧酸酯水解酶亚类，能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，释放出游离阿魏酸。阿魏酸酯酶广泛存在于谷物中，由细菌或真菌产生，是一类胞外酶，1991年首次由Faulds等(Faulds et al，Microbiology,1991,137:2339-2345)从橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)中分离出来，目前已有超过30种阿魏酸酯酶被纯化。不同来源的阿魏酸酯酶具有不同的酶学特性，根据其底物的专一性、氨基酸序列的同源性以及水解时释放二聚阿魏酸的能力，主要将阿魏酸酯酶分为A、B、C和D四大类型(Crepinet al，Appl Microbiol Biotechnol,2004,63:647-652)。目前对A型和B型阿魏酸酯酶的研究最为普遍，其中，A型倾向于催化含间位甲氧基或较大疏水取代基团的酚类衍生物，B型更倾向于催化含有一至二个羟基的酚类衍生物。

阿魏酸酯酶是降解植物细胞壁木质化纤维素的重要酶类之一，半纤维素是一种阿拉伯糖基木聚糖，其中阿魏酸、二聚阿魏酸、香豆酸等酚酸类木质素通过酯键连接到阿拉伯糖上可增强阿拉伯木聚糖链的强度，因而限制了动物和微生物对植物细胞壁中的纤维素、半纤维素的有效降解。阿魏酸酯酶可以打断阿魏酸与细胞壁多糖的连接，高效降解多糖并获得低聚糖及阿魏酸。

在造纸工业中的应用，利用阿魏酸酯酶、木聚糖酶及漆酶等的协同作用一起催化水解植物性原材料麦秆浆粕、油籽亚麻浆粕等，将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从而断开木质素、半纤维素以及纤维素之间的连接，结构变得疏松，并且能够提高纸浆的白度，减少脱除木质素漂白氯的使用量。

在饲料中添加阿魏酸酯酶能促进饲料中半纤维素的消化，降低了肠道中食糜的粘度，加速了排空速度和营养物质的吸收利用。Selinger等(Selinger et al.Anaerobe,1996,2:263-284)研究发现阿魏酸酯酶等作为饲料的添加剂，既能加快植物细胞壁等成分在瘤胃中的降解速度，也能提高反刍家畜对饲料的消化程度，减少随粪便排出的营养物质，从而提高饲料的利用效率。

此外，阿魏酸酯酶在生物质能源和生物合成中也有广泛应用。在木质纤维材料转化为燃料乙醇的过程中，乙醇的产量随半纤维素糖类利用率增大而增加，因此充分利用纤维素酶、阿魏酸酯酶和木聚糖酶的协同作用，能提高木质纤维素的糖化效率和降低成本。在生物合成方面，阿魏酸酯酶可催化在水-有机溶液混合体系或微乳液中发生的肉桂酸的酯化或酯基交换反应，形成脂溶性更好的衍生物。

目前，国内市场尚无阿魏酸酯酶成品出售，国际市场仅爱尔兰Megazyme公司提供科研级的瘤胃微生物和C.thermocellum阿魏酸酯酶标准品，且价格昂贵，无法应用于工农业生产。尽管已经利用大肠杆菌BL21、黑曲霉、毕赤酵母GS115和酿酒酵母等表达系统在实验室层面上实现了部分种类阿魏酸酯酶的同源或异源重组表达，但依旧存在诸多局限性。如丝状真菌生长条件的特殊性不利于规模化发酵；利用大肠杆菌进行原核表达时易形成包涵体、目标蛋白中有内毒素或生物热源的污染；利用毕赤酵母重组表达时需要甲醇诱导，目标产物不能应用于食品或饲料添加；而GRAS级酿酒酵母重组表达阿魏酸酯酶的产量较低，仅为2mg/L(黄雪月等，微生物学报，2017,44：68-78)。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种阿魏酸酯酶基因、含有该基因的马克斯克鲁维酵母重组表达载体和基因工程菌株以及阿魏酸酯酶的制备方法和用途。其具体技术方案如下：

本发明在第一方面提供了一种阿魏酸酯酶基因，其来源于中国牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明在第二方面提供了一种马克斯克鲁维酵母重组表达载体，该载体由上述阿魏酸酯酶基因克隆到马克斯克鲁维酵母表达载体中获得。

本发明在第三方面提供了一种马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其由上述马克斯克鲁维酵母重组表达载体导入马克斯克鲁维酵母宿主细胞中，经筛选与鉴定获得。

在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母表达载体不含有分泌信号肽或含有分泌信号肽。优选地，该分泌信号肽为来源于马克斯克鲁维酵母自身的菊粉酶信号肽或来源于酿酒酵母的alpha信号肽。

在较优实施例中，上述马克斯克鲁维酵母表达载体的DNA序列均来源于马克斯克鲁维酵母自身，不含有来源于大肠杆菌基因组上的DNA序列。

优选地，上述马克斯克鲁维酵母基因工程菌株可通过分泌表达或胞内表达阿魏酸酯酶。

本发明在第四方面提供了一种制备阿魏酸酯酶的方法，其利用上述马克斯克鲁维酵母基因工程菌株制备获得阿魏酸酯酶。

在较优实施例中，上述方法包括以下步骤：发酵时间48-72小时，发酵温度30-35℃，发酵碳源至少包括葡萄糖和蔗糖中的一种，发酵氮源至少包括无机盐和酵母抽提物中的一种。

本发明在第五方面提供了根据上述方法制备的阿魏酸酯酶的用途。

在一个较优实施例中，制备得到的阿魏酸酯酶作用于天然原料制备阿魏酸，该天然原料至少包括麦麸、玉米麸皮、玉米芯和谷物纤维中的一种或其组合。

在另一个较优实施例中，制备得到的阿魏酸酯酶与纤维素酶和/或半纤维素酶联合作用，提高含有纤维素或半纤维素物质的原料的降解率。

由上述方法制备得到的阿魏酸酯酶可应用于饲料添加、造纸、食品添加、生物质材料降解、芳香类化合物的生物合成和生物制药等领域。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1、牛瘤胃宏基因组DNA扩增阿魏酸酯酶Est1E基因

A、琼脂糖凝胶电泳，泳道1和2为Est1E的PCR扩增产物，M为1kb DNA分子量标准(DNA Marker)；B、本发明所涉及的Est1E(SEQ ID No.1)与NCBI数据库中已公开的阿魏酸酯酶(NCBI-B316-Est1E)核苷酸序列的同源性比对。

图2、阿魏酸酯酶重组表达菌株Fim-1ura3Δ-Est1E的构建与鉴定

A、Est1E表达质粒pUKD-N112-Est1E图谱；B、pUKD-N112-Est1E转化马克斯克鲁维酵母菌株Fim-1ura3Δ的转化子PCR鉴定；C/D/E、薄层层析(TLC)检测重组菌株Fim-1ura3Δ-Est1E的发酵液上清中Est1E的酶活。

图3、利用马克斯克鲁维酵母重组表达阿魏酸酯酶的发酵与制备

A、发酵48小时后上清与胞内的阿魏酸酯酶的定量分析，1：Fim-1ura3Δ菌株(空白对照)发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活；2/3：Fim-1ura3Δ-Est1E重组菌株发酵上清液中阿魏酸酯酶的酶活；4：Fim-1ura3Δ菌株(空白对照)发酵后胞内阿魏酸酯酶的酶活；5/6：Fim-1ura3Δ-Est1E重组菌株发酵后胞内阿魏酸酯酶的酶活；B、利用离子交换层析和分子筛，对上述重组表达的阿魏酸酯酶进行纯化处理，样本经12％SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，泳道M为预染蛋白分子量标准(Marker)，Raw为发酵上清原液，泳道AKTA-3至AKTA-10为不同盐离子浓度下洗脱的流穿液；C、以浓度梯度BSA标准品的SDS-PAGE条带灰度值绘制标准曲线和回归方程；D、根据该回归方程和阿魏酸酯酶纯化样品的灰度值、酶活(U/mL)推算出该条件下制备获得的阿魏酸酯酶的酶活(U/mg)。

图4、利用重组表达的阿魏酸酯酶从玉米麸皮中制备阿魏酸

A、TLC分析Est1E与木聚糖酶/纤维素酶(Xylanase/Cellulase)组合酶水解玉米麸皮释放阿魏酸的水平；B、利用HPLC定量分析Est1E与木聚糖酶/纤维素酶(Xylanase/Cellulase)组合酶水解玉米麸皮时的阿魏酸释放量(mg/g玉米麸皮)；C、DNS法检测Est1E与木聚糖酶/纤维素酶(Xylanase/Cellulase)组合酶水解玉米麸皮时反应体系中还原糖的释放量(mg/g玉米麸皮)。

具体实施方式

本发明提供一个重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株。

本发明还提供一种利用马克斯克鲁维酵母基因工程菌株制备魏酸酯酶的发酵方法。

本发明同时提供一种利用阿魏酸酯酶制备阿魏酸的方法。

本发明提供了一种新的阿魏酸酯酶的制备方法，是将来源于中国牦牛瘤胃未培养微生物的阿魏酸酯酶基因通过基因工程方法，克隆到马克斯克鲁维酵母表达载体上，并转化马克斯克鲁维酵母宿主菌株，构建获得可以重组表达阿魏酸酯酶的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株。该工程菌株分泌表达阿魏酸酯酶。该工程菌株，经过30℃，48-72小时的发酵罐液体发酵，产生的阿魏酸酯酶，可以从玉米麸皮等生物质原料中水解释放阿魏酸产物；也可以通过与纤维素酶、半纤维素酶协同作用，提高麸皮等原料的降解效率。

实施例1牦牛瘤胃微生物基因组的提取及阿魏酸酯酶基因Est1E的克隆

于中国青海省西宁市的一个屠宰场采集2头中国青海牦牛的瘤胃内容物，使用3层纱布过滤，滤液经离心收集瘤胃微生物菌体，冻存于-80℃待用。取100-200μL菌体样品，1mLPBS洗2-3次，加入650μL DNA抽提缓冲液(100mM Tris-HCl pH8.0，100mM Na₂·EDTApH8.0，100mM Na₃PO₄缓冲液pH8.0；1.5M NaCl，1％CTAB，pH8.0)，混匀后，置-80℃中，然后放置在65℃水浴中融化，重复冻融三次；冷却后加入3-4μL溶菌酶(100mg/L)于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)约30min；加入2-3μL蛋白酶K(20mg/mL)后继续振荡约30min；加入50-70uL20％SDS，混匀后，65℃保温1-2小时，每隔10-20min上下颠倒离心管混匀；12 000rpm室温离心10min，收集上清液，加入400-500μL酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提两次；氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次后加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置15-20min后，12 000rpm离心15min；沉淀用70％乙醇漂洗，干燥后用60-100μL TE(pH8.0)溶解，加入1μL RNase去除残留RNA。

根据牛瘤胃微生物Butyrivibrio proteoclasticus的阿魏酸乙酯酶基因Est1E的核苷酸序列，设计PCR扩增引物Est1E-F：5’-CCCCATATGTATATTGATTGTGACGGTATAAAAT-3’(SEQ ID No.3)和Est1E-R：5’-CCCCTCGAGTTTAGCAATCTGCTCAAGCATAAATTC-3’(SEQ IDNo.4)。以抽提获得的牦牛瘤胃宏基因为模板，进行阿魏酸酯酶基因的扩增，并将PCR扩增产物插入pMD18T载体中进行Sanger测序。序列比对分析发现该基因与B.proteoclasticusB316基因组中的假定的阿魏酸酯酶feruloyl esterase(Est1E)序列具有较高的同源性，DNA序列相似性为89％，因此，该基因命名为“Est1E”。

实施例2阿魏酸酯酶基因Est1E重组克鲁维酵母表达菌株的构建

根据测序获得的牦牛瘤胃微生物阿魏酸酯酶Est1E序列，通过常规的分子克隆方法，将该基因插入到克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)表达载体pUKD-N112的Sma I和Not I两个限制性酶切位点中间，获得了重组质粒pUKD-N112-Est1E。该重组质粒可利用马克斯克鲁维酵母菊粉酶的启动子和信号肽，进行Est1E的重组表达与分泌。

以尿嘧啶营养缺陷型的马克斯克鲁维酵母菌株Fim-1ura3Δ作为表达宿主菌，将Fim-1ura3Δ接种于含3mL YEPD培养基的玻璃试管中，30℃摇床过夜培养OD₆₀₀至12-15。取1mL菌液，8 000rpm离心30s收集菌体，加入1mL无菌水洗涤，8 000rpm离心30s，弃上清再加入1mL LiAc-TE溶液(100mM LiAc，10mM Tris-HCl，1mM EDTA)洗涤，8 000rpm离心30s，弃上清，重复洗涤1次。在菌体中依次加入5μL变性鲑鱼精子DNA(carrier DNA)，5-10μL质粒DNA(质粒DNA总量应大于500ng)，600μL PEG溶液(40％PEG 4000，100mM LiAc，10mM Tris-HClpH7.5，1mM EDTA)和终浓度为10mM DTT，充分混匀后，30℃水浴15min，47℃水浴15min，8000rpm瞬离，弃上清，加100μL无菌水悬浮菌体，涂SD-ura平板(0.67％YNB，2％葡萄糖，0.069％尿嘧啶缺陷氨基酸补充剂(Amino acid supplement without ura)，30℃倒置培养2-4天直至单克隆形成。

从SD-ura平板上挑取转化子，用Est1E-F和Est1E-R引物对转化子进行菌落PCR鉴定，然后将转化有重组质粒pUKD-N112-Est1E的克隆接种于装有50mL的YD培养基(1％酵母提取物，2％葡萄糖)的三角摇瓶中，30℃，220rpm培养96小时后离心收集上清进行阿魏酸酯酶的活性测定。

阿魏酸酯酶的活性测定采用阿魏酸乙酯为底物。称取5g阿魏酸乙酯，溶解于N,N-二甲基甲酰胺配制浓度为10％的母液，混匀，4℃避光保存。取5μL发酵上清液至40μL 50mM磷酸缓冲液，然后加入5μL 10％阿魏酸乙酯底物，37℃反应1小时。反应结束后进行薄层层析(TLC)分析。TLC分析：将硅胶板剪至适中的宽度和长度，每组反应液各取2μL有序地点在硅胶板上，重复点样三次。采用氯仿：甲醇：甲酸＝85：15：1为展开剂进行层析，至展开剂前沿达到距板上缘约2-3mm停止，烘干将硅胶板置于紫外365nm处扫描。结果表明所述马克斯克鲁维酵母重组菌株能够分泌表达具有特定生物学活性的阿魏酸酯酶Est1E。

实施例3利用马克斯克鲁维酵母重组表达阿魏酸酯酶的发酵与制备

从阿魏酸乙酯水解实验中筛选出来的降解效率较高的克隆作为发酵菌，在5L的发酵罐中进行小试发酵。根据2g葡萄糖发酵产1g酵母细胞，且酵母细胞C/N＝5：1，设计了马克斯克鲁维酵母重组菌发酵培养基，培养基N源为酵母粉，C源为葡萄糖，通过流加培养基的方法进行阿魏酸酯酶马克斯克鲁维酵母重组菌的高密度发酵。发酵培养基采用初始体积为1.6L，含2％的酵母粉，5％的葡萄糖。糖浓度<1％时开始流加补料，N源的浓度与碳源的浓度按照5：1，并且控制葡萄糖浓度为1％左右，发酵周期持续48小时。重组阿魏酸酯酶的表达水平通过测定发酵上清液以及细胞内的酶活进行评估。阿魏酸酯酶的定量采用2-氯-4-硝基苯酚-阿魏酸酯(CNPF)底物，反应体系200μL，含1mM CNPF，100mM磷酸缓冲液pH6.4和20μL的发酵上清液，37℃反应20min后通过测定410nm吸光值，利用2-氯-4-硝基苯酚的标准曲线进行定量。1U定义为每分钟催化产生1nmol的产物。结果表明，发酵48小时后，分泌到胞外的阿魏酸酯酶活性达346.34U/mL，而胞内的酶活明显高于胞外，达686.35U/mL。

离心收集所述重组菌经高密度发酵48小时后的发酵液上清，经0.45μm滤膜过滤除去非可溶性杂质，用1M HCl调pH至6.5后与10mM Bis-Tris缓冲液(pH6.5)按体积比1：1稀释后，先后经HiTrap^TM Q离子交换层析柱和Superdex^TM 200Increase 10/300GL分子筛过滤，收集不同盐离子浓度下洗脱的流穿液，对各样本进行12％SDS-PAGE电泳及CNPF酶活检测，发现标记为AKTA-5/-6/-7的样本纯度和阿魏酸酯酶的酶活均较高，用于后续定量分析。利用浓度梯度BSA标准品的SDS-PAGE电泳图进行蛋白条带的灰度扫描，并根据条带的灰度值和对应的BSA标准品的浓度绘制标准曲线和回归方程，再根据Est1E纯化样品的SDS-PAGE条带的灰度值由该回归方程推算出其所述条件下制备的阿魏酸酯酶的酶活约为186.8U/mg。由此再根据发酵上清液对应的酶活(346.34U/mL)推算出该发酵条件下的阿魏酸酯酶的产量约为1.85g/L(发酵上清液)。

实施例4利用重组表达的阿魏酸酯酶Est1E进行阿魏酸的酶法制备

以含阿魏酸丰富的玉米麸皮(Maize bran)为原料，利用马克斯克鲁维酵母重组菌株Fim-1ura3-Est1E所分泌表达的阿魏酸酯酶Est1E与商品化的木聚糖酶(Xylanase)和纤维素酶(Cellulase)协同作用，于37℃联合处理玉米麸皮24小时，水解产生的阿魏酸通过TLC和HPLC进行定量，玉米麸皮在纤维素酶和/或半纤维素酶作用下水解释放的还原糖则通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)进行定量，以麦芽糖标准品绘制标准曲线。结果表明，重组表达的阿魏酸酯酶可较高效释放玉米皮中的阿魏酸；另外，Est1E单独与半纤维素酶或纤维素酶协同作用可以显著提高阿魏酸的产量，达0.14mg/g玉米麸皮，并提高了反应体系中还原糖的含量；而在此基础上，三种酶联合使用(Est1E、Xylanase和Cellulase)能够显著提高还原糖的产量，达23.32mg/g玉米麸皮。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种阿魏酸酯酶基因、基因工程菌株以及制备方法和用途

<130> 2010

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 747

<212> DNA

<213> 未知序列()

<400> 1

atgtatattg attgtgacgg tataaaatta aatgcttatc ttgatatgcc aaagaataat 60

ccagagaaat gcccattgtg catcatcatt catggcttta caggacatag tgaagaaaga 120

catattgttg ctgttcagga gacattgaat gagataggag tagcaactct tcgcgctgat 180

atgtacggac atggaaagag cgacggcaag tttgaggatc atacactttt taagtggctt 240

acaaatattt tggctgtagt tgactatgcc aagaagctgg attttgttac agatatttac 300

atggcaggac attcgcaggg aggattatcc gtaatgctcg ctgcagcaat ggaaagagat 360

attattaaag cactcattcc actatcacct gctgcaatga tccctgaaat tgcaagaaca 420

ggagaacttc ttggacttaa atttgatccg gagaatattc ctgacgaatt ggaagcttgg 480

gatggaagaa agctcaaagg taattatgcc agagtagctc agaccatcag ggtggaagac 540

tttgtggata agtatcagaa gccagtgctt atagttcacg gagatcagga cgaggccgta 600

ccttacgagt tctcagtaaa gttttccaag cagtacaaga attgtaaatt ggtaactatc 660

ccaggagata ctcactgcta cgatcaccat cttgagcttg ttactgaagc ggtaaaagaa 720

tttatgcttg agcagattgc taaataa 747

<210> 2

<211> 248

<212> PRT

<213> 未知序列()

<400> 2

Met Tyr Ile Asp Cys Asp Gly Ile Lys Leu Asn Ala Tyr Leu Asp Met

1 5 10 15

Pro Lys Asn Asn Pro Glu Lys Cys Pro Leu Cys Ile Ile Ile His Gly

20 25 30

Phe Thr Gly His Ser Glu Glu Arg His Ile Val Ala Val Gln Glu Thr

35 40 45

Leu Asn Glu Ile Gly Val Ala Thr Leu Arg Ala Asp Met Tyr Gly His

50 55 60

Gly Lys Ser Asp Gly Lys Phe Glu Asp His Thr Leu Phe Lys Trp Leu

65 70 75 80

Thr Asn Ile Leu Ala Val Val Asp Tyr Ala Lys Lys Leu Asp Phe Val

85 90 95

Thr Asp Ile Tyr Met Ala Gly His Ser Gln Gly Gly Leu Ser Val Met

100 105 110

Leu Ala Ala Ala Met Glu Arg Asp Ile Ile Lys Ala Leu Ile Pro Leu

115 120 125

Ser Pro Ala Ala Met Ile Pro Glu Ile Ala Arg Thr Gly Glu Leu Leu

130 135 140

Gly Leu Lys Phe Asp Pro Glu Asn Ile Pro Asp Glu Leu Glu Ala Trp

145 150 155 160

Asp Gly Arg Lys Leu Lys Gly Asn Tyr Ala Arg Val Ala Gln Thr Ile

165 170 175

Arg Val Glu Asp Phe Val Asp Lys Tyr Gln Lys Pro Val Leu Ile Val

180 185 190

His Gly Asp Gln Asp Glu Ala Val Pro Tyr Glu Phe Ser Val Lys Phe

195 200 205

Ser Lys Gln Tyr Lys Asn Cys Lys Leu Val Thr Ile Pro Gly Asp Thr

210 215 220

His Cys Tyr Asp His His Leu Glu Leu Val Thr Glu Ala Val Lys Glu

225 230 235 240

Phe Met Leu Glu Gln Ile Ala Lys

245

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccccatatgt atattgattg tgacggtata aaat 34

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cccctcgagt ttagcaatct gctcaagcat aaattc 36

Claims

1.一种阿魏酸酯酶基因，其特征在于，所述阿魏酸酯酶基因来源于中国牦牛瘤胃微生物，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.一种马克斯克鲁维酵母重组表达载体，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母重组表达载体由如权利要求1所述的阿魏酸酯酶基因克隆到马克斯克鲁维酵母表达载体中获得。

3.一种马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母基因工程菌株由如权利要求2所述的马克斯克鲁维酵母重组表达载体导入马克斯克鲁维酵母宿主细胞中，经筛选与鉴定获得。

4.如权利要求3所述的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体不含有分泌信号肽或含有分泌信号肽。

5.如权利要求4所述的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其特征在于，所述分泌信号肽为来源于马克斯克鲁维酵母自身的菊粉酶信号肽或来源于酿酒酵母的alpha信号肽。

6.如权利要求3或5所述的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母表达载体的DNA序列均来源于马克斯克鲁维酵母自身，不含有来源于大肠杆菌基因组上的DNA序列。

7.如权利要求3或5所述的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株，其特征在于，所述马克斯克鲁维酵母基因工程菌株可通过分泌表达或胞内表达阿魏酸酯酶。

8.一种制备阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，利用如权利要求3所述的马克斯克鲁维酵母基因工程菌株制备获得阿魏酸酯酶；所述方法包括以下步骤：发酵时间48-72小时，发酵温度30-35℃，发酵碳源至少包括葡萄糖和蔗糖中的一种，发酵氮源至少包括无机盐和酵母抽提物中的一种。

9.如权利要求8所述的制备阿魏酸酯酶的方法，其特征在于，具体为：在5L的发酵罐中进行小试发酵，通过流加培养基的方法进行阿魏酸酯酶马克斯克鲁维酵母重组菌的高密度发酵；发酵培养基采用初始体积为1.6L，含2％的酵母粉，5％的葡萄糖；糖浓度<1％时开始流加补料，N源的浓度与碳源的浓度按照5：1，并且控制葡萄糖浓度为1％，发酵周期持续48小时。

10.如权利要求8所述的方法制备的阿魏酸酯酶的用途，其特征在于，所述阿魏酸酯酶作用于天然原料制备阿魏酸，所述天然原料至少包括麦麸、玉米麸皮和玉米芯中的一种或其组合。

11.如权利要求8所述的方法制备的阿魏酸酯酶的用途，其特征在于，所述阿魏酸酯酶与纤维素酶和/或半纤维素酶联合作用，提高含有纤维素或半纤维素物质的原料的降解率。

12.如权利要求8所述的方法制备的阿魏酸酯酶的用途，其特征在于，所述阿魏酸酯酶可应用于造纸、生物质材料降解和芳香类化合物的生物合成领域。

13.如权利要求8所述的方法制备的阿魏酸酯酶在制备饲料添加剂和/或食品添加剂中的用途。