CN102719414A - 一种新型阿魏酸酯酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新型阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明还公开了所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了含有上述新型阿魏酸酯酶DNA的表达载体、重组阿魏酸酯酶及其制备方法，以及所述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。本发明所述新型阿魏酸酯酶与重组阿魏酸酯酶在大肠杆菌表达体系中高效可溶性表达，所述重组阿魏酸酯酶能够从20mg去淀粉麦麸中释放16.3±0.9μg阿魏酸，占其中所述阿魏酸总量的16％。

Description

一种新型阿魏酸酯酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用宏基因组文库筛选的方法从海底泥样品中获得的一种新型阿魏酸酯酶，以及所述阿魏酸酯酶的应用。

背景技术

木质纤维素(如秸秆、麸皮等)是地球上最丰富的可再生资源，其生成量每年高达5×10¹⁰吨，并且可以通过光合作用年复一年再生，从而越来越受到重视。组成木质纤维的成分主要有纤维素、半纤维素和木质素，木质纤维素的酶解主要通过纤维素酶、木聚糖酶和木质素酶的共同作用。然而植物细胞壁中富含的酚酸类物质(如阿魏酸、对香豆酸)以酯键的方式在木质素之间、半纤维素之间及半纤维素与木质素之间形成交联，从而构成了一个坚硬的骨架结构，阻碍了木质纤维素的降解利用。可见，打断酯键结构可以有效的降解致密的网状交联结构，在木质纤维素的降解和利用中起着重要的作用。

阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73，Ferulic acid esterase)是一种可以水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯及多聚糖阿魏酸酯中的酯键，并将阿魏酸释放出来的羧酸酯水解酶。该酶具有广泛的应用前景，从而引起了越来越多的关注：①水解产物阿魏酸是一种天然抗氧化剂，在食品、化妆品及药品行业中具有潜在的应用价值；②阿魏酸酯酶的作用促进植物原料的脱木质化，减少了纸浆漂白过程中氯的使用，从而减少了环境污染，并且提高纸浆的亮度；③阿魏酸酯酶与其它酶的协同作用可以提高饲料的吸收利用率；④阿魏酸酯酶的作用能够促进植物细胞壁中还原性单糖(如葡萄糖和木糖等)的释放，从而为生产生物燃料提供原料；⑤阿魏酸酯酶可以催化糖类和酚酸合成酯类，通过添加酚类衍生物将糖类聚合物转化为生物活性物质的潜力。因此，深入开展阿魏酸酯酶的研究具有重要的理论意义和广阔的应用前景。

上述各种工业应用要求阿魏酸酯酶在不同的pH值和温度下与不同的底物作用，如制浆需要阿魏酸酯酶在高盐碱和高温的环境下作用，然而目前所研究的阿魏酸酯酶的酶学性质在应用方面仍然存在缺陷，限制了阿魏酸酯酶的广泛应用。因此，如何从环境中获得具有优良特性的阿魏酸酯酶，并研究其结构与功能之间的关系，是当前在阿魏酸酯酶研究中面临的一项重要任务。

宏基因组学(Metagenomics)是近年来随着微生物学和现代生命科学的迅猛发展兴起的一门新兴学科。该方法是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新型微生物学研究方法。宏基因组学技术在挖掘和利用未培养微生物自愿和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆岛如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。因此，该方法为发现阿魏酸酯酶新基因提供了新思路。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种新型阿魏酸酯酶，同时提供一种所述新型阿魏酸酯酶的DNA。

本发明的第二个目的在于提供一种所述新型阿魏酸酯酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供一种含有上述新型阿魏酸酯酶的DNA的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供一种利用上述表达载体制备重组阿魏酸酯酶的方法，同时提供一种采用此方法所得到的重组阿魏酸酯酶。

本发明的第五个目的在于提供一种上述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。

为实现本发明的第一个目的，采取的技术方案为：一种新型阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

一种如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA，所述DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

为实现本发明的第二个目的，采取的技术方案为：一种如上所述新型阿魏酸酯酶的宏基因组学克隆方法，包括以下步骤：提取南海海底泥样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经Sau3AI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

为实现本发明的第三个目的，采取的技术方案为：一种含有如上所述新型阿魏酸酯酶的DNA的表达载体。

为实现本发明的第四个目的，采取的技术方案为：一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，包括以下步骤：用上述所述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组阿魏酸酯酶。

优选地，上述所述的寄主细胞为大肠杆菌。

优选地，上述所述重组阿魏酸酯酶的制备方法具体包括以下步骤：用上述所述的表达载体的目的片段经BamHI、HindIII双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。

优选地，上述所述的IPTG终浓度为0.05～0.6mM，诱导温度为18～37℃。

一种采用上述所述方法得到的重组阿魏酸酯酶。

为实现本发明的第五个目的，采取的技术方案为：一种如上所述的重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。所述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用中，采用去淀粉麦麸(DSWB)为底物。

本发明的有益效果为：

(1)从海底泥样品构建好的宏基因组文库中得到一个新的阿魏酸酯酶的DNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，初步确定分子量为35kDa。

(2)本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆岛原核表达载体上，转化入大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

①在大肠杆菌表达体系中，所得重组蛋白具有高效可溶性表达；

②用对硝基苯酚阿魏酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为40℃，在温度低于50℃，该重组阿魏酸酯酶非常稳定；该重组蛋白的最适反应pH为6.8，且在pH10.0反应时，酶的相对活力保持在70％以上，说明其在中性及碱性条件下活性较高；该酶在pH5.0-10.0下保温24h，仍具有80％以上的酶活力，说明其具有较宽的pH酶解范围；测定高盐浓度对酶活力影响时发现，重组阿魏酸酯酶在3M KCl和5M NaCl的溶液中分别保育96h和120h，酶活力维持在50％以上，说明其具有明显的盐耐受性。对重组阿魏酸酯酶的酶活力有明显提高作用；1mM/5mM Mg²⁺和Fe³⁺对该重组阿魏酸酯酶的酶活力均有不同程度的提高作用，然而Cu2+则对该酶的酶活性具有明显的抑制作用；该重组阿魏酸酯酶对对硝基苯酚阿魏酸酯的比酶活为21.7±1.7U/mg，对阿魏酸甲酯、对香豆酸甲酯和芥子酸甲酯的比酶活分别为7.3±1.1U/mg、2.5±0.4U/mg、10.2±2.1U/mg，然而对咖啡酸甲酯无作用，推测该重组蛋白属于A型阿魏酸酯酶。

(3)在对所述重组阿魏酸酯酶对植物细胞壁(DSWB)的降解的研究中发现，重组阿魏酸酯酶需要在木聚糖酶的协同作用下，在40℃下对去淀粉麦麸作用10h，可以释放其中约16％的阿魏酸，在降解和利用木质纤维素中具有应用空间。

附图说明

图1是本发明实施例1中的SDS-PAGE的电泳图。

图2为对硝基苯酚标准曲线。

图3为重组蛋白降解底物对硝基苯酚阿魏酸酯的最适温度和热稳定性结果折线图。

图4为重组蛋白降解底物对硝基苯酚阿魏酸酯的最适pH和pH稳定性结构折线图。

图5为重组蛋白降解底物耐盐性的结构折线图。

图6为重组蛋白从DSWB中释放阿魏酸酯酶的HPLC分析结果。

其中，图1中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；

图3中，图a为最适温度折线图，图b为热稳定性折线图；

图4中，1为最适pH折线图，2为pH稳定性折线图；

图5中，1为5M NaCl对重组蛋白影响折线图，2为3M KCl对重组蛋白影响折线图；

图6中，图a为标准阿魏酸分析图谱，图b为单独使用重组阿魏酸酯酶Est27时反应液分析图谱，图c为重组阿魏酸酯酶Est27与木聚糖酶的协同作用下的反应液分析图谱。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达

1、总DNA的提取

称取6g样品，加入13.5ml DNA提取缓冲液(0.1M Tris，0.1M EDTA-Na，0.1M Na₃PO₄，1.5M NaCl，1％CTAB，pH值8.0)，剧烈振荡3-5min，加入200μL溶菌酶(100mg/ml)，反复颠倒5-6次，37℃水浴30min，加入1.5ml20％SDS，65℃水浴1h(期间每隔15min上下颠倒几次)，8000r/min离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，16000r/min离心10min，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h，20000r/min离心20min，弃上清，沉淀加5mL预冷的70％乙醇，20000r/min离心10min，收集DNA沉淀，风干，用适量TE缓冲液溶解。

2、试剂盒法纯化DNA：按照胶回试剂盒说明书进行。

3、宏基因组电泳检测：用1％琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量。

4、酶切总DNA：用限制性内切酶Sau3AI部分酶切总DNA，回收2-10kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。

5、酶切片段的电泳检测：方法同宏基因组电泳检测。

6、酶切片段的链接：将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI(BAP)载体连接过夜，向连接产物中加入0.6倍体积的异丙醇，室温沉淀1.5h，14000r/min离心20min，弃上清并向沉淀中加入70％无水乙醇洗涤2次，风干并加入适量ddH₂O重溶。

7、连接产物的转化：吸取5μl的连接产物加入到100μl的大肠杆菌DH5α高效感受态中，2500V/cm(Eppdorf 2510电击仪)电击1次，46℃热激6min，37℃，180rpm摇床培养45-60min，吸取30～40μl涂布于LB琼脂平板，37℃培养过夜。根据平板上菌落数目将剩余的转化产物涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)和X-gal(24μg/ml)的LB平板。由此构建了一个库容量约50000个转化子、多样性好的宏基因组文库。

8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定

将文库中所有的白板单菌落点种至两个含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)的LB固体培养基中，37℃培养48h，选择其中一块平板倒入0.4％含阿魏酸甲酯(1.92mg/ml)和酚红(0.456mM)的上层培养基，37℃放置30min后观察平板。能够产生明显的黄色透明圈的即为阳性克隆。通过筛选得到1株阳性克隆子。

从相应的平板中将阳性克隆子挑出并接种至10mL含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，取2mL菌体进行质粒提取，对插入片段测序，将测定的序列经过NCBI的BLASTn软件分析比较，发现该DNA由843个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA编码的多肽，含281个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，将其命名为Est27。其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的对照图。

9、基因片段的克隆

根据测序结果设计一对引物：est27-F和est27-R，引物两端引入能插入pET-28a(+)载体的HindIII和BamHI酶切位点，引物序列如下：

est27-F：3’CGCGGATCCATGACCCCCGAATTGCGCGCCAAG5’(下划线为引入的BamHI酶切位点)

est27-R：3’CCCAAGCTTCTACCGCGTCACCCTGCGCACAAAC5’(下划线为引入的HindIII酶切位点)

以质粒pUC118-est27为模板，进行PCR反应，体系如下：

质粒pUC118-est27模板	5ng
		5×Buffer	1μl
dNTP(2.5mM)	4μl
		est27-F(20μM)	1μl
est27-R(20μM)	1μl
		PrimerSTAR(2.5U/μl)	0.5μl
	补充水至50μl

PCR反应条件如下：第一阶段：94℃预变性3min；第二阶段：94℃变性30sec，65℃退火45sec，72℃延伸1min，共30个循环；第三阶段：72℃延伸10min；最后于4℃保存。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamHI、HindIII于37℃双酶切24h，与用BamHI、HindIII双酶切的pET-28a(+)(Invitrogen)表达载体进行连接，取5μl重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化液涂布含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

10、重组阿魏酸酯酶Est27粗酶液的获得及分子量检测

将重组工程菌划线至含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，按1∶100的接种量转接至50mL的含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，当生长至OD₆₀₀＝1.0时加入IPTG至终浓度1mM，37℃、200r/min摇床培养6小时(OD₆₀₀＝3.0)，14000r/min离心5min，弃上清，将菌体重悬于50ml，0.05M的Tris-HCl(pH＝6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞，4℃，14000r/min离心20min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTA Agerose(QIAGEN)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按QIAGEN公司产品说明书进行。

将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10％)将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝R-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，SEQ ID NO.1所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白Est27的分子量约为35kDa(其中含4kDa融合标签)(如附图1所示)。

实施例2重组阿魏酸酯酶Est27酶活测定

1、酶活的测定

本发明使用对硝基苯酚阿魏酸酯为底物来检测阿魏酸酯酶的酶活性。反应体系为500μl，其组成为50μl的10mM的对硝基苯酚阿魏酸酯储存液(溶于DMSO)，440μl含有2.5％(v/v)Triton X-100的0.1mM的磷酸钾缓冲液(pH6.8)和10μl酶溶液。该反应体系在40℃下反应5min，随后于405nm波长处测定该过程中释放的对硝基苯酚的吸光度，同时做不加酶液的空白对照。根据对硝基苯酚的标准曲线确定其浓度。酶活单位定义为：在反应条件下，每分钟催化1μmol对硝基苯酚阿魏酸酯所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。

上述公式中，X为405nm处光吸收值；5为反应时间5min；2.5为稀释倍数；0.6为将10μl稀释酶液(其中含0.0006mg)中的酶活力折算为1mg的酶活性

2、对硝基苯酚标准曲线的绘制

称取55.6mg对硝基苯酚(ρ-nitrophenyl，ρNP)，溶于0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)，定容于100ml，配成4mM ρNP母液。按表1配制ρNP标准液。分别加入不同量的ρNP和0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)，总体积5ml，测定其在OD₄₀₅的光吸收值。以吸光值OD₄₀₅为横坐标，ρNP的含量为纵坐标绘制标准曲线图(如附图2)。

表1对硝基苯酚(ρNP)标准液

Table 1 Standard of ρNP

编号	1	2	3	4	5	6	7
								4mM ρNP母液(μl)	62.5	125	187.5	250	312.5	375	500
0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.8)(μl)	4937.5	4875	4812.5	4750	4687.5	4625	1500
								体系中ρNP含量(nmol)	10	20	30	40	50	60	80

实施例3重组阿魏酸酯酶Est27的酶学性质研究

1、重组阿魏酸酯酶Est27最适反应温度及热稳定性

将重组魏酸酯酶Est27的粗酶液在30-65℃下进行酶促反应后，按上述方法测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100％)。在100mM磷酸缓冲液(pH6.8)，将阿魏酸酯酶Est27酶液分别置于不同温度(40～60℃)下孵育，每隔一段时间取出酶液并测定残余酶活，以处理0min的酶液酶活力为100％。检测结果如附图3所示，重组蛋白Est27的最适反应温度为40℃。该酶在40℃下保持稳定，并在45℃下的半衰期为72h，在50℃下的半衰期为7h。然而，重组蛋白Est27在55℃下保育10min即丧失70％以上的酶活力。可见Est27仅在50℃以下具有良好的稳定性。

2、重组阿魏酸酯酶Est27最适反应pH及pH稳定性

以对硝基苯酚阿魏酸酯为底物，在最适温度下检测不同pH值(pH 3～11)条件下检测阿魏酸酯酶Est27的最适反应pH。取等量的酶液，分别在不同pH值的缓冲液(pH 3～11)中40℃静置24h，确定阿魏酸酯酶Est27的pH稳定性。以酶活力最高者为100％，计算相对酶活。结果如附图4所示，重组蛋白Est27的最适反应pH为6.8。经过在各pH值的缓冲液中放置24h后，重组蛋白Est27在pH 5.0～10.0下可以保持80％以上的酶活力，表现出广泛的pH稳定性。

3、金属离子对重组阿魏酸酯酶Est27活性的影响

在酶促反应中加入不同的金属离子，研究其对重组阿魏酸酯酶Est27活性的影响，以未加离子的稀释酶液作为对照。结果见表2。

在金属离子浓度为1mM下，Mg²⁺和Fe³⁺能够提高重组蛋白Est27酶活力至122±4.3％和123±2.8％；Ca²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Al³⁺对酶活性影响不明显；Zn²⁺对的作用使该重组蛋白的酶活力降低至76±4.2％，Cu²+对重组蛋白Est27具有严重的抑制作用。随着浓度提高至10mM时，Mg²⁺对该酶的酶活性影响不明显；Ca²⁺’Co²⁺，Mn²⁺，A^l3+，Fe³⁺的添加抑制重组蛋白Est27的酶活力，Cu²⁺则使重组蛋白Est27完全失活。

4、高盐浓度对重组阿魏酸酯酶Est27活性的影响

重组阿魏酸酯酶Est27在40℃下的高盐溶液(3M KCl和5M NaCl)中静置，每隔一段时间取出酶液并测定残余酶活，以未保存于高盐溶液的酶液的酶活力为100％。如附图5所示，重组蛋白Est27在3M KCl溶液中放置96h仍然可以保持50％以上的酶活力；该酶在5M NaCl溶液中放置120h仍然可以保持50％以上的酶活力。以上结果表明重组蛋白Est27具有显著的耐盐性。

表2不同金属离子对重组蛋白Est27酶活性的影响

Table 2 Effect of various metal ions on relative activity of recombinant Est27

实施例3重组阿魏酸酯酶Est27对DSWB的水解测定

1、DSWB的制备

95℃下，将5g麦麸在100ml的0.25％(w/v)醋酸钾溶液中孵育10min。加热处理后，反复用去离子水冲洗经过处理的麦麸。干燥后，使用搅碎机将其磨碎并过100目筛，收集所得的DSWB以备使用。

2、HPLC分析

色谱条件如下：

HPLC条件
		色谱柱	DiamonsilTM C18 column(250mm×4.6mm，5μm)
流动相	acetonitrile：phosphate buffer(100mM，pH 3.0)(60∶40，v/v)
		流速	1.0ml/min
柱温	室温
		检测波长	320nm
进样量	20μl

3、DSWB中阿魏酸含量的确定

采用碱法从DSWB中提取阿魏酸。在100℃下，将10mg DSWB在2ml的1M氢氧化钠溶液中处理2h。室温下，16,000g离心5min，取上清。经过HPLC分析确定该DSWB中阿魏酸的含量为0.51％(w/w)。

4、重组蛋白Est27释放阿魏酸

通过3组实验检测重组蛋白Est27释放阿魏酸的情况(如表3)。反应液置于40℃下震荡10h，并煮沸5min终止反应，经过薄层层析(TLC)初步确定水解状况。通过HPLC分析确定反应液中阿魏酸的含量(如图6)。计算可知其中所含阿魏酸的浓度为16.3±0.9μg/ml。结果说明在木聚糖酶的共同作用下经过10h，重组蛋白Est27可以从20mg DSWB中释放16.3±0.9μg阿魏酸，占阿魏酸总量的16％。

表3检测重组蛋白Est27从DSWB中释放阿魏酸的实验体系

Table 3 The experiments of release of ferulic acid by Est27 from DSWB

体系	1	2	3
				DSWB	20mg	20mg	20mg
Est27(21.7±1.7U/mg)	10U	10U	等量的灭活Est27
				木聚糖酶(疏棉状嗜热丝孢菌，2500U/g)	-	10U	10U
100Mm磷酸钾缓冲液(pH6.8)	1ml	1ml	1ml

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种新型阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

2.如权利要求1所述新型阿魏酸酯酶的DNA，其特征在于，所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种如权利要求1所述新型阿魏酸酯酶的宏基因组学克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：提取海底泥样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经Sau3AI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过点平板和滴加底物显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。

4.一种含有如权利要求2所述新型阿魏酸酯酶的DNA的表达载体。

5.一种重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组阿魏酸酯酶。

6.如权利要求5所述的重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述的寄主细胞为大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用权利要求4所述的表达载体的目的片段经BamHI、HindIII双酶切，与pET-28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。

8.如权利要求7所述的重组阿魏酸酯酶的制备方法，其特征在于，所述的IPTG终浓度为0.05～0.6mM，诱导温度为18～37℃。

9.一种采用如权利要求5所述方法得到的重组阿魏酸酯酶。

10.如权利要求9所述重组阿魏酸酯酶在降解植物细胞壁中的应用。

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