CN102732539B - 一种新型酯酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。还公开了含上述新型酯酶基因的表达载体、重组酯酶及该重组酯酶在降解高丝氨酸内酯信号分子的应用。该新型酯酶在大肠杆菌表达体系中高效可溶性表达，具有较好的热稳定性，且对高丝氨酸内酯信号分子有强降解作用。

Description

一种新型酯酶及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新型酯酶及其应用。

背景技术

酯酶（EC3.1.1.1）是指能够催化水解酯键的一类重要生物酶，广泛应用于食品工业、医药行业、日用化工业和生物防护等领域，在群体感应猝灭方面具有广阔的应用前景。

近年来研究发现，许多人和动植物的致病菌致病过程与群体感应密切相关，它们具有的群体感应系统不仅在致病菌侵染宿主定殖过程的早期发挥关键调节作用，而且能调控致病菌毒力基因的表达，此外，病原菌具有通过群体感应系统对抗宿主的免疫防御系统和药物作用的能力。因此，通过破坏致病菌的群体感应系统是一种新的抗感染策略，达到防治病原菌发病的目的。目前，实现群体感应淬灭主要有三种策略：一是通过底物类似物破坏信号分子（的合成；二是通过群体感应淬灭酶（如AHLs-内酯酶，PONs和AHLs-酰胺酶）直接降解致病菌产生的信号分子（如AHLs）；三是合成信号分子的类似物与受体蛋白竞争结合（如砒硌类化合物）。N-酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactones，缩写AHLs）是革兰氏阴性细菌群体感应系统中最典型的一类信号分子，常见的AHLs如C4-HSL,C6-HSL,C8-HSL,C10-HSL,C12-HSL和3OC8-HSL。生物酶猝灭法是一种高效、环保的有效措施，其中AHLs-内酯酶与AHLs-酰胺酶相比，具有更广的降解谱。大量的研究结果表明AHLs-内酯酶作为一种新型抗菌策略的工具酶具有巨大的应用潜力。

传统获得酯酶的方法是从土壤中进行多轮筛选，获得产酯酶的菌株，再进行培养优化等，获得理想菌株。这种方法有一定的局限性，来源非常有限，生产成本高，酶制剂价格昂贵，或者达不到工业运用的规模。随着基因工程和分子生物学的发展，获得酯酶的另一个途径即是宏基因组方法。它以特定生态环境中微生物群体基因组的总和作为研究对象，以功能基因筛选和测序分析为研究手段，通过宏基因组文库的构建及基因克隆、异源表达等基本研究策略，筛选出有用的新基因及其产物。该方法充分利用了环境中蕴藏的大量宝贵基因资源，在挖掘和利用未培养微生物资源和筛选新颖生物活性物质方面表现出巨大的潜力，为生命科学提供了强有力的新方法，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、酯酶等新基因，这些酶具有新颖的酶学特性及工业应用潜力。到目前为止，国内外尚未有利用宏基因组技术从吐鲁番土样中发现新型耐热酯酶的研究报道。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种新型酯酶的基因Est112。

本发明的第二个目的在于提供上述新型酯酶的宏基因组学克隆方法。

本发明的第三个目的在于提供含有上述新型酯酶基因的表达载体。

本发明的第四个目的在于提供利用上述表达载体构建的重组酯酶及其制备方法。

本发明的最后一个目的在于提供上述重组酯酶在降解信号分子AHLs方面的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种新型酯酶的基因Est112，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中的新型酯酶的基因可以为如下(1)或(2)或(3)所示DNA分子：

(1)其核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示DNA分子；

(2)在严格条件下（1）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有85%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

本发明中的新型酯酶蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中的新型酯酶的蛋白可以是如下(a)或者(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有85%以上的同源性且编码所述蛋白并具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性衍生蛋白质。

本发明的第二个目的是通过如下技术方法来实现的：一种新型酯酶的宏基因组学克隆方法，其特征是：提取吐鲁番土壤样品的总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切，连接pUC118载体，电击转化大肠杆菌DH5α高效感受态建立宏基因组文库，通过原创平板显色法快速筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中的引物，从而克隆到目的片段。

实际上，扩增上述任一所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

上述引物对中，所述引物的一条引物序列如SEQ ID NO：4所示，另一条引物序列如SEQ IDNO：5所示。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：一种新型酯酶表达载体，是含有上述新型酯酶基因Est112的表达载体pET-28a(+)-Est112。

本发明所述新型酯酶表达载体为在载体pET-28a（+）的多克隆位点插入SEQ ID NO：1所述编码基因得到的重组表达载体。

本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的：一种重组酯酶的制备方法，包括用上述的新型酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。

在重组酯酶的制备方法中，所述的寄主细胞优选为大肠杆菌。

上述重组酯酶的制备方法，其具体过程为：包括上述新型酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达的重组酯酶。

在重组酯酶的制备方法中，所述的IPTG终浓度优选为0.1~1.5mM，诱导温度优选为18～37℃。

本发明提供的重组酯酶，包括用上述新型酯酶表达载体转化的寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶的步骤的方法制备。

即本发明中的重组制备是通过将新型酯酶表达载体导入大肠杆菌得到的，新型酯酶表达载体为在表达载体pET-28a（+）的多克隆位点插入新型酯酶基因Est112得到的新型酯酶表达载体。

也就是说，含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于本发明的保护范围。

本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：上述重组酯酶在降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯AHLs方面的应用。

本发明中所述的N-酰基高丝氨酸内酯AHLs包括C4-HSL,C6-HSL,C8-HSL,C10-HSL,C12-HSL或3OC8-HSL中的一种或它们的混合物。

在上述重组酯酶在降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯AHLs方面的应用中，降解温度优选为0~65℃，尤其是降解温度在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃或60℃时，降解效果更好；降解时的pH优选为4.~9.5，当pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，降解效果更好。

本发明中的重组酯酶，其耐热性好，可以作为生防酶制剂的活性组分，用于降解N-酰基高丝氨酸内酯酶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

①.本发明以吐鲁番土壤为样品构建宏基因组文库，利用功能筛选方法，从中克隆到一个新的酯酶DNA序列；

②.本发明通过基因工程技术对酯酶基因的功能研究，发现该序列在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，初步确定分子量约为35.9kDa；

③.本发明将SEQ ID NO.1所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：

(1)在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达；

(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为60℃，在温度低于50℃非常稳定，50℃保温12h后，剩余相对酶活性为91.9%，表明该酶具有热稳定；最适反应pH为7.5，在pH 5.0~9.0下处理24h，酶的相对活力保持在80%以上，说明其有较好的酸碱耐受性；

④.本发明通过测定重组酯酶的酶学性质时发现重组酯酶对信号分子C₄-HSL,C₆-HSL,C₈-HSL,C₁₀-HSL,C₁₂-HSL和3OC₈-HSL有强降解作用，高效液相色谱分析表明重组酯酶可完全降解C₈-HSL,C₁₀-HSL和C₁₂-HSL，对C₆-HSL和3OC₈-HSL的降解率高达90%以上，对C4-HSL的降解率为64.7%。因此，该酶在去除群体感性信号分子（高丝氨酸内酯）方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中的SDS-PAGE电泳图；

其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白；

图2为实施例2中以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酶的最适温度（A）和热稳定性（B）结果的折线图；

图3为实施例2中以对硝基苯酚乙酸酯为底物重组酶的最适pH（△）和pH稳定性（▲）结果的折线图；

图4为实施例3中重组酶对底物不同降解结果的高效液相色谱图，其中A、B、C、D、E和F分别为重组酶对C₄-HSL,C₆-HSL,C₈-HSL,C₁₀-HSL,C₁₂-HSL和3OC₈-HSL的降解结果，箭头所示为底物降解前后的吸收峰。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达

1、总DNA的提取：

称取吐鲁番土壤样品10g，加入13.5mL DNA提取缓冲液(0.1M Tris，0.1M EDTA-Na，0.1MNa₃PO₄，1.5M NaCl，1%CTAB，pH值8.0)，剧烈振荡5min，加入1.5ml 20%SDS，65℃水浴2h，5000rpm离心5min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，16000rpm离心10min，取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置2h，16000rpm离心20min，弃上清，沉淀加10mL预冷的70%乙醇，16000rpm离心10min，收集DNA沉淀，风干，用适量超纯水溶解。

2、试剂盒法纯化DNA：按照胶回收试剂盒说明书进行。

3、宏基因组电泳检测：用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量。

4、酶切总DNA：用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收3-10kb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。

5、酶切片段的电泳检测：方法同宏基因组电泳检测。

6、酶切片段的连接与纯化：将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI(BAP)载体连接过夜；按照微量回收试剂盒说明书对连接产物进行纯化。

7、连接产物的转化：

向100μL的大肠杆菌DH5α高效感受态中加入5μL连接产物，2500V/cm (Eppdorf2510电击仪)电击1次，46℃热激6min，37℃，200rpm摇床培养1h，吸取适量培养物涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)、IPTG(1mM)和X-gal(24μg/ml)的LB琼脂平板，37℃培养过夜。由此构建了一个库容量约26,000个转化子的宏基因组文库。

8、文库筛选和阳性克隆子的鉴定

将文库中所有的白板单菌落点种至含50μg/mL氨苄青霉素、0.5mM IPTG、100μMX-caprylate的LB筛选培养基中，37℃培养48h后观察平板，能够产生明显的蓝色水解圈的即为阳性克隆。

将阳性克隆子挑出并接种至10mL含氨苄青霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜，取2mL菌体提取质粒pUC118-A，并对插入片段进行测序。利用NCBI的BLASTn软件分析比较目的序列，发现该DNA由816个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA编码的多肽，含271个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，将其命名为Est112，其中SEQ ID NO.2为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3的对照图。

9、基因片段的克隆

根据测序结果设计一对引物est112-F和est112-R，引物两端引入能插入pET-28a(+)载体的BamHI和EcoRI酶切位点，引物est112-F的序列如SEQ ID NO.4和引物est112-R的序列如SEQ IDNO.5所示。

est112-F:5’-CGCGGATCCATGCCGCATGTAGAGAACGA-3’(下划线为引入的BamHI酶切位点)

est112-R:5’-CCGGAATTCTCAGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3’(下划线为引入的EcoRI酶切位点)

以质粒pUC118-A为模板，进行PCR反应，体系如下：

PCR反应条件如下：第一阶段：94℃预变性3min；第二阶段：94℃变性30sec，65℃退火15sec，72℃延伸1min，共30个循环；第三阶段：72℃延伸10min；最后于4℃保存。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamHI和EcoRI于37℃双酶切8h，与用BamHI和EcoRI双酶切的pET-28a(+)表达载体进行连接，取5μL连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化液涂布含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

10、重组酯酶Est112粗酶液的获得及分子量检测

将重组工程菌划线至含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，按1:100的接种量转接至50mL的含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，当菌体密度OD₆₀₀=1.1时加入IPTG至终浓度0.5mM，30℃、220rpm摇床培养8h。14000rpm离心5min，弃上清，将菌体重悬于50mL，0.05M的Tris-HCl(pH=6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞。4℃，14000rpm离心10min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTA Agerose(QIAGEN)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按QIAGEN公司产品说明书进行。

将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10%)将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝G-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，SEQ ID NO.2所述核苷酸序列所编码的多肽在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白的分子量约为35.9kDa(其中含4kDa融合标签)(如附图1所示)。

实施例2重组酯酶Est112的酶学性质研究

1、重组酯酶最适反应温度及热稳定性

将重组酯酶的粗酶液在30-75℃下进行酶促反应，反应体系为410μL，其组成为400μL含40μM的对硝基苯乙酸酯的磷酸钾溶液（pH7.5）和10μL酶溶液。该反应体系在60℃下反应4min，随后于405nm波长处测定该过程中释放的对硝基苯酚的吸光度，同时做不加酶液的空白对照。测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100%)。在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，将重组酯酶酶液分别置于不同40℃、45°С、50℃、55°С、60°С和65℃保温40h后，测定残余酶活，以处理0min酶液的酶活力为100%。检测结果如附图2所示，重组蛋白的最适反应温度为60℃，该酶在50℃下保温12h，剩余酶活力为91.9%，表明该酯酶具有良好的稳定性。

2、重组酯酶最适反应pH及pH稳定性

以对硝基苯酚乙酸酯为底物，在最适温度下检测不同pH值(pH 5.0～9.0)条件下检测重组酯酶的最适反应pH。取等量的酶液，分别在不同pH值的缓冲液(pH 5.0～9.0)中30℃静置24h，确定重组酯酶的pH稳定性。以酶活力最高者为100%，计算相对酶活。结果如附图3所示，重组蛋白的最适反应pH为7.5。经过在各pH值的缓冲液中放置24h后，重组蛋白在pH 5.0～9.0下可以保持80%以上的酶活力，表现出较好的pH稳定性。

实施例3重组酯酶Est112对AHLs的降解能力测定

1、反应体系

将1μmol的C₄-HSL,C₆-HSL,C₈-HSL,C₁₀-HSL,C₁₂-HSL和3OC₈-HSL溶于50μL的甲醇中，并加入950μL的50mM的磷酸钾缓冲液，即配制成1mM的AHLs底物溶液，31μg的重组酶粉与1ml 1mM底物混合，30°С反应30min后进行HPLC检测，同时灭火酶粉作为空白对照。

2、HPLC分析

色谱条件如下：

经HPLC检测分析，重组酯酶对C₄-HSL,C₆-HSL,C₈-HSL,C₁₀-HSL,C₁₂-HSL和3OC₈-HSL的降解率分别达到64.7%、96.2%、100%、100%、100%和94.3%，表明其具有广泛的底物特异性和较高的AHLs降解能力（降解图谱如4所示）。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种酯酶基因Est112，其特征是：它的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。

2.一种酯酶蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

3.一种酯酶表达载体，其特征是：含有权利要求1中所述的酯酶基因Est112的表达载体pET-28a(+)-Est112。

4.一种重组酯酶的制备方法，其特征是：包括用权利要求3所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。

5.根据权利要求4所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：所述的寄主细胞为大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：其具体过程为：包括用权利要求3所述的酯酶表达载体转化至寄主细胞大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到可溶性表达的重组酯酶。

7.根据权利要求6所述的重组酯酶的制备方法，其特征是：所述的IPTG终浓度为 0.1~1.5 mM，诱导温度为18～37℃。

8.一种重组酯酶，其特征是：包括用权利要求3所述的酯酶表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酶的步骤的方法制备。

9. 权利要求8所述的重组酯酶在制备生防酶制剂中的应用，其特征是：作为生防酶制剂的活性组分，用于降解信号分子N-酰基高丝氨酸内酯AHLs。

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