CN107058362A - 酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用 - Google Patents

酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。具体涉及酯酶基因est816的异源表达及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。本发明分别通过大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系构建了重组酯酶Est816，该酶在两种表达体系中高效可溶性表达，具有较好的热稳定性和酸碱耐受性；且对常用的拟除虫菊酯类农药（如氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等）有强降解作用，降解率高达90%以上，因此在去除拟除虫菊酯类农药残留方面有广阔的应用前景。

Description

酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面 的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及酯酶基因est816的异源表达及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
背景技术
目前，拟除虫菊酯类农药在农林卫病害的防治中发挥着巨大作用，其使用量在农药市场中位居第二位，且仍在持续增长。通过呼吸道和皮肤吸收可引起中毒，对人体健康造成一定的影响。而且，随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，因拟除虫菊酯大量、频繁和不规范的使用所引发的环境和食品污染问题越来越受到人们关注。因此，在自然分解能力无法满足人类安全需求的形势下，寻找高效降解农药的新方法，降低农药的毒负作用已成为一个重要研究领域。
生物法，尤其是生物酶，在处理农药残留问题上具有处理简便、安全高效、应用范围广且无二次污染等优点，日益受到重视。
到目前为止，有关拟除虫菊酯降解酶的报道较少，因此，研究探索具有优良性能的生物催化剂拟除虫菊酯降解酶，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有拟除虫菊酯残留生物处理法的技术缺陷及其降解酶的不足，提供酯酶est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
本发明另一目的是提供一种含有酯酶基因est816的重组菌，以及利用该重组菌构建的重组酯酶及其制备方法。
本发明的再一目的是提供一种含有上述酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系，以及利用该毕赤酵母重组菌构建的重组酯酶及其制备方法。
本发明的再一目的是提供上述重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了酯酶基因est816在制备拟除虫菊酯类农药降解酶方面的应用。
本发明还提供了酯酶Est816在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，所述酯酶Est816由酯酶基因est816表达或重组表达得到。
所述酯酶基因est816的序列见GenBank：JQ996501.1。
本发明还提供了一种含有酯酶基因est816的表达载体。利用该表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组酯酶。所述寄主细胞为大肠杆菌或毕赤酵母。
本发明还提供一种含有酯酶基因est816的大肠杆菌重组菌。
优选地，所述含有酯酶基因est816的大肠杆菌重组菌，是将表达载体pET-28a(+)和酯酶基因est816分别经BamHI和EcoRI双酶切后连接，并转化至E.coli BL21(DE3)，获得的重组菌。
更优选地，所述含有酯酶基因est816的大肠杆菌重组菌的构建方法如下：
S1.利用引物est816-fw和引物est816-rv，PCR扩增基因est816的目的片段；
est816-fw序列：5’-CGCGGATCCATGCCGCATGTAGAGAACGA-3’
est816-rv序列：5’-CCGGAATTCTCAGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3’
S2.将目的片段和pET-28a(+)表达载体分别用BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物进行连接，得重组质粒pET-28a(+)-est816；重组质粒转化转化E.coli BL21(DE3)，得阳性重组菌pET-28a(+)-est816-E.coli BL21(DE3)。
其中，优选地，步骤S1所述PCR扩增的体系如下：质粒模板5ng、5×PrimeSTARBuffer 10μl、dNTP(2.5mM)4μl、est816-fw(10μM)1μl、est816-rv(10μM)1μl、PrimerSTAR(2.5U/μl)1μl、水补充至50μl。
优选地，步骤S1所述PCR扩增的条件如下：第一阶段：98℃预变性3min；第二阶段：98℃变性10sec，64℃退火15sec，72℃延伸1min，共30个循环；第三阶段：72℃延伸10min。
优选地，步骤S2所述双酶切的条件为：28～32℃双酶切6～10h。
更优选地，步骤S2所述双酶切的条件为：30℃双酶切8h。本发明还提供一种含有酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系。
优选地，所述含有酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系，即含有酯酶基因est816的毕赤酵母重组菌，是将穿梭载体pPICZα B和目的片段分别经EcoRI和KpnI双酶切后连接，并转化至E.coli DH5α，获得重组载体pPICZα B-est816，然后转化至毕赤酵母X-33(Pichiapastoris X-33)，获得的重组菌。
更优选地，所述含有酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系(即含有酯酶基因est816的毕赤酵母重组菌)的构建方法如下：
S1.利用引物EcoRIfw和引物KpnIrv，PCR扩增基因est816的目的片段；
EcoRIfw的序列：5’-CCGGAATTCATGCCGCATGTAGAGAACGA-3’；
KpnIrv的序列：5’-CGGGGTACCGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3’。
S2.将目的片段和pPICZα B载体分别用EcoRI和KpnI双酶切，酶切产物进行连接，得重组质粒pPICZα B-est816；重组质粒转化转化E.coli DH5α，得阳性重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α；
S3.以重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α提取重组质粒pPICZα B-est816，然后用内切酶SacI进行单酶切线性化处理，得到pPICZα B-est816线性化片段，然后转化毕赤酵母X-33感受态细胞，得重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α(毕赤酵母X-33)。
其中，优选地，步骤S1所述PCR扩增的体系如下：质粒模板5ng、5×PrimeSTARBuffer 10μl、dNTP(2.5mM)4μl、EcoRIfw(10μM)1μl、KpnIrv(10μM)1μl、PrimerSTAR(2.5U/μl)1μl、水补充至50μl。
优选地，步骤S1所述PCR扩增的条件如下：第一阶段：98℃预变性3min；第二阶段：98℃变性10sec，64℃退火15sec，72℃延伸1min，共30个循环；第三阶段：72℃延伸10min。
优选地，步骤S2所述双酶切的条件为：28～32℃双酶切6～10h。
更优选地，步骤S2所述双酶切的条件为：30℃双酶切8h。
优选地，步骤S3所述单酶切的体系如下：质粒200ng、10×L Buffer 5μl、SacI(10U/μl)2μl、水补充至50μl。
优选地，步骤S3所述转化毕赤酵母X-33感受态细胞的具体方法如下：
取pPICZα B-est816线性化片段与毕赤酵母X-33感受态细胞混合(线性化片段与感受态细胞的质量体积比为5-10μg/100μl)(体积不超过10μl)，在1500V电压下进行电击(时间为5ms左右)，立即向电击杯中加入1ml冰冷的1M山梨醇溶液，然后将培养物转移至10ml离心管中，并在30℃恒温培养箱中静置1-2h；将上述培养物涂布于YPDS固体平板(含200μg/mlZeocinTM)，置于30℃恒温培养箱中培养2-3d。
本发明还提供了一种能够降解拟除虫菊酯类农药的重组酯酶，由酯酶基因est816表达或重组表达得到。
具体是由上述大肠杆菌重组菌或上述毕赤酵母表达体系重组表达得到。
更具体优选地，所述能够降解拟除虫菊酯类农药的重组酯酶，是由上述大肠杆菌重组菌经IPTG诱导后，高效可溶性表达得到；所述IPTG的终浓度为10～1000μM，IPTG诱导温度为18～37℃；或所述重组酯酶是由上述毕赤酵母表达体系经甲醇诱导后，高效分泌性表达得到；所述甲醇的终浓度为0.1％～1％(优选0.5％)，甲醇诱导温度为20～30℃(优选25～30℃)。
本发明制备的重组酯酶不仅具有很好的降解拟除虫菊酯类农药的活性，而且稳定性好，可以作为生防酶制剂的活性组分，用于降解拟除虫菊酯类农药。
因此，本发明制备的重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
本发明制备的重组酯酶在制备拟除虫菊酯类农药的降解制剂方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
优选地，所述拟除虫菊酯类农药包括氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯中的一种或几种的混合物。
在应用本发明的酯酶Est816降解拟除虫菊酯类农药时，降解温度优选0～65℃，尤其是降解温度在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃时，降解效果更好；降解时的pH优选为4.0～9.5，当pH为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0时，降解效果更好。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，并将酯酶基因est816进行异源表达，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下：
(1)在大肠杆菌表达体系和毕赤酵母表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。
(2)用对硝基苯酚乙酸酯为底物，测得重组蛋白的最适反应温度为60℃，在温度低于45℃非常稳定，45℃保温24h后，保留80％的相对酶活性；最适反应pH为7.5，在pH5.0-9.0下处理24h，剩余酶活性均大于80％，说明其具有较好的酸碱耐受性。
2、本发明通过测定其酶学性质时发现，本发明构建的重组酯酶对拟除虫菊酯类农药(包括氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯)有强降解作用。气相色谱分析表明，重组酯酶对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯降解率高达90％以上，因此在去除拟除虫菊酯类农药残留方面有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中重组蛋白Est816的SDS-PAGE电泳图；其中，M为标准蛋白分子量maker，1为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白。
图2为实施例2中重组表达菌株表达结果的SDS-PAGE电泳图；其中，M为标准蛋白分子量maker；泳道1-7：重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α(毕赤酵母X-33)第1-7天发酵上清液；泳道8：毕赤酵母X-33(pPICZα B)第7天发酵液上清；泳道9：pET-28a(+)-est816-E.coli BL21(DE3)细胞裂解液(箭头所示为目的蛋白)。
图3为以对硝基苯酚乙酸酯为底物测定重组酯酶的最适温度结果的折线图(温度对重组酯酶Est816活性的影响)。
图4为以对硝基苯酚乙酸酯为底物测定重组酯酶的热稳定性结果的折线图(重组酯酶Est816的温度稳定性)。
图5为以对硝基苯酚乙酸酯为底物测定重组酯酶的最适pH和pH稳定性结果的折线图(pH对重组酯酶Est816活性和稳定性的影响)。
图6为大肠杆菌体系表达的重组酯酶Est816对底物氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等拟除虫菊酯的降解结果的气相色谱图。
图7为毕赤酵母体系表达的重组酯酶Est816对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯等拟除虫菊酯的降解结果的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1酯酶基因est816的克隆与大肠杆菌表达
1、基因片段的克隆
(1)根据酯酶基因est816的基因序列设计引物如下：
est816-fw：5’-CGCATGCCGCATGTAGAGAACGA-3’(加粗并下划线部分为BamHI酶切位点)；
est816-rv：5’-CCGTCAGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3’(加粗并下划线部分为EcoRI酶切位点)。
(2)PCR扩增
以质粒pUC118-A(该质粒为以质粒pUC118为基础克隆入est816基因序列所得)为模板、est816-fw和est816-rv为引物，对est816基因进行PCR扩增，体系如下：
PCR反应条件如下：
第一阶段：98℃预变性3min；
第二阶段：98℃变性10sec，64℃退火15sec，72℃延伸1min，共30个循环；
第三阶段：72℃延伸10min。
PCR扩增结束后，取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分放于-20℃保存备用。
2、构建重组菌
用胶回收试剂盒将上述PCR产物纯化并用BamHI和EcoRI于30℃双酶切8h，与用BamHI和EcoRI双酶切的pET-28a(+)表达载体进行连接(得质粒pET-28a(+)-est816)，取5μl连接产物转化E.coli BL21(DE3)，转化液涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序验证，得阳性重组菌pET-28a(+)-est816-E.coli BL21(DE3)。
3、重组酯酶粗酶液的获得及分子量检测
将重组菌划线至含卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养过夜，按1：100的接种量转接至50mL的含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，当菌体密度OD600＝0.8时加入IPTG至终浓度0.5mM，30℃、200rpm摇床培养12h。14000rpm离心5min，弃上清，将菌体重悬于50ml，0.05M的Tris-HCl(pH＝6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞。4℃，14000rpm离心10min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTA Agerose(QIAGEN)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按QIAGEN公司产品说明书进行。
将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10％)，将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝G-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。
通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，酯酶基因est816所编码的多肽在E.coli BL21(DE3)中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白的分子量约为36.0kDa(其中含5.9kDa融合标签)(如附图1所示)。
实施例2酯酶基因est816的克隆与毕赤酵母表达
1、基因片段的克隆
(1)根据酯酶基因est816的基因序列设计引物如下：
EcoRIfw：5’-CCGATGCCGCATGTAGAGAACGA-3’(加粗并下划线部分为EcoRI酶切位点)；
KpnIrv：5’-CGGGGACACCAATGAAGCTTCTCGA-3’(加粗并下划线部分为KpnI酶切位点)。
(2)PCR扩增
以质粒pET-28a(+)-est816为模板、EcoRIfw和KpnIrv为引物，进行est816片段的PCR扩增，体系如下：
PCR反应条件如下：
第一阶段：98℃预变性3min；
第二阶段：98℃变性10sec，64℃退火15sec，72℃延伸1min，共30个循环；
第三阶段：72℃延伸10min。
PCR扩增结束后，取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分放于-20℃保存备用。
2、构建重组菌pPICZα B-est816-毕赤酵母X-33
(1)重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α的构建
用胶回收试剂盒将上述PCR产物纯化并用EcoRI和KpnI于30℃双酶切8h，与用EcoRI和KpnI双酶切的pPICZα B表达载体进行连接，取5μl连接产物转化E.coli DH5α，涂布于LB固体平板(含25μg/ml ZeocinTM)，置于37℃恒温培养箱中培养过夜。随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序验证。测序正确的阳性克隆子即为重组克隆菌株pPICZα B-est816-E.coli DH5α。
(2)构建重组酵母菌
用质粒小提试剂盒(Plasmid Mini Kit)提取大量pPICZα B-est816质粒。在37℃条件下，用内切酶SacI对20μg pPICZα B-est816和pPICZα B质粒进行单酶切线性化，其酶切体系如下：
酶切过夜后，对酶切产物进行纯化和浓缩。同时对纯化后的线性化pPICZα B-est816 和pPICZα B进行定量，-20℃冰箱储存备用。
取5-10μg pPICZα B-est816和pPICZα B线性化片段(体积不超过10μl)分别与100μl毕赤酵母X-33感受态细胞混合，在1500V电压下进行电击(时间为5ms左右)，立即向电击杯中加入1ml冰冷的1M山梨醇溶液，然后将培养物转移至10ml离心管中，并在30℃恒温培养箱中静置1-2h；将上述培养物涂布于YPDS固体平板(含200μg/ml ZeocinTM)，置于30℃恒温培养箱中培养2-3d。获得重组菌pPICZα B-est816-E.coli DH5α(毕赤酵母X-33)。
3、重组酯酶粗酶液的获得及分子量检测
挑取重组菌单菌落于含50ml BMGY培养基的500ml三角瓶中，并于30℃、250rpm条件下震荡培养至菌体OD600nm＝2-6；1500g离心离心培养液5min，并加入BMMY培养基，使菌体OD600nm＝1.0；将菌液置于1L三角瓶中，用2层无菌纱布封口，于30℃、250rpm条件下继续培养；每隔24h添加100％甲醇，使其终浓度为0.5％，同时取出1ml发酵液，检测菌体密度OD600nm和发酵上清的酯酶活性，以观察目的蛋白表达情况；当酶活性趋于稳定或下降时，终止发酵；取少量发酵上清进行SDS-PAGE电泳。用1M NaOH溶液调节发酵液上清至pH为7.0，得到粗重组蛋白，4℃，14000rpm离心10min，收集上清，将粗重组蛋白用Ni-NTA Agerose(QIAGEN)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按QIAGEN公司产品说明书进行。
将获得的粗重组蛋白和纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(10％)将粗酶液中蛋白的各个组分分开，用考马斯亮蓝G-250染色，蛋白maker估计酶蛋白的大小。
通过蛋白纯化试剂盒纯化酶蛋白，SDS-PAGE电泳得到一条单一的蛋白条带。SDS-PAGE电泳结果表明，基因est816所编码的多肽在毕赤酵母中得到高效表达，且所有重组蛋白均是可溶的，无包涵体形成，初步估计重组蛋白的分子量约为30.0kDa(如附图2所示)。
实施例3重组酯酶Est816的酶学性质研究
1、重组酯酶最适反应温度及热稳定性
将重组酯酶的酶液在20-80℃下进行酶促反应，反应体系为405μl，其组成为400μl含40μM的对硝基苯乙酸酯的磷酸钾溶液(pH6.8)和5μl酶溶液。该反应体系在不同温度下反应5min，随后于405nm波长处测定该过程中释放的对硝基苯酚的吸光度，同时做不加酶液的空白对照。测定其酶活性，得到其最适反应温度(以酶活力最高时记为100％)。
检测结果如附图3所示。在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.8)，将重组AHLs-内酯酶酶液分别置于不同30℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃保温12h后，测定残余酶活，以处理0min的酶液酶活力为100％。
检测结果如附图4所示，重组蛋白的最适反应温度为60℃。在温度低于45℃非常稳定，45℃保温24h后，保留80％的相对酶活性。
2、重组酯酶最适反应pH及pH稳定性
以对硝基苯酚乙酸酯为底物，在最适温度下检测不同pH值(pH 3.4～10.0)条件下检测重组酯酶的最适反应pH。取等量的酶液，分别在不同pH值的缓冲液(pH 3.4～10.0)中30℃静置24h，确定Est816的pH稳定性。以酶活力最高者为100％，计算相对酶活。
结果如附图5所示，重组蛋白的最适反应pH为7.5，经过在各pH值的缓冲液中放置24h后，重组蛋白在在pH 5.0-9.0下pH 3.5～10.0下可以保持80％以上的酶活力，表现出较好的pH稳定性。
实施例4重组酯酶Est816对拟除虫菊酯类农药的降解能力测定
1、反应体系
(1)配置终浓度为5mg/L的氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯标准农药混合液；
(2)取3ml上述标准农药，分别加入1ml粗酶液，每种农药做5个平行，以灭活酶作为空白对照，37℃水浴反应15min；
(3)按1:2(v/v)的比例向(2)中加入正己烷，并加入4g氯化钠，在恒温摇床上以200rpm的转速振荡20min，对反应产物进行萃取；
(4)将上述溶液8,000rpm离心5min，准确吸取1μl上清液进行气相色谱分析。
2、检测条件
GC-2010气相色谱仪：ECD检测器，RestekRTX-5色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)。以60:1比例分流进样；上样量1μl；进样口温度：250℃；柱流量：2.0ml/min；恒压方式，柱前压为50kPa；载气为高纯氮气(纯度>99.999％)，流速40ml/min；柱箱程序升温：150℃，保持1min，以30℃/min的速度上升至270℃，保持10min；ECD检测器温度300℃，电流1nA；尾吹流量30ml/min。
3、标准浓度曲线的线性相关性分析
向5.0mg/L农药标准混合液中加入不同体积的正己烷，稀释成5个不同的浓度梯度(如表)。然后取1μl稀释液上机，测定每个浓度的峰面积，作出峰面积-农药标准液浓度曲线。
表1农药标准混合液的配制
4、降解率计算
经GC检测后，根据色谱峰面积计算回收农药的浓度。对照组中农药浓度为A0，实验组农药浓度为A1，则农药降解率的计算公式如下：
降解率＝(A0-A1)/A0×100％
通过降解率的高低来评价该酶对目标农药的降解能力，降解能力的强弱与降解率成正比，降解率越高，降解能力越强，反之亦然。
经GC检测分析，大肠杆菌表达的重组酯酶对氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为92.70％、94.62％、91.70％、90.60％，表明该酶对拟除虫菊酯类农药具有较好的降解效果及广谱的底物特异性(降解图谱如图6所示)。
毕赤酵母发酵的酶液对氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯和溴氰菊酯的降解率在95％以上(降解图谱如图7所示)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学
<120> 酯酶基因est816及其重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物est816-fw
<400> 1
cgcggatcca tgccgcatgt agagaacga 29
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 引物est816-rv
<400> 2
ccggaattct caggacacca atgaagcttc tcga 34
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物EcoRIfw
<400> 3
ccggaattca tgccgcatgt agagaacga 29
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物KpnIrv
<400> 4
cggggtaccg gacaccaatg aagcttctcg a 31

Claims (10)

1.酯酶基因est816在制备拟除虫菊酯类农药降解酶方面的应用。
2.酯酶Est816在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用，其特征在于，所述酯酶Est816由酯酶基因est816表达或重组表达得到。
3.一种含有酯酶基因est816的表达载体。
4.一种含有酯酶基因est816的大肠杆菌重组菌。
5. 根据权利要求4所述含有酯酶基因est816的大肠杆菌重组菌，其特征在于，是将表达载体pET-28a(+)和酯酶基因est816分别经BamHI和EcoRI双酶切后连接，并转化至E. coli BL21(DE3)，获得的重组菌。
6.一种含有酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系。
7. 根据权利要求6所述含有酯酶基因est816的毕赤酵母表达体系，其特征在于，是将穿梭载体pPICZα B和目的片段分别经EcoRI和KpnI双酶切后连接，并转化至E. coli DH5α，获得重组载体pPICZα B-est816，然后转化至毕赤酵母X-33，获得的重组菌。
8.一种能够降解拟除虫菊酯类农药的重组酯酶，其特征在于，由酯酶基因est816表达或重组表达得到。
9.根据权利要求8所述的重组酯酶，其特征在于，由权利要求4所述大肠杆菌重组菌或权利要求6所述毕赤酵母表达体系重组表达得到。
10.权利要求7～9任一所述重组酯酶在降解拟除虫菊酯类农药方面的应用。
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