CN103045562B

CN103045562B - 一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103045562B
Application number: CN201110311080.9A
Authority: CN
Inventors: 江正强; 贾会勇; 闫巧娟; 波利特; 宋爽
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2011-10-14
Filing date: 2011-10-14
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2031-10-14
Also published as: CN103045562A

Abstract

本发明公开了一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白，是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列表中序列1自N末端第24至751位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供的蛋白作为α-半乳糖苷酶具有如下酶学性质：最适pH为4.5，在pH为4-10范围内稳定；最适温度为60℃，且在55℃以内稳定，在55℃保温30min酶活几乎不变，60℃下保温30min仍残留70％的活性，表现出较好的热稳定性。本发明提供的蛋白在工业应用中具有较大潜力。

Description

一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22，α-galactosidase)又称为蜜二糖酶，属外切糖苷酶类，能够特异性水解糖链非还原末端的α-半乳糖苷键，广泛用于食品加工、饲料工业和医药等领域。在食品工业中，α-半乳糖苷酶可用于制取低α-半乳糖基寡聚糖含量的豆奶制品，有利于人体消化。在饲料工业中，添加α-半乳糖苷酶不仅可降解低聚糖，提高豆粕的代谢能，同时还可以消除肠道的胀气现象，增加动物的采食量。在医药方面，利用α-半乳糖苷酶的转移酶活性，可改造环糊精，改变药物的理化性质，增加药物的稳定性，从而延长药效。另外，α-半乳糖苷酶在临床医学上可用于治疗法布里病。α-半乳糖苷酶被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。α-半乳糖苷酶因其广泛的用途，已成为人们研究和开发的热点。

α-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。其中尤以微生物的产量高。国外从60年代即开始从微生物中筛选产α-半乳糖苷酶的研究(Akiba et al.Agricultural and biological chemistry，1976，40：1845-1849)。我国于70年代后期开始进行微生物产α-半乳糖苷酶及酶学性质的研究(刘波等，微生物学报，1979，19：225-226)。目前，国际上报道产α-半乳糖苷酶的微生物主要有曲霉属的黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、犁头霉属的分枝犁头霉(Absdia ramosa)、卷霉属的蝇卷霉(Circinella muscae)、青霉属(Penicillium sp.)的一些菌种。其中，黑曲霉和分枝犁头霉等菌种产α-半乳糖苷酶最多。丝状真菌可将它们产生的α-半乳糖苷酶分泌到胞外，且具有合适的酸碱度和良好的稳定性而有利于技术应用。

目前，国内关于热稳定α-半乳糖苷酶的研究报道还很少。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-半乳糖苷酶及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白，命名为RmgalA蛋白，来自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，是如下(a)或(b)或(c)：

(a)由序列表中序列1自N末端第24至751位氨基酸残基组成的蛋白质；

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有α-半乳糖苷酶活性的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)至4)中任一所述的DNA分子：

1)序列表的序列2自5’末端第70至2253位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对重组子进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。

所述重组表达载体具体可为如下(I)或(II)：

(I)将所述基因插入pET-30a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；

(II)将所述基因插入pPIC9K载体的多克隆位点得到的重组质粒。

所述重组菌具体可为如下(III)或(IV)：

(III)将(I)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；

(IV)将(II)所述重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母得到的重组菌。

所述大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。所述巴斯德毕赤酵母优选为GS115菌株。

扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种制备所述蛋白的方法，是培养所述重组菌，得到所述蛋白。

所述方法中，当所述重组菌为(III)所述重组菌时，采用如下方法培养：将所述重组军的菌液以1∶100的体积比接种于LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃的恒温摇床中200rpm转速震荡培养至对数中期(OD₆₀₀＝0.5-0.6)，加入IPTG诱导剂(终浓度为1mM)，37℃诱导培养15h(10-20h均可)。

所述方法中，当所述重组菌为(IV)所述重组菌时，采用如下方法培养：

①种子培养

将0.2mL重组菌pPIC9K-RmgalA/GS115菌液接种200mL BMGY，30℃、250rpm过夜培养至OD_600nm为10.0左右；

②分批培养(基础培养)

装量2.0L(BSM)，发酵罐灭菌，28％浓氨水调pH4.0，每升起始发酵液加入PTM14.35mL；然后接种步骤①的种子培养液(接种量10％；体积比)，转速700rpm，通气量1.0vvm，30℃发酵18～24h；发酵过程中，溶氧DO从100％逐渐下降，直至5％左右，维持一段时间后回升至60％左右。

③甘油分批补料培养：

待分批培养至甘油耗尽(根据DO spikes操作，30s内溶氧迅速上升至接近70％又迅速下降)，流加甘油分批补料培养基，甘油分批补料培养基的流速为18.4mL/h/L起始发酵液，控制温度30℃、pH 4.0、始终监视DO，通过调整流加速度、转速和通气量等保持DO＞20％；流加时间4-5h，待OD_600nm达180～220左右，停止流加。

④100％甲醇诱导培养

停止流加甘油后，根据DO spikes，饥饿30min左右，流加100％甲醇诱导培养基，在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液线性增加至10.9mL/h/L起始发酵液左右，监控DO＞15％、控制温度30℃、调pH 6.0。

自所述分批培养开始计时，培养时间可为12h以上，如12h至228h。

所述蛋白可用作α-半乳糖苷酶。所述蛋白用作α-半乳糖苷酶时，反应温度可为30-70℃，优选为50-60℃，最优选60℃。所述蛋白用作α-半乳糖苷酶时，反应pH可为3.5-6.5，优选为4.0-5.5，最优选4.5。所述蛋白用作α-半乳糖苷酶时可用于降解棉籽糖、水苏糖、脱脂大豆粉、菜豆粉或pNPG。所述蛋白用作α-半乳糖苷酶时可用于制备半乳糖和/或蔗糖。

在大肠杆菌中表达本发明提供的重组α-半乳糖苷酶蛋白，活性最高达11U/mL。在毕赤酵母中表达通过发酵罐表达本发明的蛋白，酶活最高达1680U/mL。本发明提供的蛋白作为α-半乳糖苷酶具有如下酶学性质：最适pH为4.5，在pH 4-10范围内稳定；最适温度为60℃，且在55℃以内稳定，在55℃保温30min酶活几乎不变，60℃下保温30min仍残留70％的活性，表现出较好的热稳定性。本发明提供的蛋白可满足饲料、食品等工业应用中对α-半乳糖苷酶耐热性的特殊要求，具有较大应用潜力。

附图说明

图1为实施例2中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为粗酶液和RmgalA蛋白液的SDS-PAGE图谱。

图3为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的最适pH。

图4为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的pH稳定性。

图5为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的的最适温度。

图6为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶的温度稳定性。

图7为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶对棉籽糖(A)、水苏糖(B)的水解。

图8为RmgalA蛋白作为α-半乳糖苷酶分别对脱脂大豆粉(A)(含棉籽糖低聚糖)和脱脂菜豆粉(B)(含棉籽糖低聚糖)的水解。

图9为重组毕赤酵母利用5L发酵罐高密度发酵产酶历程。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料如分子试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原材料均可从商业途径获得；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Lowry法的参考文献：Lowry et al.Journal ofBiological Chemistry，1951，193：265-275。pNPG即对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷。

大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)：Novagen公司，产品编号：69450。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115：Novagen公司，产品编号C18100。

pET-30a(+)载体：Novagen公司，产品编号：69909。

pPIC9K载体：Invitrogen公司，产品编号：69909。

棉籽糖：购自Sima，产品目录号为R0250。

水苏糖：购自Sima，产品目录号为S4001。

LB培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，调pH至7.0；121℃灭菌20min。

米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4967。

实施例1、α-半乳糖苷酶及其编码基因的发现

表2α-半乳糖苷酶编码基因克隆所用的引物

引物	5′→3′	长度(bp)
			galDF	ATHAARTGGGAYATGAA	17
galDR	TCNGGNCKNGTRTTRTC	17
			gal5′GSP	GCCACTGGAGCAGGTTTCAATC	22
gal5′NGSP	CGCTTATAGTGGTGCATGGTGA	22
			gal3′GSP	GAACAGACCGTTTGCCGAAGTC	22
gal3′NGSP	TGCTGATTGAAACCTGCTCCAG	22

注：以上简并引物galDF和galDR中，H＝A/C/T，R＝A/G，Y＝C/T，N＝A/T/C/G，K＝G/T。

根据现有的同源序列和保守区设计一对引物，由galDF和galDR组成(见表2)。以米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432的基因组DNA为模板，利用galDF和galDR组成的引物对进行PCR扩增。PCR扩增条件：95℃5min；95℃30s，65-55℃(每个循环降1℃)45min，72℃1min，10个循环；95℃30s，55℃45min，72℃1min，20个循环；72℃，8min。PCR扩增的保守区片段经凝胶回收后送交生工生物工程(上海)有限公司测序。

在测序结果和序列分析的基础上，设计5′和3′RACE引物(见表2)。GSP(genespecial primer)和NGSP(nested gene special primer)分别为RACE反应第一轮和第二轮(巢式)PCR引物。取乳糖诱导培养3天的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432菌丝体，液氮研磨，利用Trizol(Invitrogen)法提取总RNA，反转录后分别进行5′和3′RACE反应，PCR扩增得到5′和3′端侧翼片段。RACE过程参照BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit User Mannal进行。分别将5′和3′RACE得到的侧翼片段凝胶回收，连接pMD18-T载体，转化E.coli DH5α，PCR鉴定后送交测序。根据5′和3′RACE测序结果，拼接得到全长cDNA序列。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为RmgalA蛋白，是一种α-半乳糖苷酶，由751个氨基酸残基组成，自N末端第1至23位氨基酸残基为信号肽。将RmgalA蛋白的编码基因命名为RmgalA基因，其cDNA中的开放阅读框如序列表的序列2所示(2256bp)。

将RmgalA蛋白及其编码基因在GenBank数据库中比对分析，基因序列与伞状毛霉菌(Lichtheimia corymbifera)α-半乳糖苷酶基因(GenBank登录号：AAF68953.1)相似性最高(为65％)，氨基酸序列相似性为67％。

实施例2、重组α-半乳糖苷酶基因的表达及纯化

一、重组表达载体的构建

1、提取米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432的总RNA，反转录为cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板，用RmgalAF(38bp)和RmgalAR(45bp)组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1(M为DL2000marker，1为PCR扩增产物)。

RmgalAF：5′-GGAATTCCATATGCTGGACACTGGCATCCACAAGCACC-3′；

RmgalAR：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTCTTTTGTACCCAAACAACAGCGCTTC-3′。

3、用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切pET-30a(+)载体，回收载体骨架(约5240bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET30a-RmgalA。根据测序结果，对重组质粒pET30a-RmgalA进行结果描述如下：骨架载体为pET-30a(+)载体，在骨架载体的Nde I和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第70至2253位核苷酸所示的DNA(该DNA编码序列表的序列1自N末端第24至751位氨基酸残基，即去除信号肽的RmgalA蛋白)。

二、重组菌的获得

将重组质粒pET30a-RmgalA通过热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pET30a-RmgalA的重组菌，将其命名为重组菌BL21-pET30a-RmgalA。

将pET-30a(+)载体通过热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有pET-30a(+)载体的重组菌，将其命名为对照菌。

三、RmgalA蛋白的诱导表达和纯化

1、RmgalA蛋白的诱导表达

(1)挑取重组菌BL21-pET30a-RmgalA单菌落接种于100mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃的恒温摇床中200rpm转速震荡培养12h(12-16h均可)。

(2)取2mL步骤(1)的菌液以1∶100的体积比接种于LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃的恒温摇床中200rpm转速震荡培养至对数中期(OD₆₀₀＝0.5-0.6)，加入IPTG诱导剂(终浓度为1mM)，37℃诱导培养15h(10-20h均可)，离心(10000rpm冷冻离心10min)收集菌体。

(3)将步骤(2)收集的菌体进行超声波破碎(超声功率为200W，共进行90次超声破碎，每次3秒，每次超声处理后停止4秒)，离心收集上清，即为粗酶液。

2、RmgalA蛋白的纯化

将步骤1的(2)收集的菌体用样品缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH 8.0，含150mM NaCl)重悬，超声波破碎(超声功率为200W，共进行90次超声破碎，每次3s，每次超声处理后停止4s)后上样于Ni-IDA亲和交换柱(1×5cm)，流速为0.5mL/min；用洗脱液甲(50mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，含0.5M NaC1及30mM咪唑)洗脱杂蛋白至OD₂₈₀＜0.1；而后用洗脱液乙(50mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，含0.5M NaCl及50mM咪唑)进一步洗脱杂蛋白至OD₂₈₀＜0.05；最后用洗脱液丙(50mM pH 8.0磷酸盐缓冲液，含0.5M NaCl及200mM咪唑)洗脱目的蛋白，洗脱至OD₂₈₀＜0.1，收集洗脱液(RmgalA蛋白液)。

四、对照蛋白液的制备

用对照菌代替重组菌BL21-pET30a-RmgalA依次进行步骤三的1和2，得到粗酶液对照液和蛋白液对照液。

五、RmgalA蛋白的鉴定

1、电泳分析

将粗酶液和RmgalA蛋白液分别进行SDS-PAGE分析(分离胶和浓缩胶浓度分别为10％和4.5％)，考马斯亮蓝染色显示蛋白带，见图2(1为蛋白分子量marker，2为粗酶液，3为RmgalA蛋白液)。

2、作为α-半乳糖苷酶的酶活

酶活检测方法(所用的缓冲液均为50mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液)如下：

(1)pNPG溶于缓冲液中，使其终浓度为20mM，即为pNPG溶液；

(2)将50μl待测溶液(即待测样本溶液或其稀释液、或处理后的待测样本溶液或其稀释液)，50μl pNPG溶液和150μl缓冲液混合，摇匀，60℃温育10min，然后加入750μl 1M的Na₂CO₃水溶液终止反应；以等体积的缓冲液代替待测溶液，作为阴性对照；检测在OD_410nm处测吸光值。

将pNP标准品溶于缓冲液，得到不同浓度的标准品溶液，检测不同浓度的标准品溶液在OD_410nm处测吸光值，制作标准曲线。

待测样本的酶活计算公式：酶活性(U/ml)＝[(0.068A+0.0005)/t/0.05]×n；A：OD_410nm处测吸光值；t：反应时间(单位为min，数值为10)，n为待测溶液的稀释倍数。

实验设3次重复，结果取平均值。

分别将粗酶液、RmgalA蛋白液、粗酶液对照液和蛋白液对照液作为待测溶液，检测其作为α-半乳糖苷酶的酶活，粗酶液的酶活为11030U/mL、粗酶液比活力为21.1U/mg，RmgalA蛋白液的酶活为7450U/mL、总蛋白比活力为198.7U/mg，粗酶液对照液和蛋白液对照液的酶活均为0U/mL。

RmgalA蛋白的纯化情况(粗酶液至RmgalA蛋白液过程中的相关参数)见表3。

表3重组α-半乳糖苷酶纯化表

	总酶活(U)a	总蛋白(mg)	比活力(U/mg)	纯化倍数	回收率(％)
						粗酶液	11030	523.8	21.1	1.0	100.0
RmgalA蛋白液	7450	37.5	198.7	9.4	67.5

实施例3、大肠杆菌产重组α-半乳糖苷酶的性质

一、最适pH测定

将实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液作为待测溶液。

酶活测定方法同实施例2的步骤五的2，差别仅在于分别采用以下几种缓冲液(浓度均为50mM)：柠檬酸-磷酸缓冲液(pH 3.0-7.5)、柠檬酸缓冲液(pH 3.0-6.0，磷酸缓冲液(pH 6.0-7.5)，Tris-Cl缓冲液(pH 7.5-9.0)，CHES缓冲液(pH 8.0-10.0)，Glycine/NaOH缓冲液(pH 9.0-11.0)。

柠檬酸-磷酸缓冲液(用“◆”表示)：分别配制50mM磷酸氢二钠和50mM柠檬酸，将两者按照不同比例混合调节pH至pH 3.0-7.5。

柠檬酸缓冲液(用“■”表示)：分别配制50mM柠檬酸和柠檬酸钠溶液，将两者按照不同比例混合调节pH至pH 3.0-6.0。

磷酸缓冲液(用“○”表示)：分别配制50mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，将两者按照不同比例混合调节pH至pH 6.0-7.5。

Tris-Cl缓冲液(用“×”表示)：配制50mM Tris溶液，利用浓盐酸调节pH至pH 7.5-9.0。

CHES缓冲液(用“▲”表示)：配制50mM CHES溶液，利用浓盐酸调节pH至pH 8.0-10.0。

RmgalA蛋白液在pH 4.5的柠檬酸缓冲液中活性最高，将该最高的酶活作为100％，计算其它缓冲液和pH下的相对酶活，结果见图3。

二、pH稳定性的测定

将实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液用步骤一中的各种缓冲液稀释10倍，然后置于50℃下处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，作为待测溶液。

酶活测定方法同实施例2的步骤五的2，差异仅在于采用50℃温育。

将未进行处理的RmgalA蛋白液的酶活作为100％，计算RmgalA蛋白液用各个pH处理后的相对酶活，结果见图4。该酶在较宽的pH范围内(4.0-10.0)稳定。

三、最适温度

将实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液作为待测溶液。

酶活测定方法同实施例2的步骤五的2，差别仅在于分别采用以下几种反应温度：30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃。

结果表明，待测溶液在60℃的反应温度下活性最高，为198.7U/mg。将检测结果最高的酶活作为100％，计算其它反应温度下的相对酶活，结果见图5。

四、温度稳定性的测定

将实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液用50mM pH4.5的柠檬酸缓冲液10倍稀释，然后置于不同温度(30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃)下处理30min，迅速将样品置于冰水中冷却30min，作为待测溶液。

酶活测定方法同实施例2的步骤五的2。

将未进行处理的RmgalA蛋白液的酶活(198.7U/mg)作为100％，计算RmgalA蛋白液用各个温度处理后的相对酶活，结果见图6。该酶在55℃保温30min酶活几乎不变。60℃下保温30min仍残留70％的活性，表现出较好的热稳定性。

五、水解特性

以用50mM pH 4.5的柠檬酸缓冲液分别配制浓度为5mg/mL的棉籽糖和水苏糖溶液，添加实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液(使其浓度为2.0U/mL)；50℃保温2h，定时取样，煮沸5min灭活酶后进行薄层层析(TLC，Kieselgel 60)分析；展层系统为丙醇/乙酸/水系统(1∶1∶0.1，体积比)，将水解的样品点样后展开两次，吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95，体积比)溶液浸湿，最后在130℃烘箱中烘烤显色。

采用棉籽糖时，各个定时取样样品的层析图谱见图7A。采用水苏糖时，各个定时取样样品的层析图谱见图7B。由图7可见，RmgalA蛋白液具有广谱的α-半乳糖苷酶活性，可将棉籽糖和水苏糖完全水解为半乳糖和蔗糖。

0.1g脱脂大豆粉(或菜豆粉)溶解于1mL 50mM、pH4.5的柠檬酸缓冲液中，添加实施例2的步骤三制备的RmgalA蛋白液(使其浓度为3.0U/mL)；50℃保温2h，定时取样，煮沸5min灭活酶后进行薄层层析(TLC，Kieselgel 60)分析；展层系统为丙醇/乙酸/水系统(1∶1∶0.1，体积比)，将水解的样品点样后展开两次，吹干后用硫酸∶甲醇(5∶95，体积比)溶液浸湿，最后在130℃烘箱中烘烤显色。

采用脱脂大豆粉(含棉籽糖低聚糖)时，各个定时取样样品的层析图谱见图8A。采用菜豆粉(含棉籽糖低聚糖)时，各个定时取样样品的层析图谱见图8B。由图8可见，RmgalA蛋白液可有效水解脱脂大豆粉和菜豆粉，生成半乳糖和蔗糖。

实施例4、毕赤酵母高密度发酵表达重组α-半乳糖苷酶

一、重组菌的制备

2、以步骤1的cDNA为模板，用F1和RmgalAR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

F1：5′-GTTGTCTGCCTAGGCTGGACACTGGCATCCACAAGCACC-3′；

RmgalAR：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTCTTTTGTACCCAAACAACAGCGCTTC-3′。

3、用限制性内切酶Avr II和Not I双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶Avr II和Not I双酶切pPIC9K载体，回收载体骨架(约5240bp)。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pPIC9K-RmgalA。根据测序结果，对重组质粒pPIC9K-RmgalA进行结果描述如下：骨架载体pPIC9K载体，在骨架载体的Avr II和Not I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第70至2253位核苷酸所示的DNA(该DNA编码序列表的序列1自N末端第24至751位氨基酸残基，即去除信号肽的RmgalA蛋白)。

6、将重组质粒pPIC9K-RmgalA转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115，得到含有重组质粒pPIC9K-RmgalA的重组菌，将其命名为重组菌pPIC9K-RmgalA/GS115。

7、将pPIC9K载体代替重组质粒pPIC9K-RmgalA转化巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，得到对照菌。

二、高密度发酵表达重组α-半乳糖苷酶

发酵方法按照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)。采用5L的发酵罐(BIOTECH，上海保兴生物设备工程有限公司)。种子培养基(BMGY)、发酵基本培养基(BSM)、甘油分批补料培养基和100％甲醇诱导培养基参照Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B，053002，Invitrogen)配制。整个发酵过程采用分批培养、甘油流加培养、100％甲醇诱导培养三个阶段。

PTM1：CuSO₄·7H₂O 6.0g，NaI 0.08g，MnSO₄·H₂O 3.0g，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g，硼酸0.02g，CoCl₂0.5g，ZnCl₂20.0g，FeSO₄·7H₂O 65.0g，生物素0.2g，浓硫酸5.0mL，加水至1L。

BMGY由溶剂和溶质组成；溶剂为100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.0)；溶质及其浓度如下：1％(g/100mL)酵母膏，2％(g/100mL)蛋白胨，1.34％(g/100mL)YNB；4×10^-5％(g/100mL)生物素，1％(体积比)甘油。

BMMY：用0.5％(体积比)甲醇代替BMGY中的1％甘油。

BSM：85％(g/100mL)H₃PO₄水溶液26.7mL，CaSO₄0.93g，K₂SO₄18.2g，MgSO₄·7H₂O 14.9g，KOH 4.13g，甘油40.0g，加蒸馏水水至1L。

甘油分批补料培养基：将50％(g/100mL)甘油水溶液高压灭菌，然后每升加入PTM1 12mL。

100％甲醇诱导培养基：每升100％甲醇加入PTM1 12mL。

发酵过程如下：

①种子培养

②分批培养(基础培养)

③甘油分批补料培养：

④100％甲醇诱导培养

发酵过程中取样(发酵液上清)，分析酶活和蛋白质浓度(酶活测定方法见实施例2的步骤五的3；蛋白质浓度测定采用Lowry法，以BSA为标准品)。结果见表4和图9。

表4发酵过程中发酵液上清的酶活和蛋白质浓度

从分批培养开始计时取样时的发酵时间(h)	酶活(U/mL)	蛋白质浓度(mg/mL)
			12	5.5	0.3
36	94.3	0.5

60	215.8	1.5
			84	257.3	8.0
108	379.9	16.5
			132	862.7	30.0
156	1167.8	30.1
			180	1437.2	30.7
204	1641.2	38.0
			228	1682.0	38.5

重组毕赤酵母经5L发酵罐高密度发酵结果显示，诱导表达204h后发酵上清液酶活达到最高，为1682U/mL。

采用对照菌代替重组菌pPIC9K-RmgalA/GS115菌液进行步骤二的操作，发酵过程中取样分析酶活和蛋白质浓度。发酵液的酶活均为0U/mL。

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：

(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)所述的DNA分子：

1)序列表的序列2自5’末端第70至2253位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：

(Ⅰ)将权利要求2或3所述基因插入pET-30a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒；

(Ⅱ)将权利要求2或3所述基因插入pPIC9K载体的多克隆位点得到的重组质粒。

6.含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为如下(Ⅲ)或(Ⅳ)：

(Ⅲ)将权利要求5的(Ⅰ)所述重组表达载体导入大肠杆菌得到的重组菌；

(Ⅳ)将权利要求5的(Ⅱ)所述重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母得到的重组菌。

8.含有权利要求2或3所述基因的表达盒。

9.一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是培养权利要求7所述的重组菌，得到权利要求1所述蛋白。

10.权利要求1所述蛋白作为α-半乳糖苷酶的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述应用中，反应温度为30-70℃，所述应用中，反应pH为3.5-6.5。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述应用中，反应温度为50-60℃；所述应用中，反应pH为4-5.5。

13.如权利要求12所述的应用，其特征在于：所述应用中，反应温度为60℃；所述应用中，反应pH为4.5。