CN106676085A - 具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用。本发明公开的具有α‑半乳糖苷酶活性的蛋白质是如下A1)‑A5)中的任一种：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92‑817位的蛋白质；A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87‑817位的蛋白质；A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87‑831位的蛋白质；A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质。实验证明，本发明的蛋白质具有α‑半乳糖苷酶活性，本发明的蛋白质及含有编码蛋白质核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α‑半乳糖苷键的物质，也可用于制备α‑半乳糖苷酶制剂。

Description

具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶又称蜜二糖酶，能够水解蜜二糖、棉籽糖、水苏糖等寡糖的末端半乳糖残基。α-半乳糖苷酶来源于植物和细菌、真菌、放线菌、酵母菌等多种微生物。不同来源的α-半乳糖苷酶在基因结构、分子量大小、等电点、催化活性等方面有很大的差异。α-半乳糖苷酶是一种糖蛋白，分子量介于30-400kDa之间，蛋白质和糖基通过共价键连接，其中糖基主要有6-8个甘露糖和乙酰葡萄糖胺单糖组成。该酶的应用领域主要包括以下几个方面：

1、在食品行业中的应用。豆类是人们营养的主要蛋白质来源，但由于豆类产品中普遍存在α-半乳糖苷类寡糖的抗营养因子，而人的消化道中又不能产生降解这类寡糖的α-半乳糖苷酶。这类寡糖经过大肠微生物发酵，容易产生胀气，影响营养物质的消化和吸收。在制糖工业中，α-半乳糖苷酶可以用来水解甜菜中的棉籽糖，降低糖蜜粘度，促进蔗糖结晶，提高蔗糖的产量和质量。

2、在饲料工业中的应用。在单胃动物饲料中，豆粕和杂粕的中半乳糖苷类寡糖含量很高，被后肠道微生物发酵后，产生胀气、腹泻、厌食等，从而影响营养物质的消化和吸收，进而影响动物生产性能。有研究表明，在肉鸡玉米-豆粕型日粮中添加α-半乳糖苷酶，可以显著提高肉仔鸡生长性能、能量和养分表观代谢率及消化酶的活性。

3、在医疗领域中的应用。α-半乳糖苷酶在医疗领域主要用于治疗法布里病、血型转换和制备环糊精衍生物。B型血与O型血的唯一差别在于红细胞表明糖链最外端多出一个以α-1,3糖苷键连接的半乳糖基，可将这个糖基用α-半乳糖苷酶切掉，实现B型血转变成O型血。

此外，α-半乳糖苷酶在造纸业中也有一定的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其相关生物材料。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质，其名称为galC，galC是如下A1)-A7)中的任一种：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92-817位的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87-817位的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87-831位的蛋白质；

A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；

A6)将A1)-A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A7)在A1)-A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1的第92-817位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签。所述标签可为表1所示标签，但不限于表1中的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过20个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

GhNAC79可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

GhNAC79的编码基因可通过将序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明还提供了与galC相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码galC的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：

1)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

2)序列表中序列4的第43-2223位所示的cDNA分子或DNA分子；

3)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；

4)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

5)在1)或2)或3)或4)的核苷酸序列的5′或3′端添加标签的编码序列得到的编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子；

7)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码galC的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码galC的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的galC的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码galC且具有galC功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码galC的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码galC的核酸分子的表达盒(galC基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达galC的DNA，该DNA不但可包括启动galC基因转录的启动子，还可包括终止galC基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的载体构建含有所述galC基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pPICZαA质粒。

B3)所述重组载体可含有序列3、序列4的第43-2223位、序列4或序列2所示的用于编码galC的DNA序列。进一步所述重组载体具体可为pPICZαA-galC或pPICZαA-galC-Y。所述pPICZαA-galC为将pPICZαA质粒的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA分子得到的重组质粒。所述pPICZαA-galC能表达序列1所示的蛋白质。所述pPICZαA-galC-Y为将pPICZαA质粒的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA分子得到的重组质粒。所述pPICZαA-galC-Y能表达序列5所示蛋白质。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，酵母可为毕赤酵母，如毕赤酵母x-33。

上述生物材料中，所述重组微生物可为将B1)所述核酸分子导入所述微生物得到的表达galC的重组微生物。所述重组微生物具体可为将所述pPICZαA-galC或所述pPICZαA-galC-Y导入所述微生物得到的重组微生物。

在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为将所述pPICZαA-galC或所述pPICZαA-galC-Y导入毕赤酵母x-33中得到的重组酵母x-33-pPICZαA-galC或x-33-pPICZαA-galC-Y。

上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了galC的制备方法，所述方法包括：培养含有galC的编码基因的表达盒的重组微生物，使galC的编码基因表达，得到表达galC的重组微生物培养物；纯化所述重组微生物培养物得到所述蛋白质。

上述galC的制备方法中，所述galC的编码基因可为上述生物材料中B1)所述核酸分子。

上述galC的制备方法中，所述含有galC的编码基因的表达盒可为上述生物材料中B2)所述表达盒。

上述galC的制备方法中，所述重组微生物可为上述生物材料中所述重组微生物。

上述galC的制备方法中，所述纯化所述重组微生物培养物可通过AKTA Pure蛋白纯化系统或亲和层析进行。所述亲和层析可为镍柱亲和层析。所述纯化所述重组微生物培养物还可包括将为便于纯化的标签切除的步骤。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种α-半乳糖苷酶制剂，所述α-半乳糖苷酶制剂包含galC或所述生物材料。

上述α-半乳糖苷酶制剂，可以galC或所述生物材料作为其活性成分，还可将galC或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述α-半乳糖苷酶制剂可为所述重组微生物的发酵产物。在本发明的一个实施例中，所述发酵产物为所述x-33-pPICZαA-galC的发酵产物，具体为所述x-33-pPICZαA-galC的发酵上清液。

为解决上述技术问题，本发明还提供了含有α-半乳糖苷键物质的降解方法，所述方法包括以α-半乳糖苷键物质为底物用galC进行催化反应，完成所述α-半乳糖苷键物质的降解。

上述方法中，所述用galC进行催化反应可用含有galC的物质进行催化反应。所述含有galC的物质可为上述重组微生物的发酵产物。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：

X1、galC在作为α-半乳糖苷酶中的应用；

X2、所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶中的应用；

X3、galC或所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶产品中的应用；

X4、galC或所述生物材料在降解含有α-半乳糖苷键物质中的应用；

X5、galC或所述生物材料在促进动物对含有α-半乳糖苷键物质的消化和/或吸收中的应用；

X6、galC或所述生物材料在促进动物饲料营养物质的消化和/或吸收中的应用；

X7、galC或所述生物材料在制备蔗糖和/或半乳糖中的应用。

本发明中，所述含有α-半乳糖苷键物质可为含有α-半乳糖苷键的寡糖或含有所述寡糖的物质，如豆浆。所述寡糖具体可为棉籽糖或水苏糖。

本发明的galC具有α-半乳糖苷酶活性，含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵上清液的α-半乳糖苷酶活性可达660U/mL。galC的α-半乳糖苷酶酶活的最适为4.67，最适温度为50℃。实验证明，本发明的galC及含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α-半乳糖苷键的物质：利用含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵上清液水解豆浆，在酶解3小时时，棉籽糖和水苏糖的降解率均可达到100％。表明，本发明的galC及含有编码galC核酸分子的重组微生物的发酵产物可用于水解含有α-半乳糖苷键的物质，也可用于制备α-半乳糖苷酶制剂。

附图说明

图1为不同pH值条件下，α-半乳糖苷酶galC的相对催化活性。

图2为不同温度条件下，α-半乳糖苷酶galC的相对催化活性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pPICZαA质粒为Invitrogen的产品。

下述实施例中的毕赤酵母x-33为Invitrogen的产品。

下述实施例中的BMGY培养基的溶剂为水，各组分及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)酵母提取物，2％(质量百分比浓度)蛋白胨，1.34％(质量百分比浓度)YNB，4×10^{- 7}g/mL生物素，1％(体积百分比浓度)甘油，100ml/L 1M磷酸钾缓冲液(PH6.0)。

下述实施例中的BMMY培养基的溶剂为水，各组分及其浓度分别为：1％(质量百分比浓度)酵母提取物，2％(质量百分比浓度)蛋白胨，1.34％(质量百分比浓度)YNB，4×10^{- 7}g/mL生物素，100ml/L 1M磷酸钾缓冲液(PH6.0)。

实施例1、α-半乳糖苷酶galC的制备

本发明提供了一个来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-半乳糖苷酶基因(galC基因)，galC基因的序列为序列表中序列2，其编码序列(CDS)为序列3(将序列3所示的DNA片段命名为galC编码基因)，序列3编码序列1的第92-817位所示的α-半乳糖苷酶(galC)，将序列3进行密码子的优化，得到编码galC的序列4的第43-2223位，将序列4的第43-2223位所示的galC编码基因记为galC-Y编码基因。

1、重组质粒及重组菌的制备

将pPICZαA质粒的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的galC编码基因，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pPICZαA-galC。pPICZαA-galC能表达序列1所示的galC融合α信号肽的蛋白质，将该蛋白质命名为galC融合蛋白1，galC融合蛋白1的表达由AOX1启动子启动。

人工合成序列4所示的DNA分子，该DNA分子由在galC-Y编码基因的5′端添加His标签的编码序列得到。将pPICZαA质粒的EcoR I和Xba I识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA分子，得到重组质粒，将该重组质粒命名为pPICZαA-galC-Y。pPICZαA-galC-Y能表达序列5所示的galC融合His标签与α信号肽的融合蛋白质，将该融合蛋白质命名为galC融合蛋白2，galC融合蛋白2的表达由AOX1启动子启动。序列5的第106-831位为galC的序列。

将重组质粒pPICZαA-galC用Sac I酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化重组质粒pPICZαA-galC的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA-galC。x-33-pPICZαA-galC胞内表达galC融合蛋白1，galC融合蛋白1分泌至胞外时α信号肽被切除，得到序列1的第87-817位所示的galC融合蛋白，将该融合蛋白记为galC融合蛋白3。见Invitrogen公司pPICZ表达手册第11页Signal Sequence Processing。

将重组质粒pPICZαA-galC-Y用Sac I酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化重组质粒pPICZαA-galC-Y的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA-galC-Y。x-33-pPICZαA-galC-Y胞内表达galC融合蛋白2，galC融合蛋白2分泌至胞外时α信号肽被切除，得到序列5的第87-831位所示的galC融合His标签的融合蛋白，将该融合蛋白记为galC融合蛋白4。

将pPICZαA质粒用Sac I酶切线性化后，电击转化毕赤酵母x-33感受态细胞，涂布于含有博来霉素的YPD平板，筛选得到含有线性化pPICZαA质粒的重组菌株，将该重组菌株命名为x-33-pPICZαA，作为空载体对照。

2、galC融合蛋白的表达纯化与酶活测定

2.1galC融合蛋白的表达纯化

将步骤1的x-33-pPICZαA-galC接种于含20mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃、280rpm震荡培养至OD600为4，然后离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，使OD600约为1.0，得到菌体悬液，向该菌体悬液中加入甲醇，得到诱导菌液，该诱导菌液中甲醇的浓度为0.5％(V/V)。将诱导菌液在30℃、280rpm下震荡培养，每24h向培养液中添加一次甲醇，每次添加甲醇后，培养液中甲醇的浓度均为0.5％(V/V)，连续培养96小时后，得到发酵液，将发酵液12,000rpm离心10min，弃沉淀，得到x-33-pPICZαA-galC发酵上清液。

按照上述发酵方法，将x-33-pPICZαA-galC替换为x-33-pPICZαA-galC-Y，其他步骤均不变，得到x-33-pPICZαA-galC-Y发酵上清液。

按照上述发酵方法，将x-33-pPICZαA-galC替换为x-33-pPICZαA，其他步骤均不变，得到空载体发酵上清液。

将x-33-pPICZαA-galC发酵上清液按照如下方法进行纯化得到galC融合蛋白3：在冰水浴中，向10mL x-33-pPICZαA-galC发酵上清液中加入硫酸铵使其饱和度为75％沉淀蛋白质，12000rpm离心30min，收集沉淀。将沉淀溶于1mL 0.1M PB溶液中，得到溶液1。用AKTAPure蛋白纯化系统纯化溶液1：所用柱子填料为Bio-Rad公司的UNOsphere Q；所用洗脱液为NaCl浓度为0-1M的NaCl溶液(NaCl溶液的溶质均为NaCl，溶剂均为20mM Tris-HCl)，按照NaCl浓度由低到高的顺序进行梯度洗脱；整个纯化过程在4℃层析柜中进行。

收集紫外检测器显示有蛋白峰的开始收集，得到对应于不同蛋白峰的流出液；将各流出液进行12％SDS-PAGE电泳分析，在100kDa处有单一蛋白条带的流出液即为含有galC融合蛋白3的流出液)，将该流出液记为galC纯化后的galC溶液，采用BSA法(Bio-Rad公司试剂盒)测定蛋白浓度，galC溶液中的蛋白浓度为0.35mg/mL。

将x-33-pPICZαA-galC-Y发酵上清液利用饱和硫酸铵水溶液进行沉淀，将沉淀溶于25mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中后，利用25mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液透析除盐，得到透析液。利用Ni柱亲和层析的方法纯化透析液，利用100mM咪唑水溶液洗脱，收集流出液，利用12％SDS-PAGE电泳分析不同体积流出液中的蛋白质，将仅含有目的蛋白的流出液记为galC-Y溶液，测定galC-Y溶液中的蛋白浓度，galC-Y溶液中galC融合蛋白4的浓度为28.5μg/mL。

将galC溶液、galC-Y溶液与空载体发酵上清液进行聚丙烯酰胺电泳，电泳结果显示，空载体发酵上清液中不含有目的蛋白，galC溶液与galC-Y溶液均含有单一条带的目的蛋白，galC溶液中目的蛋白galC融合蛋白3的大小为100kDa，galC-Y溶液中目的蛋白galC融合蛋白4的大小为100kDa。

2.2galC融合蛋白酶活测定

以对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖为底物，检测galC溶液中galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活。α-半乳糖苷酶酶活定义为：在pH 4.66、50℃条件下，每分钟内底物降解释放1μmol对硝基酚所需的酶量为一个酶活单位(U)。

1)对硝基酚标准曲线的绘制：

准确称取对硝基苯酚1.3912g，用0.5M Na₂CO₃水溶液定容至1L，配成0.01M的母液。取1mL母液用0.5M Na₂CO₃水溶液定容至100mL，配成0.1mM的对硝基苯酚工作液。分别吸取对硝基苯酚工作液0、1、2、4、8、12、16、20mL，用0.5M Na₂CO₃水溶液定容至50mL，配成浓度分别为0、0.002、0.004、0.008、0.016、0.024、0.032和0.04mM的标准梯度溶液。405nm波长下测定各标准梯度溶液的吸光值。以吸光值为横坐标，对硝基苯酚浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2)酶活测定

将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶于200mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH4.66)缓冲液(该缓冲液为由0.1M柠檬酸水溶液和0.2M磷酸氢二钠水溶液制备的pH为4.66的缓冲液)，得到对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖浓度为10mM的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液。

将步骤2的galC溶液利用超滤管进行超滤，将galC所处液体环境替换为200mM柠檬酸-磷酸氢二钠(pH4.66)缓冲液，得到pH4.66的galC溶液，作为酶液。

分别将对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液与pH4.66的galC溶液于50℃预热10min，然后再各吸取溶液1ml充分混合，于50℃恒温水浴10min，得到混合液；向混合液中加入8ml碳酸钠水溶液(碳酸钠的浓度为0.5M)，振荡混匀，终止反应。以蒸馏水调零，测定吸光度OD₄₀₅值。通过与对硝基酚标准曲线对照，计算酶解反应产生的对硝基酚的量。

按照上述方法，将步骤1的galC溶液替换为空载体发酵上清液，作为对照。

按照上述方法，将步骤1的galC溶液替换为galC-Y溶液，测定galC-Y溶液中galC融合蛋白4的α-半乳糖苷酶酶活。

实验结果表明，空载体发酵上清液没有α-半乳糖苷酶酶活，在pH 4.66、50℃条件下galC溶液中galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活为30U/mL，galC-Y溶液中galC融合蛋白4的α-半乳糖苷酶酶活为73U/mL。

利用肠激酶充分酶切galC-Y溶液中的蛋白质，得到酶切反应液；将酶切反应液过Ni柱，收集流出液，得到含有序列1的第92-817位所示galC的溶液，将该溶液命名为galC溶液1。

按照上述α-半乳糖苷酶酶活测定方法将步骤1的galC溶液替换为galC溶液1，测定galC溶液1中galC的α-半乳糖苷酶酶活及其比活力，结果显示，galC的比活力为150.9U/mg。

3、galC在5L发酵罐中的酶活测定

将步骤1的x-33-pPICZαA-galC接种于装有200mL BMGY培养基的3L摇瓶中，在30℃、280rpm下震荡培养过夜，得到OD600约为3.0的种子液。然后配制2L BMGY培养基，装入5L自动控制发酵罐中，在121℃下灭菌后，冷却至室温，接种上述种子液，用氨水和磷酸调节pH至5.5，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于20％。经测定，接入种子液24h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入流加50％(V/V)甘油水溶液阶段，流速为60mL/h。流加4h后，甘油消耗完全(溶氧标记为100％)，进入甲醇流加阶段(将加入甲醇时记为诱导第0h)，流速为12mL/h，同时控制溶氧为20％以上(如不能使溶氧保持在20％以上，停止添加甲醇，直至溶氧回升)。3h后，将甲醇流速调到24mL/h，再过2h，将流速调到30mL/h，并保持到发酵最后，得到发酵液，将发酵液离心得到发酵上清液。

按照步骤2中2.2中2)的酶活测定方法，将galC溶液替换为上述发酵上清液，其他步骤不变，测定酶活。酶活分析结果表明，诱导到第120h的发酵上清液α-半乳糖苷酶酶活力达到660U/mL。

4、galC活性最适pH

按照如下方法测定α-半乳糖苷酶galC在pH为2、3、4、4.34、4.67、5、5.34、5.67、6、7和8下的相对催化活性，具体步骤如下：

将步骤2的galC溶液利用超滤管进行超滤，将galC融合蛋白3所处液体环境分别替换为不同pH的缓冲溶液，得到不同pH的galC溶液，作为酶液；利用不同pH的缓冲溶液制备10mM的对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖溶液，作为底物溶液。所用不同pH的缓冲溶液的pH分别为2、3、4、4.34、4.67、5、5.34、5.67、6、7和8，各pH的缓冲溶液均为由0.1M柠檬酸水溶液和0.2M磷酸氢二钠水溶液制备的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

取0.4mL底物溶液和0.4mL酶液于50℃水浴反应10min，加入3.2mL 0.5M碳酸钠水溶液终止反应，于405nm处进行吸光度测定，根据相应的对硝基酚标准曲线确定galC的最适pH。

结果如图1所示。结果显示，galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活最适pH为4.67。

5、α-半乳糖苷酶galC活性最佳温度

按照如下方法测定galC融合蛋白在温度为10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下的相对催化活性，具体步骤如下：

各取步骤4的pH为4.67的底物溶液与pH为4.67的酶液0.4mL混合后，分别于10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃下水浴反应10min，加入3.2mL0.5M碳酸钠水溶液终止反应，于405nm处进行吸光度测定，根据相应的对硝基酚标准曲线确定galC的最适温度。

结果如图2所示。结果显示，galC融合蛋白3的α-半乳糖苷酶酶活最适温度为50℃。

实施例2、α-半乳糖苷酶galC可以降解豆浆中寡糖

1、豆浆的制备

称取100g黄豆，用自来水室温浸泡过夜后放入豆浆机中打碎出浆，即得到豆浆，豆浆总体积为1L，将豆浆8000rpm离心10min后取上清进行酶解实验。

2、galC可以降解豆浆中寡糖

实验设置三个处理组和三个对照组，每组两个平行实验。三个处理分别为加酶量5U/ml、10U/ml、15U/ml，即处理1、处理2和处理3。具体操作步骤如下：

处理1、处理2和处理3的操作步骤如下：调整实施例1步骤3的发酵上清液的浓度后与豆浆上清等体积混合，得到混合液，处理1的混合液中galC的酶量为5U/ml，处理2的混合液中galC的酶量为10U/ml，处理3的混合液中galC的酶量为15U/ml。将各混合液25℃水浴条件下进行酶解反应3h，80℃加热5min将酶灭活，离心取上清液作为待测液，分别得到处理1待测液、处理2待测液和处理3待测液。

三个对照组(对照1、对照2和对照3)的处理方式如下：对照组1-3均将豆浆上清和与豆浆上清等pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液等体积混合后25℃水浴条件下孵育3h、80℃孵育5min，分别得到对照1待测液、对照2待测液和对照3待测液。

将各待测液及未进行酶解的豆浆分别用水稀释500倍后用0.1μm滤膜过滤后进行离子色谱分析，根据标准品的保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析各待测液与豆浆，测定α-半乳糖苷酶产物半乳糖与蔗糖以及α-半乳糖苷酶底物棉籽糖与水苏糖的含量，计算降解率，降解率＝(C₀-C)/C₀×100％，

C——实验组稀释液中棉籽糖或水苏糖离子色谱积分峰面积

C₀——对照组稀释液中棉籽糖或水苏糖离子色谱积分峰面积

所用标准品为：

水苏糖：(水苏糖，95％)，北京百灵威科技有限公司No.578189

棉籽糖：D-(+)-Raffnose pentahydrate，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司货号：C16806000

离子色谱分析条件如下：

离子色谱仪：DIONEX ICS-3000

分析柱：CarboPac PA10(250mm×4mm)；保护柱：CarboPac PA10(50mm×4mm)

淋洗液条件：A相(NaOH溶液250mm)，B相(纯水)

梯度洗脱条件如下：

时间	A相(％，体积百分比)	B相(％，体积百分比)
			0-14min(包括14min)	7.5	92.5
14-22min(包括22min)	80	20
			22-30min	7.5	92.5

流速1.0mL/min；

检测器：ED 3000脉冲安培检测，Au工作电极，Ag/AgCl参比电极模式，四电位波形检测；进样量：25μL；

柱温：30℃。

按照上述方法，将酶解反应时间由3h替换为2h，其他不变，检测豆浆中寡糖的降解率。

表2、不同浓度的酶处理豆浆2h和3h，豆浆中寡糖的降解率(％)

结果如表2所示。结果显示，在酶解时间为3小时时，棉籽糖和水苏糖的降解率均可达到100％。

<110> 中国农业大学

<120> 具有α-半乳糖苷酶活性的蛋白质及其应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 817

<212> PRT

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae）

<400> 1

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Met Ala Gln Glu Thr

85 90 95

Ser Ser Asn Asn Ala Val Val Ala Asp Gly Lys Thr Phe Ala Leu Asn

100 105 110

Gly Glu Asn Val Ser Tyr Arg Phe Arg Val Asn Glu Thr Thr Gly Asp

115 120 125

Leu Val Ser Asp His Phe Gly Gly Ser Ile Thr Gly Asp Leu Phe Pro

130 135 140

Gly Phe Gly Ala Glu Ala Leu Gly Gly Trp Val Gly Leu Ala Gly Arg

145 150 155 160

Phe Arg Arg Glu Phe Pro Asp His Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro

165 170 175

Ala Val Arg Ile Arg Gln Glu Ala Gly Tyr Thr Val Thr Asp Leu Gln

180 185 190

Tyr Gln Ser Tyr Ser Val Ile Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Thr Phe Gly Ser Glu Glu Asp Val Thr Thr Leu Val Val His

210 215 220

Leu Tyr Asp Asn Tyr Ser Ser Ile Ala Val Asp Leu Ser Tyr Ser Ile

225 230 235 240

Phe Pro Lys Tyr Asp Ala Ile Val Arg Ser Ala Asn Val Thr Asn Lys

245 250 255

Gly Thr Gln Asn Ile Thr Val Glu Ala Leu Ser Ser Phe Ser Phe Asp

260 265 270

Phe Pro Tyr Glu Asp Leu Glu Met Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala

275 280 285

Arg Glu Ala His Arg Gln Arg Arg Lys Val Glu Tyr Gly Leu Gln Gly

290 295 300

Phe Gly Ser Ser Thr Gly Phe Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu

305 310 315 320

Ala Ile Val His Pro Ser Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Gly

325 330 335

Phe Asn Leu Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Asp Val Glu Lys Gly

340 345 350

Ser Gln Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Ser Gln Leu

355 360 365

Ser Trp Gln Leu Gly Ala Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val

370 375 380

Ser Val Tyr Ser Ser Asp Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Phe His

385 390 395 400

Arg Leu Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp

405 410 415

Arg Pro Pro Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn

420 425 430

Glu Ser Thr Ile Tyr Arg Leu Ala Glu Glu Ser Ala Ala Leu Gly Val

435 440 445

Lys Leu Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Lys Tyr Pro Arg

450 455 460

Val Ser Asp Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Val Pro Asn Pro Asp Arg

465 470 475 480

Phe Pro Asp Gly Leu Thr Pro Leu Val Glu Asp Val Thr Lys Leu Lys

485 490 495

Ala Gly Asn Ser Ser Thr Asp Leu Arg Phe Gly Leu Trp Val Glu Pro

500 505 510

Glu Met Ala Asn Pro Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His Pro Asp Trp

515 520 525

Val Leu His Ala Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Leu Gln Arg Asn Gln Leu

530 535 540

Val Leu Asn Leu Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp Tyr Ile Ile Asp Glu

545 550 555 560

Ile Thr Asn Ile Leu Asn Ser Ser Ala Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp

565 570 575

Phe Asn Arg Ala Met His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Asn Asp His Glu

580 585 590

Tyr Ile Leu Gly Met Tyr Arg Val Phe Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe

595 600 605

Pro Asp Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp

610 615 620

Pro Gly Val Leu Glu Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr

625 630 635 640

Asp Ala Leu Met Arg Ile Thr Ile Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr

645 650 655

Pro Pro Ser Ala Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn Ala Gln

660 665 670

Thr Gly Arg Thr Ile Pro Val Lys Phe Arg Gly His Val Ala Met Met

675 680 685

Gly Gly Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Glu Leu Gln Glu Asp

690 695 700

Glu Lys Ala Glu Val Pro Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn

705 710 715 720

Pro Ile Ile Leu Thr Gly Asp Met Trp Arg Leu Arg Leu Pro Glu Glu

725 730 735

Ser Asn Trp Pro Ala Val Leu Phe Ile Ser Glu Asp Gly Asn Gln Ala

740 745 750

Val Leu Phe Tyr Phe Gln Leu Gly Pro Asn Val Asn His Ala Thr Pro

755 760 765

Trp Leu Arg Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala Thr Tyr Ser Val Asp

770 775 780

Gly Asn Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Ala Leu Met Asn Met Gly Leu Gln

785 790 795 800

Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Tyr Asp Ser Lys Val Val Phe Leu Gln Lys

805 810 815

Gln

<210> 2

<211> 2319

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae）

<400> 2

atggcgcagg aaacttcaag caacaatggt aagtgaagcc acataagctc gtccttgcta 60

gcactcttcc aagcttcact tccaattgac actagtacag cagttgtcgc ggacggcaaa 120

acctttgccc tcaatggaga gaatgtctca taccgcttcc gagtgaacga gaccacgggc 180

gacctagtgt cagatcattt cggcggcagt atcactggcg atctcttccc aggatttggt 240

gccgaggcac ttggcggctg ggttggtttg gctggccgtt ttcgccgtga gtttccagat 300

cacggccggg gagattttcg gattcccgcc gttcggattc gtcaagaggc aggctacact 360

gtgactgatc tgcagtatca gtcatactcg gtgataccgg gaaagcctgc tttgcccggt 420

ctgccttcaa cctttggcag tgaagaggat gtcacaactt tggtggttca tctgtacgac 480

aactacagct ccatcgctgt ggatctgtcg tactcaatct tccctaaata tgacgccatt 540

gtgcgcagcg cgaacgttac gaacaagggt actcaaaata tcacagttga ggcactgtcc 600

agcttcagct tcgatttccc atacgaagat cttgaaatga ttagcctcag gggcgactgg 660

gcgagagaag cccaccgtca gaggcgaaag gtggaatacg gactccaagg gtaagttgct 720

gttttataaa acccaagaag aaagcagcaa attaatgttc cacccgtgat atacagcttc 780

ggaagtagca ctggtttctc ctctcacctg cacaacccct ttcttgcgat agtgcatccc 840

tccactacgg aatctcaggg tgaggcctgg ggatttaacc ttgtctacac aggctcgttc 900

tccgttgatg tcgagaaggg ctcccagggc ctcactcgcg ctctgctggg attcaatccc 960

agtcagctgt cttggcagct gggtgcgggc gagacactta cctcgccgga atgtgtttca 1020

gtctactcaa gtgacggcat cggcggcatg tctcgttcat tccatcgcct ctaccgcaac 1080

cacctgatca agagcaagtt cgccacatcg gatcgcccgc cgctgctgaa cagctgggag 1140

ggtctgtatt tcgactacaa tgagagcaca atctaccgct tggctgagga gtcggccgcc 1200

ttgggagtga aactgttcgt tatggacgac ggttggttcg gcgacaagta cccccgtgta 1260

tcggataacg ccggtctggg tgactgggtg cccaacccgg accgctttcc tgacggccta 1320

acccccctgg tggaagatgt cacgaagctg aaggcaggaa actcctcaac cgacctccgc 1380

tttggcctct gggttgaacc agaaatggcc aaccccaact cgaccctgta ccatgagcac 1440

cctgactggg tgcttcatgc cggccaatac ccacgcacct tgcaacgcaa ccagctcgtg 1500

ctcaatcttg ctttgcctga ggtacaggac tatatcatcg atgagattac caacattctc 1560

aacagctcgg ctatttccta tgtgaagtgg gacttcaacc gggcgatgca cgagacaccc 1620

tcccccagca acgaccacga atacatcctg ggcatgtacc gggtgttcga caccctgacc 1680

acgcgcttcc ccgatgttct gtgggaaggt tgtgcctctg gtggtggacg tttcgaccca 1740

ggtgtactcg agtacttccc gcagatctgg acctccgaca acaccgatgc cctgatgcgc 1800

atcaccatcc agctcggtac ttcactggca taccctccca gcgccatggg tgcccatctc 1860

tcagcagtcc cgaatgccca gactggacgt accattcctg tcaaattccg tggccacgtc 1920

gccatgatgg gcggatcatt cggtctcgaa ctagaccccg ccgagctgca ggaggatgag 1980

aaggccgaag tcccgggact gattgccctt gcagaaaagg ttaacccgat catcctgact 2040

ggcgatatgt ggcgtctcag gcttcccgag gagtctaact ggccggcggt gctattcatc 2100

tctgaggatg gtaaccaagc tgtcctcttc tacttccagc tcggccctaa tgttaaccat 2160

gccactccct ggctcaggct gcagggattg gatcctaagg ccacgtatag cgttgatgga 2220

aacggatcgt actctggtgc ggcattgatg aacatgggac tgcagtacaa gtttgaatcg 2280

gattatgata gcaaggtggt gttcttgcag aagcagtga 2319

<210> 3

<211> 2181

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzae）

<400> 3

atggcgcagg aaacttcaag caacaatgca gttgtcgcgg acggcaaaac ctttgccctc 60

aatggagaga atgtctcata ccgcttccga gtgaacgaga ccacgggcga cctagtgtca 120

gatcatttcg gcggcagtat cactggcgat ctcttcccag gatttggtgc cgaggcactt 180

ggcggctggg ttggtttggc tggccgtttt cgccgtgagt ttccagatca cggccgggga 240

gattttcgga ttcccgccgt tcggattcgt caagaggcag gctacactgt gactgatctg 300

cagtatcagt catactcggt gataccggga aagcctgctt tgcccggtct gccttcaacc 360

tttggcagtg aagaggatgt cacaactttg gtggttcatc tgtacgacaa ctacagctcc 420

atcgctgtgg atctgtcgta ctcaatcttc cctaaatatg acgccattgt gcgcagcgcg 480

aacgttacga acaagggtac tcaaaatatc acagttgagg cactgtccag cttcagcttc 540

gatttcccat acgaagatct tgaaatgatt agcctcaggg gcgactgggc gagagaagcc 600

caccgtcaga ggcgaaaggt ggaatacgga ctccaaggct tcggaagtag cactggtttc 660

tcctctcacc tgcacaaccc ctttcttgcg atagtgcatc cctccactac ggaatctcag 720

ggtgaggcct ggggatttaa ccttgtctac acaggctcgt tctccgttga tgtcgagaag 780

ggctcccagg gcctcactcg cgctctgctg ggattcaatc ccagtcagct gtcttggcag 840

ctgggtgcgg gcgagacact tacctcgccg gaatgtgttt cagtctactc aagtgacggc 900

atcggcggca tgtctcgttc attccatcgc ctctaccgca accacctgat caagagcaag 960

ttcgccacat cggatcgccc gccgctgctg aacagctggg agggtctgta tttcgactac 1020

aatgagagca caatctaccg cttggctgag gagtcggccg ccttgggagt gaaactgttc 1080

gttatggacg acggttggtt cggcgacaag tacccccgtg tatcggataa cgccggtctg 1140

ggtgactggg tgcccaaccc ggaccgcttt cctgacggcc taacccccct ggtggaagat 1200

gtcacgaagc tgaaggcagg aaactcctca accgacctcc gctttggcct ctgggttgaa 1260

ccagaaatgg ccaaccccaa ctcgaccctg taccatgagc accctgactg ggtgcttcat 1320

gccggccaat acccacgcac cttgcaacgc aaccagctcg tgctcaatct tgctttgcct 1380

gaggtacagg actatatcat cgatgagatt accaacattc tcaacagctc ggctatttcc 1440

tatgtgaagt gggacttcaa ccgggcgatg cacgagacac cctcccccag caacgaccac 1500

gaatacatcc tgggcatgta ccgggtgttc gacaccctga ccacgcgctt ccccgatgtt 1560

ctgtgggaag gttgtgcctc tggtggtgga cgtttcgacc caggtgtact cgagtacttc 1620

ccgcagatct ggacctccga caacaccgat gccctgatgc gcatcaccat ccagctcggt 1680

acttcactgg cataccctcc cagcgccatg ggtgcccatc tctcagcagt cccgaatgcc 1740

cagactggac gtaccattcc tgtcaaattc cgtggccacg tcgccatgat gggcggatca 1800

ttcggtctcg aactagaccc cgccgagctg caggaggatg agaaggccga agtcccggga 1860

ctgattgccc ttgcagaaaa ggttaacccg atcatcctga ctggcgatat gtggcgtctc 1920

aggcttcccg aggagtctaa ctggccggcg gtgctattca tctctgagga tggtaaccaa 1980

gctgtcctct tctacttcca gctcggccct aatgttaacc atgccactcc ctggctcagg 2040

ctgcagggat tggatcctaa ggccacgtat agcgttgatg gaaacggatc gtactctggt 2100

gcggcattga tgaacatggg actgcagtac aagtttgaat cggattatga tagcaaggtg 2160

gtgttcttgc agaagcagtg a 2181

<210> 4

<211> 2223

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

catcatcacc accaccacga ctacaaagac gacgacgaca aaatggccca agaaacctcc 60

tccaacaacg ccgtcgtcgc cgacggaaaa accttcgccc ttaacggtga aaacgtctct 120

tacagattca gagtaaatga aaccaccggt gatcttgtct ctgatcactt tggtggttct 180

attacaggtg atttgtttcc aggtttcggt gctgaagctt tgggtggttg ggttggtttg 240

gctggtagat ttagaagaga gtttccagat catggtagag gtgattttag aatccctgcc 300

gttagaatta gacaggaggc tggttacact gttactgatt tgcagtatca atcttactct 360

gttatacctg gtaagccagc tttgcctggt ttgccatcta cttttggttc tgaagaagat 420

gttactaccc ttgttgttca tttgtacgat aactattctt ccattgctgt tgatttgtct 480

tactctattt tccctaagta cgatgctatt gttagatcag ctaatgttac taataagggt 540

acccaaaaca ttactgtcga ggctttgtcc tccttttctt ttgattttcc atacgaagat 600

ctggagatga ttagtttgag aggtgattgg gccagagaag cccatagaca aagaagaaag 660

gtcgaatacg gattgcaagg ttttggttct tccaccggtt tttcctccca tttgcataac 720

ccatttttgg ccattgttca tccatctact actgaatccc aaggtgaagc ttggggtttt 780

aatttggttt acactggttc tttttccgtt gacgttgaga agggttctca gggtttgact 840

agagctttgt tgggttttaa tccttctcaa ttgtcttggc agttgggtgc tggtgagact 900

ttgacttctc cagagtgtgt ttctgtttat tcttctgacg gtattggagg tatgtctcgt 960

tcttttcata gactgtacag aaatcatctt atcaagtcta agttcgctac tagtgacaga 1020

ccaccattat tgaactcttg ggaaggtctt tattttgatt ataacgaatc caccatctac 1080

agactggccg aagaatccgc cgctttgggt gtcaagctgt ttgttatgga tgatggatgg 1140

tttggtgata agtaccctag agtttctgat aacgctggtt tgggtgattg ggttcctaat 1200

ccagatagat ttcctgatgg tttgactcct ttggttgagg atgttactaa gttgaaggct 1260

ggtaactcct ctactgattt gagatttggt ttgtgggttg aaccagagat ggctaacccc 1320

aactctactt tgtaccatga acacccagat tgggttttgc atgccggtca gtacccaaga 1380

actttgcaga gaaaccagtt ggtcttgaac cttgctttgc cagaagttca agattacatc 1440

attgatgaga ttaccaacat tttgaactct tctgctattt cctacgttaa gtgggatttt 1500

aacagagcca tgcatgagac tccatccccc tctaacgacc atgaatacat tttgggtatg 1560

tacagagttt ttgatacttt gactactaga ttcccagatg tcttgtggga aggttgcgca 1620

tccggtggtg gtagatttga tcctggtgtt ttggaatact ttcctcagat ttggacctcc 1680

gataacactg atgccttgat gagaataact attcaattgg gtactagttt ggcttaccca 1740

ccttctgcta tgggtgctca tttgtctgct gttcctaacg ctcaaaccgg tagaactatt 1800

ccagttaagt ttagaggtca tgttgctatg atgggtggtt cttttggttt ggaattggat 1860

cctgctgaat tgcaagaaga tgaaaaggct gaagtcccag gattgattgc cttggctgaa 1920

aaggtcaacc caattatttt gactggtgat atgtggagat tgagactgcc agaagaatct 1980

aactggccag ctgtgttgtt tatttctgaa gatggtaacc aagccgtttt gttttatttt 2040

cagctgggtc ctaacgttaa ccatgccacc ccttggctta gacttcaagg attggatcca 2100

aaggctactt attctgttga tggtaacggt tcttactccg gtgctgcttt gatgaacatg 2160

ggtttgcaat acaagtttga atccgattac gattctaagg ttgttttttt gcaaaagcaa 2220

taa 2223

<210> 5

<211> 831

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe His His His His His

85 90 95

His Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Gln Glu Thr Ser Ser

100 105 110

Asn Asn Ala Val Val Ala Asp Gly Lys Thr Phe Ala Leu Asn Gly Glu

115 120 125

Asn Val Ser Tyr Arg Phe Arg Val Asn Glu Thr Thr Gly Asp Leu Val

130 135 140

Ser Asp His Phe Gly Gly Ser Ile Thr Gly Asp Leu Phe Pro Gly Phe

145 150 155 160

Gly Ala Glu Ala Leu Gly Gly Trp Val Gly Leu Ala Gly Arg Phe Arg

165 170 175

Arg Glu Phe Pro Asp His Gly Arg Gly Asp Phe Arg Ile Pro Ala Val

180 185 190

Arg Ile Arg Gln Glu Ala Gly Tyr Thr Val Thr Asp Leu Gln Tyr Gln

195 200 205

Ser Tyr Ser Val Ile Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Thr Phe Gly Ser Glu Glu Asp Val Thr Thr Leu Val Val His Leu Tyr

225 230 235 240

Asp Asn Tyr Ser Ser Ile Ala Val Asp Leu Ser Tyr Ser Ile Phe Pro

245 250 255

Lys Tyr Asp Ala Ile Val Arg Ser Ala Asn Val Thr Asn Lys Gly Thr

260 265 270

Gln Asn Ile Thr Val Glu Ala Leu Ser Ser Phe Ser Phe Asp Phe Pro

275 280 285

Tyr Glu Asp Leu Glu Met Ile Ser Leu Arg Gly Asp Trp Ala Arg Glu

290 295 300

Ala His Arg Gln Arg Arg Lys Val Glu Tyr Gly Leu Gln Gly Phe Gly

305 310 315 320

Ser Ser Thr Gly Phe Ser Ser His Leu His Asn Pro Phe Leu Ala Ile

325 330 335

Val His Pro Ser Thr Thr Glu Ser Gln Gly Glu Ala Trp Gly Phe Asn

340 345 350

Leu Val Tyr Thr Gly Ser Phe Ser Val Asp Val Glu Lys Gly Ser Gln

355 360 365

Gly Leu Thr Arg Ala Leu Leu Gly Phe Asn Pro Ser Gln Leu Ser Trp

370 375 380

Gln Leu Gly Ala Gly Glu Thr Leu Thr Ser Pro Glu Cys Val Ser Val

385 390 395 400

Tyr Ser Ser Asp Gly Ile Gly Gly Met Ser Arg Ser Phe His Arg Leu

405 410 415

Tyr Arg Asn His Leu Ile Lys Ser Lys Phe Ala Thr Ser Asp Arg Pro

420 425 430

Pro Leu Leu Asn Ser Trp Glu Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Asn Glu Ser

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Phe Val Met Asp Asp Gly Trp Phe Gly Asp Lys Tyr Pro Arg Val Ser

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Asp Asn Ala Gly Leu Gly Asp Trp Val Pro Asn Pro Asp Arg Phe Pro

485 490 495

Asp Gly Leu Thr Pro Leu Val Glu Asp Val Thr Lys Leu Lys Ala Gly

500 505 510

Asn Ser Ser Thr Asp Leu Arg Phe Gly Leu Trp Val Glu Pro Glu Met

515 520 525

Ala Asn Pro Asn Ser Thr Leu Tyr His Glu His Pro Asp Trp Val Leu

530 535 540

His Ala Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Leu Gln Arg Asn Gln Leu Val Leu

545 550 555 560

Asn Leu Ala Leu Pro Glu Val Gln Asp Tyr Ile Ile Asp Glu Ile Thr

565 570 575

Asn Ile Leu Asn Ser Ser Ala Ile Ser Tyr Val Lys Trp Asp Phe Asn

580 585 590

Arg Ala Met His Glu Thr Pro Ser Pro Ser Asn Asp His Glu Tyr Ile

595 600 605

Leu Gly Met Tyr Arg Val Phe Asp Thr Leu Thr Thr Arg Phe Pro Asp

610 615 620

Val Leu Trp Glu Gly Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Phe Asp Pro Gly

625 630 635 640

Val Leu Glu Tyr Phe Pro Gln Ile Trp Thr Ser Asp Asn Thr Asp Ala

645 650 655

Leu Met Arg Ile Thr Ile Gln Leu Gly Thr Ser Leu Ala Tyr Pro Pro

660 665 670

Ser Ala Met Gly Ala His Leu Ser Ala Val Pro Asn Ala Gln Thr Gly

675 680 685

Arg Thr Ile Pro Val Lys Phe Arg Gly His Val Ala Met Met Gly Gly

690 695 700

Ser Phe Gly Leu Glu Leu Asp Pro Ala Glu Leu Gln Glu Asp Glu Lys

705 710 715 720

Ala Glu Val Pro Gly Leu Ile Ala Leu Ala Glu Lys Val Asn Pro Ile

725 730 735

Ile Leu Thr Gly Asp Met Trp Arg Leu Arg Leu Pro Glu Glu Ser Asn

740 745 750

Trp Pro Ala Val Leu Phe Ile Ser Glu Asp Gly Asn Gln Ala Val Leu

755 760 765

Phe Tyr Phe Gln Leu Gly Pro Asn Val Asn His Ala Thr Pro Trp Leu

770 775 780

Arg Leu Gln Gly Leu Asp Pro Lys Ala Thr Tyr Ser Val Asp Gly Asn

785 790 795 800

Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Ala Leu Met Asn Met Gly Leu Gln Tyr Lys

805 810 815

Phe Glu Ser Asp Tyr Asp Ser Lys Val Val Phe Leu Gln Lys Gln

820 825 830

Claims (10)

1.蛋白质，是如下A1)-A7)中的任一种：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1的第92-817位的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列表中序列1的第87-817位的蛋白质；

A3)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白质；

A4)氨基酸序列是序列表中序列5的第87-831位的蛋白质；

A5)氨基酸序列是序列表中序列5的蛋白质；

A6)将A1)-A5)中任一蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A7)在A1)-A5)中任一蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B10)中的任一种：

B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：

1)序列表中序列3所示的cDNA分子或DNA分子；

2)序列表中序列4的第43-2223位所示的cDNA分子或DNA分子；

3)序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子；

4)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

5)在1)或2)或3)或4)的核苷酸序列的5′或3′端添加标签编码序列得到的编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

6)与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

7)在严格条件下与1)或2)或3)或4)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：所述重组微生物为将B1)所述核酸分子导入微生物中得到的表达权利要求1所述蛋白质的重组微生物。

5.权利要求1所述蛋白质的制备方法，包括：培养含有权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达盒的重组微生物，使权利要求1所述蛋白质的编码基因表达，得到表达所述蛋白质的重组微生物培养物；纯化所述重组微生物培养物得到所述蛋白质。

6.α-半乳糖苷酶制剂，包含权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料。

7.含有α-半乳糖苷键物质的降解方法，包括以α-半乳糖苷键物质为底物用权利要求1所述的蛋白质进行催化反应，完成所述α-半乳糖苷键物质的降解。

8.下述任一应用：

X1、权利要求1所述蛋白质在作为α-半乳糖苷酶中的应用；

X2、权利要求2-4中任一所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶中的应用；

X3、权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在制备α-半乳糖苷酶产品中的应用；

X4、权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在降解含有α-半乳糖苷键物质中的应用；

X5、权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在促进动物对含有α-半乳糖苷键物质的消化和/或吸收中的应用；

X6、权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在促进动物饲料营养物质的消化和/或吸收中的应用；

X7、权利要求1所述蛋白质或权利要求2-4中任一所述生物材料在制备蔗糖和/或半乳糖中的应用。

9.根据权利要求7所述的方法或权利要求8所述的应用，其特征在于：所述含有α-半乳糖苷键物质为含有α-半乳糖苷键的寡糖。

10.根据权利要求9所述的方法或应用：其特征在于：所述寡糖为棉籽糖或水苏糖。