CN105899543A - 研磨方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于处理作物籽粒的方法，这些方法包括以下步骤：a)将籽粒浸泡在水中，以产生浸泡的籽粒；b)碾磨这些浸泡的籽粒；c)在具有蛋白酶活性的多肽的存在下处理这些浸泡的籽粒。
Description
对序列表的引用
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发明领域
本发明涉及一种处理作物籽粒的改进方法，以提供具有高品质的适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉产品。另外，本发明还涉及一种酶组合物并且涉及本发明的组合物的用途，该酶组合物包括一种或多种适于本发明的方法的酶活性。
发明背景
作为大部分作物(例如玉米、小麦、水稻、高粱大豆、大麦或果壳)籽粒的重要成分，在可以将淀粉用于将淀粉转化为糖(例如右旋糖、果糖)、醇(例如乙醇)和增甜剂之前，必须使淀粉可供使用并以一种提供高纯度淀粉的方式加以处理。如果淀粉包含多于0.5％的杂质(包括蛋白质)，则它不适于作为淀粉转化工艺的起始材料。为了从作物籽粒开始提供这样的纯的且高品质的淀粉产品，通常研磨籽粒，如将在下文进一步所描述。
通常使用湿磨将玉米籽粒分离为其四种基本组分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。
典型地，湿磨方法包括四个基本步骤。首先，将籽粒浸泡或浸渍约30分钟至约48小时，以开始使淀粉和蛋白键断裂。该方法的下一步骤涉及粗磨，以破坏果皮并使胚芽与剩余的籽粒分离。剩余的浆液由纤维、淀粉和蛋白质组成，将其细磨并筛选，以将纤维与淀粉和蛋白质分离。在水力旋流器中将淀粉与剩余的浆液分离。然后，可以将淀粉转化为糖浆或醇，或干燥并销售为玉米淀粉，或用化学方法或物理方法修饰以产生改性玉米淀粉。
已经表明了酶对湿磨方法的浸渍步骤的用途。已经显示，商业酶产品(可获得自诺维信公司(Novozymes A/S))适于湿磨方法的第一步骤，即将玉米籽粒浸泡在水中的浸渍步骤。
最近，已经研发了“酶研磨(enzymatic milling)”，这是一种改性湿磨方法，该方法使用蛋白酶以在玉米湿磨过程中显著减少总的处理时间并消除了对作为加工剂的二氧化硫的需求。参见约翰斯顿(Johnston)等人，谷物化学(Cereal Chem)，81，第626-632页(2004)。
US 6,566,125披露了一种用于从玉蜀黍获得淀粉的方法，该方法涉及将玉蜀黍籽粒浸泡在水中以产生浸泡的玉蜀黍籽粒，碾磨浸泡的玉蜀黍籽粒以产生碾磨的玉蜀黍浆液并用酶(例如，蛋白酶)孵育该经碾磨的玉蜀黍浆液。
US 5,066,218披露了一种研磨谷物(尤其是玉米)的方法，该方法包括清洗谷物，将谷物浸渍在水中以将其软化，并且然后用纤维素酶研磨谷物。
WO 2002/000731披露了一种处理作物籽粒的方法，该方法包括将籽粒在水中浸泡1-12小时，湿磨浸泡的籽粒并用一种或多种酶(包括酸性蛋白酶)处理籽粒。
WO 2002/000911披露了一种分离淀粉面筋的方法，该方法包括使研磨淀粉经受酸性蛋白酶。
WO 2002/002644披露了一种洗涤获得自研磨方法的淀粉面筋分离步骤的淀粉浆液的方法，该方法包括用包括有效量的酸性蛋白酶的水溶液洗涤淀粉浆液。
仍需要改进用于提供适于转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉的方法。
发明概述
本发明涉及一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；
b)碾磨这些浸泡的籽粒；
c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，
其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，
并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
在一个优选实施例中，具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、或来自污叉丝孔菌(Dichomitus squalens)或变色栓菌(Trametes vericolor)的S53蛋白酶。
在一个优选实施例中，该蛋白酶包括以下各项或由其组成：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6。
在一个优选实施例中，该蛋白酶包括以下各项或由其组成：披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。
本发明还涉及在处理作物籽粒的方法中使用的多肽的用途以及包括在本发明中使用的多肽的酶组合物。
序列表综述
SEQ ID NO:1是如分离自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的cDNA序列。
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是具有HQ标记的重组表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是来自大型亚灰树花菌的成熟S53蛋白酶3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是从SEQ ID NO:3获得的成熟S53蛋白酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7是引物597。
SEQ ID NO:8是引物598
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从成熟的剪接的mRNA分子逆转录制备的DNA分子，该mRNA分子是从真核细胞获得的。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指包括编码多肽的多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的其他核苷酸的线性或环形DNA分子。
片段：术语“片段”意指使一个或多个(例如若干个)氨基酸从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面，一个片段包含至少330个氨基酸残基(例如，SEQ IDNO:2的氨基酸20至349)；在另一个方面，一个片段包含至少345个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸10至354)；在一个另外的方面，一个片段包含至少355个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸5至359)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指相对于自然界中发现的那种多核苷酸通过人工手动修饰的多核苷酸。在一个方面，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的，如通过琼脂糖电泳所确定的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
分离的多肽：术语“分离的多肽”意指相对于自然界中发现的那种多肽通过人工手动修饰的多肽。在一个方面，该多肽是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于使用具有N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼(Edman)降解和整体分子量分析的测序，该成熟多肽是SEQID NO:2的编号中的氨基酸1至366。使用预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID NO:2的编号中的氨基酸-198至-182被预测为信号肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于通过具有N-末端HQ标记的成熟多肽的埃德曼降解和整体分子量分析对该成熟多肽的确定，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的编码中的核苷酸605至1702。此外，基于预测程序SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，SEQ ID NO:1的编号中的核苷酸11至61被预测编码信号肽。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以一种方式被修饰成包含在自然界中不会另外存在的核酸区段的、或合成的单链或双链核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。存在若干种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有酸性最适pH(最适pH<pH7)的丝氨酸内肽酶(EC3.4.21)。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森，M.L.，1938，普通生理学杂志22:79)。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，同上)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所使用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一个方面，一个子序列包含至少990个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸662至1651)，例如，以及至少1035个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸632至1666)；例如，以及至少1065个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸617至1681)。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外来的或不需要的核苷酸的多核苷酸制剂，并且其存在的形式适于在基因工程化多肽生产系统内进行使用。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选处于基本上纯的形式。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制剂，该制剂包含与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的蛋白酶活性。
在一个方面，该变体与如在此鉴定的SEQ ID NO:的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的在此的SEQ ID NO:的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入在此的SEQ ID NO:的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
β-葡糖苷酶：术语“β-葡糖苷酶”意指β-D-葡糖苷葡糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化末端非还原β-D-葡萄糖残基的水解，并释放β-D-葡萄糖。出于本发明的目的，根据文丘里(Venturi)等人，2002，来自嗜热毛壳菌嗜粪变种的胞外β-D-葡糖苷酶：产生、纯化以及一些生物化学特性(Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomiumthermophilum var.coprophilum:production,purification and somebiochemical properties)，基础微生物学杂志(J.Basic Microbiol.)42:55-66的程序，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物来测定β-葡糖苷酶活性。一个单位的β-葡糖苷酶定义为在25℃、pH 4.8下，在含有0.01％20的50mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
β-木糖苷酶：术语“β-木糖苷酶”意指β-D木糖苷木糖水解酶(E.C.3.2.1.37)，其催化短β(1→4)木寡糖的外水解以从非还原端去除连续的D-木糖残基。出于本发明的目的，一个单位的β-木糖苷酶定义为在40℃、pH 5下，在含有0.01％20的100mM柠檬酸钠中从作为底物的1mM对硝基苯基-β-D-木糖苷每分钟产生1.0微摩尔的对硝基苯酚阴离子。
纤维二糖水解酶：术语“纤维二糖水解酶”意指一种1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91和E.C.3.2.1.176)，其催化纤维素、纤维寡糖或任何含β-1,4-连接的葡萄糖的聚合物中的1,4-β-D-糖苷键水解，从该链的还原端或非还原端释放纤维二糖(泰里(Teeri)，1997，晶态纤维素降解：纤维二糖水解酶功能的新见解(Crystalline cellulosedegradation:New insight into the function of cellobiohydrolases)，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)15:160-167；泰里等人，里氏木霉纤维二糖水解酶：为何对晶态纤维素如此有效？(Trichoderma reeseicellobiohydrolases:why so efficient on crystalline cellulose？)，生物化学学会学报(Biochem.Soc.Trans.)26:173-178)。根据里弗(Lever)等人，1972，分析生物化学(Anal.Biochem.)47:273-279；范·帝伯赫(vanTilbeurgh)等人，1982，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)，149:152-156；范·帝伯赫和克莱森斯(Claeyssens)，1985，欧洲生化学会联合会快报，187:283-288；以及汤美(Tomme)等人，1988，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)170:575-581所描述的程序来测定纤维二糖水解酶活性。在本发明中，汤美(Tomme)等人的方法可以用于测定纤维二糖水解酶活性。
纤维素分解酶或纤维素酶：术语“纤维素分解酶”或“纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解纤维素材料的酶。此类酶包括一种或多种内切葡聚糖酶、一种或多种纤维二糖水解酶、一种或多种β-葡糖苷酶、或其组合。用于测量纤维素分解活性的两种基本方法包括：(1)测量总纤维素分解活性，和(2)测量单独的纤维素分解活性(内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶以及β-葡糖苷酶)，如在张(Zhang)等人，纤维素酶改进的展望：筛选和选择策略(Outlook for cellulaseimprovement:Screening and selection strategies)，2006，生物技术进展(Biotechnology Advances)24:452-481中所综述的。通常使用不溶性底物，包括沃特曼(Whatman)№1滤纸、微晶纤维素、细菌纤维素、藻类纤维素、棉花、预处理的木质纤维素等，测量总纤维素分解活性。最常用的总纤维素分解活性测定是使用沃特曼№1滤纸作为底物的滤纸测定。该测定是由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)(高斯(Ghose)，1987，纤维素酶活性的测量(Measurement of cellulaseactivities)，纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem.)59:257-68)确立的。
纤维素材料：术语“纤维素材料”意指含有纤维素的任何材料。纤维素是脱水纤维二糖的均聚物，并且因此是线性β-(l-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包括多种化合物，如具有一系列取代基以复杂支链结构存在的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯糖基木聚糖以及甘露聚糖。尽管纤维素一般为多态的，但发现其在植物组织中主要以平行葡聚糖链的不溶性晶体基质存在。半纤维素通常氢键合至纤维素以及其他半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
内切葡聚糖酶：术语“内切葡聚糖酶”意指一种内切-1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中的1,4-β-D-糖苷键和混合β-1,3葡聚糖如谷物β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纤维素组分的其他植物材料中的β-1,4键的内切水解。可以通过测量底物粘度的降低或通过还原糖测定所确定的还原末端的增加来确定内切葡聚糖酶活性(张(Zhang)等人，2006，生物技术进展(BiotechnologyAdvances)24:452-481)。出于本发明的目的，根据高斯(Ghose)，1987，纯粹与应用化学(Pure and Appl.Chem.)59:257-268的程序，在pH 5、40℃下，使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物测定内切葡聚糖酶活性。
家族61糖苷水解酶：术语“家族61糖苷水解酶”或“家族GH61”或“GH61”意指根据亨利萨特(Henrissat)B.，1991，基于氨基酸序列相似性的糖基水解酶的分类(A classification of glycosyl hydrolasesbased on amino-acid sequence similarities)，生物化学杂志(Biochem.J.)280:309-316；和亨利萨特B.和贝洛赫(Bairoch)A.，1996，修正糖基水解酶的基于序列的分类(Updating the sequence-based classification ofglycosyl hydrolases)，生物化学杂志316:695-696属于糖苷水解酶家族61的多肽。这个家族中的酶最初基于在一个家族成员中测量到的非常弱的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性而被分类为糖苷水解酶家族。这些酶的结构和作用模式是不规范的，并且它们不能被视为真正的糖苷酶。然而，基于它们在与纤维素酶或纤维素酶的混合物结合使用时增强木质纤维素分解的能力，它们被保留在CAZy分类中。
半纤维素分解酶或半纤维素酶：术语“半纤维素分解酶”或“半纤维素酶”意指一种或多种(例如，若干种)水解半纤维素材料的酶。参见例如，沙洛姆(Shallom)，D.和肖汉姆(Shoham)，Y.微生物半纤维素酶(Microbial hemicellulases)，微生物学新见(Current Opinion InMicrobiology)，2003，6(3):219-228)。半纤维素酶是在植物生物质的降解中的关键组分。半纤维素酶的实例包括但不限于，乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、香豆酸酯酶、阿魏酸酯酶、半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、葡糖醛酸酯酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木聚糖酶以及木糖苷酶。这些酶的底物即半纤维素是支链和线性多糖的异质群体，这些多糖经由氢键与植物细胞壁中的纤维素微纤维键合，从而将它们交联成一个稳固网络。半纤维素还共价附接至木质素，从而与纤维素一起形成高度复杂的结构。半纤维素的可变结构和组织要求许多酶的协同作用以使其完全降解。半纤维素酶的催化模块是水解糖苷键的糖苷水解酶(GH)，或是水解乙酸或阿魏酸侧基的酯键的碳水化合物酯酶(CE)。这些催化模块基于它们一级序列的同源性，可以被分配到GH和CE家族中。具有总体相似的折叠的一些家族可以进一步被分组为以字母标记的氏族(例如，GH-A)。这些和其他碳水化合物活性酶的最具信息性和最新的分类可在碳水化合物活性酶(Carbohydrate-Active Enzymes)(CAZy)数据库中获得。可以根据高斯(Ghose)和比萨拉(Bisaria)，1987，纯粹与应用化学(Pure&AppI.Chem.)59:1739-1752，在适合的温度(例如50℃、55℃、或60℃)和pH(例如5.0或5.5)下测量半纤维素分解酶活性。
具有纤维素分解增强活性的多肽：术语“具有纤维素分解增强活性的多肽”意指促进具有纤维素分解活性的酶对纤维素材料的水解的增强的GH61多肽。在一个方面，使用在总蛋白质重量的2％-3％的米曲霉β-葡糖苷酶(根据WO 02/095014在米曲霉中重组产生)或总蛋白质重量的2％-3％的烟曲霉β-葡糖苷酶(如WO 2002/095014中所描述在米曲霉中重组产生)的纤维素酶蛋白负载量存在的情况下1.5L(诺维信公司，巴格斯瓦尔德，丹麦)的混合物作为纤维素分解活性的来源。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽通过将达到相同的水解程度所需要的纤维素分解酶的量降低优选至少1.01倍，例如，至少1.05倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍，来增强由具有纤维素分解活性的酶催化的纤维素材料的水解。
木聚糖酶：术语“木聚糖酶”意指1,4-β-D-木聚糖-木糖水解酶(E.C.3.2.1.8)，其催化木聚糖中的1,4-β-D-木糖苷键的内切水解。出于本发明的目的，在37℃下，在0.01％X-100和200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中用0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖作为底物来测定木聚糖酶活性。一个单位的木聚糖酶活性定义为在200mM磷酸钠缓冲液(pH 6)中，在37℃、pH 6下，从作为底物的0.2％AZCL-阿拉伯糖基木聚糖中每分钟产生1.0微摩尔天青精。
其他定义
作物籽粒：术语“作物籽粒”包括来自例如玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、果壳以及小麦的籽粒。玉米籽粒是示例性的。已知多种玉米籽粒，包括例如马齿型玉米、硬粒玉米、有稃种玉米、具条纹玉米、甜玉米、糯玉米等。
在一个实施例中，该玉米籽粒是黄色马齿型玉米籽粒。黄色马齿型玉米籽粒具有称为“果皮(Pericarp)”的外部覆盖物，保护籽粒中的胚芽。它防水和水蒸气并且是昆虫和微生物所不希望的。
未被“果皮”覆盖的籽粒的唯一区域是“顶帽(Tip Cap)”，它是籽粒至穗轴的附着点。
胚芽：“胚芽”是玉米籽粒的唯一存活部分。它包含籽粒生长为玉米植株所必需的遗传信息、酶、维生素以及矿物质。在黄色马齿型玉米中，约25％的胚芽是玉米油。覆盖且包围胚芽的胚乳构成约82％的籽粒干重并且是种子萌发的能量(淀粉)和蛋白来源。存在两种类型的胚乳，软胚乳和硬胚乳。在硬胚乳中，淀粉被紧紧地堆积在一起。在软胚乳中，淀粉是松散的。
淀粉：术语“淀粉”意指由植物的复杂多糖构成、由广泛出现在植物组织中的呈贮藏粒形式的葡萄糖单元构成、由直链淀粉和支链淀粉组成且表示为(C6H10O5)n(其中n是任何数字)的任何材料。
研磨的：术语“研磨的”是指植物材料已经例如通过粉碎、分级、碾磨、磨碎等而被分解成更小的颗粒。
碾磨(grind或grinding)：术语“碾磨”意指破坏果皮并打开作物籽粒的任何方法。
浸渍(steep或steeping)：术语“浸渍”意指用水以及任选地SO2浸泡作物籽粒。
干固体：术语“干固体”是在干重基础上的浆液的全固体(以百分比计)。
寡糖：术语“寡糖”是具有2至10个单糖单位的化合物。
湿磨益处：术语“湿磨益处”意指改进的淀粉产量和/或纯度，改进的面筋产量和/或纯度，改进的纤维纯度、或浸渍水过滤、脱水和蒸发，更容易地分离胚芽和/或更好的糖化后过滤及其过程能源节约中的一种或多种。
发明详述
具有蛋白酶活性的多肽
具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC 3.4酶组(包括其十八个亚类中的每一个)的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于1994，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)223:1-5；1995，欧洲生物化学杂志232:1-6；1996，欧洲生物化学杂志237:1-5；1997，欧洲生物化学杂志250:1-6；以及1999，欧洲生物化学杂志264:610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
用于本发明的方法的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
(a)属于EC 3.4.21酶组的蛋白酶；和/或
(b)属于EC 3.4.14酶组的蛋白酶；和/或
(c)肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶，其包含两种不同类型的肽酶：三肽基氨肽酶(外切型)和内切肽酶；如在1993，生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.4(2011年1月31日)(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.，2010，“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)”，核酸研究(Nucl.Acids Res.)38:D227-D233中。
为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
S53肽酶家族包含酸起作用的内肽酶和三肽基-肽酶。催化三联体的残基是Glu、Asp、Ser，并且在氧阴离子穴中存在一个另外的酸性残基Asp。这些残基的次序是Glu、Asp、Asp、Ser。该Ser残基在枯草杆菌蛋白酶的Asp、His、Ser三联体中是等价于Ser的亲核体，并且该三联体的Glu是枯草杆菌蛋白酶中的广义碱基His的一个代替物。
该催化三联体或氧阴离子穴的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:5)的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175和Ser-283。来自变色栓菌(披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24)的S53蛋白酶的催化三联体和氧阴离子穴的氨基酸可能是位置Glu-85、Asp-89、Asp-175和Ser-283。
该S53家族的肽酶倾向于在酸性pH下最有活性(不像同源的枯草杆菌蛋白酶)，并且这可归因于羧基残基(尤其是Asp)在氧阴离子穴中的功能重要性。这些氨基酸序列不与家族S8(即丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶和同系物)中的那些密切相似，并且这一点与完全不同的活性位点残基以及关于最大活性的所得的较低的pH一起，为该家族提供了实质性差异。肽酶单元的蛋白质折叠对于这个家族的成员来说与枯草杆菌蛋白酶的类似，具有氏族类型SB。
关于本发明，鉴定并克隆了在低pH(3-4)下对湿磨具有高活性的来自大型亚灰树花菌的新的S53蛋白酶。为了确定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S53家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
用于本发明的方法中的蛋白酶是肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶展现了pH特性，尤其是pH稳定性特性，这使它们作为用于在湿磨和其他应用中使用的候选物具有实质性利益。
用于本发明的方法中的蛋白酶是酸性蛋白酶，其中在P1位置中偏好疏水性氨基酸残基，例如Leu、Tyr、Phe和Met。这些蛋白酶在一个宽的从2-5的pH范围下对Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA和Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA具有活性，并在经受低至3的pH 2小时之后保留多于95％的活性。
用于本发明的方法中的具有蛋白酶活性的多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
在一个实施例中，该蛋白酶可以按以下量存在：0.00005-2.5mg酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.001至1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.01至0.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。
在一个实施例中，该蛋白酶是一种按以下量添加的酸性蛋白酶：1-20,000HUT/100g DS籽粒，例如1-10,000HUT/100g DS籽粒，优选300-8,000HUT/100g DS籽粒，尤其是3,000-6,000HUT/100g DS籽粒，或4,000-20,000HUT/100g DS籽粒酸性蛋白酶，优选5,000-10,000HUT/100g，尤其是从6,000-16,500HUT/100g DS籽粒。
在一个实施例中，使用描述于以下“材料与方法”部分中的测定确定蛋白酶活性，如动力学Suc-AAPF-pNA测定、Protazyme AK测定、动力学Suc-AAPX-pNA测定以及邻苯二甲醛(OPA)。对于ProtazymeAK测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶Protazyme AK(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。
在一个实施例中，这些多肽具有SEQ ID NO:6的多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、或至少91％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少92％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少93％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少94％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少95％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少96％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少97％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少98％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少99％的序列一致性。
本发明的一个实施例，具有蛋白酶活性的该多肽或由多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有100％的序列一致性。
在本发明的一个实施例中，具有蛋白酶活性的该多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽。
在一个方面，这些多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽相差不多于三十个氨基酸，例如，相差二十五个氨基酸、相差二十个氨基酸、相差十五个氨基酸、相差十二个氨基酸、相差十个氨基酸、相差九个氨基酸、相差八个氨基酸、相差七个氨基酸、相差六个氨基酸、相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸、以及相差一个氨基酸。
在一个实施例中，用于本发明的方法中的蛋白酶优选地包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽的氨基酸序列、其等位基因变体；或是从N-末端和/或C-末端缺失例如30、25、20、15、10或5个氨基酸并具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面，该多肽包括SEQ ID NO:5的多肽或由其组成。在另一个优选方面，该多肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至366或由其组成。
在一个实施例中，用于本发明的方法中的多肽具有蛋白酶活性并且由以下多核苷酸编码，这些多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补链杂交(J.萨姆布鲁克(Sambrook)，E.F.弗里奇(Fritsch)和T.马尼亚蒂斯(Maniatis)，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。
SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列，连同SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的氨基酸序列或其片段可以用于设计核酸探针，用以根据本领域中众所周知的方法从不同属或种的菌株中鉴定并且克隆出编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。具体地说，此类探针可以用于遵循标准DNA印迹程序与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以便鉴定并分离其中的相应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少14，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的DNA。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中优选使用载体材料。
出于本发明的一个目的，杂交表明多核苷酸在非常低至非常高严格条件下与被标记的核酸探针杂交，该探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、其全长互补链或其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是其片段。在另一个方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，高至非常高严格条件定义为最佳地遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中，以及对于非常低和低严格条件在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格条件在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格条件在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃(高严格条件)和在70℃(非常高严格条件)下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件定义为最佳地遵循标准DNA印迹程序，在比使用根据博尔顿(Bolton)和麦卡锡(McCarthy)(1962，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)48:1390)的计算所计算的Tm低约5℃至约10℃下，在每ml 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt’s solution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。最后，将载体材料在比所计算的Tm低5℃至10℃下，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤两次(每次15分钟)。
在另一个实施例中，本发明涉及使用在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽或其同源序列的一个或多个(或若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的变体。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代、插入或缺失；典型地一个至约30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达约20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸标记或HQ标记、抗原表位或结合域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。预期不会实质上改变比活性的最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等。
亲本多肽中的必需氨基酸可以根据本领域中已知的程序来鉴定，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与亲本多肽相关的多肽的一致性分析推断必需氨基酸的身份。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的成熟多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数不多于20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一部分在另一种多肽的一部分的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合蛋白还可以使用内含肽技术构建，其中融合在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两种多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被位点，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白：结构、功能和遗传学(Proteins：Structure,Function,andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
该多肽可以由包含对于His标记或HQ标记的编码的重组DNA序列来表达，以在任意翻译后修饰之后给出包含该His标记或HQ标记的全部或部分的成熟多肽。该HQ标记(具有序列-RHQHQHQ)可以在翻译后修饰过程中完全或部分切割掉，得到例如附接至成熟多肽的N-末端的另外的氨基酸-RHQHQ。
碳水化合物分子通常在翻译后修饰过程中附接至来自真菌来源的多肽。为了辅助质谱分析，该多肽可以用内切糖苷酶孵育以使各N-连接的位置去糖基化。对于每个去糖基化的N-连接位点，一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链上。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的真菌获得根据本发明所使用的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是来自一个门，例如担子菌门内的具有蛋白酶活性的多肽。在一个方面，该多肽是来自伞菌纲的真菌的蛋白酶，例如来自多孔菌目，或来自革菌科，或来自亚灰树花菌属。在一个实施例中，用于本发明的方法中的多肽来自大型亚灰树花菌。
在一个实施例中，用于本发明的方法中的多肽来自叉丝孔菌属(Dichomitus)，优选来自污叉丝孔菌。在一个实施例中，用于本发明的方法中的多肽来自栓菌属，优选来自变色栓菌。
将理解的是，以上提到的物种涵盖完全状态和不完全状态(perfectand imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些分类群的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
多核苷酸
用来分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，并且包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从这样的基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods and Application)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从芽孢杆菌属的一种菌株或来自芽孢杆菌目的另一种或相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
在一些实施例中，这些多核苷酸包括以下多核苷酸或由其组成，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性程度，这些多核苷酸编码具有蛋白酶活性的多肽。
修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与该多肽基本上类似的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。该变体可以基于以SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。
在实施例中，编码具有蛋白酶活性的多肽的多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位基因变体及子序列杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)，如在此所定义。
在一个方面，该多核苷酸包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或SEQ ID NO:1的子序列，该子序列编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NO:2的一个片段，例如SEQID NO:1的核苷酸605至1702的多核苷酸。
研磨方法
研磨籽粒，以便打开结构并且允许进一步加工并且将籽粒分离成四种主要成分：淀粉、胚芽、纤维以及蛋白质。
在一个实施例中，使用湿磨方法。湿磨使纤维和/或胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于平行生产糖浆的场所。
本发明的诸位发明人已经出人意料地发现，可以通过在如在此描述的方法中处理作物籽粒而改进淀粉和/或面筋终产物的品质。
本发明的方法与传统方法相比，产生了更高的淀粉和/或面筋产量和或品质，因为淀粉和面筋终产物更纯和/或获得了更高的产量和/或使用更少的加工时间。另一种优势可以是可以减少需要使用的化学品(例如SO2和NaHSO3)的量或甚至完全除去。
湿磨
淀粉是在植物细胞内作为不溶于水的微小颗粒形式而形成。当放入冷水中时，这些淀粉颗粒可以吸收少量的液体并膨胀。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度下，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。有待根据本发明加工的颗粒状淀粉可以是含有粗淀粉的材料，该材料包括(例如，研磨的)全谷物，这些全谷物包括非淀粉级分，如胚芽残余物和纤维。可以例如通过湿磨将原料(如全谷物)的粒度减少，以便打开结构并允许进一步加工。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。
在一个实施例中，粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。
更具体而言，将玉米籽粒以及其他作物籽粒降解为适于将淀粉转化为单糖和寡糖、乙醇、甜味剂等的淀粉基本由四个步骤组成：
1.浸渍并分离胚芽，
2.洗涤纤维并干燥，
3.分离淀粉面筋，并且
4.洗涤淀粉。
1.浸渍并分离胚芽
通过在约50℃的温度(例如约45℃至60℃之间)下，在水中浸泡约30分钟至约48小时之间(优选30分钟至约15小时)而软化玉米籽粒。在浸渍过程中，籽粒吸水，从而将其水分含量从15％增加至45％并使大小增加超过一倍。任选地向水中添加例如0.1％二氧化硫(SO2)和/或NaHSO3以防止细菌在温暖环境中生长。随着玉米膨胀并软化，浸渍水的温和酸度开始使玉米内的面筋键松散并释放淀粉。在将玉米籽粒浸渍后，它们裂了开来，以释放胚芽。胚芽包含有价值的玉米油。基本上通过使不含其他物质的胚芽段在密切受控的条件下“漂浮(floating)”而将胚芽与淀粉、外壳和纤维的较重密度的混合物分离。这一方法用于消除痕量的玉米油在后面的加工步骤中的任何不利影响。
在本发明的一个实施例中，于范围在40与60℃之间的温度(优选大约50℃)下，将籽粒在水中浸泡2-10小时，优选约3-5小时。
在一个实施例中，在浸泡过程中可以添加0.01％-1％，优选0.05％-0.3％，尤其是0.1％SO2和/或NaHSO3。
2.洗涤纤维并干燥
为了得到最大的淀粉回收同时将终产物中的任何纤维保持至绝对最小值，在加工过程中必须从纤维中洗涤出游离淀粉。收集纤维，并使其成浆并过筛，以回收任何残留的淀粉或蛋白质。
3.分离淀粉面筋
将来自纤维洗涤步骤的淀粉-面筋悬浮液(称作研磨淀粉)分离成淀粉和面筋。与淀粉相比，面筋具有较低的密度。通过使研磨淀粉穿过离心机而容易地旋出面筋。
4.洗涤淀粉。
来自淀粉分离步骤的淀粉浆液包含一些不溶性蛋白质和许多的可溶物。在可以生产顶级品质的淀粉(高纯度淀粉)之前，必须将其除去。在水力旋流器中，将仅仅剩余1％或2％蛋白质的淀粉稀释，洗涤8至14次，重新稀释并再次洗涤，以除去最后痕量的蛋白质并产生高品质淀粉，典型地纯度大于99.5％。
产物
可以使用湿磨生产(但不限于)玉米浆、玉米面筋饲料、胚芽、玉米油、玉米面筋粉、玉米淀粉、改性玉米淀粉、糖浆(例如玉米糖浆)、以及玉米乙醇。
其他酶
下面描述的一种或多种酶和多肽有待以“有效量”用于本发明的方法中。下文应在上文的“定义”部分中的酶披露的背景下加以阅读。
纤维素分解组合物
在一个实施例中，该纤维素分解组合物来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株；腐质霉属的菌株，例如特异腐质霉的菌株，和/或金孢子菌属的菌株，例如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)的菌株。
在一个优选实施例中，该纤维素分解组合物来源于里氏木霉的菌株。
该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，β-葡糖苷酶，β-木糖苷酶，CBHI和CBHII，内切葡聚糖酶，木聚糖酶或其两种、三种或四种的混合物。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种β-木糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种内切葡聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种β-木糖苷酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶以及一种内切葡聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶以及一种木聚糖酶。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种β-木糖苷酶、一种内切葡聚糖酶以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶I。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶I以及一种木聚糖酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种内切葡聚糖酶II以及一种木聚糖酶。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶以及一种CBHI。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、一种β-葡糖苷酶、一种CBHI以及一种CBHII。
该纤维素分解组合物可以进一步包括一种或多种选自下组的酶，该组由以下各项组成：酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、膨胀蛋白以及植酸酶。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。
在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的GH61多肽来源于嗜热子嚢菌属，例如金黄色嗜热子囊菌的菌株(例如在WO 2005/074656中描述为序列号2的一种)；或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2005/074656中的序列号2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于来自青霉属的菌株，例如埃默森青霉菌的菌株(例如在WO2011/041397中披露的一种)，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与WO 2011/041397中的序列号2具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的该GH61多肽来源于梭孢壳属，例如土生梭孢壳霉的菌株(例如在WO 2005/074647中披露为序列号7和序列号8的一种)；或来源于曲霉属的菌株的多肽，例如烟曲霉的菌株(例如在WO 2010/138754中描述为序列号2的一种)，或以下具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，该多肽与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
内切葡聚糖酶
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种内切葡聚糖酶，例如一种内切葡聚糖酶I或内切葡聚糖酶II。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039；WO 93/15186；美国专利号5,275,944；WO 96/02551；美国专利号5,536,655；WO 00/70031；WO 05/093050)；褐色高温双歧菌(Thermobifida fusca)内切葡聚糖酶III(WO 05/093050)；以及褐色高温双歧菌内切葡聚糖酶V(WO 05/093050)。
可以用于本发明的真菌内切葡聚糖酶的实例包括但不限于：里氏木霉内切葡聚糖酶I(彭蒂莱(Penttila)等人，1986，基因(Gene)45:253-263)；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I(GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(萨洛黑莫(Saloheimo)等人，1988，基因63:11-22)；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II(GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(奥卡达(Okada)等人，1988，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64:555-563，GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(萨洛黑莫等人，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:219-228，GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉内切葡聚糖酶(黄(Ooi)等人，1990，核酸研究(Nucleic Acids Research)18:5884)；川地曲霉(spergillus kawachii)内切葡聚糖酶(坂元(Sakamoto)等人，1995，当代遗传学(Current Genetics)27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(萨里拉赫蒂(Saarilahti)等人，1990，基因90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉高温变种内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；热白丝菌(Melanocarpus albomyces)内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙链孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉CBS 117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS 494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢壳霉NRRL 8126CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinum foecundissimum ATCC62373CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是一种内切葡聚糖酶II，例如来源于木霉属的内切葡聚糖酶，例如里氏木霉的菌株(例如在WO2011/057140中描述为序列号22的一种)；或以下内切葡聚糖酶，该内切葡聚糖酶与WO 2011/057140中的序列号22具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面，该蛋白酶与WO2011/057140中的序列号22的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的WO 2011/057140中的序列号22的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入WO 2011/057140中的序列号22的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
木聚糖酶
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种木聚糖酶。在一个优选方面，该木聚糖酶是一种家族10木聚糖酶。
有用于本发明的方法的木聚糖酶的实例包括但不限于来自以下各项的木聚糖酶：棘孢曲霉(GeneSeqP:AAR63790；WO 94/21785)、烟曲霉(WO 2006/078256)、嗜松青霉菌(WO 2011/041405)、青霉菌属种(WO 2010/126772)、土生梭孢壳霉NRRL 8126(WO 2009/079210)以及褐孢长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(WO 2011/057083)。
在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如棘孢曲霉的菌株(例如在WO 94/021785中描述为序列号5(称为Xyl II)的一种)；或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO 94/021785中的序列号5具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面，该蛋白酶与描述于WO 94/021785中的序列号5的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于WO94/021785中的序列号5的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入描述于WO 94/021785中的序列号5的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
在一个实施例中，该GH10木聚糖酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2006/078256中描述为SEQ ID NO:6(作为Xyl III)；或以下GH10木聚糖酶，该木聚糖酶与WO 2006/078256中的Xyl III具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面，该蛋白酶与描述于WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于WO2006/078256中的SEQ ID NO:6的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入描述于WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
β-木糖苷酶
有用于本发明的方法的β-木糖苷酶的实例包括但不限于来自以下各项的β-木糖苷酶：粗糙链孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)、里氏木霉(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)以及埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(SwissProt登录号Q8X212)。
在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株(例如在WO 2011/057140中描述为序列号206的一种)；或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与WO 2011/057140中的序列号206具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。在一个方面，该蛋白酶与描述于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入的描述于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入描述于WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸。
在一个实施例中，该β-木糖苷酶来源于曲霉属的菌株，例如烟曲霉的菌株(例如在美国临时号61/526,833或PCT/US 12/052163(实例16和17)中披露的一种)，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株，例如WO 2011/057140中的序列号58的成熟多肽，或以下β-木糖苷酶，该β-木糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
β-葡糖苷酶
在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，该β-葡糖苷酶可以是来源于曲霉属的菌株的β-葡糖苷酶，例如来源于米曲霉的，例如披露于WO 2002/095014中的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或来源于烟曲霉的，例如在WO 2005/047499中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，例如披露于PCT申请PCT/US 11/054185(或美国临时申请号61/388,997)中的一种，例如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2005/047499中描述的一种，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
在一个实施例中，该β-葡糖苷酶来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2012/044915中描述的一种，或以下β-葡糖苷酶，该β-葡糖苷酶与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
纤维二糖水解酶I
在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBH I(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种纤维二糖水解酶I(CBHI)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶I，例如烟曲霉的菌株，例如披露于WO 2011/057140中的序列号2中的Cel7A CBHI，或来源于木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维二糖水解酶I来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或以下CBHI，该CBHI与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
纤维二糖水解酶II
在一个实施例中，该纤维素分解组合物可以包括一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II(CBHII)，例如来源于曲霉属的菌株的纤维二糖水解酶II，例如烟曲霉的菌株；或木霉属的菌株，例如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，例如土生梭孢壳霉的菌株，例如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶IICEL6A。
在一个实施例中，该纤维二糖水解酶II来源于曲霉属，例如烟曲霉的菌株，例如在WO 2011/057140中描述的一种，或以下CBHII，该CBHII与其具有至少80％，例如至少85％、例如至少90％，优选95％，例如至少96％、例如97％、例如至少98％、例如至少99％一致性。
示例性纤维素分解组合物
如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(例如酶)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素酶制剂，该制剂包含米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如WO 2008/057637中的SEQ ID NO:74或76)以及金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括棘孢曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 94/021785中的SEQ ID NO:5(Xyl II))和一种里氏木霉纤维素酶制剂的共混物，该制剂包含烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO 2005/047499中的SEQ ID NO:2)和金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括烟曲霉GH10木聚糖酶(例如，WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:206)与一种里氏木霉纤维素酶制剂的共混物，该制剂包含烟曲霉纤维二糖水解酶I(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6)、烟曲霉纤维二糖水解酶II(例如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:18)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(例如，披露于WO 2012/044915中的具有F100D、S283G、N456E、F512Y取代的变体)以及青霉属(埃默森青霉菌)GH61多肽(例如，WO 2011/041397中的SEQ ID NO:2)。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(例如，WO 2008/057637的SEQ ID NO:74或76)。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括具有纤维素分解增强活性的金黄色嗜热子囊菌GH61A多肽(例如，WO2005/074656中的SEQ ID NO:2)以及烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物进一步包括例如在WO 2011/041397中披露为SEQ ID NO:2的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(例如，WO2005/047499中的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。
该酶组合物可以是干粉或颗粒、非尘颗粒、液体、稳定化的液体或稳定化的受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，对液体酶组合物进行稳定化。
酶量
在具体实施例中，蛋白酶以酶蛋白的总量的约5％w/w至约65％w/w的范围存在于酶组合物中。在其他实施例中，蛋白酶以约5％w/w至约60％w/w、约5％w/w至约50％w/w、约5％w/w至约40％w/w、约5％w/w至约30％w/w、约10％w/w至约30％w/w、或约10％w/w至约20％w/w存在。
可以按有效量添加酶，可以根据从业者和具体过程需要调节该有效量。通常，酶可以按以下量存在：0.0001-2.5mg总酶蛋白/g干固体(DS)籽粒，优选0.001-1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.0025-0.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.025-0.25mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.05-0.125mg酶蛋白/g DS籽粒。在具体实施例中，该酶可以按以下量存在，例如2.5μg、12.5μg、25μg、50μg、75μg、100μg、125μg、150μg、175μg、200μg、250μg、500μg酶蛋白/g DS籽粒。
其他酶活性
根据本发明，以下活性中的一种或多种的有效量可以在处理籽粒的过程中存在或添加：戊聚糖酶、果胶酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶(arabinofurasidase)、木葡聚糖酶、植酸酶活性。
据信在将籽粒分为更细的颗粒后，该一种或多种酶可以更直接地作用于籽粒的细胞壁和蛋白基质并且因此更有效。因而，在随后的步骤中，更加容易地将淀粉洗出。
优选实施例
本发明的以下实施例是示例性的。
1.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；
b)碾磨这些浸泡的籽粒；
c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，
其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，
并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少80％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
2.如实施例1所述的方法，其中所述多肽是一种与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多肽。
3.如实施例1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性。
4.如实施例1所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQID NO:25的多肽。
5.如以上实施例中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3、来自污叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白酶。
6.如以上实施例中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽来自叉丝孔菌属，优选来自污叉丝孔菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽来自栓菌属，优选来自变色栓菌。
7.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在β-木糖苷酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
8.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素酶和/或半纤维素酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
9.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在木聚糖酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
10.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素分解组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该纤维素分解组合物包括：1)纤维素酶或半纤维素酶，和2)GH61多肽。
11.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在乙酰木聚糖酯酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
12.如以上实施例中任一项所述的方法，该方法进一步包括在一种选自下组的酶的存在下处理这些浸泡的籽粒，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61多肽、或其组合。
13.如以上实施例中任一项的方法，其中所述多肽按以下量存在：优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.001至1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.01至0.5mg酶蛋白质/g DS籽粒，优选0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。
14.如以上实施例中任一项所述的方法，其中这些作物籽粒来自玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、或果壳或小麦。
15.一种酶组合物，包括一种具有蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
16.如实施例15所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽。
17.如实施例15或16所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3。
18.如实施例15-17中任一项所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌。
19.如实施例15-18中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种选自下组的酶，该酶由以下各项组成：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、GH61多肽、或其组合。
20.如实施例15-19中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括β-木糖苷酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶。
21.肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽或如实施例15-20中任一项所述的酶组合物在如以上实施例1-14中任一项所述的方法中的用途，其中所述多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽或者披露于WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24或SEQ ID NO:25的多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
22.如实施例21所述的用途，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25的多肽。
23.如实施例21-22中任一项所述的用途，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3、来自污叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白酶。
24.如实施例21-23中任一项所述的用途，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽来自叉丝孔菌属，优选来自污叉丝孔菌，或具有蛋白酶活性的所述多肽来自栓菌属，优选来自变色栓菌。
实例
材料与方法
酶
蛋白酶I：来自披露于WO 95/02044中的棘孢曲霉CBS 101.43的酸性蛋白酶。
蛋白酶A：来自金黄色嗜热子囊菌(AP025)的具有如WO2003/048353-A1中的SEQ ID NO:2的氨基酸1-177所示的成熟氨基酸序列的金属蛋白酶。
蛋白酶B：产生于米曲霉中的可获得自丹麦的诺维信公司的米黑根毛霉衍生的天冬氨酸内肽酶(NovorenTM)。
蛋白酶3M.g.：如披露于下文实例1和2制备的并且可获得自丹麦的诺维信公司的来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3。
蛋白酶C：来自污叉丝孔菌的具有如WO 2014/037438中的SEQ IDNO:25所示的氨基酸序列的S53蛋白酶。
蛋白酶D：来自变色栓菌的具有如WO 2014/037438中的SEQ IDNO:24所示的成熟氨基酸序列的S53蛋白酶。
纤维素酶F：一种里氏木霉纤维素分解酶组合物，该里氏木霉纤维素分解酶组合物包含烟曲霉GH10木聚糖酶(WO 2006/078256中的SEQ ID NO:6(Xyl III))和烟曲霉β-木糖苷酶(WO 2013/028928中的SEQ ID NO:16)。
菌株
菌株大型亚灰树花菌分离自诺维信公司于1993年在丹麦收集的子实体。
方法
蛋白酶HUT活性的测定：
1HUT是在40℃和pH 4.7下经30分钟在275nm处的吸光度下将变性的血红蛋白等效物消化为吸光度为0.0084的1.10μg/ml酪氨酸于0.006N HCl中的溶液而形成水解物的酶量。在给定条件下，在0.5M乙酸盐缓冲液中通过酶消化变性的血红蛋白底物。将未消化的血红蛋白用三氯乙酸加以沉淀并且测量上清液中的水解物在275nm下的吸光度。
蛋白酶测定
动力学Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。
将20μl蛋白酶样品(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
端点Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨L-1400)。
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 4.0
将200μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用测定缓冲液稀释45倍)用移液管移至艾本德管(Eppendorf tube)中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪(Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm.)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴并添加600μl 500mM H3BO3/NaOH(pH 9.7)停止孵育。混合该管并将200μl混合物转移至微量滴定板中，将其在OD405处读取。在该测定中包括空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。OD405(样品)-OD405(空白)是蛋白酶活性的量度。
Protazyme AK测定：
底物：Protazyme AK片剂(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 6.5。
通过温和搅拌，将Protazyme AK片剂悬浮于2.0ml 0.01％TritonX-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm.)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μL上清液转移至微量滴定板中，将其在OD650处读取。在该测定中包括空白缓冲液(代替酶)。OD650(样品)-OD650(空白)是蛋白酶活性的量度。
动力学Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPA-pNA(巴亨L-1775)
Suc-AAPR-pNA(巴亨L-1720)
Suc-AAPD-pNA(巴亨L-1835)
Suc-AAPI-pNA(巴亨L-1790)
Suc-AAPM-pNA(巴亨L-1395)
Suc-AAPV-pNA(巴亨L-1770)
Suc-AAPL-pNA(巴亨L-1390)
Suc-AAPE-pNA(巴亨L-1710)
Suc-AAPK-pNA(巴亨L-1725)
Suc-AAPF-pNA(巴亨L-1400)
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，pH 4.0或pH 9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
邻苯二甲醛(OPA)测定：
这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，PM，彼得森(Petersen)，D，达姆麦妮(Dampmann)，C.用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improved method for determining food protein degree of hydrolysis)，食品科学杂志(J Food Sci)，2001，66:642-646)进行该测定。
将500μl样品通过100kDa微量浓缩(Microcon)离心过滤器(60min，11,000rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物，3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)，5.7mM二硫苏糖醇(DDT)，6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(10sec，750rpm)并且在340nm下测量吸光度。
实例1：来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3(SEQ ID NO:3)的重组表达
为了获得用于测试并表征来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3的材料，将来自SEQ ID NO:1的DNA序列克隆进曲霉属表达载体中并在米曲霉中加以表达。
通过使用以下引物，用标准PCR技术扩增来自cDNA质粒克隆pA2PR22的在Seq ID NO:1中没有DNA的终止密码子的编码区而将来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶3基因亚克隆进曲霉属表达载体pMStr100(WO 10/009400)中：
597TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT(SEQ ID NO:7)
598CAGGCCGACCGCGGTGAG(SEQ ID NO:8)
用BamHI限制性酶切PCR产物并将其连接进pMStr100的BamHI和NruI位点，从而在表达载体中形成具有C-末端标记序列RHQHQHQH(终止序列)的框内融合。对所得曲霉属表达构建体pMStr121中的S53蛋白酶3基因测序，并且确认该序列的蛋白酶编码部分与SEQ ID NO:1的原编码序列一致。还确认了标记编码序列的框内融合，从而产生SEQ ID NO:3的序列，该序列编码SEQ ID NO:4的肽序列。
使用如由克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物技术(Biotechnology)6，1419-1422和WO 04/032648描述的标准技术，用pMStr121转化米曲霉菌株BECh2(WO 00/39322)。为了鉴定产生重组蛋白酶的转化体，将这些转化体和BECh2在30℃和200RPM下在10ml的YP+2％葡萄糖培养基中进行培养。在3天生长之后取出样品并用SDS-PAGE分析，以鉴定重组蛋白酶产生。在转化体的培养物中观察到一个35与50kDa之间的新带，在未转化的BECh2的培养物中并未观察到该新带。将似乎以较高水平表达重组蛋白酶的若干转化体在30℃和200RPM下在500ml摇瓶中的100ml的YP+2％葡萄糖培养基中进一步培养。在2、3和4天生长之后取出样品并且通过用SDS-PAGE分析样品而比较表达水平。选择以相对较高的水平表达重组蛋白酶的单个转化体并将其指定为EXP01737。通过在包含0.01％X-100的选择培养基上稀释划线分生孢子而将EXP01737分离两次，以限制菌落大小，并将其如上所述地在摇瓶中的YP+2％葡萄糖培养基中进行发酵，以提供供纯化用的材料。4天生长之后收获摇瓶培养物并且通过Miracloth(卡尔生化公司(Calbiochem))过滤发酵液而除去真菌菌丝体，然后如实例2中所描述加以纯化。
YP+2％葡萄糖培养基
10g酵母提取物
20g蛋白胨
水补至1L
在121℃下高压灭菌20分钟
添加100ml 20％无菌葡萄糖溶液
实例2：从大型亚灰树花菌中纯化具有N-末端HQ标记的S53蛋白酶3
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤，以便除去剩余曲霉属宿主细胞。将0.2μm滤液转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团(GE Healthcare))上的10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)。将G25交联葡聚糖转移的酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的Q-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团)上。收集10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)的贯通流(run-through)和洗涤物并包含S53蛋白酶(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定确认活性)。在将贯通流和洗涤物级分充分混合的同时用1M HCl将该级分的pH调节至pH 3.25。将经pH调节的溶液施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.25)中平衡的SP-交联葡聚糖FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定)，并且合并峰级分。向合并物中添加固体硫酸铵，至2.0M最终(NH4)2SO4浓度。将酶溶液施加至在10mM丁二酸/NaOH、2.0M(NH4)2SO4(pH 3.25)中平衡的苯基-Toyopearl柱(来自东曹公司(TosoHaas))上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将S53蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM丁二酸/NaOH(pH 3.25)之间的线性梯度洗脱超过十个柱体积。分析来自该柱的级分的蛋白酶活性(使用pH 4下的动力学Suc-AAPF-pNA测定)。合并具有较高活性的级分并且将其转移至G25交联葡聚糖柱(来自GE医疗集团)上的10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)。将G25交联葡聚糖转移的蛋白酶施加至在10mM丁二酸/NaOH(pH 3.5)中平衡的SP-交联葡聚糖HP柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过五个柱体积。将来自该柱的构成主峰的级分合并为纯化产物。通过SDS-PAGE分析纯化产物并且在凝胶上看到一个主带和三个次带。这些带的埃德曼N-末端测序显示，所有这些带均与S53蛋白酶相关并且因此我们预期这些次带代表一些S53蛋白酶分子的切口。将纯化产物用于进一步表征。
实例3：来自大型亚灰树花菌的具有N-末端HQ标记的S53蛋白酶3的表征
将动力学Suc-AAPF-pNA测定用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10倍以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 4.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用端点Suc-AAPF-pNA测定以获得在pH 4.0下的温度-活性曲线。使用动力学Suc-AAPX-pNA测定和十种不同的Suc-AAPX-pNA底物以获得酶在pH 4.0下的P1-特异性。
结果示于下表1-4中。在这些表中包括蛋白酶10R(其在WO2014/037438中披露为蛋白酶10R)的数据。对于表1，活性是相对于酶的最适pH而言。对于表2，活性是相对于样品的残余活性而言，将这些样品保持在稳定条件(5℃，pH 4.0针对来自实例2的S53蛋白酶；pH 9.0针对蛋白酶10R)下。对于表3，活性是相对于酶(pH 4.0针对来自实例2的S53蛋白酶；pH 6.5针对蛋白酶10R)的最适温度而言。对于表4，活性是相对于酶的最佳底物(Suc-AAPL-pNA-pNA针对来自实例2的S53蛋白酶)而言。使用Protazyme AK测定以获得蛋白酶10R在pH 6.5下的温度-活性曲线。
表1：如使用动力学Suc-AAPF-pNA测定确定的在25℃下的pH-
活性曲线
表2：如使用动力学Suc-AAPF-pNA测定确定的pH-稳定性曲线(在
37℃下2小时之后的残余活性)
表3：如使用端点Suc-AAPF-pNA测定确定的在pH 4.0或pH 6.5
下的温度活性曲线
表4：如使用动力学Suc-AAPX-pNA测定确定的在37℃下在pH
4.0或pH 9.0下对10种Suc-AAPX-pNA底物的P1-特异性
来自实例2的S53蛋白酶的其他特征
确定N-端序列为：AIPASCASTI。
如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是Mr＝43kDa。
附接至成熟序列的N-末端HQ标记的确认
使用安装有10KD截留过滤器的vivaspin超滤装置将此样品与50mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)进行缓冲液交换。缓冲液交换后，添加2μL的内切糖苷酶H并且然后将该样品在5℃下孵育过夜。注：对于每个去糖基化的N-连接位点，一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链上，从而使每个位点的分子量增加203.19Da。然后通过质谱来分析样品。
通过主峰的完整分子量分析确定的分子量为：38088.6Da，对应于成熟序列加-RHQHQ和单个乙酰己糖胺。
通过次峰的完整分子量分析确定的分子量为：37961Da，对应于成熟序列加-RHQH和单个乙酰己糖胺。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整分子量分析)：
AIPASCASTITPACLQAIYGIPTTKATQSSNKLAVSGFIDQFANKADLKSFLAQFRKDISSSTTFSLQTLDGGENDQSPSEAGIEANLDIQYTVGLATGVPTTFISVGDDFQDGNLEGFLDIINFLLGESNPPQVLTTSYGQNENTISAKLANQLCNAYAQLGARGTSILFASGDGGVSGSQSAHCSNFVPTFPSGCPFMTSVGATQGVSPETAAAFSSGGFSNVFGIPSYQASAVSGYLSALGSTNSGKFNRSGRGFPDVSTQGVDFQIVSGGQTIGVDGTSCASPTFASVISLVNDRLIAAGKSPLGFLNPFLYSSAGKAALNDVTSGSNPGCSTNGFPAKAGWDPVTGLGTPNFAKLLTAVGLRHQHQ(SEQ ID NO:6)。
来自这一成熟序列的计算的分子量是37882.6Da。
实例4：在来自实例2的S53蛋白酶3M.g.的存在下的湿磨
根据以下程序，使玉米的处理经受模拟玉米湿磨过程。两个处理涉及施用来自实例2的S53蛋白酶(浸渍B和浸渍C)，而一个处理是无酶的(浸渍A)。
对于经酶处理的浸渍(浸渍B和浸渍C)，配制包含0.06％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时。16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出。
以类似方式制作无酶的对照浸渍(浸渍A)；除了将它浸渍于0.15％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸渍28小时之外。
将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液(draining)相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水(light steep water)”(“LSW”)。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。
然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器(WaringLaboratory Blender)中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B和浸渍C)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育4小时。如下表5所示进行加酶。
表5.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)
孵育后，将浆液转移至较大的烧杯中，用于除去释放的胚芽。对照浸渍不经历行这一孵育步骤，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工。
对于脱胚，使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物。停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表面。使用漏勺手动地将这些胚芽片从液面上撇出。将胚芽片放置于在其下方具有托盘的US No.100(150μm)筛网上。重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的量的胚芽上浮至表面供撇出。对漏勺中的浆醪的检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所以停止脱胚。然后，将已经积聚在No.100筛网上的胚芽片添加至烧瓶中，在该烧瓶中，将它们与125mL的淡水组合并旋涡，以模拟胚芽洗罐。然后，再次将烧瓶的内容物倾倒在筛网上，确保轻敲烧瓶并且完全清除出其中的胚芽。然后，将撇出烧杯中的脱胚浆液倾倒回搅拌器中，并且使用在筛网的下方的托盘中的胚芽洗涤水将胚芽从烧杯冲洗至搅拌器中。然后，再使用125mL的淡水第二次冲洗烧杯并将其添加至搅拌器中。在分析之前，将筛网上的经洗涤的胚芽在105℃下过夜烘干。
然后，将已经脱胚的纤维、淀粉和面筋浆液在高速下在搅拌器中碾磨3分钟。利用这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋。将搅拌器中的所得碾磨浆液用下方具有托盘的No.100振动筛(莱驰(Retsch)型号AS200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频率设为大约60HZ。一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液(称作“研磨淀粉”)转移进烧瓶中，直到进一步加工。然后，使筛网上的纤维在500mL的淡水中成浆并且然后重新倾倒在振动筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉。再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨淀粉烧瓶中。
然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛，每次使用240mL的淡洗涤水。然后是单次125mL洗涤同时振动，以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105℃下(过夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉烧瓶中。
然后，在烘干之前，通过布氏漏斗中的沃特曼滤纸真空过滤包括淀粉和面筋的研磨淀粉。测量来自真空烧瓶的总滤液体积。将250ml滤液转移至塑料瓶中，用于在105℃下烘干48小时。通过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。将滤饼转移至不锈钢皿中，用于首先在50℃下过夜干燥，以使糊化最小化并且然后在105℃下过夜干燥，以获得干重(淀粉和面筋产量)。表6显示了两个实验中的不同级分产量。
表6实验4中的实验对照和蛋白酶的级分产量。
注：A是两个批次的实验数据的平均值
实例5.在S53蛋白酶3M.g.和纤维素酶F的存在下的湿磨
根据以下程序，使玉米的处理经受模拟玉米湿磨过程。两个处理涉及施用蛋白酶和纤维素酶F的组合(浸渍B和浸渍C)，而一个处理是无酶的(浸渍A)，其中S53蛋白酶来自实例2。对于经酶处理的浸渍(浸渍B和浸渍C)，配制包含0.06％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸的浸渍溶液。针对每个烧瓶，清洗100克的干燥整齐的(黄色马齿型)玉米，以除去破碎籽粒，并且将其放入200mL上述浸渍水中。然后，将所有烧瓶放入设置为52℃同时轻轻振荡的定轨空气加热摇床中并允许在此温度下混合16小时。16小时后，将所有烧瓶从空气摇床中移出。
以类似方式制作无酶的对照浸渍(浸渍A)；除了将它浸渍于0.15％(w/v)SO2和0.5％(w/v)乳酸溶液中并且在碾磨之前浸渍28小时之外。
将玉米混合物倾倒在布氏漏斗上，以使其脱水，并且然后向原浸渍烧瓶中添加100mL的淡自来水并旋涡，用于冲洗目的。然后，将其作为洗涤液倾倒在玉米上并捕获在与原玉米导液相同的烧瓶中。这一洗涤步骤的目的在于保留含有尽可能多的可溶物的滤液。将包含可溶物的滤液称为“轻浸渍水”(“LSW”)。然后，将收集的总轻浸渍水级分烘干，以确定存在的干物质的量。通过以下方式完成干燥：在设置为105℃的烘箱中过夜干燥。
然后，将玉米放置在具有反向叶片的瓦林实验室搅拌器中(所以前缘是钝的)。向该搅拌器中的玉米中添加200mL的水，并且然后将玉米在低速设置下碾磨一分钟，以有助于释放胚芽。碾磨后，立即将浆液转移回烧瓶，用于酶孵育步骤。使用50mL淡水冲洗搅拌器并且还向烧瓶中添加洗涤水。在酶处理烧瓶(浸渍B和浸渍C)中加入酶并将其返回至定轨摇床中，以在52℃下以更高的混合速率再孵育4小时。如下表7所示进行加酶。
表7.实验设计(每克的玉米干物质施用的剂量)
孵育后，将浆液转移至较大的烧杯中，用于除去释放的胚芽。对照浸渍不经历行这一孵育步骤，但是被碾磨并且然后如下所述地被立即加工。
对于脱胚，使用漏勺轻轻地简单地搅拌混合物。停止搅拌后，大量的胚芽片浮至表面。使用漏勺手动地将这些胚芽片从液面上撇出。将胚芽片放置于在其下方具有托盘的US No.100(150μm)筛网上。重复这一混合与撇出过程，直到可忽略不计的量的胚芽上浮至表面供撇出。对漏勺中的浆醪的检查也未显示出在此时有大量的胚芽留在混合物中的证据，所以停止脱胚。然后，将已经积聚在No.100筛网上的胚芽片添加至烧瓶中，在该烧瓶中，将它们与125mL的淡水组合并旋涡，以模拟胚芽洗罐。然后，再次将烧瓶的内容物倾倒在筛网上，确保轻敲烧瓶并且完全清除出其中的胚芽。然后，将撇出烧杯中的脱胚浆液倾倒回搅拌器中，并且使用在筛网的下方的托盘中的胚芽洗涤水将胚芽从烧杯冲洗至搅拌器中。然后，再使用125mL的淡水第二次冲洗烧杯并将其添加至搅拌器中。在分析之前，将筛网上的经洗涤的胚芽在105℃下过夜烘干。
然后，将已经脱胚的纤维、淀粉和面筋浆液在高速下在搅拌器中碾磨3分钟。利用这一增加的速度从纤维中释放尽可能多的淀粉和面筋。将搅拌器中的所得碾磨浆液用下方具有托盘的No.100振动筛(莱驰型号AS200摇筛装置)过筛。将莱驰装置的振荡频率设为大约60HZ。一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液(称作“研磨淀粉”)转移进烧瓶中，直到进一步加工。然后，使筛网上的纤维在500mL的淡水中成浆并且然后重新倾倒在振动筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉。再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨淀粉烧瓶中。
然后，以此方式连续三次洗涤纤维并使其过筛，每次使用240mL的淡洗涤水。然后是单次125mL洗涤同时振动，以实现从纤维级分释放最大量的淀粉和面筋。完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105℃下(过夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉烧瓶中。
然后，在烘干之前，通过布氏漏斗中的沃特曼滤纸真空过滤淀粉和面筋浆液。测量来自真空烧瓶的总滤液体积。将250ml滤液转移至塑料瓶中，用于在105℃下烘干48小时。通过将面筋溶液的体积乘以面筋滤液的总固体而计算这一级分的总可溶性固体含量。将滤饼转移至不锈钢皿中，用于首先在50℃下过夜干燥，以使糊化最小化并且然后在105℃下过夜干燥，以获得干重。表8显示了两个实验中的不同级分产量。
表8实验5中的实验对照和所有共混物的级分产量。
注：A是两个批次实验数据的平均值；B是四个批次实验数据的平均值；C是两个批次实验数据的平均值
实例6.在不同蛋白酶的存在下的纤维洗涤
根据以下程序，使来自植物的经压制纤维的四个处理(测试A、B、C和D)经受模拟纤维洗涤过程。
将来自植物的10g(干重)经压制纤维与200mL pH 3.8(用乳酸调节)水混合。按下表添加酶并在52C孵育1h。
表9加蛋白酶计划
在下方具有托盘的75um筛上分离纤维碎片和淀粉/面筋浆液并且用平面刮刀手动挤压纤维以脱水。一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液转移进研磨淀粉和面筋烧瓶中，直到进一步加工。然后，使筛网上的纤维在200ml的淡水中成浆并且然后重新倾倒在筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉和蛋白质。再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨淀粉和面筋烧瓶中。然后，以此方式再连续两次洗涤纤维并使其过筛，每次使用200mL的淡洗涤水。
完成所有洗涤后，将纤维轻轻地按在筛网上以在将它转移至用于在105℃下(过夜)烘干的铝制秤盘中之前将其脱水。将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉和面筋烧瓶中。
使用布氏漏斗过滤研磨淀粉和面筋，并且此外在105℃烘箱中过夜干燥之前，将所得固体滤饼连同滤纸一起于50℃下放置在预称重的皿中过夜。完全烘干后，对每个级分称重，以获得干物质重量。
下表10示出了对照和酶运行的产物产量(每个级分的干固体/5g玉米干物质的百分比)以及纤维中的残余淀粉含量。这些结果表明，与常规方法和其他蛋白酶相比，蛋白酶3M.g.可以从纤维中释放更多的淀粉和面筋。
表10.实验对照和所有酶处理的级分产量(干物质的总纤维干重％)
实例7.在具有不同S53蛋白酶和纤维素酶的共混物存在下的纤维洗涤
根据以下程序，使来自植物的经压制纤维的五个处理(测试A、B、C和D)经受模拟纤维洗涤过程。
将来自植物的5g(干重)经压制纤维与100mL 0.05M pH 4.0乙酸钠缓冲液混合。按下表添加酶并在52C孵育4h。
表11加蛋白酶计划
在下方具有托盘的75um筛上分离纤维碎片和淀粉/面筋浆液并且用平面刮刀手动挤压纤维以脱水。一旦停止过滤，便将托盘中的淀粉和面筋滤液转移进研磨淀粉和面筋烧瓶中，直到进一步加工。然后，使筛网上的纤维在100ml的淡水中成浆并且然后重新倾倒在筛上，以从纤维中洗去未结合的淀粉和蛋白质。再一次，将托盘中的淀粉和面筋滤液添加至先前的研磨淀粉和面筋烧瓶中。然后，以此方式再连续两次洗涤纤维并使其过筛，每次使用100mL的淡洗涤水。
完成所有洗涤后，将来自洗涤和按压的所有滤液添加至研磨淀粉和面筋烧瓶中。使用布氏漏斗过滤研磨淀粉和面筋，并且此外在105℃烘箱中过夜干燥之前，将所得固体滤饼连同滤纸一起于50℃下放置在预称重的皿中过夜。完全烘干后，对每个级分称重，以获得干物质重量。
下表12示出了对照和酶运行的滤液的不溶物产量(淀粉和面筋)(每个级分的干固体/5g玉米干物质的百分比)。这些结果表明，与常规方法相比，所有S53蛋白酶都可以从纤维中释放更多的淀粉和面筋。
表12.实验对照和所有酶处理的不溶物产量(干物质的总纤维干
重％)
Claims (21)
1.一种用于处理作物籽粒的方法，该方法包括以下步骤：
a)浸泡籽粒以产生浸泡的籽粒；
b)碾磨这些浸泡的籽粒；
c)在具有蛋白酶活性的多肽存在下处理这些浸泡的籽粒，
其中在步骤b)之前、与其同时或之后进行步骤c)，
并且所述多肽是一种肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽是一种与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多肽。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述多肽是由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性。
4.如权利要求1所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或者披露于WO 2014/037438中的SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25。
5.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶、来自污叉丝孔菌的S53蛋白酶或来自变色栓菌的S53蛋白酶。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属、叉丝孔菌属、或栓菌属，优选来自大型亚灰树花菌、污叉丝孔菌或变色栓菌。
7.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在β-木糖苷酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素酶和/或半纤维素酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在木聚糖酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在纤维素分解组合物的存在下处理这些浸泡的籽粒，该纤维素分解组合物包括：1)纤维素酶或半纤维素酶，和2)GH61多肽。
11.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在乙酰木聚糖酯酶的存在下处理这些浸泡的籽粒。
12.如以上权利要求中任一项所述的方法，该方法进一步包括在一种选自下组的酶的存在下处理这些浸泡的籽粒，该组由以下各项组成：内切葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、GH61多肽、或其组合。
13.如以上权利要求中任一项的方法，其中所述多肽按以下量存在：优选0.0005至1.5mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.001至1mg酶蛋白/g DS籽粒，优选0.01至0.5mg酶蛋白质/g DS籽粒，优选0.025至0.25mg酶蛋白/g DS籽粒。
14.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中这些作物籽粒来自玉米(玉蜀黍)、水稻、大麦、高粱大豆、或果壳或小麦。
15.一种酶组合物，包括一种具有蛋白酶活性的多肽，其中所述多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
16.如权利要求15所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽包括以下各项或由其组成：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6。
17.如权利要求15或16所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的该多肽是一种丝氨酸蛋白酶，例如家族S53的一种丝氨酸蛋白酶，例如来自大型亚灰树花菌的S53蛋白酶。
18.如以上权利要求中任一项所述的组合物，其中具有蛋白酶活性的所述多肽来自亚灰树花菌属，优选来自大型亚灰树花菌。
19.如以上权利要求中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括一种选自下组的酶，该酶由以下各项组成：β-木糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、内切葡聚糖酶、GH61多肽、或其组合。
20.如以上权利要求中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括β-木糖苷酶、木聚糖酶和内切葡聚糖酶。
21.肽酶家族S53的丝氨酸蛋白酶或具有蛋白酶活性的多肽或如权利要求15-20中任一项所述的酶组合物在如以上权利要求1-14中任一项所述的方法中的用途，其中所述多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少或至少90％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由在高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交的多核苷酸编码：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，
(iii)(i)或(ii)的全长互补链；
(c)一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列一致性的多核苷酸编码；
(d)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6的多肽或者SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160824 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |