CN103314111A - 降解或水解多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了降解或水解多糖(优选纤维素或壳多糖)的方法，其包括使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，所述氧化水解酶优选CBM33家族蛋白(优选CBP21)或GH61家族蛋白，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况中实施所述降解或水解。还提供了一种包括所述方法的生成有机物质的方法。

Description

降解或水解多糖的方法
涉及序列表
本申请含有计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。
发明领域
本发明涉及降解或水解多糖(如壳多糖或纤维素)的方法，其包括使所述多糖与氧化水解酶(如CBP21或GH61蛋白)接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解。本发明还扩展到使用另外的糖分解酶(如水解酶和β-葡糖苷酶)来提高降解水平或程度，并将所得糖发酵以生成有机物质如醇(优选乙醇)，所述醇可以用作生物燃料。
发明背景
结晶态多糖的有效酶转化对经济和环境上可持续的生物经济是至关重要的，但不利的是，其仍然是低效的。
向环境更友好的经济转变推动了对能够有效降解顽固性碳水化合物(如纤维素和壳多糖(图1A))以产生生物燃料的酶的研究(Himmel等,2007,Science315:804)。纤维素是地球上最丰富的有机分子，并且提供了用于燃料和化学物生产的可再生且似乎用之不竭的原料。壳多糖是真菌细胞壁、甲壳动物的壳和昆虫的外骨骼的常见成分。它是自然界中第二丰富的聚合物，并且每年在生物圈中生成超过10亿吨壳多糖，主要由昆虫、真菌、甲壳动物和其它海洋生物生成。作为水产养殖(地球上发展最快的生物生产行业之一)副产物的壳多糖是充足的。
将纤维素原料转化为乙醇所具有的优点是大量原料的易可获性、对避免燃烧或填埋材料的期望以及乙醇燃料的清洁性。已经考虑过将木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物用作乙醇生产的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和非多糖木质素组成。一旦将纤维素转化为葡萄糖，葡萄糖即可被酵母容易地发酵成乙醇。
存在多种微生物来发酵多糖水解产物以得到期望的终产物如醇。选择合适的微生物，其容许将纤维素、壳多糖和其它多糖水解产物发酵以得到有用的产物如醇。
生物质的初级细胞壁中的优势多糖是纤维素，第二丰富的是半纤维素且第三是果胶。次级细胞壁(在细胞已经停止生长后产生的)也含有多糖，并且通过共价交联到半纤维素的聚合木质素得到强化。纤维素是脱水纤维二糖(anhydrocellobiose)的均聚物，且由此是线性β-(1-4)-D-葡聚糖，而半纤维素包含多种化合物如木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖，其处在具有多种取代物的复杂分支结构中。尽管纤维素一般是多形态的，但发现它在植物组织中主要是平行葡聚糖链的不可溶性结晶态基质。半纤维素通常以氢键结合至纤维素以及其它半纤维素，这有助于稳定细胞壁基质。
细菌和真菌已经进化出使其能够在富含纤维素的植物材料上生长的复杂的酶系统，但这些生物体通常需要数周、数月或甚至数年来分解倒木(fallenlog)或耕种的玉米杆(tilled corn stalk)。同样地，微生物含有用于降解壳多糖的酶系统。细菌壳多糖酶帮助提供用于细菌生长的碳源。昆虫生成壳多糖酶来消化它们在每次蜕皮阶段的表皮。在植物中，认为壳多糖酶提供了抗寄生性真菌的保护性作用。为了从这些相同的含有纤维素和壳多糖的材料生产化学物或燃料，工业需要能够在数小时或数天中完成此任务的花费得起的化学系统或酶系统。
传统上，认为能够降解这类碳水化合物的酶系统由两种类型的水解酶(称为糖苷水解酶)组成：在碳水化合物链内随机切割的内部作用酶(壳多糖或纤维二糖水解酶)，以及从链末端降解聚合物的进行性外部作用酶(图1B)。尽管此模型被广泛接受，但要理解例如内切葡聚糖酶如何能够将单条多糖链从其结晶环境中拉出并有成效地迫使该链进入其活性位点裂缝中(图1B)仍然是困难的。
自从纤维素引起生化学家的兴趣以来，一直推测可能存在底物破坏因子，其能够使结晶态底物更易于被水解酶接近(Reese等,1950,J Bacteriol.59:485)。最近，发现分解壳多糖的微生物确实生成了一种蛋白质，其增加了底物可达性并加强(potentiate)了水解酶作用(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:28492；图1C和D)。第一个例子是由壳多糖分解细菌粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)生成的称为CBP21(CBP意为壳多糖结合蛋白)的单域蛋白质。该蛋白已经被归为碳水化合物结合模块(CBM)并属于家族CBM33，如由CAZy命名法定义的(Boraston等,2004,Biochem.J.382:769,Henrissat,1991,Biochem.J.280(Pt2):309)。另一个例子涉及来自Thermobifida fusca的2种含有CBM33的蛋白质，称为E7和E8，其加强了壳多糖酶对壳多糖的水解以及纤维素酶对纤维素的水解(Moser等,2008,Biotechnol.Bioeng.100(6):1066-77)。类似于CBP21的，E7是仅包含CBM33域的单域蛋白。E8是三域蛋白质，意味着它除了CBM33域外还携带两个域。
最近显示，目前在CAZy命名法中归为家族61糖苷水解酶(GH61)的蛋白质与纤维素酶协同作用(Harris等,2010,Biochemistry49:3305)并且在结构上与CBM33蛋白相似(Harris等,2010,见上；Karkehabadi等,2008,J.Mol.Biol.383:144；图1E)。尽管CBM33和GH61具有的序列相似性很小，但在结构上的相似性却是明显的(图1D和1E)，包括N末端氨基基团、N末端组氨酸和另一个组氨酸残基的特征性的完全保守排列(图1F；Karkehabadi等,2008,见上)，其形成混杂的金属结合位点(见下文)。基于已有的文献数据(包括一项最近对数种GH61蛋白的综合研究)，GH61蛋白看来几乎不可能像最初认为的那样是内切葡聚糖酶(Harris等,2010,见上)。类似于CBM33蛋白，GH61蛋白既不具有底物结合裂缝或穴，也不具有能够指示糖苷水解酶活性的酸性氨基酸的特征性排列。相反地，这两种类型的蛋白质显示几乎平坦的底物结合表面(图1D和1E；Harris等,2010,见上；Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)。总而言之，这些结果和观察显示CBM33和GH61蛋白具有类似的功能，即加强已知的水解酶(糖苷水解酶)对结晶态多糖作用的效力。此外，这些结果和观察强烈表明这些蛋白质确实采用同一类型的机制。迄今为止，该机制仍然不清楚。
本发明提供了降解或水解多糖如壳多糖或纤维素的方法，其包括在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下使所述多糖与氧化水解酶接触。
发明概述
本发明涉及降解或水解多糖的方法，其包括使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解。
本发明还涉及生成可溶性糖的方法，其中所述方法包括通过上文限定的方法来降解或水解多糖，其中所述降解或水解释放出所述可溶性糖，以及任选地，将所述可溶性糖分离。
本发明还涉及生成有机物质的方法，其包括以下步骤：(i)通过上文所限定的方法来降解或水解多糖以生成包含可溶性糖的溶液；(ii)将所述可溶性糖发酵以生成所述有机物质作为发酵产物；并任选地，(iii)回收所述有机物质。
本发明还涉及用于生成发酵产物的工艺，其包括：(a)用酶组合物糖化纤维素材料，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、以及CBM33；(b)用一种或多种发酵微生物将所述糖化的纤维素材料发酵以生成发酵产物；并(c)从发酵中回收发酵产物。
附图简述
图1显示(A)纤维素和壳多糖中的重复二糖单元。(B)壳多糖或纤维素被内部作用(上部)和(进行性)外部作用的糖苷水解酶(底部)降解的示意图。(C)CBP21对壳多糖酶效率的影响；该壳多糖酶是壳多糖酶C(ChiC)，来自粘质沙雷氏菌的家族18内切壳多糖酶(数据来自Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:28492)。(D)CBP21的晶体结构(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)。以棍状图显示了平坦的结合表面上保守的组氨酸残基的侧链。(E)来自土生梭孢霉(Thielavia terrestris)的GH61E的晶体结构(Harris等,2010,Biochemistry49:3305)。以棍状图显示了平坦的结合表面上保守的组氨酸残基的侧链。(F)CBP21(深灰)和GH61E(浅灰)中2个组氨酸和N末端氨基基团的保守排列的详细视图，其使用PyMol叠加。图D、E和F都使用PyMol生成。
图2显示(A)MALDI-TOF MS谱，其显示由CBP21作用于β-壳多糖晶须所生成的氧化的可溶性壳寡糖(chitooligosaccharide)。这代表着首次检测出这类氧化产物。(B)具有GlcNAcA单元的壳多糖链。(C)在存在(左边小瓶)或缺乏(右边小瓶)1.0mM抗坏血酸的情况中，用1.0μM CBP21处理过的2.0mg/mLβ-壳多糖。在抗坏血酸存在或不存在的情况下温育后，以相同的方式处理管：将其摇动，随后放置1分钟以使壳多糖材料下沉/沉降。本图显示左边小瓶中破坏过的材料的沉降要慢得多。本图显示了在将CBP21应用于最佳条件(即存在还原剂和二价金属离子)下时，其在破坏结晶态壳多糖中的巨大潜力。(D)在将β-壳多糖(2.0mg/mL)与1.0μM AnCDA(一种来自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的过表达并纯化过的壳多糖脱乙酰基酶)、1.0μM CBP21和1.0mM抗坏血酸温育16h后，所获得的产物的MALDI-TOF MS谱，其显示氧化的脱乙酰化的壳寡糖(所有的主要产物都含有2个乙酰化的糖)。对照反应(无CBP21)没有得到可溶性产物(结果未显示)。(E)在将β-壳多糖(2.0mg/mL)与1.0μM AnCDA和0.5μM ChiC温育8小时后，所获得产物的MALDI-TOF MS谱，其显示脱乙酰化的壳寡糖(所有的主要产物都含有1个乙酰化的糖)。用观察到的原子质量和寡糖的聚合度(DP)来标记MS峰。标记总是指相应簇(包含数种加合物；参见图3)中具有最高强度的峰。“ox”指示在相对于非还原性末端的链末端GlcNAcA的存在。星号指示脱乙酰化产物。100%相对强度在组A、D和E中分别代表2.5x104、1.1x103和5.4x104的任意单位(a.u.)。对于产物验证的其它实验，参见图3。
图3显示了MALDI-TOF对产物身份的检验(control)。(A)CBP21降解过的β-壳多糖的含有GlcNAcA的产物与1,5δ-内酯处于平衡，且在较低的pH应该可以观察到该平衡(Pocker&Green,1973,J.Am.Chem.Soc.95:113)。将具有六聚体产物的样品用乙酸调节到pH～3.0，并在室温温育4小时。然后通过MALDI-TOF MS分析该样品。该谱清楚地显示了酸形式和1,5δ-内酯，它们相差18个原子质量单位(amu)，代表了1个水分子。这两种形式之间的平衡最终会导致反应期间加入的氧与来自溶剂水的氧的交换。实际上，将在H2 18O中实施反应(参见实施例)后获得的产物样品调节到较低pH时，我们不仅观察到相比于在H2 16O中实施的反应显示出2amu的质量增加的内酯和酸，而且还在一段时间后观察到显示出4amu的质量增加的酸(结果未显示)。(B)DP6ox质谱的详图。Na+和K+之间的质量差异对应于氧原子质量的事实可能使说明复杂化。然而，单独的钠和钾加合物与其钠/钾加合物的相应钠盐(经常对于糖酸观察到)之间的类似比率指示该产物确实是氧化的六聚体。对由MALDI-TOF MS观察到的产物的身份的第二种验证如下完成，即在MALDI-TOF MS分析前，通过向样品添加LiCl至终浓度为33mM以生成新的特征性加合物。观察到了对应于酸的Li-加合物和酸的Li盐的Li-加合物(C)，由此确认了在(B)中观察到的Na-和K-加合物的身份。依照其观察到的原子质量和寡糖的聚合度(DP)来标记所有MALDI-TOF MS谱中的峰。“ox”代表氧化的。(D)在H2 16O(黑色)和H2 18O(灰色)中用CBP21处理β-壳多糖所获得的六聚体级分的叠置PSD谱。插入提供了该谱各部分的详图。该数据显示Y离子相差2amu，而B离子无论使用哪种类型的水都显示相同的质量。该数据与质谱上面显示的化学结构完全相容，并且显示在氧化的还原性末端引入了重氧原子。注意为了更清楚已经简化了显示的化学结构：缺少大多数羟基基团以及C6。100%相对强度在组A、B、C和D中分别代表4.6x104、1.1x104、0.8x103和1.8x104a.u.。
图4显示了抗坏血酸(还原剂)对CBP21在壳多糖酶效率上的加强效果的影响。在存在(上部灰线，于实心三角形上)或缺乏(底部灰线，于实心菱形上)1.0μM CBP21和1.0mM抗坏血酸(pH8.0)的情况中，分析0.5μM ChiC对β-壳多糖(0.1mg/mL)的降解效率。运行含有β-壳多糖、ChiC和CBP21(与上文相同的浓度)但没有抗坏血酸的平行反应作为对照(中部深灰线，于实心正方形上)。结果显示，相比于其中没有抗坏血酸的情况，在存在抗坏血酸的情况中CBP21相当大地促进了ChiC对壳多糖的降解(所有的壳多糖在2.5小时后都被降解)。在没有抗坏血酸的情况中，含有β-壳多糖和ChiC(与上文相同的浓度)的平行反应会得到类似于在实心菱形上的灰线所代表的结果(结果未显示，但该实验被纳入并显示在图10B中)，意味着单独的抗坏血酸对ChiC效率没有影响。
图5显示了对来自CBP21催化的可溶性反应产物的分析。(A)在将2mg/mLβ-壳多糖与1.0μM CBP21和1.0mM抗坏血酸(pH8.0)温育4天后，可溶性产物中具有酸性还原性末端的偶数的短寡糖占优势。由于壳多糖寡糖的低可溶性，没有观察到更长的寡糖(对于更长的产物的检测，参见实施例)。(B)观察到的每一种酸性寡糖皆为H-、Na-和K-加合物以及酸性寡糖Na-盐的Na-和K-加合物。100%相对强度代表3.5x103a.u。
图6显示了具有酸性(GlcNAcA)末端的氧化寡糖的UHPLC分离。通过用UHPLC分离氧化寡糖来实施对由CBP21生成的可溶性产物的半定量分析。(A)典型的产物谱，其显示也在MALDI-TOF MS分析中观察到的偶数和奇数产物的周期性(例如，图2D和5)。注意在这些层析条件下非氧化寡糖的α-和β-异头物(anomer)会分开。仅观察到单峰的事实确认了对还原性末端的修饰。使用MALDI-TOF MS来确定峰身份(结果未显示)。(B)在存在5.0(灰线，圆形数据点)、1.0(深灰色线，正方形数据点)和0.2mM(黑线，三角形数据点)抗坏血酸的情况中，CBP21介导的壳多糖溶解成六聚体产物(实线)或五聚体产物(虚线)的初始反应速率。这些结果显示反应的速率取决于抗坏血酸浓度，并且奇数产物的生成速率低于偶数产物。
图7显示了在Tris缓冲的H2 18O pH8.0(A)或在Tris缓冲的H2 16O pH8.0(以18O2饱和)(B)中用1.0μM CBP21和1.0mM抗坏血酸处理2.0mg/mLβ-壳多糖后，对检测到的产物的MALDI-TOF MS分析。相比于在不含有经同位素标记的水或分子氧的溶液中实施的反应，所有的主要产物都显示了2amu的质量增加(参见图2A和5)。(C)组(B)中显示的氧化的六聚体产物的加合物。注意少量的未经同位素标记的产物(由箭头指示)，其最可能来自仍然存在16O2的反应初始阶段(在18O2饱和前；参见材料和方法)。100%相对强度在组A和B和C中分别代表6.8x103和2.0x103a.u.。(D)由CBP21催化的酶促反应的图示。在最终的氧化产物中，1个氧来自分子氧而1个来自水。
图8显示了各种潜在抑制的因子在CBP21活性上的影响。连二亚硫酸钠(SD)是一种公知的氧清除剂，其常规用于为酶促反应创建无氧(厌氧的)环境。(A)反应混合物的MALDI-TOF MS谱，该反应混合物含有2.0mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21、1.0mM抗坏血酸和10mM连二亚硫酸钠，在37℃在厌氧条件下温育16小时(所有小瓶都用史兰克线(Schlenk line)脱气)。该谱显示了基线噪声且没有峰具有值得注意的强度；换言之，没有可检出量的CBP21生成的产物。100%相对强度代表0.9x102a.u.。组(B)显示了通过加入连二亚硫酸钠(SD)废除了CBP21对壳多糖酶的加强效果。反应条件：0.1mg/mLβ-壳多糖、0.1μM ChiC、1.0mM抗坏血酸、10mM连二亚硫酸钠、1.0μM CBP21，在37℃在厌氧性条件下温育16小时(所有小瓶都用史兰克线脱气)。通过HPLC分析终产物的量。组(C)显示了另外的对照实验，其显示在将0.45mg/mLβ-壳多糖与0.5μM ChiC和1mM还原性谷胱甘肽(其具有与抗坏血酸相同的效果；参见图11)在20mM Tris-HCl pH8.0中温育期间的产物生成。其它添加物/条件是1.0M CBP21(用于最大活性的标准条件；黑线，实心菱形上)、1.0μMCBP21在通过气体交换获得的具有减少的氧浓度的溶液中(加号上的线；注意在图7的组C中展示的结果(其显示甚至在史兰克线中大量气体交换后也存在16O2)，显示出并未获得真正的无氧条件)，1.0μM CBP21和2mM氰化钾(一种公知的O2模拟物)(实心正方形上的线)，以及无CBP21、无其它添加物(标准的对照实验；实心圆形上的线)。添加2.0mM叠氮化钠(一种已知的Heam蛋白抑制剂)并未抑制CBP21活性，且曲线类似于实心菱形上的曲线。CBP21还被Oxyrace(Oxyrace Inc.,Mansfield,OH)(一种使用乳酸盐作为氢供体来创造无氧环境的细菌氧化酶)完全抑制(结果未显示)。组(D)显示了在缺乏(实心菱形上的线)或存在(实心正方形上的线)2.0mM氰化钾的情况中，0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21和1.0mM还原型谷胱甘肽在20mM Tris-HCl pH8.0中反应期间GlcNAc3GlcNAcA(即氧化的四聚体)的生成。该结果显示氰化物抑制氧化反应。在组B、C和D中显示的数据是均值+/-SD(N=3)；误差棒(并非所有点都可见)指示SD。
图9显示了二价阳离子对CBP21活性的影响。该图显示了通过用HPLC测量生成的(GlcNAc)2的浓度所监测到的ChiC活性。在存在或缺乏1.0μM无金属的CBP21的情况中，反应混合物含有1.0mM抗坏血酸中的2.0mg/mLβ-壳多糖、5mM EDTA、20mM Tris pH8.0中的0.5μM ChiC。实线指示有无金属的CBP21的反应；虚线指示无CBP21的反应。在反应半途(由箭头指示)，向两种(平行)反应混合物之一加入MgCl2(终浓度25mM)、ZnCl2(25mM)或缓冲液。正方形，加入MgCl2；圆形，加入ZnCl2；三角形，加入缓冲液。该结果清楚地证明了二价阳离子是CBP21功能所必需的；对照显示阳离子并未影响ChiC活性。
图10显示了保守的His114的重要性。CBP21样和GH61蛋白含有两个高度保守的组氨酸(CBP21中的H28和H114)，其中一个是分泌的成熟蛋白质的N末端组氨酸。为了探测His114的重要性，分析CBP21的H114A突变体。组(A)显示，将1.0μM CBP21H114A与2.0mg/mLβ-壳多糖、1.0mM抗坏血酸在20mMTris pH8.0中于37℃温育16小时不会引起可溶性氧化寡糖的产生。100%相对强度代表3.5x104a.u.。组(B)显示在存在或缺乏CBP21WT(分别为实心三角形上的上部灰线和实心菱形上的深灰色线)且存在CBP21H114A(实心正方形上的灰线)的情况中，在1.0mM抗坏血酸、20mM Tris pH8.0中用0.5μM ChiC降解0.1mg/mLβ-壳多糖时产物的释放。实心圆形上的深灰色线显示了无CBP21且无抗坏血酸的反应。该数据清楚地显示，His114是CBP21功能必需的，因为即使存在抗坏血酸时CBP21H114A也不能加强壳多糖酶活性。
图11显示了其它还原剂在CBP21活性上的影响。在存在1.0μM CBP21和(A)1.0mM还原型谷胱甘肽或(B)1.0mM Fe(II)SO4的情况中，将2.0mg/mLβ-壳多糖在20mM Tris pH8.0中于37℃温育16小时时获得的反应产物。注意观察到的产物谱高度类似于在存在抗坏血酸的情况中获得的那些(图5)。图5和6显示CBP21的活性在存在抗坏血酸的情况中增加。还原剂如还原型谷胱甘肽和Fe(II)SO4在降解反应的动力学上具有类似的影响(结果未显示)。100%相对强度在组A和B中分别代表1.5x104和0.8x103a.u.。
图12显示了抗坏血酸对β-壳多糖的影响。已经确立的是，还原剂在氧合溶液中经历自动氧化，由此生成反应性的氧种类，推定其可以氧化存在于周围介质中的生物分子。该图显示了对反应混合物的MALDI-TOF MS分析，该反应混合物是在将样品(在20mM Tris pH8.0中含有2.0mg/mLβ-壳多糖和1mM抗坏血酸)于37℃温育4天后获得的。该谱未显示任何可溶性氧化寡糖的迹象。100%相对强度代表4.4x104a.u.。
图13显示了CBP21对可溶性天然寡糖的影响。早期研究(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313；Suzuki等,1998,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:128)已经显示，CBP21特异性结合β-壳多糖，且不结合壳多糖的可溶性或无定形形式。考虑到此处呈现的结果，对CBP21氧化和/或水解壳多糖的天然寡糖的能力进行研究。在仅存在缓冲液、存在1.0mM抗坏血酸(AA)或存在1.0mM抗坏血酸和1.0μM CBP21的情况下，将溶液(在20mM Tris pH8.0中含有100μM GlcNAc6)温育16小时并通过MALDI-TOF MS分析反应产物(分别为组A、B和C)，并且通过HPLC定量(组D)。未观察到GlcNAc6的任何降解或氧化。用可溶性的聚合的壳多糖衍生的壳聚糖(chitosan)实施类似的实验；还是没有能检测到任何降解或氧化产物(结果未显示)。100%相对强度对于组A、B和C分别代表5.7x103、1.4x104和4.0x104a.u.。
图14显示芬顿化学(Fenton chemistry)对β-壳多糖溶解的可能影响。可以想到的是，观察到的CBP21介导的对β-壳多糖的氧化水解切割与导致芬顿型化学的条件的形成有关(类似于已经对纤维二糖脱氢酶降解纤维素所提出的)(Hammel等,2002,Enzyme.Microb.Tech.30:445；Henriksson等,2000,J.Biotechnol.78:93；Hyde&Wood,1997,Microbiol-Uk143:259)。尽管，芬顿化学在本研究中使用的pH(8.0)并不特别有效，但我们确实检查了是否可能发生芬顿样过程。公知的是，芬顿化学解聚多糖并且能够得到与CBP21生成的那些类似的氧化产物。将2.0mg/mLβ-壳多糖与0.03%H2O2和5.0mMFe(II)SO4在20mM Tris pH8.0中于37℃温育16小时。通过MALDI-TOF MS来分析反应的可溶相。本图中显示的质谱未揭示可溶性产物的形成。作为对照，使用原始样品的各种稀释物来重复MALDI-TOF实验；还分析了其中H2O2浓度为0.3%或0.003%的反应的样品。从未观察到可溶性产物(结果未显示)。100%相对强度代表1.2x104a.u。
图15显示：(A)EfCBM33(Uniprot ID:Q838S1;EF0362;uniprot.org/uniprot/Q838S1)晶体，通过悬滴蒸汽扩散(hanging drop vapordiffusion)实验(已经用于收集
Figure BDA00003011746200101
数据)获得。(B)在2Fo-Fc图中模型化的暴露于溶剂的Trp的侧链。(C)CBP21和EfCBM33主链的叠加；显示了保守的组氨酸和表面暴露的芳香族氨基酸(CBP21中的Tyr、EfCBM33中的Trp)的侧链。(D)在用溶解于20mM Tris pH8.0中的“清洗的”EfCBM33晶体处理2.0mg/mLβ-壳多糖后获得的可溶性产物的MALDI-TOF MS谱；对于CBP21，产物谱中偶数的氧化壳寡糖占优势，清楚地证明了氧化水解活性。(E)在存在或缺乏0.3μM EfCBM33和1.0mM还原剂(R：还原型谷胱甘肽)的情况下，在37℃伴随着900rpm的搅拌温育，0.3μM来自粪肠球菌(Enterococcus feacalis)的壳多糖酶(蛋白质名称为EF0361)对2.0mg/mLα-壳多糖(来自小虾壳)的降解。在存在EfCBM33和还原剂的情况下清楚地观察到了壳多糖酶活性的加强。
图16显示了CBP21活力的氧化性切割的速率和程度。组(A)显示了在0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21、0.5μM ChiC和1.0mM还原型谷胱甘肽在20mM Tris-HCl pH8.0中温育期间生成的未氧化二聚体(上部线，有菱形)、氧化三聚体(三角形上的线)和氧化四聚体(正方形上的模糊线)的生成(ChiC对氧化寡糖的水解仅生成了少量的氧化二聚体；显示的3种产物代表了在这些条件下生成的寡聚体的大多数)。5小时后，总的糖中有约4.9%(基于壳多糖浓度的理论数值)被氧化*。组(B)显示了在0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21和1.0mM还原型谷胱甘肽在20mM Tris-HCl pH8.0中温育期间氧化的糖的生成。通过用大剂量的壳多糖酶组合对处理后的壳多糖快速转化，接着对氧化的二聚体(实心菱形)和三聚体(实心三角形)进行UHPLC检测来确定氧化的程度，如在材料和方法部分中描述的。反应的线性部分代表了约1每分钟的氧化速率**。在2-3小时后达到最大水平，并代表了总的糖的7.6%(基于壳多糖浓度的理论数值)的氧化程度***。两组中的数据都是均值+/-SD(N=3)；误差棒(并非所有点都可见)指示SD。
*氧化的三聚体和四聚体的终浓度分别是53和55μM，产生总共108μMGlcNAcA。GlcNAc在溶液中的摩尔浓度是2217μM。由此氧化的程度是108/2217；换言之，4.9%的糖是GlcNAcA。**对氧化的二聚体和氧化的三聚体所计算出的速率是0.68和0.60μM/分钟。在添加时，生成氧化产物的速率是1.28μM/分钟，且在考虑到CBP21浓度(1.0μM)时，氧化水解的速率是1.28/分钟。***在达到的最大水平处，CBP21分别生成了93μM和75μM的氧化二聚体和氧化三聚体，合计达168μM GlcNAcA。溶液中GlcNAc的摩尔浓度是2217μM。由此，氧化程度是168/2217；换言之，7.6%的糖是GlcNAcA。
图17.在存在1.0mM抗坏血酸(外部电子供体)的情况下，在20mMTris-HCl缓冲液pH8.0中将CBM33蛋白(1μM CelS2)与微晶态纤维素(2.0mg/mL
Figure BDA00003011746200111
)在50℃以250rpm的水平搅拌温育20小时，对所生成的可溶性产物的MALDI-TOF MS分析。主要的峰由分子量和聚合度(DP)注释。所有有注释的峰都是氧化的纤维寡糖(因此下标“ox”)的Na-加合物。在图18中显示了对加合物簇的更具体的分析。
图18.对由CelS2生成的氧化的纤维寡糖六聚体的加合物簇(来自与图17说明中所描述的相同的样品)的MALDI-TOF MS分析。峰由分子量、聚合度(DP)注释；“ox”指示氧化。该谱显示了少量的天然六聚体寡糖(m/z=1013.14)。天然的寡糖可能起源于CelS2在还原性末端附近的底物切割或由于底物破坏导致的释出(亦参见图19)。优势峰代表了氧化六聚体的Na-加合物(m/z=1029.14)。另外，还可以观察到代表了氧化六聚体的K-加合物(m/z=1045.08)和氧化六聚体的Na盐的Na-加合物(m/z=1051.13)的峰。
图19.在存在(“粉红色”，上方线)或缺乏(“深紫色”，下方线)0.5mM还原型谷胱甘肽(外部电子供体)的情况下，在50mM Tris-HCl pH8.0、1mMMgCl2中将1.0μM CelS2与10mg/mL于50℃、900rpm(水平搅拌)温育后，对生成的可溶性产物的HPAEC分析。在缺乏还原型谷胱甘肽的情况中，仅观察到少量的天然纤维寡糖(Glc3-Glc6)，而在存在还原型谷胱甘肽时观察到较大量的天然纤维寡糖和氧化的纤维寡糖。氧化的纤维寡糖的DP由n指示，其中n=3(最短的标记的氧化纤维寡糖的DP为3(=n))。在未加入CelS2的对照反应中(在存在和缺乏0.5mM还原型谷胱甘肽的情况中，10mg/mL
Figure BDA00003011746200113
在50mM Tris-HCl pH8.0中；结果未显示)也看到了少量的天然纤维寡糖的存在。由此，即使没有CelS2，底物本身也含有一些在温育时释放出的较短的、可溶性的、未氧化的纤维寡聚物。从文献中公知的是，具有相对较低的聚合度(Wallis等,1992,Carbohydrate Polymers17:103-110)。另外，CelS2在纤维素链还原性末端附近的链切割会生成这类产物。通过将色谱图与氧化的纤维寡糖的化学法制备的混合物(具有从DP1至DP10变化的长度)所获得的色谱图进行比较，实施对峰的注释。注意氧化的纤维寡糖的周期性也被MALDI-TOF MS分析观察到了(图17)。
图20.在存在或缺乏1mM还原型谷胱甘肽(“RG”)的情况中，将1μMCelS2或E7和0.05μl/ml CELLUCLASTTM(“CC”)与10mg/mL滤纸温育24或120小时后的总糖(g/l)([Glc]+纤维二糖，其被报告为[Glc])。反应在50mMBis-tris/HCl pH6.5、1mM MgCl2中，于50℃、以900rpm(水平搅拌)进行。对照反应对于葡萄糖或纤维二糖没有给出任何可检测的信号，所述对照反应含有悬浮在缓冲液中的纤维素底物，所述缓冲液与用于酶测定法的相同。
图21.在存在或缺乏1mM还原型谷胱甘肽(“RG”)的情况中，将1.0μMCelS2和5μg/ml Cel7A(“Cel7A”)与10mg/mL滤纸温育18或40小时后的纤维二糖浓度(g/l)。这些反应在50mM醋酸钠pH5.5、1mM MgCl2中于50℃、以900rpm(水平搅拌)进行。仅量化了纤维二糖的浓度，因为葡萄糖量较少(低于总糖的5%)。对照反应对于葡萄糖或纤维二糖没有给出任何可检测的信号，所述对照反应含有悬浮在缓冲液中的纤维素底物，所述缓冲液与用于酶测定法的相同。
图22.显示了在存在1.0mM抗坏血酸(外部电子供体)、存在(标记为“粉色”的线，下方线)或缺乏(标记为“绿色”的线，上方线)2.0mM氰化钾的情况中，将CelS2(1.0μM)与微晶态纤维素(10mg/mL
Figure BDA00003011746200121
在20mMTris-HCl缓冲液pH8.0中温育后所获得的产物的HPAEC谱。在50℃以900rpm的垂直搅拌温育24小时后对产物进行分析。剩下的两条(较低)线代表了与上文所记载的在缺乏抗坏血酸的情况中相同的条件(CelS2+氰化物；“蓝色”线缓冲液+氰化物，“褐色”线)。指示了氧化的纤维寡糖的DP(n=3)，即，最短的、可见的、氧化的纤维寡糖的DP为3(GlcNAc-GclNAc-GlcNAcA)。
图23.在存在1.0mM抗坏血酸(外部电子供体)的情况下，将1μMCelS2-WT(组A)或1μM CelS2-H144(组B)与微晶态纤维素(10mg/mL
Figure BDA00003011746200123
)在20mM Tris-HCl pH8.0中，于50℃以250rpm的水平搅拌温育时24小时后，生成的可溶性产物的MALDI-TOF MS分析。主要的峰由分子量和聚合度(DP)注释。所有经注释的峰是天然纤维寡糖、氧化纤维寡糖(指示为“ox”)、或氧化纤维寡糖的钠盐的Na加合物。对于与CelS2-H144的反应(组B)，没有能观察到天然或氧化的纤维寡糖。在1199.55m/z处观察到的低强度峰不对应于任何来自纤维素氧化或水解的寡糖，并且可能是背景成分。天然纤维寡糖的存在可能是底物的低均值DP的结果(Wallis等,1992,Carbohydrate Polymers17:103-110)；CelS2在纤维素链还原性末端附近的链切割也会产生这类产物。对于另外的论述，参见图19的图例。
图24.在20mM醋酸钠缓冲液pH5.5、1.0mM MgCl2、1.0mM还原型谷胱甘肽(RG；外部电子供体)中于50℃、以250rpm(水平搅拌)温育20小时的情况中，CelS2(1.0μM)对CELLUCLASTTM(0.016μl/ml)降解蒸汽爆破的锯屑(来自白杨木)(SEP;2.0mg/mL)的影响。本图显示了20小时后的纤维二糖释放。
图25.在存在或缺乏40μg/ml CelS2和0.5mM还原型谷胱甘肽(RG)的情况中，在20mM醋酸钠缓冲液pH5.5中，0.8μg/ml CELLUCLASTTM(CC)对高分子量滤纸纤维素(10mg/mL)的降解，如由可溶性纤维寡糖(Glc和Glc2；转换成总的Glc)随时间的增加所显示的。在没有CelS2的反应中，加入40μg/ml纯化的BSA以维持相等的蛋白质负载。在这些条件下，仅具有CelS2的反应未得到可检测量的Glc或Glc2(未显示)。壳多糖活性的CBM33、CBP21未影响CC效率(未显示)。RG在仅具有CC的反应中没有影响；仅显示了两条重叠曲线中的一条。数据是均值+/-SD(N=3)；误差棒指示SD。
图26.10mg/mL滤纸与具有40μg/ml CelS2(或40μg/ml BSA，用来补偿无CelS2的反应中的蛋白质负载)和5μg/ml纯化的HjCel7A的组合在1mMMgCl2、20mM醋酸钠缓冲液pH5.5中的反应中，对纤维素的降解。迄今为止这些反应的主要产物是由纤维素酶(其活性被CelS2加强)释放的纤维寡糖。在HjCel7A的情况中(组C)，主要产物是纤维二糖，并且显示了该产物的形成。RG指示了还原剂的存在，在此情况中是还原型谷胱甘肽。标记“+/-RG”指示了在有和无RG的情况下，单独的Cel7A(无CelS2存在)的生成曲线是基本相同的。反应在50℃进行。
图27.在缺乏还原剂(底部线)、存在还原型谷胱甘肽(从底部起第二条线)、存在没食子酸(上部线的较深者)或存在抗坏血酸(上部线的较浅者)(都充当外部电子供体)的情况中，将
Figure BDA00003011746200131
与CelS2的N末端CBM33域温育后所获得的产物的HPAEC谱。将1μM的CelS2的N末端CBM33域与10mg/mL
Figure BDA00003011746200132
在存在0.8mM的一种还原剂或缺乏任何还原剂的情况下温育。反应在50mM琥珀酸盐缓冲液pH5.5、1mM MgCl2，于50℃和900rpm(垂直搅拌)进行20小时。
图28.在存在或缺乏作为外部电子供体的1μM E7和2mM还原型谷胱甘肽(RG)的情况中，将0.08μl/ml CELLUCLASTTM(CC)与2mg/mL滤纸纤维素温育后释放出的总糖(g/l)[Glc](葡萄糖和纤维二糖，其报告为[Glc])。将反应物在20mM醋酸钠缓冲液pH5.5、1mM MgCl2中，于50℃和900rpm(水平搅拌)温育达50小时。RG在仅有CC的反应中没有影响；仅显示了两条重叠曲线中的一条。对照反应未得到可检测量的Glc或Glc2(未显示)，所述对照反应具有悬浮于与用于酶测定法的相同的缓冲液中的滤纸，或在缺乏纤维素酶的情况下具有E7。
图29.在存在作为外部电子供体的1mM抗坏血酸的情况下，将1μM E7与10mg/mL在20mM Tris-HCl缓冲液pH8.0和1mM MgCl2中，于50℃以900rpm的垂直搅拌温育20小时，对由此生成的可溶性产物的MALDI-TOF MS分析。观察到作为钠加合物和作为寡糖钠盐的钠加合物的氧化寡糖(Glc3-7GlcA)，并由其分子量(m/z)注释；也存在天然的纤维-寡糖，但没有注释。这类天然的寡糖可能是CBM33在底物还原性末端附近切割的结果。
图30.当与10mg/mL
Figure BDA00003011746200142
温育时，在存在(上方灰线)或缺乏(底部深灰线)1mM抗坏血酸(AA)的情况中由1μM全长CelS2，或者在存在AA(次上方，深色线)的情况中由CelS2的N末端CBM33域，或者在存在AA(从底部起第二条线，深色线)的情况中由CelS2的C末端CBM2域所生成的产物的HPAEC谱。在20mM醋酸铵缓冲液pH5.0、1mM MgCl2中，于50℃和900rpm(垂直搅拌)温育20小时后，对产物进行分析。将层析图放大以突出由全长CelS2和CelS2的N末端CBM33域生成的氧化的纤维寡糖。
图31.通过向EDTA处理过的CelS2的N末端CBM33域加入金属来重新激活活力。将0.8mg/mL CBM33与400μM EDTA在温育3小时。将EDTA处理过的该酶(40μg/ml)与10mg/mL
Figure BDA00003011746200143
在50mM MES缓冲液pH6.6中温育，所述缓冲液含有1.7mM还原型谷胱甘肽和6种不同的金属离子之一(10μM;Mg2+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Ca2+、Cu2+)。这些反应混合物中EDTA的剩余浓度是20μM。叠加的HPAEC层析图显示了在50℃温育20小时后释放出的产物。在这些条件下且在使用这些较低的金属浓度时，仅有Cu2+(上方，灰线)重新激活了该酶。
图32.A)使用ClustalW比对GH61序列。将HjGH61A序列对齐于由结构性比对的TtGH61E和HjGH61B所创建的概貌(谱)。在产生比对前，将天然初级基因产物中存在的N末端信号肽从序列移除。B)可以看到TtGH61E(绿色)和HjGH61B(橙色)的结构性叠加。在(B)中以紫红色显示了在比对(A)中呈红色的6个保守的活性位点和表面残基的侧链。存在于HjGH61B中的插入在(A)(阴影部分)和(B)(3转角螺旋)中呈黄色。
图33.比较CBP21的结构(A)与E7的结构模型(B)，以及TtGH61E的结构(C)。注意E7和TtGH61E之间的相似性(位置207和161处的分别的Met和Val都是疏水性残基；CBP21中的相应的残基T183是更极性的)。CBP21缺少组氨酸(CBP21具有D182)、酪氨酸(CBP21具有F187)和谷氨酰胺(CBP21具有E60)，它们在显示的两种GH61中是保守的。按照残基在初始基因产物(即具有N末端信号肽的蛋白质)中呈现的对它们进行编号。成熟的正确加工的蛋白质起始于组氨酸，因此其为组氨酸1(如在(A)的比对中显示的)。组A、B、和C中分别的H28、H37、和H19对应于组氨酸1。
图34.HPAEC层析图，其显示通过TtGH61E(上方曲线，具有更高的峰)和TaGH61A(下方曲线)从微晶态纤维素()生成寡糖。将GH61蛋白(140μg/ml)与10mg/mL Avicel在含有2.4mM抗坏血酸(还原剂)的50mMMES缓冲液pH6.6中于50℃以700rpm的水平搅拌温育24小时。
图35.其显示在存在或缺乏抗坏血酸的情况中，通过CellicTMCTec2(所加蛋白的终浓度为1.1μg/mL)从
Figure BDA00003011746200152
和滤纸(Filter Paper)生成葡萄糖的层析图(Rezex RFQ-Fast Fruit H+柱)。在有或无0.5mM抗坏血酸的情况下，将该酶与10mg/mL底物(或滤纸)在50mM MES缓冲液pH6.6中于50℃以700rpm的水平搅拌温育24小时。
发明详述
令人惊讶地，发明人已经发现了作为氧化水解酶的CBM33和GH61蛋白利用了分子氧和水在结晶态多糖的表面(即在固相的表面上)上引入链断裂，从而为普通糖苷水解酶的水解打开了难以接近的多糖材料。尽管不希望受任何理论束缚，但认为碳水化合物链由分子氧氧化，并且对链的切割由伴随的水解完成(图7D)。考虑到该机制，我们将该酶称为氧化水解酶。然而，考虑到这些酶影响或帮助切割多糖中糖苷键的能力，它们在本文中或可被称为多糖降解酶(或简称为酶)。迄今为止，还未有对反应中依赖于反应性氧种类的结晶态多糖的酶法切割的描述。
这些酶具有平表面，其结合结晶态材料的平的、固态的、有序的表面并催化链断裂。链断裂会导致晶体堆积的破坏并增加底物的可接近性，这是一种可以通过修饰新的链末端而增加的效果。在切割点处，新末端中的一个是通常的非还原性末端(由图7D中的R-OH指示)。如果切割是由普通的糖苷水解酶实施的话，另一个新末端会是新的还原性末端。然而，在此情况中产物是不同的，并且最后的糖被氧化变成2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡糖酸(图7D)。这种新的“酸性链末端”会干扰正常的晶体排列，因为它不会具有糖环的正常椅构象，并且因为它携带电荷。在非结晶态底物上的影响也是可能的。
在降解壳多糖和纤维素的微生物中富含编码这些氧化水解酶的基因(如编码CBM33或GH61家族成员的基因)。如由基因序列所评估的，发现了作为单域蛋白(即仅由一个CBM33或GH61域组成)和作为多域蛋白(即至少还包含一个域，经常是推定为牵涉底物结合的域)的CBM33和GH61蛋白。当含有CBM33或GH61域的蛋白质具有多于一个域时，其余的域通常偶联于CBM33或GH61域的C末端，因为CBM33或GH61域的N末端是氧化水解活性所必需的。对这些酶的作用模式的认识允许对其催化效率进行优化，从而使生物质到糖的酶法转化(可用于发酵)更有效。
由于鉴定了分子氧在催化中的作用，目前已经发现可以通过加入还原剂来改进反应的效率，所述还原剂可以充当电子供体和/或生成反应性氧种类。在存在二价金属离子的情况中，还原剂改进了对顽固性多糖的酶促转化。
因此，在第一个方面，本发明提供了降解或水解多糖的方法，其包括使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解。
如在本文中所指的，“降解”所述多糖指通过破坏多糖聚合物中连接糖单体的糖苷键来进行的降解。
通过使用所述还原剂和金属来降解所述多糖相比于没有使用这些手段的所述方法的成效有所改进，由此对连接糖单体的糖苷键的破坏速率和程度得到了增加。这可以通过测量产物形成(例如在某些限定的时间点上)或通过测量剩余的未降解的多糖底物的量(例如在某些限定的时间点上)容易地确定。可以使用本领域中公知的方法实施，所述方法基于例如对释放的还原性糖的测定(Horn等,2004,Carbohydrate Polymers56(1):35-39及其中参考文献)，或对释放片段(例如纤维素或壳多糖片段)的测定，例如通过对由高效液相层析获得的层析图的定量分析(Hoell等,2005,Biochim.Biophys.Acta1748(2):180-190)。优选地，在存在如下文所描述的一种或多种有关的糖分解酶的情况下来评估所述降解的量度。
当底物暴露于氧化水解酶时，如果在特定时间段中存在还原剂和金属离子比不存在这两者的情况的降解(例如水解)速率(即被破坏(例如水解)的键的数目)要大，那么认为降解速率是提高了的。优选地，还原剂和金属离子的使用使降解(完全地或到部分降解的相同水平，例如当使用另外的糖分解酶时，参见下文)所花的时间减少了至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。换言之，还原剂和金属离子的使用使降解速率增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
“水解”指其中水与化合物反应以生成其它化合物，且牵涉分裂键并加成水中的氢阳离子和氢氧根阴离子的化学反应。在多糖水解的情况中，水解切割糖苷键。将多糖水解为可溶性糖被称为“糖化”。如本文中所指的多糖的水解使得多糖被降解为更小的多糖，包括寡糖和糖单体如葡萄糖。
多糖的水解可以是部分或完全的。在完全水解的情况中实现了完全糖化，即仅剩余可溶性糖(例如单糖和二糖)。在部分水解中，除了可溶性糖外还剩余更大的寡糖和多糖。如本文中描述的，本发明的方法包括其中仅将氧化水解酶用于降解或将氧化水解酶和糖分解酶都用于降解的方法。在前一情况中，优选地，至少0.05-10%，例如0.05-5%，优选地0.1-1%的起始多糖的糖苷键被降解(即破坏，例如水解)为寡糖，所述寡糖可以与多糖底物分开，或者尽管切割但仍保持结合的。在后一种还使用糖分解酶的情况中，优选地至少50%(特别优选地，60、70、80、90、95、96、97、98、99或100%)的起始多糖的糖苷键被降解(例如水解)。换言之，在后一情况中，优选地，至少50%(特别优选地，60、70、80、90、95、96、97、98、99或100%)的起始多糖被水解成单糖或二糖。
关于纤维素，可以通过测定纤维二糖和/或葡萄糖的水平的增加来评估降解水平。
如本文中所指的，所述“多糖”是聚合的碳水化合物结构，其由通过糖苷键结合在一起的重复单元(单糖或二糖)形成，并且具有通用分子式(C6H10O5)n，例如其中40≤n≤3000。优选地，所述多糖至少是部分结晶的，即处于结晶形式或具有结晶部分，即某种形式或部分，其显示在组成部分之间具有固定距离的原子、离子或分子的重复的、三维的模式。
优选地，所述多糖是纤维素、半纤维素或壳多糖，并且可以以分离的形式或以不纯的形式存在，例如在含有纤维素、半纤维素或壳多糖的材料(即含有多糖的材料)中，其任选地可以含有其它多糖，例如在纤维素的情况中，还可以存在半纤维素和/或果胶。
举例而言，含有纤维素的材料可以是植物的茎、叶、皮、壳和穗轴，或者树的叶、枝和木材。含有纤维素的材料可以是(但不限于)草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆以及造纸厂残余物。含有纤维素的材料可以是任何类型的生物质，包括但不限于，木材资源、城市固体废物、废纸、作物和作物残余物(参见例如Wiselogel等,1995,于“Handbookon Bioethanol”(Charles E.Wyman编),第105-118页)。优选地，含有纤维素的材料是以木质纤维素的形式，例如在混合基质中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁材料。
在一个优选的方面，所述含有纤维素的材料是玉米秸秆。在另一个优选的方面，所述含有纤维素的材料是玉米纤维、玉米穗轴、柳枝稷(switch grass)或稻草。在另一个优选的方面，所述含有纤维素的材料是纸和纸浆处理废料。在另一个优选的方面，所述含有纤维素的材料是木本或草本植物。在另一个优选的方面，所述含有纤维素的材料是甘蔗渣。
“纤维素”是由β-1,4-键共价连接的单糖葡萄糖的聚合物。纤维素是直链聚合物：与淀粉不同，不存在卷曲或分支，并且该分子采用了一种由葡萄糖残基的平伏(equatorial)构象帮助的、延伸的并且比较像刚性杆(rather stiffrod-like)的构象。来自一条链的葡萄糖上的多个羟基基团与同一条或相邻链上的氧分子形成氢键，其将链并排地稳固保持在一起并形成具有高拉伸强度的微纤维。
与淀粉相比，纤维素还是远更结晶性的。当在水中加热超过60-70℃(如同在蒸煮中)时，淀粉经过从结晶态到无定形态的转变，而纤维素需要320℃的温度和25Mpa的压强以在水中变成无定形态的。
已知纤维素的数种不同的结晶态结构，其对应于链间和链内的氢键的位置。天然的纤维素是具有结构Iα和Iβ的纤维素I。由细菌和藻类生成的纤维素富含Iα，而更高等的植物的纤维素主要由Iβ组成。再生纤维素纤维中的纤维素是纤维素II。纤维素I到纤维素II的转化是不可变的，暗示了纤维素I是亚稳态而纤维素II是稳态的。采用各种化学处理，产生纤维素III和纤维素IV结构是可能的。
除了葡萄糖以外，“半纤维素”还自其它数种糖衍生，特别是木糖，但还包括甘露糖、半乳糖、鼠李糖和阿拉伯糖。半纤维素由比纤维素更短的链组成；约200个糖单元。此外，半纤维素是有分支的，而纤维素是无分支的。
“壳多糖”在本文中定义为含有以线性方式连接的β-(1-4)连接的N-乙酰葡糖胺残基的任何聚合物。α形式(其中链逆向平行前进)、β形式(其中链平行前进)或γ形式(其中有平行和逆向平行的链的混合物)、无定形壳多糖、胶体壳多糖、其中N-乙酰葡糖胺糖的部分(例如高达5、10、15或20%)被脱乙酰基化的壳多糖形式都包含在该术语的定义中。
在自然界中发现的壳多糖的其它形式包括与蛋白质的共聚物，这些共聚物(包括在昆虫和甲壳动物的壳中发现的蛋白质壳多糖基质)和任何其它天然存在或合成的包含如本文中定义的壳多糖分子的共聚物都包含在“壳多糖”的定义中。
术语“壳多糖”由此包括纯化的结晶态α、β和γ制备物，或从天然来源获得或制备的壳多糖，或存在于天然来源中的壳多糖。这类天然来源的例子包括鱿鱼羽状壳(squid pen)、虾壳、蟹壳、昆虫表皮/护膜(cuticle)和真菌细胞壁。商品化的壳多糖的例子是从来源如France Chitin、Hov-Bio、Sigma、Sekagaku Corp等等中可获的那些壳多糖。
如本文中所指的，使所述多糖与氧化水解酶“接触”指以适当的方式将这两种实体结合在一起以使酶的催化特性有效。
氧化水解酶和多糖之间的反应的精确动力学会取决于许多因素，如要降解的多糖的类型、存在的酶量、温度和pH。多糖的类型和其无定形程度会随着底物来源和分离/纯化过程而变，但可以例如通过测量底物结晶性(crytallinity)的程度(其为本领域中已知的方法)来进行评估。
考虑到这些，可以确定适当的温育时间和条件来使降解(例如用糖苷水解酶水解)最大化。在下文论述了例示性的方法。
因此，将多糖和氧化水解酶混合在一起或使彼此进行接触以允许它们的相互作用。这可能简单地牵涉将不同成分的溶液直接混合，或者牵涉将酶施加到含有多糖的材料中。
如本文中所指的，“一种或多种”优选地指2、3、4、5或6或更多种所记载的酶。当使用多于一种酶时，可以按照所要使用的底物对它们进行选择，例如，来提供互补或协同作用。因此，例如可以组合在底物的不同区(例如不同的晶体面)上有效的氧化水解酶。在下文中描述了优选的组合。
如本文中使用的，“氧化水解酶”是一种使用分子氧或其活化形式(“反应性氧种类”)来切割多糖(优选地是壳多糖或纤维素)中的糖苷键的酶。新生成的链末端一个是通常非还原性的末端，一个是氧化的“酸性”末端，其在壳多糖的情况中是2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡糖酸且在纤维素的情况中是葡糖酸。
优选地，所述酶具有金属结合位点，并且需要二价金属离子的存在以达到完全活性。该金属离子的结构环境对于CBM33和GH61酶是特征性的(且统一的)。该金属被至少3种在两个家族中完全保守的配体结合：(1)位于成熟蛋白质的位置1(即在切掉用于分泌的信号肽后的蛋白质的N末端)的组氨酸；(2)成熟蛋白质的N末端氨基基团；和(3)完全保守的另一个组氨酸残基。
通过使用标准的生物信息学方法对基因序列(和相应的预测出的基因产物的氨基酸序列)进行分析，可以鉴定出属于CBM33或GH61家族的氧化水解酶。例如，可以使用CBM33或GH61酶的现有多序列的比对(例如由隐马尔科夫模型(Hidden Markov Model)呈现)来搜索序列数据库中的同源序列。由这类搜索取回的序列将很可能是活性的氧化水解酶。通过以下手段可以获得更高的确定性：(1)使用例如程序SignalP来确定基因编码具有用于分泌的信号肽的蛋白质；(2)检查信号肽切割后(要使用例如SignalP来预测切割位点)的N末端是组氨酸；(3)检查在蛋白质序列中有另一个组氨酸，其与多序列比对中的完全或几乎完全(>90%)保守的组氨酸对齐；(4)使用经由同源性的建模，使用自动化服务器如Swiss-Model，确定第二个组氨酸可能位于N末端和N末端的组氨酸附近。
通过确定蛋白质是否可以切割糖苷键并且该过程在存在分子氧、还原剂和二价金属离子的情况中是否变得更有效，技术人员可以容易地通过实验来确定该蛋白质是否是符合上文所描述的定义的氧化水解酶。另外，可以测试假定的氧化水解酶是否和已知的糖分解酶制备物协同作用，并且该协同效应的幅度是否依赖于还原剂和二价金属离子的存在。可以利用实验如在实施例中进行的那些，由此可以评估还原剂和金属离子对酶活性的效果。
优选地，所述氧化水解酶含有至少1个域，其在序列同源性(如例如在现有的Pfam或CAZy数据库中分析的)的基础上被归为CBM33或GH61家族蛋白。当含有CBM33或GH61的蛋白质具有超过1个域时，另外的域通常偶联于CBM33或GH61域的C末端，因为CBM33或GH61域的N末端是氧化水解活性所必需的(参见下文)。CBM33家族已经被CAZy(Carbohydrate-Active EnZymes)系统归为碳水化合物结合模块家族，这暗示着其缺乏酶活性。GH61蛋白已经被归为糖苷水解酶。然而，考虑到本发明人提供的结果，这两种分类都不正确，并且显然需要对这两个蛋白家族的CAZy分类进行校正。CAZy分类基于序列相似性，其将具有特定的最低水平的序列同源性的蛋白域分到一个家族中。CBM33和GH61域具有类似的功能，并且它们具有类似的结构折叠，其核心是扭曲的β-片层三明治样的折叠，类似于对纤连蛋白III型域见到的(图1D,E)。它们还具有完全保守的、位于表面的特征性结构元件(图1F)，所述元件由以下组成：成熟蛋白质(即切掉驱动分泌的信号肽后的蛋白质)的位置1中的组氨酸、另一个完全保守的组氨酸残基(已知对于催化活性是关键的)、和在结合金属离子中与这两个组氨酸一起作用的N末端氨基基团。尽管有这许多一致的且特征性的属性，但这两个家族几乎没有序列同一性，因此最可能的情况是，即使在校正了CAZy分类后也仍然会保留在两个不同的家族中。
优选地，氧化水解酶是GH61类蛋白。由此，本发明的氧化水解酶可以含有、组成为或基本组成为：GH61域、或GH61蛋白、或其生物学活性片段。在此背景中，“基本组成为”指除了构成GH61域或蛋白的那些氨基酸外，在蛋白质中还可以存在另外的氨基酸。优选地，存在1-3、1-5、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100或更多个另外的氨基酸。这些氨基酸通常位于GH61域的C末端。
如上文所提及的，所述氧化水解酶可以包含GH61域或蛋白。蛋白质中因此可以存在另外的模块或域，当其存在时，优选地位于C末端。
在一个优选的特征中，使用天然的GH61域或蛋白、或其生物学活性片段，不过也可以使用天然形式的变体，在下文中描述了其中一些。
包含GH61域或蛋白、或其片段或变体，或者由GH61域或蛋白、或其片段或变体组成的氧化水解酶在本文中被统一称为GH61蛋白、或GH61家族成员或蛋白。
在下表中提供了该家族中合适的天然蛋白质的例子，该表提供了相关的数据库登录号，其通过提述据此并入。
Figure BDA00003011746200211
Figure BDA00003011746200221
Figure BDA00003011746200231
Figure BDA00003011746200251
Figure BDA00003011746200261
Figure BDA00003011746200271
还优选来自黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的GH61蛋白(参见Vanden Wymelenberg等,2009,Appl Environ Microbiol.75(12):4058-68;Hori等,2011,FEMS Microbiol Lett.321(1):14-23)。
优选的GH61蛋白来自真菌，特别是梭孢壳属(Thielavia)，特别优选地来自土生梭孢霉或桔橙梭孢壳(Thielavia aurantiacus)。特别优选地，所述GH61蛋白是来自桔橙梭孢壳的GH61A，或来自土生梭孢霉的GH61B、GH61C、GH61D、GH61E或GH61G，如上文所描述的。其它优选的GH61蛋白包括来自红褐肉座菌的GH61A和B(SEQ ID NO:15和16)。
由此，GH61蛋白可以是、或对应于、或包含在自然界中发现的天然存在的GH61蛋白或其生物学活性片段。或者，GH61蛋白可以是如下文中披露的非天然的变体。
在另一个优选的特征中，所述氧化水解酶是CBM33家族类蛋白。CBM33家族包含碳水化合物结合模块(CBM)，其被定义为碳水化合物结合蛋白内的相连的氨基酸序列，所述蛋白具有碳水化合物结合活性的谨慎(discreet)折叠。例如，已知除了催化区外还含有一个或多个壳多糖结合模块的壳多糖酶。粘质沙雷氏菌的ChiA含有纤连蛋白III型-CBM型，粘质沙雷氏菌的ChiB含有家族5CBM，且粘质沙雷氏菌的ChiC含有家族12和纤连蛋白III型-样CBM。对于域的命名法，参见Bourne&Henrissat,2001,Curr.Opin.Struct.Biol.11:593。同样地，许多纤维素酶含有结合纤维素的CBM。结合壳多糖并含有刺激这类结合的CBM的蛋白质可以是，例如结构性或信号传导分子，或者它们可以是酶，并且可以由除了碳水化合物结合模块以外存在的域确定该蛋白质的总体功能。然而，用在本发明的方法中的CBM必须具有如上文所限定的氧化水解活性。迄今为止，仅在一个CBM家族中检测到这类氧化水解活性，该家族即CBM家族33。该家族由壳多糖结合蛋白(CBP)CBP21的功能例示。
可以依照基于序列相似性的CAZY分类系统(cazy.org/CAZY/fam/acc_CBM.html)来鉴定碳水化合物结合模块家族33(CBM33)的成员(Davies&Henrissat,2002,Biochem Soc T30:291-297和Bourne&Henrissat,2001,见上)。已知该家族中的蛋白质结合壳多糖，但还观察到它们结合其它多糖，包括纤维素(Moser等,2008,Biotechnol.Bioeng.100(6):1066-77)。对于其中一些蛋白，已经显示它们在壳多糖和纤维素的降解中分别与壳多糖酶和纤维素酶协同作用(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280(31):28492-7;Vaaje-Kolstad等,2009,FEBS J.276(8):2402-15;Moser等,2008,见上)，如在实施例中描述的。
对壳多糖结合蛋白CBP21(以及其它CBM33蛋白)的作用的研究目前已经导致对CBM33蛋白作为氧化水解酶的鉴定。
如本文中描述的，CBM家族33的所有成员都含有家族33碳水化合物结合模块。在数种情况中，CBM33模块构成了整个蛋白质，即蛋白质由或基本由单个家族33CBM组成，其天然就如此合成并分泌。然而，可以将一些家族33CBM融合到一种或多种另外的非催化性的碳水化合物结合模块(例如CBM家族2、CBM家族3、和CBM家族5模块)上。这些蛋白质是双域或多域蛋白质。还有一个作为单独模块存在于大得多的催化蛋白质中的家族33碳水化合物结合模块的已知例。它是Caldibacillus cellulovorans的β-1,4-甘露聚糖酶蛋白(Sunna等,2000,Appl.Environ.Micro.66(2):664-670)。
家族33CBM通常为约150-250个氨基酸，例如大小为160-240、170-230、180-220、190-210个氨基酸且具有约20kDa的分子量，优选地，大小为19-21kDa、18-21kDa、19-22kDa或18-20kDa，不过也可以使用长达300-400个氨基酸、具有约30-40kDa分子量的CBM33域。可以通过本领域中已知的标准方法容易地测定蛋白质的大小。
优选地，所述氧化水解酶由单独的家族33CBM组成，或基本由家族33CBM组成。
如果所述氧化水解酶“基本由家族33CBM组成”，那么意味着蛋白质中除了那些构成家族33CBM的氨基酸外还可能存在另外的氨基酸。优选地，存在1-3、1-5、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100或更多个另外的氨基酸。这些另外的氨基酸通常位于家族33CBM的C末端。
或者，所述氧化水解酶可以包含家族33CBM。由此，该蛋白质中可以存在另外的模块或域。这类模块的例子是CBM家族2、CBM家族3、和CBM家族5模块。如果存在另外的域或模块，它们一般被发现位于家族33CBM的C末端。
因此，在一个优选的方面，所述氧化水解酶可以含有、组成为或基本组成为：天然存在的家族33CBM(或CBM33家族蛋白)如CBP21(或其另一物种的同源物)、或其生物学活性片段。或者，其可以含有、组成为或基本组成为：天然存在的家族33CBM(或CBM33家族蛋白)的变体或其生物学活性片段。
包含或组成为家族33CBM模块、或完整的家族33CBM蛋白(其包含家族33CBM模块)、或其片段或变体的氧化水解酶在本文中被统一称为CBM33蛋白、或CBM33家族成员或蛋白。
可以在本发明中使用的天然存在的CBM33蛋白包括微生物(例如细菌)、真核生物(例如网柄菌属(Dictyostelium))或病毒的CBM33蛋白。然而，优选细菌CBM33蛋白。
在表1中列出了可以在本发明方法中使用的已知的CBM33蛋白的例子和相关的数据库登录号(其通过提述据此并入)：
Figure BDA00003011746200291
Figure BDA00003011746200301
Figure BDA00003011746200311
Figure BDA00003011746200331
Figure BDA00003011746200341
Figure BDA00003011746200351
Figure BDA00003011746200352
Figure BDA00003011746200353
Figure BDA00003011746200361
Figure BDA00003011746200371
其他优选的细菌CBM33蛋白包括：
Figure BDA00003011746200372
细菌CBM33蛋白可以来自任何合适的来源，但优选地，来自选自下组的属：芽孢杆菌属(Bacillus)、色杆菌属(Chromobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、Hahella、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、李斯特菌属(Listeria)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、发光杆菌属(Photobacterium)、Photothabdus、变形菌属(Proteus)、交替假单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、噬糖菌属(Saccharophagus)、Salinvibrio、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、Sodalis、链霉菌属(Streptomyces)、Thermobifida、弧菌属(Vibrio和耶尔森氏菌属(Yersini)，以及任选地纤维单胞菌属(Cellulomonas)和纤维弧菌属(Cellvibrio)。
优选地，所述CBM33蛋白是如记载于美国专利申请No.2007/0218046(其通过提述并入本文)中的CBP21。例如，优选粘质沙雷氏菌的CBP21(SEQID NO:4)。或者，可以使用粪肠球菌的EfCBM33(SEQ ID NO:5)、Thermobifida fusca的E7(SEQ ID NO:6)、天蓝色链霉菌A3(2)的CelS2(SEQID NO:7)、产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)DSM20109的Cfla_0175(SEQ ID NO:8)、产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0172(SEQ ID NO:9)、产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0316(SEQ ID NO:10)、产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0490(SEQ ID NO:11)、日本纤维弧菌Ueda107的CJA_2191(Cbp33A)(SEQ ID NO:12)、日本纤维弧菌Ueda107的CJA_3139(Cbp33/10B)(SEQ ID NO:13)、和天蓝色链霉菌A3(2)的SCO1734(SEQ IDNO:14)。在本发明中还优选使用的CBM33蛋白是解淀粉芽孢杆菌的ChbA(Chu等,2001,Microbiology147(Pt7):1793-803)、链霉菌属的CHB1、2&3(Svergun等,2000,Biochemistry39(35):10677-83,Zeltins等,1997,Eur.J.Biochem.246(2):557-64,Zeltins等,1995,Anal.Biochem.231(2):287-94,Schnellmann等,1994,Mol.Microbiol.13(5):807-19;Kolbe等,1998,Microbiology144(Pt5):1291-7;Saito等,2001,Appl.Environ.Microbiol.67(3):1268-73)和交替单胞菌属的CBP1(Tsujibo等,2002,Appl.Environ.Microbiol.68:263-270)。所有这些引用都通过提述并入本文。
因此，所述氧化水解酶可以是、或对应于、或包含自然界中发现的天然存在的CBM33家族蛋白(如CBP21、EfCBM33、ChbA、CHB1、2&3和CBP1或E7、CelS2、Cfla_0175、Cfla_0172、Cfla_0316、Cfla_0490、CJA_2191(Cbp33A)、CJA_3139(Cbp33/10B)和SCO1734)或GH61家族蛋白、或其生物学活性片段。或者，所述氧化水解酶可以是如下文中披露的非天然的变体。
如上文提及的，所述氧化水解酶可以是天然蛋白质、或其生物学活性片段、或含有那些酶的分子。此外，非天然的蛋白质可以自天然存在的蛋白质(例如自GH61或CBM33家族蛋白)衍生。
优选地，这类片段长度至少为200、300或400个氨基酸，且优选地，包含来自N或C末端的简单的短的缺失，例如C末端1、2、3、4或5个氨基酸的缺失。
所有这类变体或片段必须保留其所起源的蛋白质的功能特性，从而使它们是“生物学活性的”。因此，它们在例如实施例中描述的条件下必须保留氧化水解活性(例如，在存在还原剂和一种或多种糖分解酶的情况下使用时，与没有还原剂的情况下实施该方法相比，显示出增强的活性，参见例如图4)。此外，在存在还原剂和二价金属离子的情况下使用时，相对于略去还原剂和二价金属离子的降解，所述生物学活性片段和变体必须能够如本文中描述的增强降解，即增强多糖底物的降解(例如，在存在一种或多种糖分解酶的情况下实施所述降解时)。预期会有一些活性损失，例如所述生物学活性片段或变体可以具有天然全长序列的至少50、60、70、80、90或95%的氧化水解活性，其中可以就在设定时间段内达到的降解(例如水解)程度或水平对所述活性进行评估，例如通过反应产物如寡糖和/或二糖的生成来评估的。
变体包括或包含上文所描述的氧化水解酶的天然存在的变体，如在其它物种中发现的可比较的蛋白质或同源物，或者更特别地，在其它微生物中发现的具有如上文描述的酶的功能特性的变体。
还可以通过合成生成如本文中限定的天然存在的氧化水解酶的变体，例如通过使用本领域中已知的标准分子生物学技术，例如标准的诱变技术，如位点定向或随机诱变。这类变体进一步包括或包含与天然存在的氧化水解酶在氨基酸水平上具有至少70、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列相似性或同一性的蛋白质。
因此，在一个优选的方面，在本文描述的方法中使用的氧化水解酶是一种多肽，所述多肽包含如在SEQ ID NO:1-14(例如SEQ ID NO:1-4或1-5)和/或15-16(在存在的情况下，任选地有或无前导肽)的任意一个中所列出的氨基酸序列，或者包含与其有至少30、40、50、60、70、80、90、95、97、98或99%的序列同一性的序列，或所述序列的包含至少100个氨基酸(优选地至少200或300个氨基酸)的生物学活性片段。
在下面的序列中，当存在前导肽时在其下划线：
SEQ ID NO:1–来自土生梭孢霉的GH61E(登录号ACE10234)
MLANGAIVFLAAALGVSGHYTWPRVNDGADWQQVRKADNWQDNGYVGDVTSPQIRCFQATPSPAPSVLNTTAGSTVTYWANPDVYHPGPVQFYMARVPDGEDINSWNGDGAVWFKVYEDHPTFGAQLTWPSTGKSSFAVPIPPCIKSGYYLLRAEQIGLHVAQSVGGAQFYISCAQLSVTGGGSTEPPNKVAFPGAYSATDPGILINIYYPVPTSYQNPGPAVFSCMLANGAIVFLAAALGVSGHYTWPRVNDGADWQQVRKADNWQDNGYVGDVTSPQIRCFQATPSPAPSVLNTTAGSTVTYWANPDVYHPGPVQFYMARVPDGEDINSWNGDGAVWFKVYEDHPTFGAQLTWPSTGKSSFAVPIPPCIKSGYYLLRAEQIGLHVAQSVGGAQFYISCAQLSVTGGGSTEPPNKVAFPGAYSATDPGILINIYYPVPTSYQNPGPAVFSC
SEQ ID NO:2–来自桔橙梭孢壳的GH61A(登录号ABW56451)
MSFSKIIATAGVLASASLVAGHGFVQNIVIDGKKYYGGYLVNQYPYMSNPPEVIAWSTTATDLGFVDGTGYQTPDIICHRGAKPGALTAPVSPGGTVELQWTPWPDSHHGPVINYLAPCNGDCSTVDKTQLEFFKIAESGLINDDNPPGIWASDNLIAANNSWTVTIPTTIAPGNYVLRHEIIALHSAQNQDGAQNYPQCINLQVTGGGSDNPAGTLGTALYHDTDPGILINIYQKLSSYIIPGPPLYTG
SEQ ID NO:3–来自土生梭孢霉的GH61B(登录号ACE10231)
MKSFTIAALAALWAQEAAAHATFQDLWIDGVDYGSQCVRLPASNSPVTNVASDDIRCNVGTSRPTVKCPVKAGSTVTIEMHQQPGDRSCANEAIGGDHYGPVMVYMSKVDDAVTADGSSGWFKVFQDSWAKNPSGSTGDDDYWGTKDLNSCCGKMNVKIPEDIEPGDYLLRAEVIALHVAASSGGAQFYMSCYQLTVTGSGSATPSTVNFPGAYSASDPGILINIHAPMSTYVVPGPTVYAGGSTKSAGSSCSGCEATCTVGSGPSATLTQPTSTATATSAPGGGGSGCTAAKYQQCGGTGYTGCTTCASGSTCSAVSPPYYSQCL
SEQ ID NO:4-来自粘质沙雷氏菌的CBP21
MNKTSRTLLSLGLLSAAMFGVSQQANAHGYVESPASRAYQCKLQLNTQCGSVQYEPQSVEGLKGFPQAGPADGHIASADKSTFFELDQQTPTRWNKLNLKTGPNSFTWKLTARHSTTSWRYFITKPNWDASQPLTRASFDLTPFCQFNDGGAIPAAQVTHQCNIPADRSGSHVILAVWDIADTANAFYQAIDVNLSK
在上面的序列(SEQ ID NO:4)中，氨基酸残基1-27对应于天然系统中蛋白质分泌所必需的前导肽，且氨基酸28-196对应于成熟的蛋白质。将Pfam用于域/模块发现(Finn等,2010,Nucleic Acids Research数据库第38期：D211-222,“The Pfam protein families database”)，对于SEQ ID NO:4，残基28-194(即基本完整的成熟蛋白质)被归为CBM33。类似地，对于下面的SEQ ID NO:5中呈现的序列，成熟的蛋白质起始于位置29(H)。
SEQ ID NO:5–来自粪肠球菌的EfCBM33(登录号Q838S1)
MKKSLLTIVLAFSFVLGGAALAPTVSEAHGYVASPGSRAFFGSSAGGNLNTNVGRAQWEPQSIEAPKNTFITGKLASAGVSGFEPLDEQTATRWHKTNITTGPLDITWNLTAQHRTASWDYYITKNGWNPNQPLDIKNFDKIASIDGKQEVPNKVVKQTINIPTDRKGYHVIYAVWGIGDTVNAFYQAIDVNIQ
SEQ ID NO:6–来自Thermobifida fusca的E7(登录号Q47QG3)
MHRYSRTGKHRWTVRALAVLFTALLGLTQWTAPASAHGSVINPATRNYGCWLRWGHDHLNPNMQYEDPMCWQAWQDNPNAMWNWNGLYRDWVGGNHRAALPDGQLCSGGLTEGGRYRSMDAVGPWKTTDVNNTFTIHLYDQASHGADYFLVYVTKQGFDPTTQPLTWDSLELVHQTGSYPPAQNIQFTVHAPNRSGRHVVFTIWKASHMDQTYYLCSDVNFV
SEQ ID NO:7–来自天蓝色链霉菌A3(2)的CelS2(登录号Q9RJY2)
MVRRTRLLTLAAVLATLLGSLGVTLLLGQGRAEA
HGVAMMPGSRTYLCQLDAKTGTGALDPTNPACQAALDQSGATALYNWFAVLDSNAGGRGAGYVPDGTLCSAGDRSPYDFSAYNAARSDWPRTHLTSGATIPVEYSNWAAHPGDFRVYLTKPGWSPTSELGWDDLELIQTVTNPPQQGSPGTDGGHYYWDLALPSGRSGDALIFMQWVRSDSQENFFSCSDVVFDGGNGEVTGIRGSGSTPDPDPTPTPTDPTTPPTHTGSCMAVYSVENSWSGGFQGSVEVMNHGTEPLNGWAVQWQPGGGTTLGGVWNGSLTSGSDGTVTVRNVDHNRVVPPDGSVTFGFTATSTGNDFPVDSIGCVAP
SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6和7中蛋白质的信号肽已被划线。以粗体形式显示了这些蛋白质的金属结合基序中的两个保守的组氨酸。类似地，对下面的SEQ ID NO:8-14显示了信号肽和组氨酸。
SEQ ID NO:8–来自产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0175
MPRHRSTRRALAGLAATAVVTTALVTVPTVAQAHGGLTNPPTRTYACYQDGLAGGAAAGEAGNIRPRNAACVNAFDNEGNYSFYNWYGNLLGTIAGRHETIADGKVCGPDARFASYNTPSSAWPTTKVTPGQTMTFQYAAVARHPGWFTTWITKDGWNQNEPIGWDDLEPAPFDRVLDPPLREGGPAGPEYWWNVKLPSNKSGKHVLFNIWERTDSPESFYNCVDVDFGGGGTVTPSPTPSVTPTRTPTPSPTPSVTPSPTPSVTPTPTPTPTPTPSPTPTLTVTPTPTPTSVPGDSVCELEVDTSSAWPGGFQGTVTVFNATMEPVNGWQVSWKFTNGETIAQSWSGVTSQSGSTVTVKNADWNSTIAHHNAVNFGFIGSGTPKAVTDATLNGKPCIVR
SEQ ID NO:9–来自产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0172
MFIPTRSRFGRLARLALAVPLALAATGIVATSASAHGSVTDPPSRNYGCWEREGGTHMDPAMAQRDPMCWQAFQANPNTMWNWNGNFREGVGGRHEQVIPDDQLCSAGKTQNGLYASLDTPGPWIMKTVPHNFTLTLTDGAMHGADYMRIYVSKAGYDPTTDPLGWDDIELIKETGRYGTTGLYQADVSIPSNRTGRAVLFTIWQASHLDQPYYICSDININGTAPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQNPGTGACTATVKAASTWGNGWQGEVTVTAGSSAINGWKVTVGGASITQAWSGSYSGGTFSNAEWNGKLAAGASTTAGFIASGTPGTLTATCTAA
SEQ ID NO:10–来自产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0316
MSRISPLRRVAAACGALAIGAATVVGSIALAAPASAHGAVSDPPSRIYGCWERWASNFTDPAMATSDPQCWDAWQSEPQAMWNWNGMFKEGAAGQHEQSIPDGKLCSADNPLYAAADDPGPWRTTPVDHDFRLTLHDPSNHGADYLKIYVTKQGYDARSEALTWADLELVKTTGRYATSSPYVTDVSVPRDRTGHHVVFTIWQASHLDQPYYQCSDVTFGGGGTPTTSPTTPAPTPTTPAPTTPAPTPTTPAPTTPAPTTPAPTTPAPTTPAPTQPADGACTAAIEVVSAWQGGYQATVTVTAGSGGLDGWTVTVPGATITQAWNGTATGSTITAAGWNGTVAAGGTAGVGFLGSGSPDGLTATCAAA
SEQ ID NO:11–来自产黄纤维单胞菌DSM20109的Cfla_0490
MRSHALPRSARPTPGRLLLSVLAVIALAFAVLTVAPAPSAQAHGWISDPPSRQDLCYTGAVSNCGPVMYEPWSVEAKKGSMQCSGGGRFTELDNESRSWPRQNLKTNQVFTWDIVANHSTSTWEYFVDGRLHTTIDDKGALPPNRFTHTINNLPEGNHKIFVRWNIADTVNAFYQCIDAYITPGGTPGPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPTQQPGNGACTATFKTNNAWGNGYQGEITVTAGSSAIRGWKVTVNGATITQAWSSQLSGSTLSNASWNGSLNAGASTTLGFIANGTPSGVTATCAAA
SEQ ID NO:12–来自日本纤维弧菌Ueda107的CJA_2191(Cbp33A)
MFNTRHLLAGVSQLVKPASMMILAMASTLAIHEASAHGYVSSPKSRVIQCKENGIENPTHPACIAAKAAGNGGLYTPQEVAVGGVRDNHDYYIPDGRLCSANRANLFGMDLARNDWPATSVTPGAREFVWTNTAAHKTKYFRYYITPQGYDHSQPLRWSDLQLIHDSGPADQEWVSTHNVILPYRTGRHIIYSIWQRDWDRDAAEGFYQCIDVDFGNGTGTGSSSSVASSVVSSVTSSSVASSVASSLSNDTCATLPSWDASTVYTNPQQVKHNSKRYQANYWTQNQNPSTNSGQYGPWLDLGNCVTSGGSSSVASSSVASSVASSVTSSVASSVVSGNCISPVYVDGSSYANNALVQNNGSEYRCLVGGWCTVGGPYAPGTGWAWANAWELVRSCQ
SEQ ID NO:13-来自日本纤维弧菌Ueda107的CJA_3139(Cbp33/10B)
MNNKFVKMGGMGALLLAFSALSFGHGFVDSPGARNYFCGAVTKPDHVMNGVARYPECAGAFANDFNGGYSYMSVLTHHQGRKVLGPVARNVCGFDSETWNGGKTPWDNAINWPVNNINSGTLTFSWDISNGPHFDDTSDFRYWITKPGFVYQVGRELTWADFEDQPFCDLAYNDDNPGAYPNVRADKPNTHFHTTCTVPARTGRHVIYAEWGREPPTYERFHGCIDVQIGGGSNSSVPVSSSSSSRSSSSSSLAPSSSSRSSSSSSSVSSSRSSSSSVVSSSSSSRPASSSSSSTGGSTEYCNWYGWQVAICKNTTSGWSNENQQTCIGRDTCNAPR
SEQ ID NO:14-来自天蓝色链霉菌A3(2)的SCO1734
MPAPSASRRAAAVAVAGLAPLALTTLAAAPASAHGSMGDPVSRVSQCHAEGPENPKSAACRAAVAAGGTQALYDWNGIRIGNAAGKHQELIPDGRLCSANDPAFKGLDLARADWPATGVSSGSYTFKYRVTAPHKGTFKVYLTKPGYDPSKPLGWGDLDLSAPVATSTDPVASGGFYTFSGTLPERSGKHLLYAVWQRSDSPEAFYSCSDVTFGGDGDGDGDGGSGSGAATGDDTASGDAEAGAAPAPEASAPSEEQLAAAAEKSTIEHHGHGDQDAATTTDPTDPAAAPEEAPGTAAEPHQVKAAGGGTENLAETGGDSTTPYIAVGGAAALALGAAVLFASVRRRATTGGRHGH
显示无信号肽的SEQ ID NO:15和16。以粗体形式显示这些蛋白质的金属结合基序中的两个保守的组氨酸。
SEQ ID NO:15-来自红褐肉座菌的HjGH61A
HGHINDIVINGVWYQAYDPTTFPYESNPPIVVGWTAADLDNGFVSPDAYQNPDIICHKNATNAKGHASVKAGDTILFQWVPVPWPHPGPIVDYLANCNGDCETVDKTTLEFFKIDGVGLLSGGDPGTWASDVLISNNNTWVVKIPDNLAPGNYVLRHEIIALHSAGQANGAQNYPQCFNIAVSGSGSLQPSGVLGTDLYHATDPGVLINIYTSPLNYIIPGPTVVSGLPTSVAQGSSAATATASATVPGGGSGPTSRTTTTARTTQASSRPSSTPPATTSAPAGGPTQTLYGQCGGSGYSGPTRCAPPATCSTLNPYYAQCLN
SEQ ID NO:16-来自红褐肉座菌的HjGH61
HGQVQNFTINGQYNQGFILDYYYQKQNTGHFPNVAGWYAEDLDLGFISPDQYTTPDIVCHKNAAPGAISATAAAGSNIVFQWGPGVWPHPYGPIVTYVVECSGSCTTVNKNNLRWVKIQEAGINYNTQVWAQQDLINQGNKWTVKIPSSLRPGNYVFRHELLAAHGASSANGMQNYPQCVNIAVTGSGTKALPAGTPATQLYKPTDPGILFNPYTTITSYTIPGPALW
当生成变体时，应当注意的是适于修饰的残基取决于在这类变体中所寻找的特性。在寻找具有与天然的亲本分子相同的氧化水解活性的变体的情况中，残基通常是那些不牵涉酶与壳多糖底物的催化反应或相互作用的残基。然而，备选的方案是，可以靶向那些残基来产生具有改进的反应性的变体。这可以通过标准的蛋白质工程改造技术或通过基于随机诱变继而筛选的技术来实现，所有技术都是本领域中公知的。试图改进氧化水解酶功能的尝试可以包括改进酶的结合和催化能力，例如作用于其它底物(例如含有碳水化合物的共聚物，例如蛋白质-碳水化合物共聚物)。
本领域中的技术人员会认识到使用天然蛋白质的框架来创建经优化以用于其它不可溶性的聚合多糖底物(例如壳多糖或纤维素的其它形式)或不可溶性的含有碳水化合物的共聚物的变体的潜力。
在如SEQ ID NO:1、2和3(和15-16)中所列出的GH61蛋白的情况中，优选地，位于SEQ ID NO:1的位置19、86、169、171和210处的残基或其它GH61蛋白中的相应残基是保守的(参见Harris等，2010,Biochemistry49:3305-3316，其中成熟蛋白质的His-1出现在位置19处)。可以通过序列比对容易地发现这类相应残基。
在CBP21的情况中，已经显示数个残基在CBP21对壳多糖的结合中以及更特定地对CBP21增强壳多糖降解的能力是重要的(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313-11319和28492-28497)。已经显示了数种突变不影响CBP21的结合，但影响CBP21增强壳多糖降解的能力。对其它CBM33蛋白也可以预料到这些结果，所述CBM33蛋白如EfCBM33、E7、CelS2、Cfla_0175、Cfla_0172、Cfla_0316、Cfla_0490、CJA_2191(Cbp33A)、CJA_3139(Cbp33/10B)和SCO1734。如果目的是修饰例如CBP的稳定性(例如在工艺条件下)，优选地不将这些残基相对于如在SEQ ID NO:4(或SEQ ID NO:5-14中任意一个，例如SEQ ID NO:5)中列出的野生型CBP21序列进行修饰，但如果目的是改进或改变CBP21的功能特性，那么可以靶向这些残基。
优选的CBP21变体保留了一个或多个以下氨基酸，优选地保留所有以下氨基酸：位于位置54处的酪氨酸残基、位于位置55处的谷氨酸残基、位于位置60处的谷氨酸残基、位于位置114处的组氨酸残基、位于位置182处的天冬氨酸残基和位于位置185处的天冬酰胺(序列编号依照SEQ ID NO:4)。
与氨基酸序列有关的“序列相似性”(优选地“序列同一性”)指当使用例如使用蛋白序列数据库，使用FASTA pep-cmp(具有可变的pam因子，缺口创建罚分设置成12.0，缺口延伸罚分设置成4.0且窗口为2个氨基酸)评估时，具有规定值的序列。在特定残基处的序列同一性意图包括已经被简单地衍生化的相同残基。参照用于比较的所记载序列的全长序列来进行序列同一性评估。
优选的“变体”包括其中出现在序列中的氨基酸并非天然存在的氨基酸，而是其结构性的(例如非天然的)类似物的那些序列。在序列中使用的氨基酸也可以是经过衍生化或修饰的，例如经过标记、糖基化或甲基化的，只要氧化水解酶的功能并未受到重大的不利影响。
进一步优选的变体是其中相对于上文所描述的氨基酸序列，已经通过单个或多个氨基酸(例如，1-10，例如1-5，优选地1或2个残基)的取代、添加和/或缺失或化学修饰(包括去糖基化或糖基化)进行了修饰，但仍然保留功能活性(其程度在于特别在与一种或多种糖分解酶联合使用时，它们结合多糖底物并增强其降解)的氨基酸序列。
“添加”变体的意义中包括氨基和/或羧基末端融合蛋白或多肽，其包含融合到酶序列的另外的蛋白质或多肽或其它分子。优选羧基末端融合。必须确保任何对酶的这类融合不会对其在本发明的方法中使用所需的功能特性(如在本文中别处陈述的)有不利影响。
优选地，“取代”变体牵涉将一个或多个氨基酸用相同数目的氨基酸替换和进行保守性取代。
上文所提及的这类功能等同的变体具体地包括天然存在的生物学变体(例如在其它微生物物种中发现的)和使用已知的技术制备的衍生物。具体而言，本文中所描述的氧化水解酶的功能等同变体扩展到在不同于本文中所提及的特定分子的属或种中有功能的(或存在的)、或自其衍生的酶。
使用本领域中已知并记载的技术，例如使用标准的重组DNA技术，可以以任何适当的方式生成变体如上文所描述的那些。
优选地，本文中描述的变体或片段衍生于上文所列出的天然序列，特别是那些SEQ ID NO:1-14(例如SEQ ID NO:1-4或1-5)和/或15-16中的任何一个。
如本文中所指的，“还原剂”是在氧还(氧化还原)反应中还原另一种物质并由此变成氧化态的要素或化合物，并且其因此是氧还反应中的电子供体。优选地，所述还原剂是非酶的。在此具体的发明中，被还原的化合物是氧，其通过还原而被活化，从而增强了例如GH61或CBM33蛋白的氧化水解功能。所述还原剂可以在酶促过程中充当电子供体，而且可以通过反应性氧种类如O2 -的生成发生电子赠献。还原剂促进了电子赠献和/或反应性氧的生成。优选地，所述还原剂是抗坏血酸、还原型谷胱甘肽或Fe(II)SO4。进一步优选的还原剂是LiAlH4和NaBH4。其它优选的还原剂包括有机酸(如琥珀酸、没食子酸、香豆酸、胡敏酸(humic acid)和阿魏酸)和还原糖(如葡萄糖、葡糖胺和N-乙酰葡糖胺)，或者可以使用含有还原基团的木质素或其片段作为还原剂。如上文所记载的，可以使用Fe(II)SO4作为还原剂，并且由此还会提供需要的二价金属离子。尽管单一的化合物可以提供还原剂和金属离子，但优选通过不同的化合物来提供这些特征，即还原剂和金属离子是分别的化合物。
按照本发明的方法可以使用超过一种这类试剂，并且可以依照使用的底物和条件(例如，pH和温度)进行选择。会理解的是，还原剂的效力和稳定性在这些试剂间不同并依赖于pH。因此，应当使pH和还原剂针对要使用的氧化水解酶优化。
优选地，所述二价金属离子是Ca、Co、Mg、Mn、Ni或Zn。在一个备选的实施方案中，所述二价金属离子是Cu。因此，可以使用例如盐，如MgCl2、ZnCl2或CoCl2(或者CuCl2)。
下列描述列出了可以用于实施本发明方法的条件，但应当注意的是可以使用任何适当的条件。
在使含有多糖的材料与氧化水解酶接触前，可以对所述含有多糖的材料进行预处理。
可以使用本领域中已知的常规方法对含有多糖的材料进行预处理，例如以破坏植物细胞壁组分。在预处理前，在合适的情况下，可以使用本领域中已知的方法将含有多糖的材料经过预浸渍、润湿或调节。物理预处理技术包括，例如各种类型的磨制、辐射、气蒸/蒸汽爆破和水热解；化学预处理技术可以包括稀酸、碱(例如石灰预处理)、有机溶剂(如有机溶剂预处理)、氨处理(例如氨渗滤(APR)和氨纤维/冷冻爆炸(AFEX))、二氧化硫、二氧化碳、湿氧化和pH控制的水热解；以及生物预处理技术可以牵涉应用溶解木质素的微生物(参见例如Hsu,1996,Pre-treatment of biomass，于“Handbook onBioethanol:Production and Utilization”,Wyman编，Taylor&Francis,Washington,DC,179-212;Ghosh&Singh,1993,Adv.Appl.Microbiol.39:295-333;McMillan,1994,Pretreating lignocellulosic biomass:a review，于“Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production”,Himmel等编，ACSSymposium Series566,American Chemical Society,Washington,DC，第15章；Gong等,1999,Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology,Scheper编，Springer-Verlag Berlin Heidelberg,Germany,65:207-241;Olsson&Hahn-Hagerdal,1996,Enz.Microb.Tech.18:312-331；和Vallander&Eriksson,1990,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.42:63-95)。另外的预处理包括超声、电穿孔、微波、超临界CO2、超临界H2O和氨渗滤。
预处理后的玉米秸秆是通过例如加热和稀酸处理，自玉米秸秆衍生的含有纤维素的材料。
在任选的预处理后，可以将含有多糖的材料(底物)在任何合适的容器中体外暴露于氧化水解酶，例如通过将底物和酶在合适的介质(例如溶液如水溶液)中混合在一起，或通过将酶施加到底物(例如通过将酶溶液施加到底物)。
在一个优选的实施方案中，所述氧化水解酶存在于缓冲液，如磷酸盐缓冲液例如磷酸钠缓冲液或Tris缓冲液中。这类缓冲液的合适的浓度范围是1-100mM。氧化水解酶可以以纯化的制备物(如下文所描述的)或可以存在于组合物中提供，其中它可以是主要组分，优选地包含组合物中至少20、30、40、50、60或70%w/w的干重，或者它可以是次要组分(例如，在与一种或多种糖分解酶的混合物中)，优选地包含组合物中至少1、2、5或10%(例如1-5%)w/w的干重。
所述酶在溶液中可以以任何合适的浓度存在，如0.001-1.0mg/ml的浓度，例如0.01-0.1mg/mL或0.05-0.5mg/mL。
多糖底物以任何合适的浓度存在于反应混合物中，该浓度在一定程度上会取决于含有多糖的材料中多糖的纯度。然而，合适地，多糖自身以0.1-200mg/ml的浓度存在，优选地0.2-20mg/mL或0.5-50mg/mL，或更优选地25-150mg/mL，特别优选地至少25mg/mL。优选地，多糖在含有多糖的材料中以在材料中大于50%，例如大于60、70、80或90%w/w干重的水平存在。
优选地，将所述多糖底物暴露于酶(例如通过一起温育)达4、6、12或24小时或更长，如4-24或6-24小时，例如36或48小时或更长，或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更长。在一个优选的方面，温育达6-24小时。该温育通常在50℃或在约50℃实施，尽管本领域中的技术人员能够容易地确定用于优化多糖降解的增强的合适温度。例如，温度可以在20-65℃的范围内，例如30-60℃，优选地50-55℃。
会理解的是，必需的温育时间、pH、温度、底物和酶浓度并不是彼此独立的。因此，可以涵盖较大范围的条件，其可以被容易地评估。氧化水解酶起着增强由糖分解酶进行的降解的作用，并因此允许使用更低浓度的糖分解酶或更短的反应时间。
优选地，使用范围在4-9的pH。优选地，pH范围在5-8。优选的pH为约pH5-6。
在使用还原剂的情况下，优选地，在降解反应持续期间加入还原剂，不过可以在反应开始后加入，并可以仅当氧化水解酶存在或为活性时存在。优选地，加入还原剂至终浓度范围为0.1-100mM，优选地0.5-20mM，特别优选地1-5mM。还原剂可以存在于多糖底物(例如存在于木质纤维素生物质中的木质素)中，但优选地向反应混合物加入所述还原剂。
和还原剂类似的，可以在开始时或在降解反应期间加入金属离子。然而，向反应混合物中加入金属离子并非总是必须的，因为一些含有底物的材料可能含有充足的金属离子使反应成功进行。然而，在一个优选的方面，向反应混合物加入金属离子。在一个实施方案中，可以在氧化水解酶生成或分离期间或者在将该酶加入反应混合物前向其加入金属离子，从而使该酶已经“预负载”了相关的金属离子。优选地，加入金属离子至终浓度范围为0.001-50mM，例如0.01-50mM，优选地0.1-5mM。对于要在反应混合物中使用的特定的金属离子，可以容易地确定要使用的浓度。例如，相对于其它金属离子需要的浓度，较低浓度的Cu2+(例如0.001-0.1mM)可能是合适的。会理解的是，最适金属离子浓度在一定程度上取决于在建立的酶促转化反应中使用的酶和底物浓度。
如本文中记载的，氧化水解酶被认为通过分子氧氧化来催化水解。因此，在反应中可以使用分子氧是必要的(如在实施例中记载的)。如此，必须避免任何导致无氧(厌氧)环境的条件。
因此，在一个优选的方面，所述方法包括使所述多糖与氧化水解酶接触并向反应混合物加入至少一种还原剂，以及优选地，加入至少一种二价金属离子。
优选地，特别在使用含有纤维素的材料时，伴随着搅拌实施温育。
在一个优选的方面，以0.01-0.5mg/mL的浓度使用氧化水解酶，并以25-150mg/mL使用多糖底物(当依照靶底物含量计算且不考虑与底物同时存在的其它物质时)，并且反应在50-55℃以pH5-8进行6-24小时。
在其中仅与氧化水解酶一起实施降解或水解的反应中，所述反应的结果是对多糖的不完全降解，从而得到大量地不可溶性的长寡糖和少部分可溶性寡糖，可能包括非常少部分的二糖。优选地，通过使用合适的另外的降解性糖苷水解酶来进一步增强或完成所述降解或水解。
因此，在一个进一步优选的方面，本发明提供了降解或水解多糖的方法，包括：
a)使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解，并
b)使所述多糖(或其降解或水解产物)与一种或多种选自纤维素水解酶或壳多糖水解酶的糖分解酶接触。
显然，在实施所述方法时，必须按照多糖底物来选择氧化水解酶和糖分解酶，例如，针对纤维素的GH61和纤维素水解酶，以及针对壳多糖的CBP21或另一种CBM33家族蛋白和壳多糖水解酶。不同底物之间的交叉反应也是可能的，例如，CBM33家族蛋白可有效作为对纤维素的氧化水解酶，例如在纤维素上实施的本发明的方法中可以使用SEQ ID NO:5(EfCBM33)和本文中描述的其它CBM33蛋白。同样地，在纤维素以外的其它底物(例如壳多糖或半纤维素)上可以使用GH61家族成员。
到目前为止，仅报告了CBM33家族成员以壳多糖作为底物的酶活性(例如来自粘质沙雷氏菌的CBP21)。然而，本发明证明了CBM33家族的成员(例如E7和CelS2)可以作用于纤维素。该酶功能使不可溶性纤维素晶体中纤维素链被水解(切割)和氧化，这使得纤维素酶能够将纤维素更快地解构。作用于纤维素的CBM33酶在存在外部电子供体(例如还原剂)和二价金属离子的情况下工作最佳。这些酶的特征高度类似于之前对作用于壳多糖的CBM33酶所观察到的那些。在本文中所描述的实验中，表达并纯化了来自Thermobifidafusca的单域CBM33(Uniprot ID:Q47QG3;E7)和来自天蓝色链霉菌A3(2)的多域CBM33(Uniprot ID:Q9RJY2；CBM33在该蛋白质C末端一侧附着有CBM2；CelS2)，并观察了它们加强纤维素降解酶活性的能力。
优选地，与纤维素反应的CBM33蛋白获自纤维素分解细菌，例如纤维单胞菌属、纤维弧菌属、Thermobifida或链霉菌属的细菌，例如产黄纤维单胞菌、日本纤维弧菌、Thermobifida fusca或链霉菌属菌种的细菌(优选地，如本文中披露的E7和CelS2以及Cfla_0175、Cfla_0172、Cfla_0316、Cfla_0490、CJA_2191(Cbp33A)、CJA_3139(Cbp33/10B)和SCO1734)，和/或具有附接于C末端的一个或多个纤维素结合模块(例如属于CBM家族2)。
可以将这些天然的氧化水解酶或其具有改变的底物特异性(例如从壳多糖到纤维素)的工程化改造的变体与其它底物和糖分解酶组合。
对本领域中的技术人员明显的是，在植物细胞壁材料的情况中，多糖如壳多糖，尤其是纤维素可以存在于复杂的包含例如半纤维素的共聚基质中。由于纤维素和半纤维素有强烈地相互作用，通过氧化水解酶使纤维素结构松散可能不仅使纤维素还使半纤维素更易受到合适的糖分解酶的攻击。因此，在复杂的含有壳多糖或纤维素的共聚材料中，可以将氧化水解酶如GH61和CBM33家族蛋白与例如半纤维素酶或靶向复杂的含有壳多糖或纤维素的共聚材料中非壳多糖和非纤维素聚合物的其它酶共同使用，从而增加这些酶的糖分解效率。
如本文中所指的，“糖分解酶”是能够切割多糖中糖单体或二聚体之间的糖苷键的酶，其使用标准的水解机制，如在CAZy数据库中分类在糖苷水解酶(GH)家族中的大多数酶所采用的。这些酶包括纤维素水解酶、壳多糖水解酶和β-葡糖苷酶。
如本文中所指的，“纤维素水解酶”是水解纤维素或中间分解产物的酶。优选地，所述水解酶是纤维素酶。基于纤维素酶的同一性程度，将其归为糖基水解酶(GH)家族，并属于GH家族1、3、5-9、12、44、45、48和74。基于机制，可以将它们分成外切-1,4-β-D-葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH，EC3.2.1.91)、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(EG，EC3.2.1.4)、和β-葡糖苷酶(BG，EC3.2.1.21)。EG切割纤维素微纤维内的糖苷键，其优先作用于无定形的纤维素区。EG使纤维素链片段化以生成CBH的反应端，而CBH“进行性”地作用以从还原性(CBH1)或非还原性(CBHII)端降解纤维素(包含结晶态纤维素)，从而主要生成纤维二糖。纤维二糖是葡萄糖的一种水可溶性的β-1,4-连接二聚体。β-葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。GH61酶之前在该家族某成员的活性基础上被归为弱内切葡聚糖酶，但现在认为这是不正确的。如上文所提及的，本发明人已经发现GH61酶是氧化水解的。
可以通过本领域中已知的方法来评估纤维素水解酶水解纤维素的能力，所述方法包括其中将未经修饰的纤维素用作底物的方法。然后通过测量释放出的产物来测量活性，其使用基于HPLC的方法或测定新形成的还原性末端数目的方法(例如Zhang等,2009,Methods Mol.Biol.581:213-31;Zhang等,2006,Biotechnol.Adv.24(5):452-81)。或者，可以通过使用合适的底物并测定温育混合物的粘度在反应期间是否降低来评估纤维素水解酶的效力。可以由振动式粘度计(例如Sofraser,France的MIVI3000)测定所得的粘度减少。对纤维素酶活力的测定(以纤维素粘度单位(CEVU)测量)通过测量样品减少底物溶液的粘度的能力，定量了样品中存在的催化活力的量。
可以从商业来源获得纤维素酶，即公司如Novozymes,Danisco和Biocatalysts。商品化的纤维素的例子包括，例如CELLICTMCTec(NovozymesA/S)、CELLICTMCTec2(Novozymes A/S)、CELLUCLASTTM(NovozymesA/S)、NOVOZYMTM188(Novozymes A/S)、CELLUZYMETM(NovozymesA/S)、CEREFLOTM(Novozymes A/S)、和ULTRAFLOTM(Novozymes A/S)、ACCELERASETM(Genencor Int.)、LAMINEXTM(Genencor Int.)、SPEZYMETMCP(Genencor Int.)、
Figure BDA00003011746200511
NL(DSM)；
Figure BDA00003011746200512
S/L100(DSM)、ROHAMENTTM7069W(GmbH)、
Figure BDA00003011746200514
LDI(DyadicInternational,Inc.)、
Figure BDA00003011746200515
LBR(Dyadic International,Inc.)、或150L(Dyadic International,Inc.)。
或者，可以使用蛋白质表达的标准重组技术来生成纤维素酶。科学文献含有各种类型的纤维素酶(例如内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶)的克隆、过表达、纯化和其后应用的大量例子。
可以在本发明的方法中使用的细菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)内切葡聚糖酶(WO91/05039;WO93/15186;美国专利No.5,275,944;WO96/02551;美国专利No.5,536,655、WO00/70031、WO05/093050);Thermobifida fusca内切葡聚糖酶III(WO05/093050);和Thermobifida fusca内切葡聚糖酶V(WO05/093050)。
可以在本发明的方法中使用的真菌内切葡聚糖酶的例子包括但不限于，里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶I(Penttila等,1986,Gene45:253-263；里氏木霉Cel7B内切葡聚糖酶I；GENBANKTM登录号M15665)；里氏木霉内切葡聚糖酶II(Saloheimo等,1988,Gene63:11-22；里氏木霉Cel5A内切葡聚糖酶II；GENBANKTM登录号M19373)；里氏木霉内切葡聚糖酶III(Okada等,1988,Appl.Environ.Microbiol.64:555-563；GENBANKTM登录号AB003694)；里氏木霉内切葡聚糖酶V(Saloheimo等,1994,MolecularMicrobiology13:219-228；GENBANKTM登录号Z33381)；棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)内切葡聚糖酶(Ooi等,1990,Nucleic Acids Research18:5884)；川地曲霉(Aspergillus kawachii)内切葡聚糖酶(Sakamoto等,1995,Current Genetics27:435-439)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)内切葡聚糖酶(Saarilahti等,1990,Gene90:9-14)；尖镰孢内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号L29381)；灰腐质霉(Humicola grisea)变种thermoidea内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号AB003107)；Melanocarpus albomyces内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号MAL515703)；粗糙脉孢菌内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号XM_324477)；特异腐质霉(Humicola insolens)内切葡聚糖酶V；嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)CBS117.65内切葡聚糖酶；担子菌纲(basidiomycete)CBS495.95内切葡聚糖酶；担子菌纲CBS494.95内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6B内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL6C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7C内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL8126CEL7E内切葡聚糖酶；土生梭孢霉NRRL 8126 CEL7F内切葡聚糖酶；Cladorrhinumfoecundissimum ATCC 62373 CEL7A内切葡聚糖酶；以及里氏木霉菌株号VTT-D-80133内切葡聚糖酶(GENBANKTM登录号M15665)。
可以在本发明中使用的纤维二糖水解酶的例子包括但不限于，里氏木霉纤维二糖水解酶I；里氏木霉纤维二糖水解酶II；特异腐质霉纤维二糖水解酶I；嗜热毁丝霉纤维二糖水解酶II；土生梭孢霉纤维二糖水解酶II(CEL6A)；嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)纤维二糖水解酶I；和嗜热毛壳菌纤维二糖水解酶II。
可以在本发明中使用的β-葡糖苷酶的例子包括但不限于，米曲霉β-葡糖苷酶；烟曲霉β-葡糖苷酶；巴西青霉(Penicillium brasilianum)IBT 20888 β-葡糖苷酶；黑曲霉β-葡糖苷酶；和棘孢曲霉β-葡糖苷酶。
可以使用纤维素酶混合物，例如一种包含以下的纤维素酶混合物：至少一种内切葡聚糖酶(例如属于GH家族5、7或12)，一种向还原性末端移动的纤维二糖水解酶(例如属于GH家族6)，一种移向非还原性末端的纤维二糖水解酶(例如属于GH家族7)，和β-葡糖苷酶。更优选地，使用更复杂的混合物，特别是含有具有不同底物特异性(例如作用于纤维素晶体的不同面)的数种内切葡聚糖酶的混合物。考虑到要降解的底物，可以容易地鉴定合适的纤维素酶。
如本文中所指的，“壳多糖水解酶”是水解壳多糖或中间分解产物的酶。优选地，所述壳多糖水解酶是壳多糖酶、脱乙酰壳多糖酶(chitosanase)或溶菌酶。降解可以是完全或部分的。例如，一些壳多糖水解酶例如壳多糖酶在壳多糖底物上的活性没有强到足以使底物完全降解。对于不具有其自身CBM的壳多糖酶如来自天蓝色链霉菌的ChiG，或壳多糖酶如来自粘质沙雷氏菌的ChiB来说尤其如此。在此情况中，依照本发明使用作用于壳多糖的氧化水解酶可以使壳多糖降解增强，并且优先地导致之前不可能发生的完全降解。其它壳多糖酶如来自粘质沙雷氏菌的ChiC能够完全降解壳多糖，但在加入氧化水解酶如CBP21时此过程的速率增加。
在植物、微生物和动物中发现了壳多糖酶。已经从各种微生物物种克隆了壳多糖酶，并且已经基于序列相似性分到两个不同的家族中，这两个家族被命名为糖苷水解酶的家族GH18和家族GH19(Henrissat和Bairoch,1993,Biochem,J.293:781-788)。这些酶在本文中被共同称为壳多糖水解酶。
有数种本领域中公知的方法来测量壳多糖酶活性，包括其中使用未经修饰的壳多糖作为底物的方法。通过测量释放出的产物来测量在未经修饰的壳多糖上的活性，其使用基于HPLC的方法或确定新形成的还原性末端数目的方法。
可以从商业来源获得壳多糖酶，即公司如Sigma。或者，可以使用蛋白质表达的标准重组技术来生成壳多糖酶。科学文献含有各种类型的壳多糖酶的克隆、过表达、纯化和其后应用的大量例子(例如Horn等,2006,FEBS J.273(3):491-503和其中的参考文献)。
适用于水解其它非纤维素(或非壳多糖)多糖的其它水解酶包括半纤维素酶如乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
纤维素酶混合物可以与半纤维素酶联合使用。还可以从商业来源获得半纤维素酶。商品化的半纤维素酶的例子包括，例如SHEARZYMETM(Novozymes A/S),CELLICTMHTec(Novozymes A/S),CELLICTMHTec2(Novozymes A/S),(Novozymes A/S),
Figure BDA00003011746200532
(Novozymes A/S),
Figure BDA00003011746200533
HC(Novozymes A/S),
Figure BDA00003011746200534
木聚糖酶(Genencor),
Figure BDA00003011746200535
XY(Genencor),
Figure BDA00003011746200536
XC(Genencor),
Figure BDA00003011746200537
TX-200A(AB Enzymes),HSP6000木聚糖酶(DSM),DEPOLTM333P(Biocatalysts Limited,Wales,UK),DEPOLTM740L.(BiocatalystsLimited,Wales,UK)，和DEPOLTM762P(Biocatalysts Limited,Wales,UK)。
可用在本发明的方法中的木聚糖酶的例子包括但不限于，棘孢曲霉木聚糖酶(GeneSeqP:AAR63790;WO94/21785)、烟曲霉木聚糖酶(WO2006/078256)、和土生梭孢霉NRRL8126木聚糖酶(WO2009/079210)。
可用在本发明的方法中的β-木糖苷酶的例子包括但不限于，里氏木霉β-木糖苷酶(UniProtKB/TrEMBL登录号Q92458)、埃默森踝节菌(Talaromycesemersonii)(SwissProt登录号Q8X212)，和粗糙脉孢菌(SwissProt登录号Q7SOW4)。
可用在本发明的方法中的乙酰木聚糖酯酶的例子包括但不限于，红褐肉座菌乙酰木聚糖酯酶(WO2005/001036)、粗糙脉孢菌乙酰木聚糖酯酶(UniProt登录号q7s259)、土生梭孢霉NRRL8126乙酰木聚糖酯酶(WO2009/042846)、球毛壳(Chaetomium globosum)乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q2GWX4)、细丽毛壳(Chaetomium gracile)乙酰木聚糖酯酶(GeneSeqP登录号AAB82124)、Phaeosphaeria nodorum乙酰木聚糖酯酶(Uniprot登录号Q0UHJ1)，和特异腐质霉DSM1800乙酰木聚糖酯酶(WO2009/073709)。
可用在本发明的方法中的阿魏酸酯酶的例子包括但不限于，特异腐质霉DSM1800阿魏酸酯酶(WO2009/076122)、粗糙脉孢菌阿魏酸酯酶(UniProt登录号Q9HGR3)，和费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)阿魏酸酯酶(UniProt登录号A1D9T4)。
可用在本发明的方法中的阿拉伯呋喃糖苷酶的例子包括但不限于，特异腐质霉DSM1800阿拉伯呋喃糖苷酶(WO2009/073383)和黑曲霉阿拉伯呋喃糖苷酶(GeneSeqP登录号AAR94170)。
可用在本发明的方法中的α-葡糖醛酸糖苷酶的例子包括但不限于，棒曲霉(Aspergillus clavatus)α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号alcc12)、里氏木霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q99024)、埃默森踝节菌α-葡糖醛酸糖苷酶(UniProt登录号Q8X211)、黑曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(Uniprot登录号Q96WX9)、土曲霉(Aspergillus terreus)α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q0CJP9)，和烟曲霉α-葡糖醛酸糖苷酶(SwissProt登录号Q4WW45)。
尽管优选使用天然的糖分解酶，但也可以使用依照本文中对于氧化水解酶变体所描述的特性限定的变体。
优选地，当所述多糖是纤维素时，所述糖分解酶是任选与其它1,4-β-D-葡聚糖酶如纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶组合使用的内切-1,4-β-D-葡聚糖酶。
因此，可以基于要水解的底物选择要在本发明的方法中使用的酶。例如，CBP21仅结合β-壳多糖，并且因而如果本发明的方法要应用到β-壳多糖上时，它将是适于使用的氧化水解酶。类似地，可以将来自解淀粉芽孢杆菌的ChbB(如记载于Chu等(见上)中的)应用到β-壳多糖上。
已经从S olivaceovirides分离出CHB1、CHB2和CHB3三者(Svergun等、Zeltins等、Schnellman等、Kolbe等、Saito等，见上)。已经确定了这三种蛋白质的结合次序，CHB1和CHB2优选结合α-壳多糖，而CHB3既结合α-壳多糖也结合β-壳多糖。由Tsujibo等描述的来自交替单胞菌属的CBP1既结合α-壳多糖也结合β-壳多糖，但α形式优先。
或者，可以在本发明的方法中使用GH61家族成员(如本文中描述的)来协助壳多糖降解。
类似地，当底物是壳多糖时，可以相应地选择糖分解酶。壳多糖酶的特性已有记载(例如Hollis等,1997,Arch.Biochem.Biophys.344:335-342和Suzuki等,1998,Biosci.Biotech.Bioch.62:128-135;Horn等,2006)。
用于β-壳多糖水解的优选组合是CBP21(或其变体或片段)与ChiA、ChiB、ChiC和ChiG中的一种或多种。用于α-壳多糖水解的优选组合是CHB1或CHB2(或其变体或片段)与ChiA、ChiB、ChiC和ChiG中的一种或多种。或者可以和合适的壳多糖酶一起使用如本文中描述的GH61家族成员。
当底物是纤维素时，氧化水解酶优选为GH61家族蛋白(如本文中描述的)，不过考虑到CBM33家族蛋白作用于纤维素的能力，也可以使用它们。可以从已知的酶(例如如本文中描述的纤维素酶)选择合适的糖分解酶。
在一个优选的方面，在本发明的方法中采用了两种或更多种氧化水解酶。考虑到它们优选的底物特异性，当一起使用时可以预期有增强的降解效果。由此，例如，可以在所述方法中使用两种或更多种CBM33家族蛋白和/或GH61家族蛋白(如本文中描述的)，例如两种或更多种CBM33家族蛋白、两种或更多种GH61家族蛋白、或一种或多种各来自CBM33家族蛋白和GH61家族蛋白的组合(例如至少一种CBM33家族蛋白和至少一种GH61家族蛋白)。由此，例如可以使壳多糖(或纤维素)与一种CBM33家族蛋白和一种GH61家族蛋白接触，例如优选地选自本文中描述的蛋白质(例如包含如在本文中描述的SEQ ID NO:4和/或5和/或6-14的任意一个中列出的氨基酸序列或相关序列或片段的多肽(CBM33家族蛋白)，以及包含如在本文中描述的SEQ IDNO:1-3和/或15-16的任意一个中列出的氨基酸序列或相关序列或片段的多肽(GH61家族蛋白))。
可以通过使用筛选技术评估体外水解来测定依照本发明要使用的合适的酶，例如如在实施例中描述的。
为了鉴定可以组合使用的氧化水解酶，可以对酶进行评估以确定它们的活性是否会在底物上达到增强的效果。例如，在降解生物质时，可以组合CBM33/GH61家族从实验已知的成员(如那些在本文中描述的)以对以下材料具有不同的特异性：自然界中存在的各种形式的壳多糖(例如α-壳多糖或β-壳多糖)或纤维素(例如各种类型的纤维素纤维、纤维素纸浆、滤纸、微晶纤维素、
Figure BDA00003011746200551
羧甲基纤维素)、生物质和/或预处理过的生物质，或者可以通过化学修饰来获得，这些形式中有许多是实验法可容易接近的。在生物质中，壳多糖和纤维素经常以杂聚物存在，其含有经常被称为半纤维素的其它多糖或甚至蛋白质。可以预期CBM33/GH61家族的不同成员在这些不同的底物上具有不同的活性。生物质经常是异质的，或者是因为天然如此，或者是因为在工厂中工艺进行期间生物质被混合。通过混合具有已知的生物质偏向差异的CBM33/GH61家族成员，可以获得更有效的过程。进一步地，使用优先作用于生物质中不同的多糖(如木聚糖)的CBM33/GH61家族成员，可以获得进一步的协同。
通过检查反应产物的周期性还可以鉴定具有不同活性的氧化水解酶(参见本文中的实施例)。由此，可以在具有不同周期性的氧化水解酶(例如CBM33/GH61家族成员)之间进行组合。在图2D、6A和7B中显示了CBP21的周期性；在图15D中显示了EfCBM33的周期性；在图17、19、23A、27和31中显示了CelS2的周期性；且在图29中显示了E7的周期性。对周期性中变化的一种可能的解释为，结晶态纤维素具有数种形式且晶体具有不同的面(即表面类型，参见例如Carrard等,2000,Proc Natl Acad Sci USA97(19):10342-7)，并且CBM33和GH61家族的不同成员进攻不同的面。考虑到不同的酶活性，可以将酶组合(可能实现协同效应)。由此，例如可以将GH61与CelS2组合。
在上文所描述的使用氧化水解酶和糖分解酶两者的方法中，在允许酶与如本文中描述的多糖相互作用或结合的条件下实施用氧化水解酶的步骤。将相同的条件和考虑事项应用到使用另外的糖分解酶(水解酶)的其它步骤，所述步骤可以和第一步同时或在其后实施。温育总共可以进行3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或更多，但优选地，通常实施约8至约96小时，更优选地，约8至约72小时，且最优选地，约8至约48小时或4至24小时。
优选地，使用酶的水溶液，且优选地，在本领域中技术人员可以容易地确定的条件下在合适的含水环境中实施酶促水解。
在所述方法中使用的每种酶可以以纯化的制备物(如下文中描述的)或存在于组合物(例如包含在所述方法中使用的其它酶)中提供，优选地，占组合物中至少1、2、5或10%，优选地1-5%w/w的干重。
对于本文中描述的方法，可以以补料分批或连续的过程来实施水解，其中将可以经过预处理的含有多糖的材料(底物)逐渐加料到例如含有酶的水解溶液中。
一般地，在如本文中论述的受控pH、温度和混合条件下在搅拌釜反应器或发酵罐中实施糖化作用。合适的过程时间、温度和pH条件可以由本领域中的技术人员容易地确定且都在本文中论述过，而且它们可能取决于使用的底物和酶及其浓度、以及底物是否经过预处理且是否包含发酵微生物，参见下文。
优选地，干固体含量在约5-约50wt.%的范围内，更优选地，约10-约40wt.%，且最优选地约15-约30wt.%。
在反应中使用的每种酶可以在溶液中以任何合适的浓度存在，如0.001-1.0mg/ml的浓度，例如0.01-0.1mg/mL或0.05-0.5mg/mL。换言之，可以以每克多糖底物0.1-100mg酶的浓度使用酶，例如每克底物1-50mg酶。可以根据底物和含有该底物的材料以及反应条件(例如温度、pH和持续时间)确定合适的浓度。
可以将其中使氧化水解酶和糖分解酶(一种或多种)与多糖底物接触的步骤分开或一起或组合实施，例如，可以先加入氧化水解酶并且可以在起始温育期后加入糖分解酶(一种或多种)。或者，可以在加入糖分解酶前除去氧化水解酶。任何其中没有氧化水解酶的步骤(例如其中仅使用糖分解酶的步骤)都不需要在存在还原剂和/或金属离子的情况下进行。
根据要降解的底物的性质，可以额外加入或作为上文论述的壳多糖或纤维素水解酶的备选加入其它酶。例如，要降解的多糖是含有蛋白质的共聚物，那么可以加入蛋白酶。合适的例子包括碱性蛋白酶(Alcalase)、中性蛋白酶(Neutrase)、木瓜蛋白酶和其它具有广泛特异性的蛋白水解酶。在每个实验设置中，必须检查蛋白酶的适宜性，特别是如果同时存在其它酶(例如壳多糖酶或纤维素酶)而这些酶又可能被一些存在的蛋白酶破坏的情况。如果多糖是含有半纤维素的共聚物，那么可以加入半纤维素分解酶。
此外，使用上文描述的氧化水解酶和糖分解酶所得的产物可能包含可溶性短寡糖(特别是二糖)。由于二聚体产物抑制糖苷水解酶且由于单体是最期望从降解/水解过程得到的用于进一步处理(参见下文)的产物，优选地，还在本发明的方法中使用β-葡糖苷酶。
由此在一个优选的方面，所述降解或水解多糖的方法进一步包括使所述多糖(或其降解或水解产物)与一种或多种β-葡糖苷酶接触。可以如本文中对其它糖分解酶所说明的来鉴定和使用这类酶(例如，关于它们的浓度)。对于纤维素，可以使用β-葡糖苷酶(一种或多种)，且对于壳多糖，可以使用β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(一种或多种)。
可以将其中使氧化水解酶、糖分解酶(一种或多种)和β-葡糖苷酶(一种或多种)与多糖底物接触的步骤分开或一起或组合实施，例如，可以先加入氧化水解酶，并且可以在起始温育期后加入糖分解酶(一种或多种)和β-葡糖苷酶(一种或多种)，或者可以连续加入后两种酶。或者，在加入其它酶之前可以除去氧化水解酶。任何其中没有氧化水解酶的步骤(例如其中仅使用糖分解酶(一种或多种)和/或β-葡糖苷酶(一种或多种)的步骤)都不需要在存在还原剂和/或金属离子的情况下进行。
可以从各种不同来源分离、提取或纯化，或者通过各种不同的手段合成在本发明方法中使用的氧化水解酶和糖分解酶。如上文所提及的，所述酶可以以纯化的制备物或存在其它组分的形式提供。
可以通过本领域中公知的方法来实施化学合成，在多肽的情况中，末端氨基酸的功能性基团选择性去保护并偶联选择性保护的氨基酸残基的反应的循环组(cyclic sets)，接着最后将所有功能性基团去保护。可以在溶液中或使用本领域中已知的合适固相在固体支持物上实施合成，如公知的Merrifield固相合成规程。
优选地，在本发明中使用的酶是基本纯化的，例如无致热原的，例如超过70%纯的，特别优选超过90%纯的(如例如在多肽或蛋白质的情况中通过合适的技术如肽作图(mapping)、测序或层析或凝胶电泳评估的)。可以通过例如层析(例如HPLC、大小排阻、离子交换、亲和力、疏水相互作用、反相)或毛细管电泳来实施纯化。
蛋白质的重组表达也是本领域中公知的，并且可以使用合适的核酸序列表达本文中使用的酶，从而使用本领域中公知的技术进行后续表达并任选地纯化。例如，可以将合适的核酸序列可操作地连接于启动子以在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))中表达要使用的酶，然后可以将其分离或者如果该酶是被分泌的话，可以将培养基或表达该酶的宿主用作酶的来源。
上文所描述的方法应用在许多不同领域中，在这些领域中多糖的水解形成了一个方法步骤或其中水解产物是有用的。
因此，在一个进一步的方面，本发明提供了生成可溶性糖的方法，其中所述方法包括通过使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触来降解或水解多糖，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解，并且所述降解或水解释放所述可溶性糖。
在另一个优选的方面，本发明提供了生成可溶性糖的方法，其中所述方法包括通过以下步骤来降解或水解多糖：
a)使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解，
b)使所述多糖(或其降解或分解产物)与一种或多种选自纤维素水解酶或壳多糖水解酶的糖分解酶接触，以及任选地
c)使所述多糖(或其降解或分解产物)与一种或多种β-葡糖苷酶接触；
其中所述降解或水解释放所述可溶性糖。
完全水解的结果是可溶性糖。通常，生成单糖和更高级的寡糖(例如二糖)的混合物。如上文论述的，优选地，使用β-葡糖苷酶来生成单糖。优选地，将部分或完全降解的含有多糖的材料回收以用于进一步处理例如发酵。使用本领域中公知的技术如离心、过滤和重力沉降，可以将含有多糖的材料降解的可溶性产物与不可溶性物质分离。
优选地，在所述降解或水解过程后将所述可溶性糖分离或回收。优选地，分离或回收的可溶性糖是壳二糖和/或N-乙酰葡糖胺(来自壳多糖)或纤维二糖和/或葡萄糖(来自纤维素)和/或其寡糖。
N-乙酰葡糖胺和N-乙酰葡糖胺的寡糖具有许多商业用途，包括用作食品补充剂。已经发现了壳多糖片段在多种应用包括用作免疫刺激物中的效用(Aam等,2010,Drugs8(5):1482-517)。
从纤维素水解得到的可溶性糖具有各种应用，特别是在发酵反应中用作能量来源。
优选地，将水解后释放的含有单糖的糖混合物发酵以生成有机物质如醇，例如乙醇。
由此，本发明进一步提供了生成有机物质(优选为醇)的方法，包括下列步骤：
i)降解或水解多糖以生成包含可溶性糖的溶液，其通过包括以下步骤的方法：
a)使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解，并
b)使所述多糖(或其降解或分解产物)与一种或多种选自纤维素酶或壳多糖酶的糖分解酶接触，以及任选地
c)使所述多糖(或其降解或分解产物)与一种或多种β-葡糖苷酶接触；
ii)将所述可溶性糖发酵以生成所述有机物质作为发酵产物，优选地，使用一种或多种发酵微生物；以及任选地
iii)回收所述有机物质。
任选地，可以将步骤(i)中生成的所述可溶性糖从所述溶液分离或纯化。
由此生成的有机物质形成了本发明的一个进一步的方面。
如本文中所指的，“可溶性糖”包含水可溶性的单糖、二糖和寡糖，优选为单糖和/或二糖。优选地，所述可溶性糖例如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和/或可溶性寡糖是可发酵的。
“发酵”指任何发酵过程或任何包含发酵步骤的过程。
上文的方法可以额外地包括使用一种或多种另外的酶如酯酶(例如脂肪酶、磷脂酶和/或角质酶(cutinase))、蛋白酶、漆酶和过氧化物酶。
可以分开和/或同时实施水解(糖化作用)和发酵的步骤，并且包括但不限于，分开的水解和发酵(SHF)，同时糖化作用和发酵(SSF)，同时糖化作用和共发酵(SSCF)，混合水解和发酵(HHF)，分开水解和共发酵(SHCF)，混合水解和共发酵(HHCF)以及直接的微生物转化(DMC)。适宜地，可以在实践上文的方法时使用本领域中已知的任何包括预处理、酶法水解(糖化作用)、发酵、或其组合的方法。
适宜地，常规仪器可以包括补料分批搅拌反应器、分批搅拌反应器、具有超滤的连续流搅拌反应器和/或连续活塞流(plug-flow)柱式反应器(deCastilhos Corazza等,2003,Acta Scientiarum.Technology25:33-38;Gusakov&Sinitsyn,1985,Enz.Microb.Technol.7:346-352)、研磨(attrition)反应器(Ryu&Lee,1983,Biotechnol.Bioeng.25:53-65)，或者具有由电磁场引起的强烈搅拌的反应器(Gusakov等,1996,Appl.Biochem.Biotechnol.56:141-153)。用于水解和/或发酵的另外的反应器类型包括，例如流化床(fluidized bed)、升流层(upflow blanket)、固定化和挤压型反应器。
在本文中论述了可以使用的预处理，并将其应用到本发明的所有方法上。在水解和/或发酵前可以预处理含有多糖的材料。优选地，在水解步骤前实施预处理。或者，可以与水解同时实施预处理，如与用所述方法中使用的酶(即氧化水解和糖分解酶)对含有多糖的材料进行处理同时，以释放可发酵糖如葡萄糖和/或纤维二糖。在大多数情况下，预处理步骤本身产生了从生物质到可发酵糖的一些转化(即使没有酶)。
可以通过一种或多种能够将糖直接或间接发酵为期望的发酵产物的发酵微生物来将由本发明的方法获得的可发酵糖发酵。
发酵条件取决于期望的发酵产物和发酵微生物，并且可以由本领域中的技术人员容易地确定。
在发酵步骤中，通过发酵微生物(如酵母)将从底物释放的糖发酵成产物例如乙醇。可以基于期望的发酵产物选择要在所述方法中使用的多糖底物。
“发酵微生物”指任何适合在发酵过程中使用以生成发酵产物的微生物，包括细菌和真菌生物。发酵微生物可以是C6和/或C5发酵生物，或其组合。C6和C5发酵生物都是本领域中公知的。合适的发酵微生物能够将糖如葡萄糖、木糖、木酮糖、阿拉伯糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖或寡糖直接或间接发酵(即转化)成期望的发酵产物。
Lin等,2006,Appl.Microbiol.Biotechnol.69:627-642描述了生成乙醇的细菌和真菌发酵生物的例子。
能够发酵C6糖的发酵微生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母属菌种(Saccharomyces spp.)，优选酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。
能够发酵C5糖的发酵生物的例子包括细菌和真菌生物，如酵母。优选的C5发酵酵母包括毕赤酵母属(Pichia)，优选树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS5773；假丝酵母属(Candida)，优选博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)、芸薹假丝酵母(Candida brassicae)、休哈塔假丝酵母(Candida sheatae)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。
其它发酵生物包括发酵单胞菌属(Zymomonas)，如运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的菌株；汉逊酵母属(Hansenula)，如异常汉逊酵母(Hansenula anomala)的菌株；克鲁维酵母属(Klyveromyces)，如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)的菌株；裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如粟酒裂殖酵母(S.pombe)的菌株；和大肠杆菌菌株，特别是已经进行了遗传修饰以提高乙醇产量的大肠杆菌菌株。
在一个优选的方面，所述酵母是酵母属菌种。在一个更优选的方面，所述酵母是酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces distaticus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)。在另一个优选的方面，所述酵母是克鲁维酵母属，例如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或脆壁克鲁维酵母。
可以使用的其它酵母包括棒孢酵母属(Clavispora)，例如葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae)或仙人掌棒孢酵母(Clavispora opuntiae)；管囊酵母属(Pachysolen)，例如嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)；和酒香酵母属(Bretannomyces)，例如克劳森酒香酵母(Bretannomyces clausenii)。
能够将己糖和戊糖有效发酵成乙醇的细菌包括，例如发酵单胞菌属，如运动发酵单胞菌，和梭菌属(Clostridium)如热纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)。
适用于乙醇产生的商品化的酵母包括，例如ETHANOL REDTM酵母(可自Fermentis/Lesaffre,USA获得)、FALITM(可自Fleischmann's Yeast,USA获得),SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(可自Ethanol Technology,Wl,USA获得)、BIOFERMTMAFT和XR(可自NABC-North American BioproductsCorporation,GA,USA获得)、GERT STRANDTM(可自Gert Strand AB,Sweden获得)和FERMIOLTM(可自DSM Specialties获得)。
通常将发酵微生物(一种或多种)加入到降解的多糖材料中，并且发酵实施约8-约96小时，如约24-约60小时。温度通常在约26℃-约60℃，特别是约32℃-50℃，且在约pH3-约pH8，如约pH4-5、6,或7。上述条件当然会取决于各种因素，包括使用的发酵微生物。
优选地，以每ml发酵培养液约105-1012个，优选地约107-1010个，特别是约2x108个活细胞计数的量应用所述发酵微生物。
对于乙醇产生，在发酵后将发酵浆料蒸馏以提取乙醇。依照本发明的方法获得的乙醇可以被用作，例如燃料乙醇、饮用乙醇(即中性酒精饮料(potableneutral spirits))或工业乙醇。
可以将发酵刺激物与本文中描述的任一种酶促过程组合使用来进一步改良发酵过程，具体地，即发酵微生物的表现，如速率提高和乙醇产量。“发酵刺激物”指对发酵微生物特别是酵母的生长的刺激物。优选的对于生长的发酵刺激物包括维生素和矿物。维生素的例子包括多种维生素、生物素、泛酸(盐)、烟酸、内消旋肌醇(meso-inositol)、硫胺素、吡哆醇(pyridoxine)、对氨基苯甲酸、叶酸、核黄素和维生素A、B、C、D和E。
作为发酵产物的有机物质可以是自发酵衍生的任何物质。所述发酵产物可以是(不限于)，醇(例如阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇或木糖醇)；有机酸(例如乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡糖酸、甲酸、延胡索酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖醛酸、戊二酸、3-羟基丙酸、衣康酸(itaconic acid)、乳酸、苹果酸(malic acid)、丙二酸、草酸、丙酸、琥珀酸或木质酸(xylonic acid))；酮(例如丙酮)；醛(例如甲醛)；氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸)；或气体(例如甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)或一氧化碳(CO))。发酵产物可以是烷、环烷、烯、异戊二烯、或聚酮化合物。发酵产物还可以是蛋白质。
在一个优选的方面，所述发酵产物是醇。会理解的是，术语“醇”涵盖了含有一个或多个羟基模块的物质。优选地，所述醇是阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇或木糖醇。优选的产物是乙醇。
可以使用本领域中已知的方法从发酵介质中回收发酵产物(一种或多种)，所述方法包括但不限于，层析(例如离子交换、亲和力、疏水性、色谱聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、蒸馏或提取。例如，从发酵的含有纤维素的材料分离乙醇并通过常规的蒸馏方法纯化。可以获得高达约96vol.%的乙醇。
通过下列实施例进一步描述本发明，但不应将其理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1：氧化水解酶CBP21、EfCBM33、CelS2和E7对壳多糖或纤维素底物的影响。
材料和方法
试剂
来自鱿鱼羽状壳的纯β-壳多糖粉(80#筛孔)购自France Chitin(Marseille,France)。H2 18O(含有97%18O)和18O2(含有99%18O)购自Cambridge IsotopeLaboratories Inc.(Andover,MA)。2,5-二羟基-苯甲酸(DHB)购自Bruker Daltonics(Bremen,Germany)。连二亚硫酸(盐)、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽、Fe(II)SO4、醋酸Cu(I)、MgCl2、ZnCl2、CoCl2、LiCl、乙腈(acetonitrile)、Trisma碱、HCl、EDTA和H2O2(30%v/v)购自Sigma-Aldrich Inc。史兰克线是在Oslo大学手动制备的，并与内部N2供应(99.999%纯)一起使用。N2气体购自YARA PRAXAIR(Oslo,Norway)。N-乙酰-D-葡糖胺从二聚体到六聚体的寡糖购自Seikagaku(Tokyo,Japan)。用于蛋白质纯化的壳多糖珠购自New England Biolabs。
依照记载于Fan等,2008,Biomacromolecules9:1919中的制备β-壳多糖的纳米晶须(Nano-whisker)，其通过使用装备有3mm超声处理探头的VibracellUltrasonic Processer(Sonics,Newtown,CT)，将悬浮在0.2M乙酸中的3.0mg/mLβ-壳多糖颗粒以1分钟时间段(interval)、每个时间段之间30秒暂停进行4次来实施超声处理。在使用前，通过渗析将壳多糖-晶须悬液中的缓冲液变成20mM Tris pH8.0。将这些晶须用于图2A中展示的实验，其中需要增加的表面区域，从而在缺乏还原剂和另外酶的情况中能够检测CBP21活性。用未经处理的β-壳多糖实施所有其它实验。
重组蛋白的克隆、表达和纯化
来自粘质沙雷氏菌的壳多糖结合蛋白21(CBP21)
如之前描述的克隆、生成并纯化CBP21(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)。简言之，过夜生长并收获携带pRSET-B载体(含有cbp21基因)的大肠杆菌BL21 DE3菌株。通过冷渗透休克来提取含有CBP21的细胞的周质内容物，经由0.2微米注射滤器过滤并保持在4℃。进一步地，通过壳多糖亲和层析从周质提取物纯化CBP21，其使用壳多糖珠(NEB)作为层析介质。使用20mM Tris pH8.0和1.0M(NH4)2SO4作为结合缓冲液，将CBP21结合至柱。在未结合的蛋白质已经经过柱之后，在用20mM乙酸洗脱CBP21前，运行一个柱体积的结合缓冲液。使用具有10kDa分子量截留的Amicon超离心滤器单元(Ultra centrifugal filter unit)浓缩含有CBP21的级分，渗析到20mMTris-HCl pH8.0中并存储于4℃直到使用。通过SDS-PAGE评估蛋白质纯度(总是大于99%纯的)，并通过Bio-Rad蛋白测定(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)依照制造商提供的说明书来测定蛋白质的浓度。使用QuickChange位点定向诱变试剂盒(Stratagene)，如之前描述的制备CBP21的单个位点突变体(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)。
来自粘质沙雷氏菌的壳多糖酶C(ChiC)
如之前描述的克隆并生成ChiC(Synstad等,2008,Biosci.Biotechnol.Biochem.72:715)。简言之，将携带pREST-B载体(含有在T7启动子控制下的chic基因)的大肠杆菌BL21DE3细胞生长至OD为0.6，并用0.4mM IPTG诱导。通过经由冷渗透休克的周质提取从细胞提取该酶。进一步地，通过壳多糖亲和层析从周质提取物纯化ChiC，其使用壳多糖珠(NEB)作为柱材料。使用20M Tris-HCl,pH8.0作为运行缓冲液，将含有ChiC的周质提取物以2.5ml/分钟经过柱，使得壳多糖酶能与壳多糖珠结合。在提取物中未结合的蛋白质已经通过柱后，在用20mM乙酸洗脱结合的壳多糖酶前，将一个柱体积的运行缓冲液流过柱。在洗脱后，使用Amicon超滤装置(Millipore)浓缩纯化的蛋白质并最终渗析到20mM Tris-HCl,pH8.0中，并在使用前存储于4℃。通过SDS-PAGE常规测定蛋白质的纯度并通过Bio-Rad方法来测定蛋白质的浓度。
来自构巢曲霉的壳多糖脱乙酰基酶(AnCDA)
将构巢曲霉FGSC A4(获自FGSC)于37℃在固体YAG培养基(5g/L酵母提取物、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂、1ml/L Cove's微量元素、1.2g/L MgSO4·7H2O)中生长24-48h以提供接种物，并在液体YG培养基中通常生长16-24小时，伴随着剧烈摇动(250-300rpm)。用SP真菌DNA Mini试剂盒(Omega Bio-tek,USA)分离基因组DNA。从构巢曲霉FGSC A4基因组DNA扩增该基因(GeneBank登录号EAA66447.1)，其使用重叠延伸聚合酶链式反应，排除了内含子以及编码信号肽的基因部分。用于反应的引物是P1f(BglII):cga aga tct acg cct ctg cctttg gtt c(SEQ ID NO:17),P2r:gag acg tgg tcg tat gta tgt gcg ccg act tga tg(SEQID NO:18);P3f:caa gtc ggc gca cat aca tac gac cac gtc tcc ctc c(SEQ ID NO:19);P4r:cca aca gtc gta gct atc aac cct cga gca tta ac(SEQ ID NO:20);和P5r(HindIII):cag aag ctt tca atg ata cca cgc aat ctc tcc atc acc gag aca atc acc aac agtcgt agc tat caa c(SEQ ID NO:21)。在AnCDA基因的起始和末端并入BglII和HindIII位点以在pBAD/HisB载体中产生符合读框的N-末端His标签融合的构建物。该载体是商业化载体pBAD/HisB(Invitrogen,USA)的变体，其中已经缩短了N末端多组氨酸尾部和多克隆位点之间的区域(Kallio等,2006,J.Mol.Biol.357:210)。将所得质粒转化到大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen)中，并在Norwegian University of Life Sciences的化学、生物技术和食品科学系的测序设备处对插入的基因进行测序。
对于蛋白质表达，将转化的大肠杆菌菌株于37℃在含有100mg/L氨苄青霉素的2×TY培养基(16g/L胰蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L NaCl)中生长至OD600=0.6，并随后在进一步于28℃过夜温育前，用0.02%(w/v；终浓度)阿拉伯糖诱导。通过离心收获细胞并通过Ni2+亲和层析将蛋白质纯化到同质。使用Bio-Rad蛋白质测定法，以牛血清白蛋白作为标准来确定蛋白质浓度。
来自Thermobifida fusca xy的E7(Q47QG3)
克隆编码T.fusca xy的Q47QG3的成熟变体(E7；残基37-222)的基因序列，其通过使用依照In-Fusion克隆方案(Clontech)设计的引物，从T.fusca xy(购自ATCC)的基因组DNA扩增相应的基因区。使用In-FusionTM技术(Clonetech)，将所得PCR产物以符合信号肽读框的方式插入到经修饰的pRSETB载体(Invitrogen)中，所述信号肽用于在大肠杆菌中表达时指导蛋白质产物进入周质中。经修饰的pRSETB载体具有被来自粘质沙雷氏菌的cbp基因的信号序列编码区替换的含有His标签的区域(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)。通过将感兴趣的基因以符合信号序列读框的方式插入，在大肠杆菌中表达时可以将基因产物转运到周质中，并且输出的蛋白质会具有天然的N末端，这意味着蛋白质序列起始于组氨酸。对成功的构建物进行测序验证，并转化到大肠杆菌BL21DE(3)中用于蛋白质表达。在37℃过夜生长培养基。通过离心收获细胞并通过冷渗透休克进行周质提取。通过壳多糖亲和层析将成熟的E7蛋白质纯化，其使用壳多糖珠来捕捉该蛋白质。捕捉缓冲液含有20mM Tris-HCl pH8.0和1.0M硫酸铵。使用20mM乙酸从柱洗脱该蛋白质。汇集含有纯蛋白的峰，并使用具有10kDa截留的Sartorius Vivaspin装置浓缩。使用相同的蛋白质浓缩装置，将缓冲液变成20mM Tris pH8.0。
来自天蓝色链霉菌A3(2)的CelS2(Q9RJY2)
克隆编码天蓝色链霉菌A3(2)的Q9RJY2的成熟形式(CelS2；残基35-364)的基因，其通过使用依照LIC克隆方案(Novagen)设计的引物从天蓝色链霉菌A3(2)(购自ATCC)的基因组DNA扩增相应的基因区，所述引物在蛋白质的N末端置有六组氨酸标签，可以使用因子Xa蛋白酶将其除去而在该蛋白质的N末端不留下任何非天然的氨基酸。依照制造商(Novagen)提供的说明书将PCR产物插入到pET-32LIC载体中。对成功的构建物进行测序验证，并转化到大肠杆菌Rosetta DE(3)中用于蛋白质表达。通过在37℃过夜生长转化的RosettaDE(3)细胞的5ml预培养物，其在第二天用于接种300ml体积的LB培养基并在37℃以250rpm摇动持续生长来获得可溶性靶蛋白的表达。当细胞密度达到0.6O.D.时，通过添加IPTG至终浓度为0.1mM来诱导基因表达，接着立即将培养物转移到20℃摇动培养箱并持续过夜培养。在接下来的一天，通过离心收获细胞。将细胞沉淀重悬在超声处理缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、100MPMSF、溶菌酶和DNA酶)中，接着使用装备有3mm超声处理探头的Vibra CellUltrasonic processor(Sonics)进行超声处理以释放细胞质蛋白。通过离心除去细胞碎片，并通过标准的IMAC(固定化的金属亲和层析)纯化方案使用镍-NTA IMAC树脂(Qiagen)纯化带有His标签的Q9RJY2。使用具有10kDa截留的Sartorius Vivaspin蛋白浓缩装置将纯化的蛋白质浓缩，该装置还可以同时用于将缓冲液变成适用于用因子Xa除去His-标签的缓冲液(100mM NaCl、5.0mM CaCl2、50mM Tris pH8.0)。通过加入因子Xa，并在室温过夜温育，接着使用标准的IMAC层析除去His标签来切除His标签。收集含有加工过的Q9RJY2蛋白和因子Xa的流过的蛋白级分，并使用具有10kDa截留的Sartorius
Figure BDA00003011746200671
浓缩装置浓缩。最后，使用Xarrest琼脂糖珠依照制造商的说明书(Novagen)将因子Xa除去。使用具有10kDa截留的Sartorius
Figure BDA00003011746200672
浓缩装置，将纯蛋白的缓冲液变成20mM Tris pH8.0。通过SDS-PAGE分析验证对His标签的正确处理。
使用Bio-Rad Bradford微测定法(Bio-Rad)对蛋白浓度定量，并通过SDS-PAGE验证蛋白质纯度。
使用
Figure BDA00003011746200675
诱变试剂盒(Stratagene)并依照制造商提供的说明书进行对编码CelS2蛋白的基因的位点定向诱变。使用与用于野生型蛋白质的那些相同的方法来表达并纯化突变的蛋白质。
纯化来自里氏木霉/红褐肉座菌的Cel7A
从商品化的红褐肉座菌提取物CELLUCLASTTM(Novozymes)纯化来自红褐肉座菌的内部作用的家族GH7纤维素酶Cel7A，其使用由Jager等,2010,Biotechnology for Biofuels3(18)描述的纯化方案。简言之，将红褐肉座菌提取物调节为10mM AmAc pH5.0，并使用附接于
Figure BDA00003011746200673
Purifier的运行10mM AmAcpH5.0作为流动相的DEAE-琼脂糖柱对酶进行纯化。汇集有关的级分并使用具有10kDa截留的Sartorius
Figure BDA00003011746200674
浓缩装置浓缩。利用SDS-PAGE分析来评估纯度。
通过质谱(MS)进行产物分析
基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间(MALDI-TOF)
将2微升2,5-二羟基苯甲酸(DHB)在30%乙腈中9mg/mL的混合物应用到MTP384靶板磨钢TF(target plate ground steel TF)(Bruker Daltonics)上。然后将1微升样品混合到DHB小滴中并在空气气流下干燥。用具有氮337nm激光束的Ultraflex MALDI-TOF/TOF仪器(Bruker Daltonics GmbH,Bremen,Germany)分析样品。以正采集模式操作仪器并由FlexControl3.3软件包控制。所有的谱都使用反射模式(reflectron mode)获得，其具有加速电压25kV、反射电压26、和阳离子模式中脉冲离子提取40ns。使用的采集范围是从m/z0-7000。从平均400次激光射击收集数据，最低的激光能量必需获得足够的信噪比。使用Bruker Flex分析软件(版本3.3)，是从MS光谱生成峰列表。记录8kv前体离子加速电压和片段加速(LIFT电压19kV)处使用Bruker DaltonicsLIFT系统的源后衰变(PSD)谱。反射电压1和2分别被设置为29和14.5kV。
通过HPLC和UHPLC进行的产物分析
高效液相层析(HPLC)
在具有酰胺(Amide)-80保护柱、组装有4.6x250毫米酰胺-80柱(TosohBioscience,Montgomeryville,PA,USA)的Dionex Ultimate3000HPLC系统上运行等度(Isocratic)HPLC。移动相由70%乙腈：30%MilliQ H2O组成，并且流动速率是0.7ml/分钟。通过记录190nm处的吸收来监测洗脱的寡糖。使用Chromeleon 6.8层析软件(Dionex)记录、积分并分析层析图。ChiC对壳多糖降解的主要产物是(GlcNAc)2(在摩尔基础上超过降解产物总量的95%)，因此仅对(GlcNAc)2峰进行数据分析并用于量化壳多糖的降解程度。在样品组期间，以定期的时间间隔分析含有0.10mM(GlcNAc)2的标准溶液，并将所得平均值(显示小于3%的标准偏差)用于校准。
为了实验的简单性和通量，通过仅测量优势产物(GlcNAc)2的浓度来定量地评估与ChiC和CBP21的反应中壳多糖的降解。该简化的结果是，最大降解的壳多糖的产物水平倾向于比基于壳多糖的起始浓度预期的要低达25%。该“损失”是由于缺少对下列产物的检测：(1)更长的寡聚物和单体，其可达总产物混合物的估计5wt.%，(2)部分脱乙酰化产物；我们使用的壳多糖含有少部分的脱乙酰化的糖(约8%)，(3)氧化的糖。我们已经使用了使CBP21活性升高到最大的条件。未检出的氧化糖的量可多达起始材料的10-15%(图16)。
超高效液相层析(UHPLC)
在装备有二极管阵列检测器、组装有使用5μL样品注射的Waters AcquityUPLC BEH酰胺柱(2.1x150毫米和2.1x30毫米的预柱，两者都具有1.7μM的柱材料颗粒大小)的Agilent1290Infinity UHPLC系统上运行UHPLC。在柱温度30℃和0.4mL/分钟的流动，开始于72%ACN(A):28%15mM Tris-HCl pH8.0(B)4分钟，接着是11分钟的梯度变化到62%A:38%B并保持3分钟，由此获得对氧化寡糖的分离。通过2分钟梯度变化到初始条件并随后在初始条件运行5分钟获得对柱的重调。通过记录205nm处的吸收来监测洗脱的寡糖。使用ChemStation rev.B.04.02层析软件(Agilent Technologies)来记录、积分并分析层析图。通过MALDI-TOF MS分析依照上文描述的方案验证洗脱的寡糖的身份。
降解反应和取样
通用反应条件
通过将β-壳多糖(0.5-2mg/mL)与CBP21(0.1-1μM)、ChiC(0.5μM)或AnCDA(1μM)或这些酶的组合以总体积0.5ml混合于1.5ml塑料反应管(Axygen Scientific Inc,CA)或具有螺旋帽顶和
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线纹的橡皮隔片的1.7ml硼硅玻璃小瓶中来启动典型反应。除非另外规定的，所有反应都在20mM Tris-HCl,pH8.0中实施并在37℃伴随着1000rpm摇动在EppendorfThermo mixer中温育。用于定量的所有反应都以一式三份进行。将用于定性目的的所有反应至少都重复三次。
与CBP21的反应
通过向反应溶液加入1.0μM CBP21来研究CBP21对壳多糖的增溶作用，所述反应溶液在20mM Tris-HCl pH8.0中含有2.0mg/mLβ-壳多糖和5.0、1.0、或0.2mM抗坏血酸。在37℃温育反应并以定期的时间间隔取样用于MALDI-TOF MS和UHPLC分析。为了研究还原剂对CBP21功能的影响，在一些反应中将抗坏血酸与1mM还原型谷胱甘肽或1mM Fe(II)SO4交换。
通过向反应溶液加入0.5μM ChiC和1.0μM CBP21来研究CBP21对壳多糖酶活性的影响，所述反应溶液在20mM Tris-HCl pH8.0中含有2.0mg/mLβ-壳多糖和1.0mM抗坏血酸。在37℃温育反应并以定期的时间间隔取样。通过由HPLC测定(GlcNAc)2浓度来测量壳多糖的降解。以相同的方式实施对照实验，其中反应溶液中没有CBP21和/或抗坏血酸。
为了研究CBP21是否能够切割和/或氧化可溶性底物，在通过MALDI-TOF MS进行产物分析前，将500μL反应溶液在37℃温育16小时，所述反应溶液含有都溶解于20mM Tris pH8.0中的1.0μM CBP21、100μM(GlcNAc)6(0.12mg/mL)和1.0mM抗坏血酸。对对照实验实施同样的过程，其中反应溶液中没有CBP21和/或抗坏血酸。
通过在反应溶液中组合1.0μM CBP21和1.0μM AnCDA来实施设计为使由CBP21生成的聚合产物的范围可见的实验，所述反应溶液含有在20mMTris-HCl pH8.0中的2.0mg/mLβ-壳多糖、1.0mM抗坏血酸和10μl CoCl2(完全的AnCDA活性所必需的)。实施对照反应，其中反应溶液中没有CBP21，和/或被0.5μM ChiC替换。将反应在37℃温育16小时，接着用MALDI-TOF MS进行产物分析。
无分子氧的反应和相关的对照反应
为了获得无双氧的反应溶液，将除一种或多种酶以外的所有反应组分都在用螺旋帽(含有橡皮隔片)封闭的玻璃小瓶中混合，并用史兰克线脱气。将酶加入到另一小瓶中，使该小瓶与含有反应混合物的小瓶经过相同的处理。在开始脱气规程前，向反应溶液加入新鲜制备的1.0M连二亚硫酸盐溶液以确保完全除去溶液中的分子氧。通过将密封小瓶的橡皮隔片用连接到史兰克线的针头穿透，接着是5个循环的5分钟脱气(真空)和1分钟的N2饱和来实施脱气规程。最后一个循环后的小瓶被N2轻微加压。在将反应溶液和酶溶液都脱气后，使用注射器来抽取适当量的酶溶液，随后立即将其注射到含有反应溶液的小瓶中以启动反应，而同时避免注射空气泡。通过由MALDI-TOF MS分析在20mM Tris-HCl pH8.0中存在1.0mM抗坏血酸的情况下，1.0μMCBP21对2.0mg/mLβ-壳多糖的活性来评估无分子氧环境的效果。另外，在相同的无双氧的环境中分析在20mM Tris-HCl pH8.0中存在1.0μM CBP21和1.0mM抗坏血酸的情况下，0.5μM ChiC对0.1mg/mLβ-壳多糖的降解。在37℃温育16小时后通过HPLC分析样品。
还在缺乏连二亚硫酸钠且壳多糖浓度更高(0.45mg/mL)的情况下，但以其它都相同的反应条件进行后一实验。应当注意的是，尽管采取了各种防范来避免氧进入反应溶液中，但是双氧的移除并非100%有效的。这可以通过研究18O2实验的结果(参见图7C)看到，其中检出来自16O2氧化的产物。
实施另外的对照实验，其通过进行其中在存在2.0mM叠氮钠或2.0mM氰化钾的情况下，实施20mM Tris-HCl pH8.0中0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μMCBP21、0.5μM ChiC和1.0mM还原型谷胱甘肽的实验。在37℃温育反应，在30、60和90分钟时采样并通过UHPLC分析产物。
在金属螯合条件下的反应
通过螯合作用除去二价阳离子，其经由10mg/mL CBP21溶液在含有20mM Tris-HCl和5mM EDTA的缓冲液中渗析。该蛋白质溶液存在于具有10kDa MW截留渗析膜的Slide-A-Lyzer盒(Pierce)中。渗析在4℃以蛋白质对缓冲液体积比1:1000以中等磁力搅拌实施16小时。除了向反应缓冲液加入EDTA至终浓度为5mM外，如上文描述的实施与无金属的CBP21的反应。通过向反应混合物加入ZnCl2或MgCl2至终浓度为25mM来实现无金属的CBP21的重新活化。反应进行180分钟并以30分钟的时间间隔取样。对于重新激活实验，在第三次取样(90分钟)后立即将二价阳离子加入到合适的反应溶液中。通过用HPLC测定(GlcNAc)2的浓度来测量壳多糖降解。
在缓冲H2 18O中的反应
将β-壳多糖和抗坏血酸各自重悬/溶解于H2 18O中以得到分别为2mg/mL和1.0M的浓度。为了在H2 18O反应溶液中达到正确的pH，将10μL1.0MTris-HCl pH8.0转移到玻璃小瓶中，用干空气在60℃加热该小瓶直至所有的液体都已经蒸发掉。将498μLβ-壳多糖悬浮液转移到同一个玻璃小瓶，达到意图用于反应的pH。同时，向溶液加入0.5μL抗坏血酸(溶解于H2 18O)和0.75μL660μM CBP21溶液(溶解于H2 16O)以开始反应，得到终浓度为1mM的抗坏血酸和1μM的CBP21。用具有
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包被的橡皮隔片的螺旋帽密封玻璃小瓶以确保尽可能少的H2 16O从气相进入反应溶液的污染。在37℃温育16小时后，通过MALDI-TOF MS分析反应产物。
在18O2气体饱和溶液中的反应
在含有在20mM Tris pH8.0中的2.0mg/mLβ-壳多糖和1.0mM抗坏血酸的反应混合物的玻璃小瓶中，加入CBP21以得到1.0μM的终浓度。在反应启动后，立即使用含有
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线纹的橡皮隔片的螺旋帽来关闭小瓶，并使用史兰克线除去溶解的分子氧并用N2填充顶部空间(依照在标题“无分子氧的反应”下描述的规程)。在完成5个循环的脱气和N2填充后，通过将针头推动经过小瓶的隔片将含有压缩18O2气体的高压气筒连接于小瓶。然后将小瓶放到真空下，除去管道系统和小瓶顶部空间中存在的大气。通过关闭合适的在线阀门将小瓶和18O2气体气筒从剩余的史兰克线分离后，通过缓慢打开气体气筒调节器将18O2填充到小瓶的顶部空间中。然后将小瓶从针头连接取下，在37℃温育16小时后用MALDI-TOF MS分析反应产物。
β-壳多糖与芬顿化学的反应
为了确定芬顿化学(将Fe2+和H2O2组合在氧饱和的溶液中以得到反应性羟基自由基；Sawyer等,1996,Acc.Chem.Res.29:409)是否会从壳多糖得到可溶性产物，将悬浮于20mM Tris-HCl pH8.0中的2mg/mLβ-壳多糖与10mMFe(II)SO4和0.3,0.03或0.003%(v/v)H2O2在具有打孔盖(以释放反应期间生成的气体)的塑料样品管中温育16小时。通过MALDI-TOF MS分析样品。
与另一种由基因组挖掘(genome mining)鉴定的CBM33蛋白-来自粪肠球菌的CBM33(EF0362)的对照反应
将编码粪肠球菌的成熟的家族33CBM(Uniprot ID:Q838S1;EF0362;uniprot.org/uniprot/Q838S1)(没有其天然的前导肽)的基因以符合CBP21前导肽的读框的方式克隆到pRSET-B-CBP21载体中，替换编码CBP21的基因。在大肠杆菌BL21DE3细胞中表达该蛋白，通过冷渗透休克从周质级分收获，并通过壳多糖亲和层析纯化到同质。因此，该蛋白以与CBP21完全相同的方式表达和纯化，其使用CBP2的前导肽来驱动分泌。汇集含有纯蛋白(由SDS-PAGE评估)的级分并使用具有10kDa截留的Amicon离心浓缩器浓缩以得到20mg/mL的溶液。通过悬滴蒸汽扩散实验使蛋白质结晶，其使用含有1.0M K/Na酒石酸盐、0.1M咪唑pH8.0和0.2M NaCl的结晶液。在室温温育48小时后获得了形状为锥形且宽度测量为约0.2mm的晶体(参见图15A)。已经从单个晶体收集数据集并通过使用CBP21(PDB ID2BEM)作为模板的分子替换来解析结构。精化(refinement)是完全的，但并未发表。图15的组B例示了数据的质量。该图15的组C显示了CBP21和EfCBM33的结构重叠。
为了在壳多糖降解实验中使用，从2μL液滴使用尼龙环(nylon loop)收获8个晶体，并从缓冲液池转移到含有结晶液的4μL液滴中。将晶体搅拌均匀以“清洗掉”潜在的污染物。在第一次漂洗后，将晶体转移到含有结晶液的新的4μL液滴中以进行第二个漂洗循环。最后，将所有的晶体转移并溶解于含有20mM Tris-HCl,pH8.0的4μL液滴。通过将所得溶液加入到含有46μL20mM Tris-HCl,pH8.0的试管来将其稀释。对于与β-壳多糖的反应，将5μLEfCBM33溶液与在20mM Tris-HCl pH8.0中含有2mg/mLβ-壳多糖和2mM抗坏血酸的95μL溶液混合；然后将反应混合物在以1400rpm旋转的试管温箱中于37℃温育90分钟。通过MALDI-TOF分析反应上清液中的可溶性产物，其使用与用于测试CBP21活性的那些相同的方法。进一步地，通过进行实验来探寻EfCBM33加强α-壳多糖降解的能力，该实验中在存在或缺乏的0.3μMEfCBM33和1.0mM还原剂(R：还原型谷胱甘肽)的情况下将2.0mg/mLα-壳多糖(虾壳)与0.3μM来自粪肠球菌的壳多糖酶(蛋白质名称(EF0361))在37℃以900rpm搅拌温育。在存在EfCBM33和还原剂的情况下清楚地观察到了壳多糖酶活性的加强。
对CBP21反应速率和底物氧化程度的测定
使用UHPLC方法来分离氧化的壳寡糖，通过对β-壳多糖样品分级来获得纯的GlcNAc3GlcNAcA和GlcNAc4GlcNAcA样品，所述样品在存在抗坏血酸的情况下被CBP21处理过。将级分在真空(SpeedyVac)下干燥，并重悬于50μLMilliQ水中。通过MALDI-TOF MS来验证纯度。将分离的GlcNAc3GlcNAcA或GlcNAc4GlcNAcA各在37℃与7.0μM纯的重组家族19壳多糖酶(来自天蓝色链霉菌的ChiG(Hoell等,2006,FEBS J.273:4889))温育2小时，分别导致等摩尔量的GlcNAc2和GlcNAcGlcNAcA或GlcNAc2GlcNAcA的生成。使用预测定的标准曲线来估算从水解得到的GlcNAc2的量。通过测定GlcNAcGlcNAcA/GlcNAc2和GlcNAc2GlcNAcA/GlcNAc2峰面积比获得了含有GlcNAcA的寡糖的响应因子，并发现其分别为0.71和0.81。通过外推两个实验测定的响应因子，约略GlcNAc3GlcNAcA的响应因子为0.88。使用测定的响应因子，可以使用用于校准的GlcNAc2量化GlcNAcGlcNAcA和GlcNAc2GlcNAcA峰。在用于同时检测和量化GlcNAc2和氧化寡聚物的实验中，使用1.0mM还原型谷胱甘肽而不是抗坏血酸作为还原剂，因为后者干扰色谱分析。另外，该反应在20mM Tris-HCl pH8.0中含有0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21和0.5μM ChiC。
将反应在37℃在以1000rpm摇动的Eppendorf Thermo mixer中温育，并在30、60、120和300分钟时取样。所有样品都以1:1与100%乙腈混合以终止反应，并通过UHPLC分析可溶性产物。使用柱温度30℃和0.4mL/分钟的流速，以80%ACN(A):20%15mM Tris-HCl pH8.0(B)的开始梯度4.5分钟，接着11分钟梯度变化到63%A:37%B，并保持3.5分钟，由此实现氧化寡糖和GlcNAc2的分开。通过2分钟梯度变化到起始条件，随后在起始条件运行5分钟来实现对柱的重调。通过记录205nm处的吸收来监测洗脱的寡糖。使用ChemStation rev.B.04.02层析软件(Agilent Technologies)来记录、积分并分析层析图。
为了估计CBP21氧化水解活性的速率，将在20mM Tris-HCl pH8.0中含有0.45mg/mLβ-壳多糖、1.0μM CBP21和1.0mM还原型谷胱甘肽的反应在37℃温育，并在10、15、30、45、60和300分钟时取样。与用乙腈终止反应不同，向样品(0.1体积)加入纯化的重组壳多糖酶混合物来获得对壳多糖的快速完全降解，所述混合物含有28μM ChiC(见上文)、71μM ChiG(Hoell等,2006,见上)、63μM ChiB(Brurberg等,1995,Microbiology141:123,Brurberg等,1996,Microbiology142:1581)和15μM ChiA(Brurberg等,1996,见上,Brurberg等,1994,FEMS Microbiol.Lett.124:399)。在这些条件下，不可溶解的壳多糖在30分钟内完全消失。使用上文概述的UHPLC方法来确定氧化产物(独有GlcnAcGlcNAcA和GlcNAc2GlcNAcA)的量。
通过HPLC分析和量化葡萄糖和纤维二糖(E7和CelS2)
通过在装置有加热到80℃的7.8x100mm Rezex RFQ-Fast Fruit H+柱(Phenomonex)的Dionex Ultimate3000HPLC系统上运行的等度HPLC分析含有葡萄糖和纤维二糖的样品。流动相由5mM硫酸组成并且使用的流动速率是1.0ml/分钟。通过记录折光率监测洗脱的葡萄糖和纤维二糖。通过运行葡萄糖和纤维二糖标准获得量化。使用Chromeleon6.8层析软件(Dionex)来记录、积分并分析层析图。
使用HPAEC对天然和氧化的纤维寡糖的分析(E7和CelS2)
使用装备有CarboPack PA1的Dionex Bio-LC、柱温30℃和0.25ml/分钟的流速，以起始条件即0.1M NaOH实现对天然和氧化的纤维寡糖的分离。应用具有递增量的醋酸钠的渐进线性梯度，从0.1M NaOH和0.1M醋酸钠10分钟，接着到0.1M NaOH和0.3M醋酸钠25分钟，然后增加至0.1M NaOH和1.0M醋酸钠30分钟，并保持10分钟。通过梯度变化1分钟到起始条件并随后在起始条件运行14分钟来实现对柱的重调。通过PAD检测来监测洗脱的寡糖。使用Chromeleon7.0来记录和分析层析图。通过包括以下步骤的规程实现对峰的鉴定：依照由Westphal等,2010,Journal of Chromatography A1217:689-695开发的方法，使用Dionex Ultimate3000UHPLC系统分离氧化的纤维寡糖，该系统携带Hypercarb150x2.1mm柱(Thermo Scientific)，运行水/0.1%TFA和乙腈/0.1%TFA的梯度(从20至80%乙腈)。将洗脱峰手动分级、冻干、重新溶解于MilliQ水并使用MALDI-TOF MS鉴定。然后使用如上文描述的HPEAC方法分析已知身份的纯的氧化纤维寡糖，从而建立由CelS2和E7生成的氧化纤维寡糖的身份。
纤维素降解实验(E7和CelS2)
建立为了评估E7和CelS2的功能而实施的测定法，其在含有1.0mMMgCl2的反应混合物中在pH5.5(20mM醋酸钠缓冲液)、6.5(20mM Bis-Tris缓冲液)或8.0(20mM Tris缓冲液)使用多种纤维素底物(
Figure BDA00003011746200741
滤纸和蒸汽爆破的来自白杨的木屑)。通过向反应混合物加入1.0mM或0.5mM还原型谷胱甘肽或抗坏血酸来探寻存在外部电子供体的效果(具体参见图例)。
结果
我们在此显示CBP21(包含一个CBM33域的单域蛋白质)实际上是催化结晶态壳多糖中糖苷键的氧化水解切割的酶，由此为正常的糖苷水解酶水解打开了不可进入的多糖材料。此酶活性的首次发现是在我们将β-壳多糖纳米晶须与CBP21温育时检测到痕量的非天然壳寡糖的时候(图2A)。该产物被鉴定为在还原性末端具有2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡糖酸(GlcNAcA)的壳多糖寡糖(图2B和3)。我们因此发现加入还原剂急剧增加了反应效率(图4和6)，使得由单独的CBP21解构大的结晶态β-壳多糖颗粒成为可能(图2C)，释放出一系列氧化产物(图5和下文)而且将壳多糖酶效率加强到比之前观察到的高得多的水平(比较图1C和图4)。
如果CBP21在结晶表面上随机作用，会预期生成较长的寡糖，由于其低溶解度而难以检出。在存在还原剂的情况下由CBP21生成的主要可溶性产物具有低于10的DP(图2A；图5)。为了看到较长的产物，我们采用了新克隆的来自构巢曲霉的壳多糖脱乙酰基酶(AnCDA)以通过脱乙酰作用增加较长的壳多糖片段的可溶性。此办法确实揭示了用CBP21(图2D)或者用内切壳多糖酶(ChiC；图2E)都形成具有高DP的壳多糖片段。CBP21和ChiC都生成了长产物，指示着“内切的”活性类型。
有两个突出的重要特征。首先，当使用CBP21时，所有的检测出的产物都被氧化(即它们含有GlcNAcA模块)，确认了CBP21催化糖苷键氧化性水解的观察结论。其次，尽管由ChiC释放的产物表现出连续长度，但由CBP21释放的产物中偶数的寡糖占优势(图2D和6)。这显示ChiC倾向于切割任何糖苷键，而CBP21显示切割每个第二糖苷键的强烈偏向。考虑到底物中的二糖周期性(图1A)，这一关键性的观察结果暗示着ChiC从“任一侧”接近单一的聚合物链，而CBP21必须从固定侧接近底物。如果由CBP21切割的多糖链是完整的结晶结构的一部分时就会获得后一情形。显然，内切壳多糖酶ChiC和CBP21在壳多糖水解中具有不同的作用。
通过同位素标记更详细地探寻CBP21介导的切割机制。在H2 18O中的实验显示在氧化的新的链末端引入的氧原子中的一个来自水(图7A)。第二个氧的唯一可能的来源是分子氧，并且这已经通过在18O2饱和条件中实施的实验得到了验证(图7B和C)。除去溶解的或在反应溶液中的分子氧抑制了CBP21活性(图8A、B和C)，确认了需要分子氧用于催化。由氰化物(分子氧的普通模拟物)的强烈抑制证明了氧化步骤所起的关键作用(图8C和D)。由此，由CBP21催化的反应包含水解步骤和氧化步骤，如在图7D中汇总的。对多糖的酶促氧化水解迄今还未有记载。CBP21在本文中被称为“壳多糖氧化水解酶”。同样地，GH61蛋白被称为“纤维素氧化水解酶”。
发现CBP21催化依赖于可能结合保守的组氨酸基序(图1F)的二价阳离子的存在(图9)。有意思的是，GH61蛋白的活性也依赖于二价阳离子(Harris等,2010,Biochemistry49:3305)。对CBP21(Vaaje-Kolstad等,2005,J.Biol.Chem.280:11313)和GH61蛋白(Harris等,2010,Biochemistry49:3305;Karkehabadi等,2008,J.Mol.Biol.383:144)的结构研究显示了金属结合位点中的相当大的结构可塑性(plasticity)，解释了该金属结合位点为何是混杂的以及并且对二价阳离子的需要为何是相当地无特异性的(如图9中和Harris等,2010,Biochemistry49:3305中显示的)。在金属结合基序中对第二个组氨酸(CBP21中的His114和来自土生梭孢霉的GH61E中的His89)的突变都敲除了两种蛋白质的活性(分别为图10和Harris等,2010,Biochemistry49,3305)。可以想到的是，金属离子结合直接有助于在催化期间对反应性氧种类和/或水解水的结合/稳定/活化。或者，金属离子可能是稳定蛋白质的活性位点区结构而不直接与氧或水相互作用所必需的。
还原剂将CBP21的氧化水解活性加强到极端水平(图2C、4、6、11)，其很可能超过天然所曾达到过的。还原剂可能在氧化酶促过程中充当电子供体，但对电子从还原剂到分子氧的确切流动还不清楚。一种观点是电子的赠献经由反应性氧种类如O2 -的生成而发生。另一种观点是电子不知何故被导入涉及CBP21、底物和O2的复合物中，暗示着反应性氧种类如O2 -仅在底物上出现并且不会或几乎不会在溶液中存在。最有意思的且具有生物技术重要性的是，我们的数据显示可以通过简单调节反应条件来相当大地加强这些新酶的活性。
我们进行了众多对照实验，它们都确认了这一结论，即氧化产物的形成仅发生在存在CBP21和结晶态底物的情况中。仅存在还原剂没有得到氧化产物(图12)，而且也没有强化或抑制壳多糖酶作用(图4和10B)。当与六聚的N-乙酰葡糖胺在最优条件下温育时，既未观察到降解产物也未观察到氧化寡糖(图13)。我们还研究了CBP21不与切割键本身直接相互作用而发挥功能的可能性，因为可能设想到一种CBP21诱导的“解构(destructuring)”机制，其使得底物更容易受到以不依赖于CBP21的方式例如由芬顿化学生成的反应性氧种类的作用。然而，我们在使β-壳多糖经受芬顿化学时不会检测到任何可溶性产物(图14)。所有这些实验都确认了CBP21积极地参与氧化水解切割反应。
如在图8中显示的，CBP21活性被氰化物(一种已知的O2模拟物)而不被叠氮化物(一种已知的蛋白抑制剂)强烈抑制。数种能够作为电子供体作用的还原剂加强了CBP21的活性(图2C和11)。实验数据指示，由CBP21催化的氧化步骤是不依赖于辅因子的，而依赖于外部电子供体。之前已经描述过不依赖于辅因子的加氧酶，但通常认为这些酶使用底物中缀合的碳负离子作为电子供体(Fetzner和Steiner,2010,Appl.Microbiol.Biotechnol.86:791)，这是一种不太可能出现在多糖底物的情况中的机制。如果先发生氧化步骤，这会暗示CBP21催化对饱和碳的不依赖于辅因子的加氧作用，这是无先例的并且也许不太可能的。在另一方面，这类机制能够得到中间产物，例如酯键，其可能比起始糖苷键更倾向于水解。或者，可能首先发生水解步骤，这会暗示着CBP21能够使用迄今未知的机制，在结晶环境中水解糖苷键。这类水解步骤会需要一定程度的底物变形(Davies等,2003,Mapping the conformational itinerary ofβ-glycosidases by X-ray crystallography.Biochem.Soc.Trans.31:523以及Vocadlo和Davies,2008,Mechanistic insights into glycosidase chemistry.Curr.Opin.Chem.Biol.12:539)，这在结晶堆积中似乎是具有挑战性的。然而，支持该机制的是，所得糖醛(“还原性末端”)的随后氧化比饱和碳的氧化更直接。
CBP21在可能是结晶态多糖底物的最可不接近和刚性的部分中引入链断裂，且其作用模式从根本上不同于糖苷水解酶的作用模式。关键区别是糖苷水解酶被设计为在其催化的裂缝或穴中容纳单个“可溶性”多糖链，并且它们对结晶态底物的亲和力和接近度倾向于受到非水解结合域的介导。相比之下，CBP21和GH61酶具有平坦的表面(图1D和E)，其结合结晶态材料的平坦、固态、有序的表面并催化通过氧化水解机制的链断裂。链断裂会导致对结晶堆积的破坏和增加的底物可接近性，这是一种可以通过对新的链末端之一的修饰得到增加的效应。在切割点，新末端之一是正常的非还原性末端(在图7D中由R-OH指示)。如果切割是由正常的糖苷水解酶实施的话，另一个新末端会是新的还原性末端。然而，在此情况中，产物是不同的且最后一个糖被氧化变成2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-葡糖酸(图2B和7D；GlcNAcA)。这一新的“酸性链末端”会干扰正常的晶体堆积，因为其不具有糖环的正常的椅构象且因为其携带电荷。
难以发现在本研究中证明的酶活性，因为依赖于检测具有低溶解度且潜在地高度倾向于保持附接于结晶态材料的产物。在此意义中，与壳多糖作用比与纤维素作用简单，因为产物溶解度稍微高一些，且因为结晶堆积不那么紧密(Eijsink等,2008,Trends Biotechnol.26:228)。使用壳多糖脱乙酰基酶的实验(图2D和E)提供了基本的领悟，但不能简单地将该办法用于纤维素。由于氧化机制，用通常使用的还原性末端测定法来寻找GH61蛋白的链断裂活性显然不会起作用。
使用用于量化氧化产物的方法，我们能够估计在多种条件下氧化的速率和程度(图16)。当CBP21在最佳条件下单独地作用于β-壳多糖时，氧化速率在1每分钟的数量级，并且最大氧化程度是约7.6%的糖。在最佳条件下用CBP21和ChiC同时降解β-壳多糖导致约4.9%的糖氧化。必须注意的是，在自然界中酶如CBP21通常与至少1种(且在粘质沙雷氏菌的情况中与3种)壳多糖酶同时作用(Suzuki等,1998,Biosci.Biotechnol.Biochem.62:128)。
在CBM33家族蛋白EfCBM33上进行的实验揭示，该蛋白在功能上类似于CBP21。在图15的组D中绘出的MS分析结果类似于那些用CBP21获得的，清楚地显示了氧化产物的形成和该蛋白的氧化水解特性。有意思的是，注意到EfCBM33不仅作用于β-壳多糖(图15D)，而且还作用于α-壳多糖(图15E)。
检查了CBM33蛋白对作为底物的纤维素的效力。使用记载于材料和方法部分的克隆、表达和纯化策略，将成熟的野生型E7、CelS2和一种被归为属于GH家族7并且起始于里氏木霉的称为Cel7A的纤维素酶(Harjunpaa等,1999,FEBS Letters443:149-153)纯化到～95%纯度。最后，使用称为CELLUCLASTTM的纤维素混合物，其为一种容易得到且公知的来自Novozymes的商业化产品。
为了确定CelS2和/或E7是否具有从结晶态纤维素释放可溶性糖的能力，在存在或缺乏外部电子供体(还原型谷胱甘肽或抗坏血酸)的情况下将CelS2或E7与
Figure BDA00003011746200781
温育。使用用于定性检测产物类型的MALDI-TOF MS和HPAEC(高压阴离子交换层析，一种能够鉴定产物并在原理上量化产物的层析方法)来分析推定的反应产物。确实，对两种蛋白质(仅对CelS2显示；图17-19)和对两种检测方法都观察到了可溶性寡聚产物。在有无外部电子供体的两种条件中都观察到了天然的纤维寡糖，但在前一条件中观察到大得多的量。仅在其中存在外部电子供体的实验中观察到氧化的纤维寡糖。
更具体地，MALDI-TOF MS分析揭示了具有氧化的还原性末端的纤维寡糖的存在(即还原性葡萄糖模块被葡糖酸模块替换的纤维寡糖；图17和18)。在图17中可见的释放的可溶性氧化寡糖的聚合度(DP)范围在DP4-DP7，且根据纤维寡糖就DP而言是偶数还是奇数，产物信号显示交替的强度/量(偶数的纤维寡糖占优势)。对相同样品的HPAEC分析反映了由MALDI-TOF MS分析提供的结果，显示了代表氧化的纤维寡糖的具有交替强度的峰的存在(图19)。
偶数寡糖占优势是以下事实的合理的后果，即CBM33酶攻击结晶环境中的多糖链。由于纤维素和壳多糖的重复单元是二聚体，在结晶态多糖链上仅有每个第二糖/糖苷键倾向于被CBM33酶切割，意味着释放出的产物倾向具有偶数的DP。(注意对结晶态纤维素或壳多糖的酸水解产生了偶数和奇数的寡糖的平均分布(even distribution of even and odd numbered oligosaccharides))。
图19显示了在存在还原剂的情况下与CelS2温育导致以氧化水解方式对晶体中的纤维素链进行切割，释放出可溶性的氧化的纤维寡糖(浅灰色，上方线)。这也导致另外释放出未氧化的纤维寡糖，其可能部分起因于对晶体表面的破坏，该破坏促进在晶体中捕捉的较短的寡聚体的释放。另外，CelS2在纤维素链的还原性末端附近的链切割会产生这类产物。
监测含有结晶态纤维素(滤纸)和纤维素酶(称为CELLUCLASTTM的纤维素酶混合物，或单个组分的纤维素酶Cel7A)的反应在存在和缺乏CelS2/E7和/或外部电子供体的情况下纤维二糖和葡萄糖的释放。
当将CELLUCLASTTM与滤纸在存在CelS2或E7的情况下温育时，葡萄糖产量确实要高于当将滤纸仅与CELLUCLASTTM温育时(图20；在温育24小时后，对于CelS2和E7增加～3.0倍，在温育120小时后，对于CelS2增加～9倍，对于E7增加～3.5倍)。当加入CelS2和外部电子供体两者时，葡萄糖产量甚至更高(图20；在温育24小时后，对于CelS2增加～5倍，对于E7增加3.5倍，在温育120小时后，对于CelS2增加～11倍，对于E7增加～4.5倍)，指示着外部电子供体的存在对于CelS2和E7的加强效果确实具有重要性。
由于CELLUCLASTTM产品含有水解活力的复杂混合物(可能使对结果的解释复杂化)，从CELLUCLASTTM(Novozymes)纯化出单组分纤维素酶(Cel7A)并用于探寻CelS2的加强效率。当将Cel7A与CelS2温育时，也观察到了与当组合CELLUCLASTTM和CelS2时在存在和缺乏外部电子供体的情况中所观察到的那些类似的效果(图21)。在缺乏外部电子供体的情况下，在温育18和40小时后，CelS2将Cel7A活性(就纤维二糖产量而言)分别提高了5.5和7.3倍。在存在外部电子供体的情况中，在温育18和40小时后，CelS2将Cel7A活性分别提高了6.7和9.8倍。
图20和21显示，除了提高纤维素酶活性外，在两种情况中CelS2的存在还帮助维持纤维素酶随时间的活性。尽管在存在或缺乏外部电子供体的情况下温育的纤维素酶的活性在第一个18-24小时内达到几乎完全停止，但在与CelS2温育的样品中纤维素酶活性持续。此效果可能为CBM33蛋白对于通过水解酶(分别是壳多糖酶和纤维素酶)降解壳多糖或纤维素所具有的协同效应提供了部分解释。
在存在外部电子供体的情况下由CelS2生成的氧化产物以两种形式的平衡存在，即葡糖酸δ-内酯(在略酸性pH时在群体中增加)和葡糖酸形式(在略碱性pH时占优势)。在略碱性pH(例如pH8.0)，可能的情况是，在纤维素晶体表面上由于CelS2活性产生的电荷可能帮助纤维素晶体的变形和破坏/溶解，并由此增加底物对纤维素酶的可进入性。然而，可以想到的是纤维素晶体中的氧化的寡糖和/或氧化的链末端也可能抑制某些纤维素酶(例如外部作用的酶)，使得可能应该仔细调节CelS2/CBM33活性程度以得到最佳的加强效率。
当使用单组分Cel7A作为纤维素水解组分来探寻CelS2在各个pH的纤维素加强特性时，发现pH5.5是对活性最优的pH。在pH6.5看到活性变小且在pH8.0未检测到任何活性(数据未显示)。对于纤维素水解在增加的pH中降低的最明显的原因是Cel7A的pH稳定性和效率。该纤维素酶在pH8.0处接近无活性，这是一般真菌纤维素酶的普遍特征(Garg&Neelakantan,1981,Biotechnology andBioengineering23:1653-1659和Wood,1985,Biochemical Society Transactions13:407-410.)。CelS2是起源于链霉菌属菌种的细菌酶，已知该物种在约中性pH条件中在纤维素底物上生长最佳(Kontro等,2005,Letters in Applied Microbiology41:32-38.)。图19中呈现的数据显示CelS2在pH8.0处有活性。
由于纤维素酶的pH依赖型特性，此处报告的协同实验在微酸性pH处实施，这对于使用的特定CBM33(主要是来自链霉菌属的)可能是未达最佳的(suboptimal)。由此，观察到的CelS2的效果可能小于在对CelS2活性优化过的条件下能达到的效果。
更一般地，本领域中的技术人员会知道天然酶关于其活性的最优pH和温度会变化。技术人员会知道这也适用于水解酶如纤维素酶和壳多糖酶，且适用于氧化水解酶如CBP21和CelS2。显然，为了获得最佳的总体反应效率和/或使CBM33的加强效果最大化，需要考虑CBM33和水解酶的最适pH和最适温度。通过从自然界中选择适当的酶或通过使用蛋白质工程改造类型的技术来修饰天然酶的特性如最适pH，可以获得具有不同最适pH和温度的酶。
可以想到的是，pH影响着CBM33加水解酶(一种或多种)类型的酶系统的性能，因为pH影响着氧化产物的内酯和酸形式之间的平衡，这又可以影响水解酶的效率。pH还可以影响还原剂。
这些实验显示，一些家族33CBM如CelS2和E7对结晶态纤维素有活性，在存在或缺乏外部电子供体的情况下都加强纤维素酶活性，但在存在电子供体时显示实质性更高的活性/加强效果。这些观察结果以及之前对作用于壳多糖CBP21获得的结果，指示了对新生成的链末端之一的氧化对于这些CBM33酶的功能是重要的。氧化确实还是作用于纤维素的CBM33的机制的一部分的观点还进一步得到数据的支持，该数据显示在存在外部电子供体的情况下将CelS2与
Figure BDA00003011746200811
温育时，氰化物(一种公知的氧模拟物)抑制氧化的纤维寡糖的生成(图22)。
另外，生成了CelS2的变体，其含有推定基本保守的残基组氨酸144到丙氨酸的突变。该组氨酸是家族33CBM的特征性金属结合基序中强烈保守的残基之一且对应于CBP21中的His114(图1D和F；图10；Vaaje-Kolstad等,2010,Science330:219-222)。图23显示在存在外部电子供体的情况下，CelS2-H144A不能生成氧化的纤维寡糖(图23)。
要再一次强调的是，实验仅在1个pH实施，如上文论述的这对于两种酶组分(CBM33或水解酶)之一可能不是最优的。使用的纤维素酶在酸性pH范围处工作最佳，而氧化纤维素的CBM33在碱性pH范围处更具活性。本领域中的技术人员会理解，当改变反应的pH和/或选择更适于此处使用的pH的酶变体并在此特定pH工作时，可能得到不同的和更好的结果。由此在这些实验中可能没有看到氧化加强效果的全部潜力。
最后，还探寻了将其它纤维素变体(滤纸和蒸汽爆破的来自白杨的锯屑)作为CelS2的底物。通过MALDI-TOF分析未观察到可溶性氧化纤维寡糖(结果未显示)。这最可能是由于这些底物中的纤维素的高DP；当总DP非常高时，在结晶表面上的切割不会容易地导致可溶性(即短的)纤维寡糖的释放。的特别之处在于，相比于测试的其它底物，它是具有非常低DP(～60-100；Wallis等,1992,Carbohydrate Polymers17:103-110以及Mormann和U,2002,Carbohydrate Polymers50:349-353)的微晶纤维素形式。
然而，当用更“天然”的底物来探寻CBM33(在此情况中为CelS2)的纤维素酶加强效果时，CelS2的效果确实存在，如由图24的～2倍增加显示的。对于在蒸汽爆破的来自白杨的锯屑(其代表了更类似于在工业生物质降解应用中使用的底物)上加强的CELLUCLASTTM效果显示的数据还显示，CelS2活性不依赖于底物具有较高纯度。显然，CelS2也作用于存在于更天然的环境中的纤维素(即包埋在植物/木材细胞壁基质中的)。
除了显示全新的酶活力用于修饰固体多糖表面外，我们的结果还指向顽固性多糖的酶法转换的新方向。显然，CBM33家族蛋白(如CBP21、EfCBM33(图15)、E7和CelS2(图17-24))和GH61家族蛋白(如在土生梭孢霉、黄孢平革菌或红褐肉座菌中发现的GH61蛋白)能够急剧增加水解酶混合物对壳多糖和纤维素的效率，并且最近确实提出了GH61蛋白对于纤维素转化的潜力的首次发现(Harris等,2010,Biochemistry49:3305)。本发明显示如何通过调节反应条件(即合适的金属离子和还原性的和/或生成反应性氧种类的试剂的组合存在)加强CBM33和GH61家族蛋白的有益效果。显然，这些氧化水解酶对于分子氧和充当外部电子供体的还原剂的存在的依赖性提供了对工艺设计的指引。
实施例2：在存在还原型谷胱甘肽的情况下，CelS2对纤维素酶降解纤维素的影响。
图20和21显示了CelS2和E7的一种影响是延长纤维素酶活性。尽管与单独的CELLUCLASTTM或Cel7A反应在第一个时间点(在图20中为24小时，在图21中为18小时)后几乎不生成任何另外的可溶性葡萄糖，但是在存在CBM33蛋白的情况下在大多数情况中都持续释放可溶性葡萄糖，并且该效果在存在还原剂时还得到增加。为了进一步对此进行分析，我们进行了时程实验来检查CelS2对CELLUCLASTTM活性随时间的影响。
材料和方法
如实施例1。对于本实施例和下面的实施例，必要时在图例中提供了进一步的实验细节，包括与在实施例1中描述的标准方案的微小偏差。
结果
结果(图25)清楚地显示，由CELLUCLASTTM进行的可溶性葡萄糖生成变平缓(level off)，而如果存在CelS2时可溶性葡萄糖的生成持续。如果还存在还原剂则该效果增加。可以想到的是，通过修饰纤维素底物的表面，CelS2不知何故防止了纤维素酶不可逆且没有成果地结合至底物的现象，而该现象一般被认为降低纤维素酶的效率(Jalak和2010,Biotechnology andBioengineering106:871-883)。
实施例3：在存在还原型谷胱甘肽的情况下，CelS2和Cel7A对纤维素酶降解纤维素的影响。
为了检查CelS2的功能性，包括其在延长纤维素酶活性上的影响，更详细地研究了CelS2对单组分纤维素酶效率的影响。所述单组分的酶是通过从来自红褐肉座菌(里氏木霉)的纤维素酶混合物纯化获得的HjCel7A。
材料和方法
如实施例1。
结果
结果(在图26中描述)清楚地显示CelS2加强了纤维素酶Cel7A的活性，并且该加强效果在存在还原剂时更大。该结果还显示CelS2的存在延长了Cel7A的活性。
实施例4：不同的还原剂对CBM33效率的影响-用CelS2的重组生成的N末端CBM33域进行的研究。
为了检查不同还原剂的功能性，将CelS2的重组生成的N末端CBM33域与0.8mM还原型谷胱甘肽、没食子酸或抗坏血酸温育并监测氧化寡糖从的释放。
材料和方法
如实施例1。
结果
图27显示所有测试的还原剂都加强了CBM33蛋白的活性，尽管以不同的程度。最优还原剂的选择会取决于pH、底物和GH61/CBM33蛋白的类型，等等。
实施例5：还原剂对E7在纤维素酶活性上的加强效果的影响。
依照Pfam生物信息学分析(pfam.org)，E7是单域CBM33蛋白(UniprotID:Q47QG3；E7)，而CelS2(Uniprot ID:Q9RJY2)包含CBM33域和附接于该蛋白的C末端一侧的CBM2(糖结合模块2；参见cazy.org)。重要的是，注意单域蛋白质如E7本身是有活性的，如在图20中例示的。为了进一步对此进行例示，准备了图28，其显示了在存在或缺乏还原剂的情况中，由CELLUCLASTTM或CELLUCLASTTM和E7的组合对纤维素的降解。
材料和方法
如实施例1。
结果
在图28中清楚地看到，E7与CELLUCLASTTM协同作用，并且还原剂的存在对E7有加强效果。还注意图28显示E7的一个效应是其延长了纤维素酶随时间的活性，类似于如上文描述的对于CelS2所观察到的。图29显示了当与和还原剂温育时，由E7生成的氧化产物的MALDI谱。
实施例6：其它CBM(CelS2的N末端CBM33域和CelS2的C末端CBM2域)的效果。
如在实施例6中记载的，E7是单域CBM33蛋白，而CelS2包含CBM33域和附接于该蛋白的C末端一侧的CBM2。要注意单域蛋白质如E7本身是有活性的，如在图28中例示的。为了进一步对此进行例示，准备了图30，其显示了通过全长CelS2、CelS2的重组表达的N末端CBM33域、和CelS2的重组表达的C末端CBM2域从纤维素释放的产物。
材料和方法
如实施例1。重组产生的N末端CBM33域的序列是：
HGVAMMPGSRTYLCQLDAKTGTGALDPTNPACQAALDQSGATALYNWFAVLDSNAGGRGAGYVPDGTLCSAGDRSPYDFSAYNAARSDWPRTHLTSGATIPVEYSNWAAHPGDFRVYLTKPGWSPTSELGWDDLELIQTVTNPPQQGSPGTDGGHYYWDLALPSGRSGDALIFMQWVRSDSQENFFSCSDVVFDGG(SEQ ID NO:22)。
结果
如预期的，单独的CBM2域对纤维素未显示任何活性(图30)。然而，没有CBM2的CBM33域对
Figure BDA00003011746200842
显示活性，尽管该活性低于完整蛋白质的活性。
这些数据清楚地显示，单独的CBM33域可以与纤维素酶协同作用，且这些单域的活性受到还原剂存在的刺激(亦参见图27)。数据还显示其它CBM域如CelS2中的CBM2的存在对于CBM33活性可能是有益的。通过与科学文献中已知的关于加入各种类型的CBM对各种类型的碳水化合物活性酶的效果进行类比，会理解可以通过除去、加入或改变融合于CBM33或GH61域的其它CBM来操作天然存在的CBM33和GH61蛋白的活性和效率。
实施例7：CelS2的金属活化。
为了鉴定出哪种是CelS2的优选金属，通过EDTA来抑制CelS2的N末端CBM33域的活性并对不同的金属重新活化该蛋白进行测试。
材料和方法
如实施例1。
结果
图31清楚地显示，在本实验中使用的包括非常低的金属浓度(相比于例如在图9中使用的浓度)的条件下，测试的金属中仅铜能够重新活化CelS2(在存在20μM EDTA时金属浓度为10μM)。由此，铜离子可能是CelS2的优选金属离子。但应当注意的是，在稍微高(但仍然是较低的)的浓度，许多其它的金属离子也可以发挥作用(至少用于实践目的)(Vaaje-Kolstad等,2010,见上；Harris等,2010,见上；图9)。
CBM33和GH61采用的确切的金属离子仍然是有些不确定的，但对于实践目的，数种金属离子会在较低的浓度发挥作用(1mM范围)。如果CBM33和GH61优选铜，那么已经观察到其它二价金属离子活化CBM33和GH61酶的事实(例如图9和Harris等,2010,见上)可能是由于以下原因：在反应混合物中以非常低的量天然存在的Cu2+离子(例如作为底物的部分)可能是酶不可接近的，因为它们结合于例如底物。通过加入其它倾向于结合至相同“结合位点”的二价金属离子，可以释放结合的铜离子并由此变成酶可获的(它们被加入的二价金属从结合位点“竞争排出”)。在1mM范围内的浓度上，这较好地适用于其它金属，Cu2+可能由于非特异性结合而抑制CBM33作用(未显示)。
实施例9：序列和活性比较。
已知对纤维素有活性或通过类比可能对纤维素有活性的GH61酶，如在红褐肉座菌(或里氏木霉；HjGH61A&HjGH61B)的基因组中编码的两种GH61蛋白，除了构成金属结合位点的两个组氨酸外，还都享有数个保守的残基(图32)。有意思的是，这些相同的残基在纤维素活性的E7中保守，而其中一些不存在于壳多糖活性的CBP21中(图33)。
实施例10：在存在还原剂的情况中GH61蛋白对纤维素的切割。
将GH61蛋白TtGH61E(SEQ ID NO:1)和TaGH61A(SEQ ID NO:2)与纤维素和抗坏血酸温育来证明这些蛋白质在存在抗坏血酸的情况下能够切割纤维素并得到氧化产物。克隆并生成这两种蛋白质，如记载于Harris等,2010,见上中的。图34清楚地显示TtGH61E以与CBM33蛋白类似的方式切开纤维素，生成氧化的和天然的纤维寡糖。尽管产物模式类似于用CBM33获得的，但它们并不相同。在存在还原剂的情况下，由CBM33作用于纤维素通常获得的模式(图19、22、27、30和31)显示不同的周期性(即各种产物(氧化和天然寡糖)的相对丰度)。这可能指示TtGH61E以略微不同的方式作用于底物，例如通过攻击晶体的另一个面。不过显然，TtGH61E在存在还原剂的情况中的总体反应成果类似于CBM33在存在还原剂的情况中对纤维素的反应成果。图34还显示TaGH61A至少在该底物上的活性比TtGH61E低得多，氧化糖的生成非常低。显著地，该酶生成相对多的天然纤维寡糖，即该产物模式明显不同于用TtGH61E和CBM33获得的产物模式，这可能再次指示了底物结合特异性中的轻微变化。
实施例11：还原剂对CellicTMCTec2(一种含有GH61的纤维素酶制备物)的影响。
由于商品化的纤维素酶制剂CellicTMCTec2含有GH61蛋白，测试了抗坏血酸对该酶制备物效率的影响。在本实验中，研究了抗坏血酸对通过CellicTMCTec2从纤维素释放葡萄糖的影响。图35显示了抗坏血酸的存在使葡萄糖从滤纸和的释放增加了约30%，从而证明了抗坏血酸的有益效果。
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Claims (31)

1.一种降解或水解多糖的方法，其包括使所述多糖与一种或多种氧化水解酶接触，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况下实施所述降解或水解。
2.如权利要求1的方法，其中所述多糖是壳多糖或纤维素。
3.如权利要求1或2的方法，其中所述氧化水解酶是CBM33家族蛋白(优选CBP21)或GH61家族蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其中在所述方法中使用两种或更多种氧化水解酶。
5.如权利要求4的方法，其中所述氧化水解酶中一种是CBM33家族蛋白且所述氧化水解酶中另一种是GH61家族蛋白。
6.如权利要求1-5中任一项的方法，其中所述氧化水解酶是一种多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO:1-16的任一个中所列出的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少30%序列同一性的序列、或其生物学活性片段，所述片段包含所述序列的至少100个氨基酸。
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其中所述多糖是纤维素。
8.如权利要求7的方法，其中所述氧化水解酶是GH61蛋白、E7、CelS2、Cfla_0175、Cfla_0172、Cfla_0316、Cfla_0490、CJA_2191、CJA_3139或SCO1734。
9.如权利要求7或8的方法，其中所述氧化水解酶是一种多肽，所述多肽包含如SEQ ID NO:1-3或6-16的任一个中所列出的氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有至少30%序列同一性的序列、或其生物学活性片段，所述片段包含所述序列的至少100个氨基酸。
10.如权利要求1-9中任一项的方法，其中所述还原剂是抗坏血酸、还原型谷胱甘肽、Fe(II)SO4、LiAlH4、NaBH4或木质素或其片段。
11.如权利要求1-10中任一项的方法，其中所述二价金属离子是Ca2+、Co2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+或Zn2+。
12.如权利要求1-10中任一项的方法，其中所述二价金属离子是Cu2+。
13.如权利要求1-12中任一项的方法，其进一步包括：
(a)使所述多糖(或其降解或水解产物)与选自纤维素水解酶或壳多糖水解酶的一种或多种糖分解酶接触，并
(b)任选地，使所述多糖(或其降解或水解产物)与一种或多种β-葡糖苷酶接触，
其中优选地，使所述酶和所述氧化水解酶同时与所述多糖接触。
14.如权利要求13的方法，其中所述糖分解酶是壳多糖酶或纤维素酶。
15.一种生成可溶性糖的方法，其中所述方法包括通过如权利要求1-14中任一项所限定的方法来降解或水解多糖，其中所述降解或水解释放所述可溶性糖，以及任选地将所述可溶性糖分离。
16.如权利要求15的方法，其中所述可溶性糖是壳二糖和/或N-乙酰葡糖胺和/或其寡糖，或者纤维二糖和/或葡萄糖和/或其寡糖。
17.一种生成有机物质的方法，其包括下列步骤：
(i)通过如权利要求1-16中任一项的方法来降解或水解多糖以生成包含可溶性糖的溶液；
(ii)将所述可溶性糖发酵以生成所述有机物质作为发酵产物；以及任选地
(iii)回收所述有机物质。
18.如权利要求17的方法，其中所述有机物质是醇。
19.如权利要求18的方法，其中所述醇是乙醇。
20.一种用于生成发酵产物的方法，包括：
(a)用酶组合物降解或水解纤维素材料，所述酶组合物包含一种或多种选自下组的酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、半纤维素酶、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素(swollenin)，其中在存在至少一种还原剂和至少一种二价金属离子的情况中实施所述降解或水解；
(b)用一种或多种发酵微生物将所述降解过的纤维素材料发酵以生成所述发酵产物；并
(c)从所述发酵回收所述发酵产物。
21.如权利要求20的方法，其中所述纤维素材料是经过预处理的。
22.如权利要求20或21的方法，其中所述纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
23.如权利要求20-22中任一项的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：木聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、木糖苷酶和葡糖醛酸糖苷酶。
24.如权利要求20-23中任一项的方法，其中在同时糖化和发酵中同时实施步骤(a)和(b)。
25.如权利要求20-24中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、烷、环烷、烯、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物(polyketide)。
26.一种用于生成发酵产物的方法，包括：
(a)用酶组合物糖化纤维素材料，所述酶组合物包含内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、和CBM33；
(b)用一种或多种发酵微生物将所述糖化的纤维素材料发酵以生成所述发酵产物；并
(c)从所述发酵回收所述发酵产物。
27.如权利要求26的方法，其中所述纤维素材料是经过预处理的。
28.如权利要求26或27的方法，其中所述酶组合物进一步包含一种或多种选自下组的酶：酯酶、棒曲霉素、半纤维素酶、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
29.如权利要求28的方法，其中所述半纤维素酶是一种或多种选自下组的酶：乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和木糖苷酶。
30.如权利要求26-29中任一项的方法，其中在同时糖化和发酵中同时实施步骤(a)和(b)。
31.如权利要求26-30中任一项的方法，其中所述发酵产物是醇、烷、环烷、烯、氨基酸、气体、异戊二烯、酮、有机酸、或聚酮化合物。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105899543A (zh) * 2013-11-26 2016-08-24 诺维信公司 研磨方法
CN106164284A (zh) * 2014-04-03 2016-11-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于木质纤维素材料的酶促水解和糖的发酵的方法和设备
CN106255760A (zh) * 2014-04-30 2016-12-21 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
US10557157B2 (en) 2014-12-19 2020-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10717995B2 (en) 2012-11-09 2020-07-21 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10731192B2 (en) 2012-11-09 2020-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN112442488A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用
CN113981025A (zh) * 2021-09-24 2022-01-28 闽南师范大学 一种氨基酸酰胺化果胶的制备方法
CN114727643A (zh) * 2019-11-14 2022-07-08 Bcd生物科学有限公司 高产过氧化物淬灭控制的多糖解聚及其组合物

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2601302T3 (da) * 2010-08-06 2021-01-04 Novozymes Inc Fremgangsmåder til nedbrydning eller hydrolyse af et polysaccharid
US9458483B2 (en) 2010-08-12 2016-10-04 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof
WO2012021410A1 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a liquor and uses thereof
EP2710132A1 (en) * 2011-05-19 2014-03-26 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
EP2756091A1 (en) 2011-09-13 2014-07-23 Novozymes North America, Inc. Methods of hydrolyzing and fermenting cellulosic material
WO2013110242A1 (en) * 2012-01-29 2013-08-01 Novozymes A/S Methods for degrading or converting cellulosic material
US20150210991A1 (en) * 2012-09-19 2015-07-30 Novozymes, Inc. Methods For Enhancing The Degradation Or Conversion Of Cellulosic Material
WO2015004099A1 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112016002045A2 (pt) 2013-07-29 2017-08-29 Danisco Us Inc Variantes de enzimas
CN103450352A (zh) * 2013-08-30 2013-12-18 中国农业科学院饲料研究所 几丁质结合蛋白cbp21及其编码基因和应用
EP3322802B1 (en) 2015-07-14 2022-01-19 University of Copenhagen Light-driven system and methods for chemical modification of an organic substrate
KR101716209B1 (ko) * 2015-07-30 2017-03-15 배재대학교 산학협력단 염류토양으로부터 분리된 비브리오 파라헤모리티쿠스의 셀룰로오스 분해활성능
JP6774494B2 (ja) 2016-02-19 2020-10-21 インターコンチネンタル グレート ブランズ エルエルシー バイオマス源から複数の有用なストリームを形成するためのプロセス
WO2018060498A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Norwegian University Of Life Sciences Process for degrading a polysaccharide employing a lytic polysaccharide monooxygenase
ES2680196B1 (es) * 2017-02-01 2019-07-30 Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa Polipeptidos con actividad polisacarido monooxigenasa y su usopara la produccion de azucares fermentables
EP3701037A1 (en) 2017-10-23 2020-09-02 Novozymes A/S Processes for reducing lactic acid in a biofuel fermentation system
CN109609471A (zh) * 2018-11-16 2019-04-12 天津科技大学 胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO14g及其制备方法与应用
CN110487888B (zh) * 2019-05-15 2020-10-16 浙江大学 组合型基质dhb/dhbh在maldi质谱中对还原糖检测中的应用
CN113667035B (zh) * 2021-07-26 2023-02-14 厦门大学 一种苹果果胶低聚糖的制备方法
CN113564135B (zh) * 2021-09-26 2021-12-07 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一种酶活力和稳定性提高的裂解多糖单加氧酶突变体、基因工程菌及应用
WO2023192177A1 (en) * 2022-03-28 2023-10-05 Worcester Polytechnic Institute Method of improved cellulose hydrolysis

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4540664A (en) * 1983-05-13 1985-09-10 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method of saccharifying cellulose

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1682655B1 (en) 2003-10-30 2009-09-02 Novozymes A/S Carbohydrate-binding modules
ES2469840T3 (es) * 2004-01-30 2014-06-20 Novozymes Inc. Polip�ptidos con actividad de mejora celulol�tica y polinucle�tidos que los codifican
WO2005074656A2 (en) * 2004-02-06 2005-08-18 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20080251374A1 (en) * 2007-04-16 2008-10-16 Team Ten, Llc System and method for producing ethanol from paper mill sludge
CN101970651B (zh) * 2007-05-31 2013-10-09 诺维信股份有限公司 用于降解纤维素材料的组合物
WO2008151079A2 (en) * 2007-05-31 2008-12-11 Novozymes, Inc. Compositions for degrading cellulosic material
DK2601302T3 (da) * 2010-08-06 2021-01-04 Novozymes Inc Fremgangsmåder til nedbrydning eller hydrolyse af et polysaccharid

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4540664A (en) * 1983-05-13 1985-09-10 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Method of saccharifying cellulose

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HARRIS: "Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: structure and function of a large, enigmatic family", 《BIOCHEMISTRY》 *
HARRY J. GILBERT: "The Biochemistry and Structural Biology of Plant Cell Wall Deconstruction", 《PLANT PHYSIOLOGY》 *
VALDEIR ARANTES: "Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis", 《BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS》 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10731192B2 (en) 2012-11-09 2020-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11434508B2 (en) 2012-11-09 2022-09-06 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11434507B2 (en) 2012-11-09 2022-09-06 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11427844B2 (en) 2012-11-09 2022-08-30 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10717995B2 (en) 2012-11-09 2020-07-21 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10724057B2 (en) 2012-11-09 2020-07-28 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN105899543A (zh) * 2013-11-26 2016-08-24 诺维信公司 研磨方法
CN106164284A (zh) * 2014-04-03 2016-11-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于木质纤维素材料的酶促水解和糖的发酵的方法和设备
US10907183B2 (en) 2014-04-30 2021-02-02 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10337040B2 (en) 2014-04-30 2019-07-02 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10597689B2 (en) 2014-04-30 2020-03-24 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11773420B2 (en) 2014-04-30 2023-10-03 Versalis S.P.A. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10947573B2 (en) 2014-04-30 2021-03-16 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11512334B2 (en) 2014-04-30 2022-11-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN106255760A (zh) * 2014-04-30 2016-12-21 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
CN106255760B (zh) * 2014-04-30 2020-09-29 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
US11091784B2 (en) 2014-12-16 2021-08-17 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US10557157B2 (en) 2014-12-19 2020-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
CN112442488B (zh) * 2019-08-30 2021-11-23 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用
CN112442488A (zh) * 2019-08-30 2021-03-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用
CN114727643A (zh) * 2019-11-14 2022-07-08 Bcd生物科学有限公司 高产过氧化物淬灭控制的多糖解聚及其组合物
CN113981025A (zh) * 2021-09-24 2022-01-28 闽南师范大学 一种氨基酸酰胺化果胶的制备方法

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