CN112442488B - 一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用 - Google Patents

一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶解性多糖单加氧酶的突变体及其应用，具体涉及一种活性提高的溶解性多糖单加氧酶突变体及其在降解多糖中的应用，属于酶工程领域。本发明通过定向进化的方法获得了一种活性提高的溶解性多糖单加氧酶的突变体。所述突变体能和糖苷水解酶共同作用催化降解底物多糖获得葡萄糖，为高效降解多糖获得葡萄糖奠定了基础。

Description

一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其在降解纤维素中的应用。
背景技术
多糖如纤维素是地球上最丰富的生物质多糖和重要的可再生资源，广泛存在于植物界，每年产量约为8亿吨。纤维素的高效降解是纤维素的规模化开发中需解决的首要问题。
在纤维素生物降解转化工艺中，提高酶解效率是降低纤维素降解成本的关键。世界各国科学家围绕纤维素酶和纤维素的生物降解转化展开了广泛的研究。纤维素降解的关键是高效地断裂其糖苷键。传统的酶法降解纤维素主要是通过糖苷水解酶(纤维素酶)来完成的，即通过水解作用断裂糖苷键。然而，糖苷水解酶降解结晶纤维素的效率较低，严重限制了纤维素的高效利用。
近年来发现的溶解性多糖单加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase，LPMO)是一类作用于结晶多糖的氧化酶，能够通过氧化作用来断裂多糖(如纤维素，几丁质，淀粉等)的糖苷键，使得结晶底物的结构趋于松散，暴露出更多作用位点从而为之后的糖苷水解酶进一步作用提供基础。LPMO的这种氧化作用对多糖的高效降解过程至关重要，是糖苷水解酶(如纤维素酶)的重要助力。LPMO对糖苷键进行氧化断裂，能够帮助解决水解酶难降解结晶纤维素的问题并协同提高纤维素的降解效率。LPMO的这一特性对推动多糖的规模化开发具有非常重要的意义，其相关研究已成为该领域的热点之一。
自然存在的LPMO酶活力不足是其在多糖降解应用中的主要限制性因素。加强其对多糖的氧化活性，提高其与多糖水解酶协同降解多糖(如纤维素)的能力从而增强多糖的降解效率，对推动多糖的资源化利用具有非常重要的现实意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种活性提高的溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种溶解性多糖单加氧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列选自如下的组：
a)对应于SEQ ID NO.1第526位天冬酰胺发生突变；
b)对应于SEQ ID NO.1第469位苯丙氨酸突变为丝氨酸；
c)对应于SEQ ID NO.1第358位丝氨酸突变为脯氨酸；
d)对应于SEQ ID NO.1第150位天冬氨酸突变为天冬酰胺；
e)在a)-d)所述突变体的基础上，氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而得到的具有溶解性多糖单加氧酶活性的衍生蛋白质；
f)来源于哈赫拉菌Hahella chejuensis，与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的相似性大于90％，并具有溶解性多糖单加氧酶活性的蛋白质。
在一个实施方案中，对应于SEQ ID NO.1第526位天冬酰胺突变为丝氨酸，所述溶解性多糖单加氧酶突变体包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对应于SEQ ID NO.1第469位苯丙氨酸突变为丝氨酸的溶解性多糖单加氧酶突变体包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对应于SEQ ID NO.1第358位丝氨酸突变为脯氨酸的溶解性多糖单加氧酶突变体包括如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，对应于SEQ ID NO.1第150位天冬氨酸突变为天冬酰胺的溶解性多糖单加氧酶突变体包括如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的在于提供一种核苷酸序列，其编码权利要求第一目的任一所述的突变体。
在一个实施方案中，编码对应于SEQ ID NO.1第526位天冬酰胺突变为丝氨酸的突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.6所示的序列。
在一个实施方案中，编码对应于SEQ ID NO.1第469位苯丙氨酸突变为丝氨酸的突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.7所示的序列。
在一个实施方案中，编码对应于SEQ ID NO.1第358位丝氨酸突变为脯氨酸的突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.8所示的序列。
在一个实施方案中，编码对应于SEQ ID NO.1第150位天冬氨酸突变为天冬酰胺的突变体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的序列。
本发明的第三个目的在于提供一种表达载体，其包括第二个目的所述的核苷酸序列。
本发明的第四个目的在于提供一种宿主细胞，其包括第三个目的所述的表达载体。
本发明的第五个目的在于提供一种多糖降解方法，其特征在于，以多糖为底物，利用第一目的任一所述溶解性多糖单加氧酶突变体或第三目的所述表达载体或第四目的所述宿主细胞表达产生的溶解性多糖单加氧酶突变体单独氧化或与糖苷水解酶协同进行催化反应。
在一个实施方案中，所述多糖为纤维素、几丁质、淀粉中的一种或几种。
在一个实施方案中，所述糖苷水解酶为纤维素酶、淀粉酶或几丁质酶中的一种或几种。
本发明的第六个目的在于提供第一目的所述溶解性多糖单加氧酶突变体或第三目的所述表达载体或第四目的所述宿主细胞表达产生的溶解性多糖单加氧酶突变体在多糖降解或葡萄糖制备中的应用。
通过上述技术方案，本发明获得了酶活明显提高的溶解性多糖单加氧酶突变体，使得该酶提高其与糖苷水解酶协同降解多糖的能力，从而增强多糖降解酶系对多糖的降解效率，对推动多糖的资源化利用具有非常重要的现实意义。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1：突变体N526S中的氢键S526-E458结构图。
图2：纤维素酶单独或与溶解性多糖单加氧酶协同对纤维素的降解作用。
图3：野生型溶解性多糖单加氧酶及突变体的葡萄糖产量对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进行说明。实施例中纤维素酶、抗坏血酸钠和氯化铜购于上海麦克林生化科技有限公司，其他涉及的试剂材料未特殊说明均来源于商业购买。
突变PCR为本领域技术人员所熟悉的易错PCR。
实施例1溶解性多糖单加氧酶的基因克隆
委托苏州金唯智生物技术有限公司人工合成哈赫拉菌Hahella chejuensis来源的溶解性多糖单加氧酶基因，基因序列如SEQ ID NO.10所示，然后连接到pET-28(+)载体(New England Biolabs公司)，转化入大肠杆菌BL21 Gold(DE3)，于含卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆并培养，抽提质粒，测序确定载体构建成功，命名为pET28a-lpmo。
实施例2活性提高的溶解性多糖单加氧酶突变体筛选
为了提高上述溶解性多糖单加氧酶的酶活，以实施例1中构建得到的重组质粒pET28a-lpmo为模板，设计引物(上游引物：5′-GGTGCCGCGCGGCAGCCATATG-3′；下游引物：5′-TGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTA-3′)，进行易错PCR，对目的基因进行随机突变。经过多轮筛选，最终获得了四株酶活显著提高，且活性稳定的突变体。通过基因测序，得到所述四株突变体的名称及对应突变氨基酸见表1。
表1突变体名称及对应突变氨基酸
Figure BDA0002185707520000041
实施例3重组溶解性单糖多加氧酶及其突变体在大肠杆菌中的表达
接种针挑取野生型和突变体的阳性菌接种于5mL LB培养基中，以37℃、200r/min培养12h，然后以1％(V/V)接种量接种于100mL LB培养基中，以37℃、200r/min培养。当OD600达到0.6时，加入0.4mM的IPTG进行诱导表达，表达条件为20℃低温诱导，200r/min，24h。
实施例4重组溶解性单糖多加氧酶及其突变体活性检测
4℃离心收集实施例3中的菌体，PBS(20mM，pH6.0)重悬，冰浴超声破菌，离心收集上清。取100μL细胞重悬液或破碎上清液与50μL Amplex Red，50μL HRP混合均匀，采用动力学法检测荧光值(λex＝560nm；λem＝590nm)，计算野生型LPMO及突变体全细胞和粗酶液酶活力，突变体酶活力相对于野生型的百分比如表2所示(以野生型酶全细胞酶活力为100％)。
表2野生型LPMO及突变体的全细胞与粗酶液活性
Figure BDA0002185707520000051
实施例5重组多糖单加氧酶及其突变体的纯化
4℃离心收集实施例3中的菌体，PBS(20mM，pH6.0)重悬，冰浴超声破菌，离心收集上清，利用Ni2+层析柱对上述表达的野生型LPMO和突变体N526S进行亲和层析纯化，用咪唑洗脱后经过脱盐柱脱盐，纯化后的蛋白保存在PBS缓冲液中备用。
实施例6重组溶解性单糖多加氧酶及其突变体纯酶的动力学参数测定
将相同浓度的纯酶加入到反应体系中，取不同浓度的底物进行荧光检测，确定每个反应的初始速率。具体检测方法如下：
1.用20mM磷酸盐缓冲液将纯化后的野生型LPMO和突变体N526S稀释至250μg/mL的浓度。
2、反应体系中加入不同浓度的Amplex red作为底物(终浓度分别为0μM、0.12μM、0.18μM、0.24μM、0.37μM、0.49μM、0.73μM、0.98μM、1.46μM、1.95μM、2.93μM、3.9μM、5.86μM、7.81μM、11.72μM、15.63μM、23.44μM、31.25μM、46.88μM、62.5μM、93.75μM、125μM、187.5μM、250μM)，加入上述纯酶和终浓度为7U/mL的HRP，最后加入终浓度2mM的抗坏血酸钠启动反应，在激发波长560nm，发射波长590nm条件下检测30min。
3、根据检测结果计算出不同底物浓度下酶促反应的初速度，计算Km值和Vmax，进一步计算得出kcat值，计算结果如表3所示，N526S的kcat值相比于野生型提高了75.9％，催化效率kcat/Km提高了90.4％
表3野生型LPMO及突变体的动力学参数
Figure BDA0002185707520000061
实施例7溶解性多糖单加氧酶关键位点526的结构分析
LPMO中存在直接参与纤维素结合的CBM结构域(Gaston et al.Journal ofBiological Chemistry,2018,293(34):13006-13015)。该结合区的β-stand(427-436位氨基酸残基)与loop结构(511-526位氨基酸残基)形成相互作用。结构分析显示(图1所示)，野生型LPMO中526位天冬酰胺(N526)和458位谷氨酸(E458)形成氢键相互作用(N526-E458)。该氢键主要形成在E458的侧链羧基和N526的侧链氨基之间。而N526被其他19种氨基酸取代后，均会在不同程度上改变这一相互作用。以本发明中突变体N526S为例，在526位用Ser取代Asn导致N526和E458之间氢键发生变化。突变体N526S中氢键S526-E458形成在S526的主链氨基和E458的主链羰基之间。这一更稳定的氢键稳定了loop511-526的构象，因此加强了loop511-526与其邻近的β-stand427-436的相互作用，最终导致更稳定的纤维素结合面的形成，有利于LPMO与纤维素结合和进一步氧化。因此，以稳定loop511-526与其邻近的β-stand427-436相互作用为目的，而在N526位点发生的任何氨基酸替换，或在该位点与其他位点同时发生的氨基酸替换，而最终影响LPMO降解纤维素活性，对本领域技术人员而言是显而易见。
实施例8纤维素酶单独或与溶解性多糖单加氧酶协同降解纤维素
本实施例对比了纤维素酶单独或与LPMO协同作用，对纤维素的降解能力。所用纤维素酶浓度为100U/mL，野生型LPMO或突变体N526S为250μg/mL，反应体系还包括终浓度为2mM的抗坏血酸钠(Asc)，0.1mM的氯化铜和4％w/v的纤维素。检测结果如图2所示。实验结果表明突变体N526S对纤维素酶降解能力的促进效果比野生型LPMO好。在72h时，突变体N526S和纤维素酶协同降解的葡萄糖产量是纤维素酶单独作用的2.6倍左右，相比于野生型的1.6倍得到显著的提高。
实施例9利用溶解性多糖单加氧酶及其突变体分解纤维素生产葡萄糖
利用20mM磷酸缓冲液(pH6.0)将纯化好的酶液稀释到750μg/mL，取5mL稀释后的野生型和突变体LPMO酶液，加入50U/mL纤维素酶、底物4％(w/v)纤维素、2mM抗坏血酸钠、0.1mM铜离子，在45℃，120r/min反应72h。取样后，样品12000r/min离心后取上清，HPLC检测。
分析HPLC检测结果可得野生型与突变体N526S对应产量如图3所示，野生型溶解性多糖单加氧酶在72h的产量为0.66g/L，而突变体N526S在72h的产量为2.44g/L。突变体产量较野生型提高3.7倍，即突变体在降解纤维素方面更有应用价值，更加适应于工业降解纤维素，对推动纤维素、几丁质、淀粉等多糖的资源化利用具有非常重要的现实意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种溶解性多糖单加氧酶突变体及其应用
<130> 2019.8.19
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 532
<212> PRT
<213> Hahella chejuensis
<400> 1
His Gly Leu Ile Glu Asp Pro Pro Ser Arg Asn Trp Tyr Cys Gly Val
1 5 10 15
Val Thr Lys Pro Asp Glu Ile Asp Asn Gly Thr Ala Glu Tyr Glu Glu
20 25 30
Cys Arg Gly Ala Phe Ala Gln Asp Pro Val Gly Gly Tyr Gln Phe Met
35 40 45
Ser Val Leu Thr His Ala Arg Gly Arg Ala Val Val Asp Pro Leu Pro
50 55 60
Glu His Val Cys Gly Phe Gly Ser Glu Thr Trp Gln Gly Gly Ala Thr
65 70 75 80
Pro Trp Asp Ser Ala Ile Asp Trp Pro Ala Ser Gln Leu Ser Pro Gly
85 90 95
Pro Lys Thr Phe Thr Trp Asn Ile Ser Trp Gly Pro His Phe Asp Asp
100 105 110
Thr Glu Glu Phe Arg Tyr Trp Ile Thr Lys Pro Gly Phe Gln Phe Gln
115 120 125
Ser Gly Arg Ser Leu Thr Trp Asp Asp Phe Glu Glu Asp Ala Phe Cys
130 135 140
Val Leu Asn Tyr Asp Asp Lys Asn Pro Asp Ala Asn Pro Asn Val Glu
145 150 155 160
Pro Asp Lys Ala Asn Ala Arg Phe Arg Thr Thr Cys Asp Ile Pro Glu
165 170 175
Arg Ser Gly Arg His Val Ile Tyr Gly Glu Trp Gly Arg Asn Gln Tyr
180 185 190
Thr Phe Glu Arg Phe His Gly Cys Val Asp Val Val Phe Asp Gly Thr
195 200 205
Asp Pro Gly Asp Gly Glu Asn Val Phe Ala Lys Ile Ala Val Thr Pro
210 215 220
Asp Val Ser Glu Phe Thr Gly Ala Gly Glu Leu Arg Leu Asp Ala Gly
225 230 235 240
Glu Ser Gln Gly Glu Gly Leu Thr Tyr Gln Trp Ser Leu Ser Ser Gln
245 250 255
Ser Pro Ala Leu Tyr Glu Leu Asp Gly Ala Asn Gln Lys Glu Ala Thr
260 265 270
Leu Arg Leu Ala Asn Pro Glu Thr Ala Gly Arg Ile Thr Ile Ser Leu
275 280 285
His Val Ser Asn Ile Asp Asp Ser Asp Asp Ala Ser Val Ala Ile Thr
290 295 300
His Leu Pro Ala Gly Ser Ser Pro Trp Leu Asp Leu Gly Ala Leu Thr
305 310 315 320
Ala Gln Pro Met Thr Leu Ala Ala Gly Asp Lys Val Ser Val Arg Val
325 330 335
Val Leu Gln Asp Gly Arg Asp Leu Tyr Tyr Pro Ala Gln Pro Leu Val
340 345 350
Leu Gly Asp Ala Asp Ser Ala Ala Ala Glu Trp Pro Tyr Ala Leu Ala
355 360 365
Gln Ala Val Asn Ala Ala Gly Ala Glu Ile Lys Val Gly Val Val Asp
370 375 380
Ala Asp Gly Ala Val Asn Pro Val Arg Asp Pro Val Ala Asn Lys Ile
385 390 395 400
Tyr Ala Lys Thr Asp Ala Ala Val Ala Asn Ala Tyr Leu Gln Val Lys
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Thr Gly Glu Thr Phe Asp Tyr Gly Trp Asn Ala Asn Phe Ser Ala Asp
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485 490 495
Leu Ala Ala Asn Gly Gly Thr Ser Thr Phe Gly Phe Ile Gly Lys Lys
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gaaccggctg ctgactgcac cgttgactac gacgttgtta acgaatggga cggtggtttc 1320
cacaccgttg ctaccatcac caacaactct gacgaaccgg ttcgtggtta cgaactggct 1380
tggaccctgg gtaccggtga aaccttcgac tacggttgga acgctaactt ctctgctgac 1440
ggtgctggtg ttaccgctgc tgttccggct acccagtgga acggtaccct ggctgctaac 1500
ggtggtacct ctaccttcgg tttcatcggt aaaaaaggtt ctgctccggc taaaatcccg 1560
gcttctatca aactgaacgg taccgaatgc ggtcagtaa 1599

Claims (6)

1.一种溶解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列选自如下的组：
a)由SEQ ID NO.1第526位天冬酰胺突变为丝氨酸得到的SEQ ID NO.2；
b)由SEQ ID NO.1第469位苯丙氨酸突变为丝氨酸得到的SEQ ID NO.3；
c)由SEQ ID NO.1第358位丝氨酸突变为脯氨酸得到的SEQ ID NO.4；
d)由SEQ ID NO.1第150位天冬氨酸突变为天冬酰胺得到的SEQ ID NO.5。
2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的突变体。
3.一种表达载体，其包括权利要求2所述的多核苷酸序列。
4.一种宿主细胞，其包括权利要求3所述的表达载体。
5.一种纤维素降解方法，其特征在于，以纤维素为底物，利用权利要求1所述溶解性多糖单加氧酶突变体或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞表达产生的溶解性多糖单加氧酶突变体，与纤维素酶协同进行催化反应。
6.权利要求1所述溶解性多糖单加氧酶突变体或权利要求3所述载体或权利要求4所述宿主细胞表达产生的溶解性多糖单加氧酶突变体与纤维素酶协同分解纤维素生产葡萄糖中的应用。
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Title
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