CN116064616A - 一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用 - Google Patents

一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用，纤维素酶基因序列，如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，纤维素酶的底物结合结构域为PKD‑Fn3，KD‑Fn3核苷酸序列如SEQ ID NO.3。本申请利用宏基因组学技术挖掘研究珠穆拉玛峰土壤宏基因组文库中新颖、高效的纤维素酶基因，将筛选到的纤维素酶基因异源表达及蛋白纯化获得纤维素酶后，分析其酶学特性与动力学性质。本研究筛选的新型、高效纤维素酶不仅能丰富现有的纤维素酶资源库，还可为提高木质纤维素利用效率提供参考依据。

Description

一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。
背景技术
纤维素是地球上含量最丰富、分布最广泛的可再生能源物质。利用微生物来源的纤维素酶将纤维素转化为生物燃料或制备具有高附加产值的工业产品，为缓解当前世界所面临的环境污染和能源短缺提供了一个有效途径。然而，现有纤维素酶存在活力低、酶解效率有限、稳定性差、产率低等问题一直制约着纤维素酶的工业化。因此，挖掘新型高效的纤维素酶具有十分重要的意义。尽管利用传统的微生物培养方法已筛选到大量高效产纤维素酶的菌株，但自然环境中的大多数微生物仍不可培养。而宏基因组技术避开了传统的微生物培养方法，直接对所有环境样本中的微生物基因组信息进行研究，打破不可培养微生物的操作壁垒。因此，通过宏基因组技术有望最大限度的挖掘自然界的活性酶基因，获得新颖的纤维素酶。
纤维素是自然界中储量丰富、价格低廉的可再生生物质原料，对解决全球能源危机问题具有巨大应用潜力，但其结构复杂，难以降解，导致综合利用率较低。现阶段工业化生产生物质能源的主要难点在于高效的纤维素生物质降解酶的匮乏。虽然通过微生物体外培养技术已经筛选出许多优良的纤维素酶基因，但仍有大量不可培养微生物的纤维素酶基因有待挖掘。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用。纤维素酶ZFEG1907，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，截短体ZFEG1907t为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域(PKD-Fn3)余下的催化功能序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，纤维素酶的底物结合结构域基因序列PKD-Fn3，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本实验课题避开传统的微生物直接培养方法，利用宏基因组学技术挖掘研究珠穆拉玛峰土壤宏基因组文库中新颖、高效的纤维素酶基因，将筛选到的纤维素酶基因异源表达及蛋白纯化获得纤维素酶后，接着分析其酶学特性与动力学性质。本研究筛选的新型、高效纤维素酶不仅能丰富现有的纤维素酶资源库，还可为提高木质纤维素利用效率提供参考依据。新纤维素酶SEQ ID NO.1对应的酶蛋白发现，用以催化水解纤维素类降解；另外SEQ ID NO.3有助于底物结合。因此，深入挖掘产纤维素酶基因并实现其高效表达具有非常重要的现实意义。
实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种纤维素酶基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
纤维素酶阳性克隆筛选后，纤维素酶阳性亚克隆构建，对阳性亚克隆测序结果使用SnapGene Viewer 4.1.9.0软件进行分析，预测获得一个全长为2118bp的 ORF(核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示)，该序列的GC含量为69％，编码705 个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kDa，预测等电点pI为6.02。将预测的ORF上传到NCBI数据库进行BALSTX同源性比对，结果显示该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第四十四家族(GH44)，且与来源于梨单胞菌科细菌 76.38％的相似性(MBA3515422.1)，与来源于装甲菌门的细菌有73.17％的相似性(MCC2671073.1)，与来源于酸杆菌门的细菌有63.65％的相似性(AHL27901.1)。比对结果表明，该ORF编码的蛋白质是潜在的纤维素酶，命名该基因为 ZFEG1907(核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示)。对该基因编码的纤维素酶 ZFEG1907、GH44家族以及其他GH家族的部分纤维素酶经ClustalW进行多序列比对，并利用MEGA5.1构建系统发育进化树。通过建立进化树，进一步确定 ZFEG1907属于GH44家族。将ZFEG1907序列提交SWISS-PROT数据库分析蛋白质结构，获得相似度最高的模板3ii1.1，与该模板相比一致性为76.25％，该模板对应的蛋白质为GH44家族纤维素酶celM2(ABL11223.1)
优选的是，所述核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域余下的催化功能序列，催化功能序列如SEQ ID NO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
上述任一方案中优选的是，所述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除最后561个碱基对核酸获得。
本发明还公开上述纤维素酶基因的扩增，设计特异性引物zfeg1907-F和zfeg1907-R(引物序列P1907-F(5’-TTT AAG AAG GAG ATA TAC ATA TGC AGA ACC CCG CCGTCAACA TCA-3’)和P1907-R(5’-GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTC GAG TCT CTT AAG AGTTCT GGC GCC CGC-3’)对纤维素酶基因 zfeg1907进行PCR扩增；构建质粒表达蛋白ZFEG1907t使用特异性引物 zfeg1907t-F和zfeg1907t-R对纤维素酶基因zfeg1907进行校正PCR扩增；对目的条带回收纯化。
本发明还公开上述纤维素酶基因的诱导表达和纯化方法，包括：
(1)通过在液体LB培养基中加入诱导剂IPTG对重组质粒 pET-30a(+)-zfeg1907及pET-30a(+)-zfeg1907t进行低温诱导表达；
(2)在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中对重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和 pET-30a(+)-zfeg1907t进行诱导表达，对目的蛋白进行纯化。
经过镍柱亲和层析纯化，成功获得纯纤维素酶ZFEG1907及ZFEG1907t。
本发明还公开上述纤维素重组酶活力及稳定性的影响研究，包括以下方法：
(1)温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响；
(2)pH对纤维素重组酶活力和稳定性的影响；
(3)金属离子和化学试剂对纤维素重组酶活力的影响。
温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响研究结果：纤维素酶ZFEG1907 和截短体ZFEG1907t的酶活性随着温度的升高而逐渐升高，在40℃-50℃范围内均有较高活性，50℃时酶活性均达到最大，当温度高于50℃时，纤维素酶的活性随着温度的升高而不断下降。70℃时纤维素酶ZFEG1907的酶活降低至最高酶活的43％，纤维素酶ZFEG1907t的酶活降低至最高酶活的61％。综上，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的最适反应温度为均为50℃，属于嗜热酶，具有广阔的工业应用前景。
pH对纤维素重组酶活力和稳定性的影响研究结果：纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的最适反应pH均为5.0。纤维素酶ZFEG1907和截短体 ZFEG1907t的pH稳定性大体相似。二者在pH 4.0-8.0相对稳定，均能保持50％以上的活性。纤维素酶ZFEG1907在pH 3.0及pH 9.0的条件下处理后依然保持 40％以上活性，而截短体ZFEG1907t在pH 3.0及pH 9.0条件下处理后在其活性均低于30％以下，说明纤维素酶ZFEG1907的pH稳定性比其截短体ZFEG1907t 强。
金属离子和化学试剂对纤维素重组酶活力的影响研究结果：1mM的金属离子除Cu2+和Mn2+对ZFEG1907和截短体ZFEG1907t酶活力均有一定的抑制作用， Mg2+和Ca2+对ZFEG1907t酶活力均有一定的促进作用外其他金属离子对该酶的活性影响不明显；1％的有机溶剂除乙腈、乙醇、丙酮和甲醇对ZFEG1907酶活力均有一定的抑制作用，乙腈、丙酮、甲醇和乙酸乙酯对ZFEG1907t酶活力均有一定的促进作用外其他化学试剂对该酶的活性影响不明显。
本发明还公开一种纤维素酶的底物结合结构域基因序列，底物结合结构域为PKD-Fn3，PKD-Fn3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或由SEQ ID NO.3所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和 /或缺失和/或添加和/或移位。
利用PFAM网站预测ZFEG1907可能存在的催化以及底物结合相关结构域，并同时预测GH44家族其他的纤维素酶结构域，与ZFEG1907进行比较。结果表明，ZFEG1907蛋白中除了含有GH44家族的催化结构域外还含有PKD及Fn3 二个结构域。
本发明还公开一种上述所述的底物结合结构域基因序列在促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性、提高酶的催化效率方面的应用。
优选的是，所述底物至少包括羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、魔芋胶(KGM)、地衣多糖(Lichenan)。实验结果显示，PKD-Fn3结构域能够通过提高对CMC、 KGM和Lichenan三种底物的结合能力来提高纤维素酶ZFEG1907的催化效率。因此，纤维素酶ZFEG1907的PKD-Fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。
本发明还公开一种纤维素酶，其氨基酸序列由上述SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中任意一项所述的核苷酸序列编码，或由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
本发明还公开一种重组载体，含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 中任意一项所示的核苷酸序列。所述的载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。本发明中，编码纤维素酶的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。
优选的是，该重组载体的表达载体为大肠杆菌。在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) 中对重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和pET-30a(+)-zfeg1907t进行诱导表达。
本发明还公开一种上述所述的纤维素酶在降解羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖或微晶纤维素、羧甲基纤维素钠中的应用。最适条件下测定的纤维素酶 ZFEG1907和截短体ZFEG1907t底物特异性检测，纤维素酶ZFEG1907和截短体 ZFEG1907t表现出相似的底物特异性。两酶只在羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖、微晶纤维素这四种底物中表现出降解活性，且对魔芋胶的活性最高，其次是地衣多糖和羧甲基纤维素钠，而对刺槐豆胶、木聚糖、葡聚糖、茯苓多糖、瓜尔豆胶、几丁质、pNPG没有降解活性。
本发明具有以下有益效果：
本文以西藏土壤微生物宏基因组为研究对象，通过功能筛选方法从土壤宏基因组文库中挖掘纤维素酶阳性克隆，应用生物信息学分析克隆中潜在的纤维素酶基因，并利用生化实验进一步对纤维素水解酶进行酶学及结构域功能研究。为纤维素酶在工业上的应用提供坚实的理论基础。主要研究内容及结果分述如下：
(1)基于功能宏基因组学策略从土壤文库中获得一个新型纤维素酶基因，命名为zfeg1907，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因全长2118bp，序列 GC含量为69％，编码705个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kDa，预测等电点pI为6.02；同源性分析结果显示，该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第44家族(GH44)，与来源于紫单胞菌科细菌的水解酶有76.38％的同源性。蛋白结构预测表明，ZFEG1907蛋白中除了含有GH44家族的催化结构域外还含有PKD及Fn3结构域。
(2)了阐明ZFEG1907蛋白中PKD-Fn3结构域在该纤维素酶结构中的功能，构建PKD-Fn3结构域缺失型纤维素酶ZFEG1907t，核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。通过将目的基因片段与表达载体pET-30a(+)连接，在蛋白羧基端融合6× His标签，选用E.coli BL21(DE3)作为蛋白的表达宿主菌进行目的基因的异源表达。经过镍柱亲和纯化，分别得到ZFEG1907以及ZFEG1907t目的蛋白， SDS-PAGE电泳结果显示分子量分别与预测值大小一致。
(3)重组蛋白酶学性质结果显示，纤维素酶ZFEG1907及截短体ZFEG1907t 的最适温度均为50℃，在40℃以下热稳定性较好。二者的最适pH均为5.0，在中性及偏酸性条件(pH4.0-6.0)下有较高的酶活，且稳定性较好，是一个嗜酸性酶。Cu2+和Mn2+(1mM和10mM)对两者均有明显的抑制作用，Mg2+(1mM及 10mM)和Ca2+(1mM)对ZFEG1907t酶活力均有明显的促进作用，K+(10mM) 对ZFEG1907有明显的促进作用；1％乙腈和1％甲醇对纤维素酶ZFEG1907有明显的抑制作用，15％的有机溶剂对ZFEG1907及ZFEG1907t酶均有一定的抑制作用，且对ZFEG1907酶的抑制作用更显著。而SDS作为一种强变性剂，无论浓度高低均对ZFEG1907和ZFEG1907t的酶活力均有明显抑制作用。100mM的咪唑显著抑制ZFEG1907和ZFEG1907t的活性。
(4)对重组蛋白酶进行底物特异性及动力学参数分析，结果显示ZFEG1907 及截短体ZFEG1907t表现出相似的底物特异性，两者只在羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖、微晶纤维素这4种底物中表现出水解活性，且对魔芋胶的活性最高。对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物做酶促动力学参数测定，结果显示以羧甲基纤维素钠为反应底物时，纤维素酶ZFEG1907的Km值比 ZFEG1907t低42.27％，kcat/Km值比ZFEG1907t高35.85％。以魔芋胶为反应底物时，纤维素酶ZFEG1907的Km值比ZFEG1907t低33.79％，kcat/Km值比ZFEG1907t高 70.08％；以地衣多糖为反应底物时，纤维素酶ZFEG1907的Km值比ZFEG1907t低61.62％，kcat/Km值比ZFEG1907t高92.73％。以上结果表明：PKD-Fn3结构域能够通过提高对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物的结合能力来提高纤维素酶ZFEG1907的催化效率。纤维素酶ZFEG1907(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和截短体ZFEG1907t(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的最适反应温度为均为50℃，属于嗜热酶，具有广阔的工业应用前景。
(5)综上，通过基于功能宏基因组学策略从西藏土壤文库中获得一个新型纤维素酶基因zfeg1907，其蛋白ZFEG1907中除了含有GH44家族的催化结构域外还含有PKD-Fn3结构域。将目的基因与载体pET-30a(+)连接，在E.coli BL21(DE3)中异源表达得到蛋白ZFEG1907和PKD-Fn3结构域缺失型蛋白 ZFEG1907t。重组蛋白酶学特性研究结果表明PKD-Fn3结构域对纤维素酶的常规特性(最适温度、最适pH、金属离子和化学试剂耐受性、底物特异性)几乎没有影响。但PKD-Fn3结构域能够通过提高对羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖三种底物的结合能力来提高纤维素酶ZFEG1907的催化效率。所以纤维素酶 ZFEG1907的PKD-Fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。PKD-Fn3结构域(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)能够通过提高对CMC、KGM和Lichenan三种底物的结合能力来提高纤维素酶ZFEG1907 的催化效率。因此，纤维素酶ZFEG1907的PKD-Fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。
附图说明
图1为纤维素酶活性阳性克隆的功能筛选：图中A为宏基因组文库中筛到的阳性克隆，B为对第一轮的阳性克隆进行二次筛选；
图2为构建含有纤维素酶的阳性亚克隆，图中A为用Sau3A I对阳性克隆进行限制性内切酶消化，B为用酶BamH I对阳性亚克隆进行限制性内切酶消化， C为2000-3000bpDNA片段插入阳性亚克隆的功能筛选；
图3为ZFEG1907的进化树分析；
图4为ZFEG1907的多重序列比图；
图5为ZFEG1907与GH44家族其他纤维素酶结构域比较；
图6为zfeg1907及zfeg1907t的琼脂糖凝胶电泳检测；1：zfeg1907 PCR扩增产物；2：zfeg1907t PCR扩增产物；3：重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907酶切验证；4：重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907t酶切验证；M：DNA Marker；
图7为ZFEG1907截短的方案和SDS-PAGE分析；图中A：纯化ZFEG1907 和ZFEG1907t的SDS-PAGE分析；M：蛋白分子量标记；Lane 1：ZFEG1907纯化重组蛋白，预期分子量为75.3KDa；Lane 2：截短ZFEG1907的纯化重组蛋白，显示预期分子量为56.8KDa，图中B为截短型纤维素酶ZFEG1907t的构建方案；
图8为温度对ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响(20-90℃)；
图9为温度对ZFEG1907及ZFEG1907t酶稳定性的影响；
图10为pH对ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响(pH 2.0-9.0)；
图11为pH对ZFEG1907及ZFEG1907t酶稳定性的影响；
图12为不同金属离子(1mM)对纤维素酶ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响；
图13为不同金属离子(10mM)对纤维素酶ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响；
图14为不同化学试剂(1％)对纤维素酶ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响；
图15为不同化学试剂(15％)对ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响；
图16为不同有机物对ZFEG1907和ZFEG1907t酶活力的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。本发明对试验中所使用的材料以及试验方法进行一般性或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法等。
实施例1
1.1纤维素酶阳性克隆筛选
西藏文库：土壤样品来自西藏珠穆朗玛峰(北纬28.21度，东经86.56度，海拔4276米)地区。该地区地形险峻，环境条件独特，气候变化敏感，土壤中微生物种类丰富、数量繁多。
西藏土壤宏基因组中约含1.04×107个文库克隆，插入的目的片段平均38000 bp，囊括了数量众多的微生物基因资源。本课题基于功能宏基因组筛选策略以 CMC-Na(羟甲基纤维素钠)为筛选底物对西藏土壤宏基因组文库进行纤维素酶基因挖掘，筛选了约200万个文库菌克隆后，获得一个单菌落周围有水解圈的阳性克隆。对该阳性克隆进行二次筛选验证，将该克隆子划线验证其周围依然有透明水解圈，确认该克隆是产纤维素酶的阳性克隆，如图1所示。
筛选原理：本实验对产纤维素酶微生物选用的筛选底物是羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)。由于产纤维素酶微生物可以分解培养基中的CMC-Na，而其他微生物无法分解CMC-Na。经过酸性刚果红染色液染色后，由于刚果红与CMC-Na 结合可形成红色复合物而不能与纤维素酶水解产物纤维二糖和葡萄糖等结合，因此经染色脱色以后，产纤维素酶微生物的菌落周围就会显现出透明水解圈。
筛选方法：经前期预实验确定文库菌合适的稀释倍数后，将文库菌稀释后均匀涂布于固体LB培养平板中，待其长出菌落后倒一层筛选培养基，经染色脱色后，通过观察菌落周围有无透明水解圈来寻找产纤维素酶的阳性克隆。
将适度稀释的菌液均匀涂布在3块LB固体培养平板上(含抗生素Amp和 Chl，终浓度分别为100μg/mL和12.5μg/mL。这样可将该编号文库菌所包含的约5000克隆覆盖完全)，置于37℃恒温培养箱中培养2-3d后，在菌落上层再倒一层筛选培养基，然后置于同样条件下培养1-2d。培养结束后使用酸性刚果红染色液染色40-60min，再用氯化钠溶液脱色40-60min，弃去脱色液后在光线良好的环境中进行观察(若经脱色后未观察到透明水解圈，可能是由于部分纤维素酶活性较弱的缘故。可延长脱色时间再观察)，如果培养平板上的单菌落周围中出现透明水解圈，则用已灭菌的枪头将其挑出再次划线于LB固体培养平板上，待菌落长出后选挑单个菌落37℃培养，并将平板上对应的单菌落用自来水冲洗干净，采用上述染色脱色方法，观察所挑的单菌落周围是否依然有透明水解圈，用于排除假阳性的现象。确证是阳性克隆后，将其于37℃，225r/min过夜震荡培养后保存在终浓度20％的甘油中，并-80℃冻存。
1.2纤维素酶亚克隆的构建
提取纤维素酶阳性克隆质粒并部分酶切，回收其中2-3kb之间的DNA片段，部分酶切的电泳检测结果如图2A所示，酶切后的电泳条带呈弥散状。用T4连接酶将酶切回收的DNA片段与酶切回收的pWEB-TNCTM载体连接来构建亚克隆。采用同样的刚果红染色法，从中挑出具有纤维素酶活性的阳性亚克隆，如图 2C所示。对阳性亚克隆进行二次筛选，再次划线确认活性后提取亚克隆质粒酶切电泳验证，酶切验证电泳结果如图2B所示，泳道2是对阳性亚克隆质粒进行 BamH I酶切的质粒电泳结果，电泳条带从大至小依次对应5812bp的线性质粒 pWEB-TNCTM片段及大小约2000bp的纤维素酶基因插入片段，插入片段条带大小符合预期(2000-3000bp)。酶切验证纤维素酶阳性亚克隆构建成功。将已酶切验证成功的阳性亚克隆质粒送擎科公司测序。
1.2.1亚克隆载体的制备
pWEB-TNCTM菌株在LB固体培养基(含抗生素Amp和Chl，终浓度分别为 100μg/mL和12.5μg/mL)上划线，挑取单菌落于液体LB液体培养基中37℃，225 r/min过夜震荡摇浓，按照质粒小提试剂盒说明书提取pWEB-TNCTM载体质粒。将经过琼脂糖凝胶电泳检测后的载体质粒用限制性内切酶BamH I进行酶切处理，得到线性化的pWEB-TNCTM质粒。酶切反应温度37℃，时间60min，酶切体系(10μL)如表1：
表1 pWEB-TNCTM质粒的酶切
Figure BDA0003933608480000091
反应结束后65℃、20min使酶灭活，对其电泳实验并回收含有目的基因的条带，利用凝胶回收试剂盒纯化。
1.2.2阳性克隆质粒的部分酶切
使用已提前用FD buffer稀释500倍的限制性内切酶Sau3A I对纤维素酶阳性克隆质粒进行不完全酶切。酶切反应温度37℃，反应时间40min。酶切体系 (10μL)如表2：
表2阳性克隆的部分酶切
Figure BDA0003933608480000101
反应结束65℃，20min灭活处理。然后对酶切体系进行琼脂糖凝胶电泳，参照DNAMaker切胶回收其中2000-3000bp的DNA片段。
1.2.3目的片段与载体的连接、转化
用T4连接酶将纯化后的pWEB-TNCTM载体与回收的2000-3000bp的 DNA片段连接。连接体系(10μL)如表3：
表3目的片段与载体的连接体系
Figure BDA0003933608480000102
将连接体系于16℃孵育18-20h后65℃，20min处理终止反应。然后将连接体系置于葡萄糖-琼脂糖凝胶中脱盐40-60min。将冰上脱盐完成的连接体系与50μL的大肠杆菌E.coli EPI100感受态混匀后转移至预冷的电击杯中1.5 kV电击。电击后迅速加入1mL的无抗LB，混匀后再转至无菌EP管中， 37℃，225r/r/min孵育50-60min，最后将孵育的菌液全部涂布于LB培养平板上，于37℃条件下培养2-3d后，采用1.2.1中的筛选方法筛选纤维素酶阳性亚克隆。
1.2.4亚克隆质粒测序
将阳性亚克隆在液体LB中37℃，227rpm培养10-12h后提质粒，使用 BamH I对亚克隆质粒酶切处理，酶切体系见表4。37℃，30min酶切完成后 65℃，20min灭活处理。电泳检测插入的目的片段是否正确。若插入的片段正确无误后将获得的纤维素酶阳性克隆质粒使用载体引物pWEBcexuUS (5’-AAATAGGGGTTCCGCGCA-3’)和pWEBcexuUS(5’-ATCCAGGGTGACGGTGCC-3’)进行送擎科公司测序。
表4 BamH I酶切亚克隆质粒
Figure BDA0003933608480000111
1.3潜在纤维素酶基因的序列分析
对阳性亚克隆测序结果使用SnapGene Viewer 4.1.9.0软件进行分析，预测获得一个全长为2118bp的ORF(序列信息见SEQ ID NO.1所示))，该序列的 GC含量为69％，编码705个氨基酸组成的蛋白，预测其分子量为75.3kDa，预测等电点pI为6.02。将预测的ORF上传到NCBI数据库进行BALSTX同源性比对，结果显示该基因所编码的蛋白属于糖苷水解酶第四十四家族(GH44)，且与来源于梨单胞菌科细菌76.38％的相似性(MBA3515422.1)，与来源于装甲菌门的细菌有73.17％的相似性(MCC2671073.1)，与来源于酸杆菌门的细菌有63.65％的相似性(AHL27901.1)。比对结果表明，该ORF编码的蛋白质是潜在的纤维素酶，命名该基因为zfeg1907。对该基因编码的纤维素酶ZFEG1907、GH44家族以及其他GH家族的部分纤维素酶经ClustalW进行多序列比对，并利用 MEGA5.1构建系统发育进化树。如图3所示，通过建立进化树，进一步确定 ZFEG1907属于GH44家族。
实施例2
2.1 ZFEG1907结构域预测以及多重比对分析
将ZFEG1907序列即SEQ ID NO.1所示序列提交SWISS-PROT数据库分析蛋白质结构，获得相似度最高的模板3ii1.1，与该模板相比一致性为76.25％，该模板对应的蛋白质为GH44家族纤维素酶celM2(ABL11223.1)。在此基础上，以该模板结构作为参考结构，利用Clustal X 2.0和ESPript 3.0将ZFEG1907与部分 GH44家族纤维素酶蛋白进行多重比对。结果如图4所示，由图可知纤维素酶 ZFEG1907有14个α螺旋，26个β折叠，在核心催化结构域(58-304氨基酸部分) 与GH44家族部分相似度较高，520位氨基酸之后的序列，与GH44家族的其他的蛋白质相似度均较低。推测在核心的催化结构域之外，ZFEG1907可能还存在其他的结构域，在催化过程起到特定的作用。
因此，利用PFAM网站预测ZFEG1907可能存在的催化以及底物结合相关结构域，并同时预测GH44家族其他的纤维素酶结构域，与ZFEG1907进行比较。结果表明，ZFEG1907蛋白中除了含有GH44家族的催化结构域外还含有PKD 及Fn3二个结构域，如图5及表5所示，与该结构域相似的仅有同样来自不可培养微生物的纤维素酶Lc-celH(AHL27901.1)。然而，Lc-celH的研究仅停留于基因层面，并未深入研究该酶的性质以及相关PKD-Fn3结构域的特定功能，PKD-Fn3 结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
表5 ZFEG1907的PFAM预测
Figure BDA0003933608480000121
实施例3
3.1纤维素酶基因的扩增：
为了构建质粒表达蛋白ZFEG1907，设计特异性引物zfeg1907-F和 zfeg1907-R(酶切位点Nde I和Xho I)对纤维素酶基因zfeg1907进行PCR扩增。为了构建质粒表达蛋白ZFEG1907t使用特异性引物zfeg1907t-F和zfeg1907t-R (酶切位点Nde I和Xho I)对纤维素酶基因zfeg1907进行校正PCR扩增(使用 zfeg1907作为模板去除最后561个碱基对核酸即纤维素酶ZFEG1907 C末端的最后186个氨基酸，截短方案如图7B所示)。PCR扩增反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳实验。PCR扩增产物电泳结果如图6泳道1及泳道2所示，泳道1为zfeg1907基因PCR扩增产物电泳结果，2000bp附近明亮条带对应2118bp长度的纤维素酶zfeg1907基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，泳道2为zfeg1907t 基因PCR扩增产物电泳结果，1500bp附近明亮条带对应1557bp长度的纤维素酶zfeg1907t基因，核苷酸序列如SEQID NO.2所示。确认PCR扩增结果无误后对目的条带回收纯化。
利用Primer软件设计PCR扩增zfeg1907及zfeg1907t基因所用的引物，并在zfeg1907及zfeg1907t的两端分别引入Nde I与Xho I酶切位点，将组氨酸标签留在C端，便于目的蛋白共同表达。引物具体序列如表6。
表6扩增基因zfeg1907及zfeg1907t的引物
Figure 1
序列中黑体及下划线部分为限制性内切酶识别位点。
以成功构建的阳性亚克隆质粒为PCR模板，以表7中zfeg1907-F、zfeg1907-R、zfeg1907t-F、zfeg1907t-R为上下游引物，分别扩增目的基因zfeg1907及zfeg1907t PCR扩增体系(50μL)如下：
表7纤维素酶基因PCR扩增体系
Figure BDA0003933608480000131
目的基因zfeg1907及zfeg1907t的PCR扩增程序如下：
Figure BDA0003933608480000132
PCR扩增反应结束后，将PCR扩增产物进行电泳实验，检测扩增的目的基因片段并将PCR扩增产物纯化。
实施例4
4.1重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和pET-30a(+)-zfeg1907t的构建
对构建的重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907及pET-30a(+)-zfeg1907t进行双酶切电泳验证，结果如图6泳道3及泳道4所示。泳道3是对重组质粒 pET-30a(+)-zfeg1907进行NdeI和Xho I双酶切的质粒电泳结果，电泳条带从大至小对应5422bp的线性质粒pET-30a(+)片段及2118bp的zfeg1907插入片段；泳道4是对重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907t进行Nde I和Xho I双酶切的质粒电泳结果，电泳条带从大至小对应5422bp kb线性质粒pET-30a(+)片段及1559bp的zfeg1907t插入片段。酶切验证重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和 pET-30a(+)-zfeg1907t构建成功。
将酶切验证成功的pET-30a(+)-zfeg1907和pET-30a(+)-zfeg1907t质粒送擎科公司测序，测序结果分别与zfeg1907及zfeg1907t基因序列进行比对，结果100％吻合。测序验证重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907及pET-30a(+)-zfeg1907t构建成功。
4.1.1重组载体与目的片段的连接与转化
将胶回收后获得的载体与目标DNA片段，按照表8和表9的连接体系加入各组分，用枪头轻柔吹洗若干次混匀体系。将上述连接体系放置于16℃环境中孵育18-20h后取出，置于65℃条件下灭活20min，然后将连接体系转化到大肠杆菌E.coli EPI100中，待长出单菌落后，挑取单菌落在液体LB中37℃，225 r/min培养10-12h后提质粒，使用限制性内切酶NdeI和Xho I酶切验证(表10)，电泳检测，对插入片段正确的重组质粒送擎科公司测序，并将序列正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，构建重组表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+)-zfeg1907和E.coli BL21(DE3)/pET-30a(+) -zfeg1907t。
表8 pET-30a(+)载体与zfeg1907基因片段的连接
Figure BDA0003933608480000141
表9 pET-30a(+)载体与zfeg1907t基因片段的连接
Figure BDA0003933608480000142
表10双酶切重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907/ET-30a(+)-zfeg1907t
Figure BDA0003933608480000143
Figure BDA0003933608480000151
4.2纤维素酶基因的诱导表达和纯化
通过在液体LB培养基中加入诱导剂IPTG对重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907 及pET-30a(+)-zfeg1907t进行低温诱导表达，分别制备粗酶液。利用0.4％CMC-Na (羧甲基纤维素钠)做底物DNS法测定纤维素酶活力(99℃、15min灭活的纤维素酶作对照)，结果显示非诱导表达组没有纤维素酶活力，而诱导组均检测到纤维素酶酶活力。
在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中对重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和 pET-30a(+)-zfeg1907t进行诱导表达，由于重组质粒载体上带有6个His标签，根据Ni2+与带有His标签的重组蛋白亲和力原理，对目的蛋白进行纯化。通过 SDS-PAGE电泳检测，纯化。蛋白SDS-PAGE电泳结果如图7A所示，泳道1为纯化后的纤维素酶ZFEG1907的电泳结果，70.0KDa附近条带对应75.3KDa的纤维素酶ZFEG1907蛋白，说明纤维素重组酶ZFEG1907在大肠杆菌中成功表达；泳道2为纯化后的纤维素酶ZFBG1907t的电泳结果，55KDa附近条带对应 56.8KDa的纤维素酶ZFEG1907蛋白，说明纤维素重组酶ZFEG1907t在大肠杆菌中成功表达。结果显示经过镍柱亲和层析纯化，成功获得纯纤维素酶 ZFEG1907及ZFEG1907t，核苷酸序列如SEQ IDNO.1和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.21重组质粒pET-30a(+)-zfeg1907和pET-30a(+)-zfeg1907t的诱导表达
分别将重组大肠杆菌菌E.coli BL21/pET-30a(+)-zfeg1907和E.coli BL21/pET-30a(+)-zfeg1907t在含Kanamycin抗性的液体LB培养基中过夜摇浓，按1∶100的接种比例转接至400mL液体LB培养基中(Kanamycin抗性)，37℃， 225r/min培养2.5-3h，使其OD600达到0.4-0.6，在冰水中下放置，待菌体稍冷后加入诱导剂IPTG(终浓度为0.4mM)，20℃，180r/min发酵20-24h。
4.2.2纤维素酶的亲和层析纯化
将诱导表达完成的发酵液转移至已预冷的干净离心瓶中，置于已预冷的低温高速离心机中4500r/min，离心15min，轻轻倒掉上清液，加10ml Lysisi buffer 将菌体悬起，然后转移到离心管中；使用超声波细胞破碎仪(探头直径6mm) 将菌体破碎裂解，处理条件为：总工作20min，冰浴工作2s，停歇2.5s，最后将破碎的菌体经4℃、12000r/min离心30min将上清与沉淀分离后，收集上清液于4℃保存。上清液即诱导表达得到的粗酶。由于纤维素酶zfeg1907和zfeg1907t 基因上已带有His标签，可以利用偶联镍离子的亲和层析法对粗酶液进行纯化，具体步骤如下。
(1)用5-10个柱体积的ddH2O冲洗层析柱；
(2)用5-10个柱体积的Lysisi buffer冲洗层析柱，以平衡镍柱；
(3)将粗酶液加入层析柱中，加样时注意控制层析柱中酶液流速，确保酶液中的His与Ni2+充分结合；
(4)用5-10个柱体积的Washing buffer过柱，洗去粗酶中的杂质；
(5)先后用不同浓度的咪唑溶液(50mM、100mM、200mM)过柱，收集各组分；
(6)洗脱完成后用5-10个柱体积ddH2O，再用3-5个柱体积的20％乙醇过柱，留3mL乙醇封柱。
实施例5纤维素重组酶活力及稳定性的影响试验
5.1温度对纤维素重组酶活力及稳定性的影响
结果如图8所示，纤维素酶ZFEG1907(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示) 和截短体ZFEG1907t(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的酶活性随着温度的升高而逐渐升高，在40℃-50℃范围内均有较高活性，50℃时酶活性均达到最大，当温度高于50℃时，纤维素酶的活性随着温度的升高而不断下降。70℃时纤维素酶ZFEG1907的酶活降低至最高酶活的43％，纤维素酶ZFEG1907t的酶活降低至最高酶活的61％。综上，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的最适反应温度为均为50℃，属于嗜热酶，具有广阔的工业应用前景。
酶的温度稳定性结果如图9所示，在20-40℃条件下孵育1h，ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的残余纤维素酶活性均能保持80％以上的活性，当温度高于 50℃时，两酶的酶活力开始呈现明显下降趋势，如在60℃条件下孵育1h后两酶的残余酶活均低于10％，基本处于失活状态，说明两酶在低于40℃时热稳定性良好。
本实验采用经典的Miller方法测定纤维素酶水解活性。该实验方法采用 DNS(3，5-二硝基水杨酸)试剂定量检测反应体系中还原糖的含量，通过测定多糖底物所释放的还原糖量，来确定纤维素酶对多糖底物的水解活性。其主要实验原理为：纤维素酶催化纤维素水解后产生葡萄糖、纤维二糖等还原糖。纤维素酶催化羧甲基纤维素钠(CMC-Na)多糖底物水解后产生葡萄糖、纤维二糖等还原糖。还原糖将3，5-二硝基水杨酸(DNS)中的硝基还原为氨基，生成产物3-氨基 -5-硝基水杨酸。该产物煮沸后中表现为棕红色，在OD540处有最大吸收峰，且在一定浓度范围内，棕红色的深浅程度与样品中的还原糖含量成正比。用比色法测定还原糖含量，间接测定出纤维素酶的活力。
实验方法
基于4.2.1的DNS显色原理，纤维素酶活力测定的具体操作为：用移液枪取 60μL对应pH的0.4％(w/v)CMC-Na溶液于PCR管中，加入5μL稀释好的预冷酶液后充分混匀(以上操作全部于冰上操作)，以99℃、15min已灭活的酶液做对照。置于PCR仪中50℃反应30min。反应结束后向处于冰上的反应体系加入60μL的DNS溶液充分混匀，在99℃反应15min后立即将PCR管置于到冰上。取100μL的反应液加入酶标板中，轻柔混匀后测OD540值。实验组OD540值减去对照组OD540值，每组实验平行3次。计算平均值。根据葡萄糖标准曲线，计算纤维素酶的酶活力。
酶活力(U)定义为：在特定条件下(25℃，其他条件为最适条件)单位时间内分解多糖底物产生1μmol葡萄糖所需的酶量。
酶活力计算公式：
Figure BDA0003933608480000171
其中：C-纯化后酶液浓度(μg/mL)；V-加入反应体系酶液的体积(μL)；M- 葡萄糖的摩尔质量；N-纯化后酶液的稀释倍数；m-还原糖含量(mg)(由OD540值从标准曲线获取)；T-试验反应时间(min)。
5.2 pH对纤维素重组酶活力和稳定性的影响
本实验中pH 3.0-6.0的缓冲液由柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系配制，pH 6.0-8.0 的缓冲液由磷酸盐缓冲体系进行配置，pH 8.0-9.0的缓冲液由Tris-Hcl溶液配置。纤维素蛋白酶是两性化合物，其结构中大都含有大量的碱性氨基和酸性羧基，因此，蛋白酶在不同的pH环境中会呈现不同的解离状态。其中，在最适合催化反应的解离状态下的溶液pH值即为该酶的最适反应pH。通过一系列的酶促反应，实验结果如图10，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的最适反应pH均为5.0。pH超过5.0，酶活力均随pH值升高而降低；pH值低于5.0，酶活力随 pH值降低而减少，在pH 8.0-9.0时，ZFEG1907t有30％的活力残余，而ZFEG1907仅有有10％的活力残余。
纤维素重组酶的pH稳定性结果如图11所示，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t的pH稳定性大体相似。二者在pH 4.0-8.0相对稳定，均能保持50％以上的活性。纤维素酶ZFEG1907在pH 3.0及pH 9.0的条件下处理后依然保持 40％以上活性，而截短体ZFEG1907t在pH 3.0及pH 9.0条件下处理后在其活性均低于30％以下，说明纤维素酶ZFEG1907的pH稳定性比其截短体ZFEG1907t 强。
5.3温度、pH、金属离子和化学试剂对重组酶的影响
将适度稀释的纤维素酶样品即纯化后的纤维素酶酶液与pH5.0的0.4％(w/v)CMC-Na底物混匀，分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的环境中充分反应，通过测定不同温度条件下的相对酶活力研究不同温度对纤维素酶活力的影响(酶活力测定方法采用DNS方法测定)。以最高酶活力为100％，其余数值按照百分比换算绘制相对酶活力曲线。
经适度稀释的纤维素酶样品与0.4％(w/v)CMC-Na溶液混匀后分别处于 pH2.0-9.0的缓冲液中(梯度为1个pH单位)在50℃条件下反应，通过测定相对酶活研究不同pH对纤维素酶活力的影响。以最高酶活力为100％，其余数值按照百分比换算绘制相对酶活力曲线。
将适度稀释的纤维素酶样品在20-80℃的温度条件下孵育1h，将孵育后的酶液与pH5.0的0.4％(w/v)CMC-Na底物混匀进行酶促反应，通过测定残余酶活研究纤维素酶生物温度稳定性。测定酶活性，以4℃放置的酶液的酶活性为100％。
将适度稀释的纤维素酶样品分别置于pH2.0-9.0缓冲溶液(梯度为1个pH 单位)中4℃孵育2h后与0.4％(w/v)CMC-Na溶液混匀在50℃条件下反应，通过测定残余酶活力研究其pH稳定性。按照4.2.2的方法测定酶活性，以4℃放置的酶液的酶活性为100％。
在适度稀释的纤维素酶样品与0.4％(w/v)CMC-Na的反应体系中加入终浓度为1mM和10mM的金属离子(包括：Li+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、K+、Na+、Cu2+、 Fe3+、Zn2+)，在最适酶促反应条件下通过测定其残余酶活力研究不同金属离子对纤维素酶活的影响。对照为未添加任何金属离子，酶活设定为100％。
将适度稀释的纤维素酶样品与0.4％(w/v)CMC-Na的反应体系中分别加入终浓度分别为1％和15％的化学试剂(包括：DMSO，DMF，乙腈，乙醇，甲醇，异丙醇，丙酮和乙酸乙酯)，终浓度分别为1mM和10mM的EDTA、SDS、尿素、咪唑，最适酶促反应条件下通过测定其残余酶活力研究化学试剂对纤维素酶活的影响。对照为未添加任化学试剂的，酶活设定为100％。
5.3金属离子和化学试剂对纤维素重组酶活力的影响
不同金属离子及化学试剂会导致纤维素酶结构的变化，进而对纤维素酶的活力产生促进或抑制的作用。在反应体系中加入各种金属离子，使其终浓度分别为 1mM和10mM，通过测定酶促反应中残余酶活力来反应不同金属离子对ZFEG1907和截短体ZFEG1907t酶活力的影响。如图12所示，1mM的金属离子除Cu2+和Mn2+对ZFEG1907和截短体ZFEG1907t酶活力均有一定的抑制作用， Mg2+和Ca2+对ZFEG1907t酶活力均有一定的促进作用外其他金属离子对该酶的活性影响不明显。如图13所示10mM的金属离子除Cu2+、Li+和Mn2+对ZFEG1907 和截短体ZFEG1907t酶活力均有一定的抑制作用，Zn2+、K+和Ca2+对ZFEG1907 酶活力均有一定的促进作用，Mg2+和Ca2+对ZFEG1907t酶活力均有一定的促进作用外其他金属离子对该酶的活性影响不明显。因此，ZFEG1907和截短体 ZFEG1907t对这些金属离子表现出中度耐受性。金属离子可以通过与某些氨基酸的亲核残基形成共价键来调节酶的活性。如果这些氨基酸结合到酶的活性中心，形成的金属氨基酸复合物将对酶的活性产生抑制作用。一些金属离子可以增强酶的活性。例如钙与电子供体氨基酸残基和肽键中的氮原子相互作用，这些氮原子不一定并入酶活性中心。
在反应体系中加入各种有机试剂，使其终浓度分别为1％和15％，通过测定酶促反应中残余酶活力来反应不同有机试剂对ZFEG1907和截短体ZFEG1907t 酶活力的影响。如图14所示，1％的有机溶剂除乙腈、乙醇、丙酮和甲醇对 ZFEG1907酶活力均有一定的抑制作用，乙腈、丙酮、甲醇和乙酸乙酯对 ZFEG1907t酶活力均有一定的促进作用外其他化学试剂对该酶的活性影响不明显。如图15所示，15％的有机溶剂对纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t 均有明显的抑制作用，且对纤维素酶ZFEG1907对15％的化学溶剂的耐受性更差。说明ZFEG1907t酶对15％有机溶剂耐受性较ZFEG1907酶强。如图16所示，EDTA 作为一种金属螯合剂，但无论浓度高低均对ZFEG1907及ZFEG1907t的酶活力无明显抑制作用，说明该酶不是金属酶。而SDS作为一种强变性剂，无论浓度高低均对ZFEG1907及ZFEG1907t的酶活力均有明显抑制作用。低浓度的咪唑 (1Mm、10mM)对ZFEG1907及ZFEG1907t酶活力的影响不大，但当浓度为 100mM时刻明显抑制二者的活性。10Mm及100mM的尿素对二者酶活性均有一定的促进作用。
实施例6
6.1纤维素重组酶的底物特异性和动力学参数的检测
将适度稀释的纤维素酶样品与0.4％(w/v)的底物(包括：羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)、魔芋胶(KGM)、地衣多糖(Lichenan)、微晶纤维素、刺槐豆胶(LBG)、木聚糖、葡聚糖、茯苓多糖、瓜尔豆胶、几丁质、pNPG)于最适条件下(pH 5.0，温度50℃)反应后测定酶活力，分析底物特异性。
将适度稀释的纤维素酶样品分别与不同浓度(0.1％(w/v)，0.2％(w/v)，0.3％(w/v)，0.4％(w/v)，0.5％(w/v))的底物(CMC-Na、KGM、Lichenan)于最适条件下(pH 5.0，温度50℃)反应后测定酶活力，利用米氏方程双倒数法求得重组酶的Km值和Vmax值、Km值、Kmm/kcat值。
最适条件(pH 5.0，50℃)下测定的纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t 底物特异性检测结果如表11所示，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t表现出相似的底物特异性。两酶只在羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖、微晶纤维素这四种底物中表现出降解活性，且对魔芋胶的活性最高，其次是地衣多糖和羧甲基纤维素钠，而对刺槐豆胶、木聚糖、葡聚糖、茯苓多糖、瓜尔豆胶、几丁质、pNPG没有降解活性。重组纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t对0.4％ (w/v)魔芋胶的比活力分别为27.79±0.12U/mg和25.53±0.17U/mg；对0.4％(w/v) 地衣多糖的比活力分别为13.17±0.07U/mg和15.03±0.32U/mg；对0.4％(w/v)羧甲基纤维素钠的比活力分别为10.24±0.15U/mg和11.82+0.20U/mg；对0.4％(w/v)微晶纤维素的比活力分别为3.24±0.22U/mg和4.56±0.21U/mg。从比活力数据结果来看，截短体ZFEG1907t对四中底物的特异性较ZFEG1907相差不大。说明 PKD-Fn3结构域对纤维素酶ZFEG1907的底物特异性几乎没有影响。
依据重组酶底物特异性检测结果，选取ZFEG1907和截短体ZFEG1907t水解比活力较高的三种底物(CMC-Na、KGM和Lichenan)做酶促动力学测定，利用Origin软件对梯度底物浓度以及相应的酶促反应速率进行双曲线拟合得到纤维素酶对相应底物的Km(substrateaffinity)，Vmax(maximum reaction velocity)， kcat(turmover rate)和kcat/Km(catalytic efficiency)测定，检测结果如表12所示。酶促反应动力学参数不仅反映了酶与底物见的亲和力而且也用来衡量酶对底物的催化效率。以CMC-Na为反应底物时，纤维素酶ZFEG1907t有更快的催化反应速率，Vmax值比ZFEG1907的高74.11％。而ZFEG1907具有更小的Km值，其 Km值比ZFEG1907t低42.27％。动力学常数Km值代表酶和底物之间的亲和力，Km越小，亲和力越大，所以ZFEG1907对CMC-Na底物的亲和力比ZFEG1907t 更强；kcat值是指单位时间内酶分子将底物转变成产物的分子数，从结果来看，纤维素酶ZFEG1907和截短体ZFEG1907t在kcat值上相差不大，ZFEG1907t略高一些；kcat/Km通常用来衡量酶的催化效率，不同酶对同一底物kcat/Km值的差异可能非常大，通一个酶对不同底物kcat/Km值的差异可能也非常大。由结果可见， ZFEG1907有更快的催化反应效率，kcat/Km值比ZFEG1907t高35.85％。
以KGM为反应底物时，纤维素酶ZFEG1907t同样有更快的催化反应速率，Vmax值比ZFEG1907的高19.48％，但ZFEG1907却具有更小的Km值，其Km值比ZFEG1907t低33.79％，表明ZFEG1907对KGM底物的亲和力更强；两酶在kcat值上相差不大，ZFEG1907略高一些；ZFEG1907有更快的催化反应效率， kcat/Km值比ZFEG1907t高70.08％。由此可见，以KGM为反应底物时ZFEG1907 催化效率更高。
以Lichenan为反应底物时，ZFEG1907t也有更快的催化反应速率，Vmax值比ZFEG1907的高86.67％，但ZFEG1907却具有更小的Km值，其Km值比 ZFEG1907t低61.62％，表明ZFEG1907对Lichenan底物的亲和力更强；ZFEG1907 有更快的催化反应效率，kcat/Km值比ZFEG1907t高92.73％，由此可见，以Lichenan 为反应底物时ZFEG1907催化效率更高。
以上实验结果有力说明，PKD-Fn3结构域能够通过提高对CMC、KGM和 Lichenan三种底物的结合能力来提高纤维素酶ZFEG1907的催化效率。因此，纤维素酶ZFEG1907的PKD-Fn3结构域有助于促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性。
表11 ZFEG1907和截短体ZFEG1907t酶的底物特异性检测
Figure BDA0003933608480000211
以上数据表示平均值±标准差；ND：未检测到。
The values shown are mean±standard deviation；ND：not detected.
表12 ZFEG1907和截短体ZFEG1907t酶动力学参数的检测
Figure BDA0003933608480000212
Figure BDA0003933608480000221
以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003933608480000231
Figure BDA0003933608480000241

Claims (10)

1.一种纤维素酶基因序列，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
2.根据权利要求1所述的纤维素酶基因序列，其特征在于：所述核苷酸序列由SEQ IDNO.1所示核苷酸序列去除底物结合结构域余下的催化功能序列，催化功能序列如SEQ IDNO.2所示，或由SEQ ID NO.2所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因序列，其特征在于：所述SEQ ID NO.2所示核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示核苷酸序列去除最后561个碱基对核酸获得。
4.一种纤维素酶的底物结合结构域基因序列，其特征在于：底物结合结构域为PKD-Fn3，PKD-Fn3核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或由SEQ ID NO.3所示核苷酸序列发生位点突变后获得，所述突变包括经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加和/或移位。
5.一种如权利要求4所述的底物结合结构域基因序列在促进酶与大分子底物的结合，提高酶与底物的亲和性、提高酶的催化效率方面的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述底物至少包括羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖。
7.一种纤维素酶，其特征在于：其氨基酸序列由权利要求1-3中任意一项所述的核苷酸序列编码。
8.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求1-3中任意一项所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的重组载体，其特征在于，该重组载体的表达载体为大肠杆菌。
10.一种根据权利要求3-5中任意一项所述的纤维素酶在降解羧甲基纤维素钠、魔芋胶、地衣多糖或微晶纤维素、羧甲基纤维素钠中的应用。
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