CN117296994B - 一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用，属于基因工程技术领域。本发明通过宏基因组测序技术从鸡腺胃和肌胃内容物微生物群落基因组中挖掘纤维素酶基因，并通过纤维素酶基因的序列分析、毕赤酵母表达获得纤维素酶。本发明表达的纤维素酶在模拟鸡胃酸性环境pH2.0条件下具有高纤维素酶活性，克服了普通纤维素酶在鸡嗉囊、腺胃和肌胃强酸性环境没有酶活性的问题，解决了纤维素酶在鸡饲料添加剂应用中受限的问题。因此，可以应用本发明方法制备纤维素酶用于鸡饲料添加剂，提高鸡对饲料中纤维素的消化吸收，提高养殖效益。尤其适用于雏鸡饲料添加剂，解决雏鸡纤维素消化不良拉稀问题。

Description

一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用。

背景技术

玉米、豆粕等谷物是家禽饲料的主要原料，谷物粉是饲料中的最主要碳源，其中葡萄糖、淀粉等糖类禽类容易消化吸收，而纤维素在禽类消化道中难以消化吸收。食草类反刍动物能充分消化利用摄入草料中的纤维素，主要得益于瘤胃中微生物产生的纤维素酶对纤维素的酶解作用。而现在高密度笼养的蛋鸡、肉鸡、鸭、鹅等禽类嗉囊和胃肠道中缺少产纤维素酶微生物，导致食入饲料中的纤维素难以消化吸收。这一方面造成营养浪费，另一方面不能消化利用的纤维素排泄会导致禽类拉稀，雏鸡肠道紊乱拉稀与不能吸收的纤维素有直接关系。目前已知纤维素酶最适酶活为弱酸性至中性条件，鸡的嗉囊、腺胃、肌胃pH接近2.0，一般纤维素酶进入鸡消化道中会失去活性。如何获得耐酸纤维素酶作为鸡饲料添加剂是目前急需解决的问题。

一些地方土鸡品种，因独特的生存环境，具有潜在的生物特性，可挖掘丰富的生物资源。本发明从青海某天然山坡草场围栏养殖的鸡腺胃肌胃内容物微生物群落中提取DNA，利用宏基因组测序技术，经比对分析，挖掘到一个与GenBank中已登录纤维素酶氨基酸序列同源性为83.14%的纤维素酶编码基因。并利用毕赤酵母表达系统成功表达了该纤维素酶。本发明表达的纤维素酶在模拟鸡胃酸性环境pH2.0条件下具有高纤维素酶活性，克服了普通纤维素酶在鸡嗉囊、腺胃和肌胃强酸性环境没有酶活性的问题，解决了纤维素酶在鸡饲料添加剂应用中受限的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用，属于基因工程技术领域。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

其一，本发明提供了一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用，所述纤维素酶为毕赤酵母表达的耐酸性纤维素酶，所述纤维素酶的核苷酸序列为SEQ IDNO.1。

进一步地，所述纤维素酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

进一步地，所述毕赤酵母表达的纤维素酶基因经密码子优化为酵母偏嗜性密码子，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

进一步地，所述饲料添加剂能够用于改善雏鸡拉稀症状，饲料添加剂按千分之一的重量比拌料添加。

进一步地，所述饲料添加剂能够用于降低肉鸡料肉比，饲料添加剂按千分之一的重量比拌料添加。

进一步地，所述饲料添加剂能够用于降低蛋鸡料蛋比，饲料添加剂按千分之一的重量比拌料添加。

其二，本发明提供了一种耐酸性纤维素酶。

其三，本发明提供了一种用于表达耐酸性纤维素酶的基因。

本发明的有益效果在于，从地方特有品种鸡胃内容物微生物群落中挖掘到一个纤维素酶基因，构建了表达纤维素酶的毕赤酵母，得到的纤维素酶在模拟鸡胃酸性环境pH2.0条件下具有高纤维素酶活性，克服了普通纤维素酶在鸡嗉囊、腺胃和肌胃强酸性环境没有酶活性的问题，解决了纤维素酶在鸡饲料添加剂应用中受限的问题。因此，可以应用本发明方法制备纤维素酶用于鸡饲料添加剂，提高饲料中纤维素的消化吸收率，提高养殖效益。尤其适用于雏鸡饲料添加剂，解决雏鸡纤维素消化不良拉稀问题。

附图说明

图1：表达鸡胃内微生物源纤维素酶的毕赤酵母菌株于含1000ug/ml博莱霉素的YPD平板划线效果图。

图2：表达鸡胃内微生物源纤维素酶的毕赤酵母菌株经发酵表达的纤维素酶电泳图。

图2中标号：M：Protein ladder，1：空白X33酵母培养5天上清液，2：X-Cellulase酵母培养5天上清液，3 ：X-Cellulase酵母培养7天上清液，4：纯化的纤维素酶。

具体实施方式

一种鸡胃内微生物源纤维素酶基因挖掘分析，从青海某天然山坡草场围栏养殖的健康鸡腺胃肌胃内容物微生物群落中提取DNA，利用宏基因组测序技术，经比对分析，挖掘到一个与GenBank中已登录纤维素酶氨基酸序列同源性为83.14%的纤维素酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例1：鸡胃内微生物源纤维素酶宏基因组测序

（1）从青海某天然山坡草场围栏养殖的鸡群中挑选5只健康鸡，实验室处死。外表经消毒液浸泡10分钟，擦干后在超净工作台中解剖。取腺胃和肌胃内容物，浸泡于灭菌的生理盐水中，搅拌混匀后置室温自然沉降20分钟；

（2）移液器吸取1ml上述上清液，置于1.5ml离心管中。5000r/min离心5min，弃上清液，沉淀中加入200ul无菌超纯水，重悬沉淀；

（3）用天根生化科技（北京）有限公司细菌基因组 DNA 提取试剂盒，按说明书提取微生物基因组DNA；

（4）DNA样品送至上海中科新生命生物科技有限公司进行宏基因组测序；

（5）对测序结果中的开放阅读框氨基酸进行比对分析，挖掘纤维素酶基因编码序列。

为挖掘鸡肠道微生物中编码纤维素酶的基因序列，本发明通过宏基因组测序技术实现高通量测序，比传统微生物分离培养的常规测序方法减少了很大的工作量。传统微生物分离培养对于一些难培养的微生物资源往往不能分离获得，导致有用基因资源不能充分挖掘。本发明对宏基因组测序所得开放阅读框进行比对分析，挖掘到一个与GenBank中已登录纤维素酶氨基酸序列同源性为83.14%的纤维素酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：表达鸡胃内微生物源纤维素酶的毕赤酵母菌株构建

(1)将测序得到的核苷酸序列SEQ ID NO.1优化为毕赤酵母偏嗜密码子的序列SEQID NO.3，上下游分别添加XhoI和NotI限制性内切酶位点。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ ID NO.3，并克隆到pUC57质粒上获得pUC57-Cellulase质粒；

(2)利用限制性内切酶XhoI和NotI对pUC57-Cellulase质粒进行双酶切，并回收基因片段；

(3)利用限制性内切酶XhoI和NotI双酶切表达载体pPICZαA，并回收基因片段；

(4)将步骤(2)、(3)中双酶切回收的核酸片段用T4 DNA连接酶连接，再转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，XhoI和NotI双酶切鉴定，获得重组表达质粒pPICZα-Cellulase；

(5)用PmeI酶切质粒pPICZα-Cellulase，乙醇沉淀回收线性化pPICZα-Cellulase；

(6)线性化pPICZα-Cellulase电转化毕赤酵母X-33感受态细胞；含1000ug/ml博莱霉素的YPD平板筛选阳性转化子，阳性菌落于含1000ug/ml博莱霉素的YPD平板划线纯化单菌落，见图1；

(7)转化菌株经0.5%甲醇诱导蛋白表达5天、7天，SDS-聚丙烯凝胶电泳分析表达蛋白条带，见图2。1泳道为空白X33酵母培养5天上清液，70kD无明显条带；2泳道为X-Cellulase酵母培养5天上清液，70kD有明显条带，为表达的纤维素酶；3泳道为X-Cellulase酵母培养7天上清液，70kD有明显条带，为表达的纤维素酶；4泳道为本发明构建的X-Cellulase酵母培养7天，培养上清离子交换层析法纯化的纤维素酶，与理论分子量70.8kD相符。

实施例3：X-Cellulase酵母表达纤维素酶的活性分析

（1）内切葡聚糖酶：利用DNS法测定内切葡聚糖酶活性。配制的葡萄糖标准溶液如下表1所示反应，分别于沸水中煮10 min后立即取出，冷却后将混合均匀的反应液分别吸取200μL至酶标板中，每个编号测3个重复，测定OD₅₄₀的值，绘制葡萄糖标准曲线。以0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液（pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0）为溶剂配制1%的CMC-Na作为底物，每10μL酶液与100μL 1%羧甲基纤维素钠在37℃孵育10 min，通过加入100μL DNS溶液终止酶促反应，混合物在100℃煮沸10 min，用酶标仪测定OD₅₄₀的值，测定孵育过程中形成的还原糖量。

表1 葡萄糖标准曲线

（2）β-葡萄糖苷酶：按表2加样，测定OD₄₁₀的值，绘制标准曲线。以5 mmol/L

的p NPG作为底物（pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0）。取100 μL底物与10μL酶液混合均匀并在37℃温水浴10 min，反应后加入200 μL 1 mol/L的Na₂CO₃终止该试验，在离心机瞬时离心后，吸取200 μL上清液至酶标板中，并在酶标仪上测定410 nm处的吸光度。

表2 对硝基苯酚标准曲线

（3）外切葡聚糖酶：按表2加样后，测定OD₄₁₀的值，绘制标准曲线。对硝基苯酚含量为横坐标，绘制标准曲线。取100 μL 1 mg/mL的pNPC（pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH6.0）与10 μL酶液均匀混合后，于37℃水浴10 min，反应后立即加入100 μL 1 mol/L的Na₂CO₃终止该反应，瞬时离心后吸取200 μL上清液，测定OD₄₁₀的值。

（4）X-Cellulase酵母表达纤维素酶在不同pH缓冲液中的活性分析

通过检测X-Cellulase酵母表达纤维素酶在pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH6.0缓冲液中的内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶活性。由表3结果可见，X-Cellulase酵母表达纤维素酶在pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0三种酶活性均良好，尤其内切葡聚糖酶活性达到了已有研究报道纤维素酶内切葡聚糖酶活性最高酶活力。由此可见本发明表达的纤维素酶在模拟鸡胃酸性环境pH2.0条件下具有高纤维素酶活性，克服了普通纤维素酶在强酸性环境没有酶活性的问题。

表3 纤维素酶活性测定结果

本发明还提供了上述的一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用。其应用方法为，酵母发酵液经离心、上清液喷雾干燥，获得纤维素酶饲料添加剂，以千分之一的重量比拌料饲喂鸡。

实施例4：检测X-Cellulase酵母表达的纤维素酶饲料添加剂对白羽肉鸡生长性能的影响

（1）X-Cellulase酵母经0.5%甲醇诱导表达7天，发酵液经连续流离心机离心，上清液经喷雾干燥机干燥处理成粉末状，塑料袋分装制成纤维素酶饲料添加剂；

（2）纤维素酶饲料添加剂分别按不同比例加进基础饲料中，充分搅拌均匀。按纤维素酶饲料添加剂重量：基础饲料重量，1:100、1:1000、1:10000配制三种饲料；

（3）400只1日龄健康白羽肉鸡随机分为4组，100只/组，隔离饲养；

（4）每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为40天，饲养期间按照白羽肉鸡常规免疫程序免疫和饲养管理，期间每天观察试验鸡生长情况，实验结束统计鸡料肉比。

表4 不同比例纤维素酶饲料添加剂饲喂对白羽肉鸡生长的影响

添加比例	料肉比	雏鸡粪便性状
			1:100	1.62:1	正常
1:1000	1.66:1	正常
			1:10000	1.83:1	拉稀便
不添加	2.07:1	拉稀便

从表4可以看出，本发明所表达的纤维素酶作为饲料添加剂按1:100、1:1000、1:10000配比加入基础饲料中饲喂白羽肉鸡，均能明显降低料肉比。其中1:100与1:1000比例添加效果相当，因此本发明纤维素酶饲料添加剂按1:1000拌料添加能增加肉鸡养殖效益。并且按1:1000及以上剂量拌料饲喂均能改善雏鸡拉稀便症状，有益雏鸡健康。

实施例5：检测X-Cellulase酵母表达的纤维素酶饲料添加剂对海兰褐蛋鸡生产性能的影响

（1）纤维素酶饲料添加剂分别按不同比例加进基础饲料中，充分搅拌均匀。按纤维素酶饲料添加剂重量：基础饲料重量，1:100、1:1000、1:10000配制三种饲料；

（2）400只200日龄海兰褐蛋鸡随机分为4组，100只/组，隔离饲养；

（5）每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为60天，饲养期间按照海兰褐蛋鸡常规免疫程序免疫和饲养管理，期间每天观察试验鸡产蛋情况情况，实验结束统计鸡产蛋率、料蛋比。

表5 不同比例纤维素酶饲料添加剂饲喂对海兰褐蛋鸡生产性能的影响

添加比例	产蛋率	料蛋比	蛋壳质量
				1:100	95%	2.01:1	良好
1:1000	95%	2.03:1	良好
				1:10000	93%	2.34:1	良好
不添加	90%	2.45:1	良好

从表5可以看出，本发明所表达的纤维素酶作为饲料添加剂按1:100、1:1000、1:10000配比加入基础饲料中饲喂海兰褐蛋鸡，均能提高产蛋率、降低料蛋比。其中1:100与1:1000比例添加效果相当，因此本发明纤维素酶饲料添加剂按1:1000拌料添加能增加蛋鸡养殖效益。

Claims (6)

1.一种鸡胃微生物源纤维素酶在制备鸡饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述纤维素酶为毕赤酵母表达的耐酸性纤维素酶，所述纤维素酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂能够用于改善雏鸡拉稀症状。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂能够用于降低肉鸡料肉比。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂能够用于降低蛋鸡料蛋比。

5.一种如权利要求1应用中所述的纤维素酶。

6.一种用于表达如权利要求1应用中所述纤维素酶的基因。