CN115851671A - 木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用 - Google Patents
木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用。本发明是将来源于瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn进行突变，筛选获得木聚糖酶突变体xynH1、xynH2、xynH3，和原始基因相比，本发明得到的木聚糖酶突变体酶活力分别提高了15％、23％、35％，且在发酵条件下，产酶水平达到12万U/mL。本发明利用含所述木聚糖酶突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸、多苞桉桉树精油复合成全新的酶制剂，其能够提高保育猪养殖中的饲料转化率，提高生产性能，对保育猪的养殖具有很好的效果。
Description
技术领域
本发明属于酶工程领域，具体涉及木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用。
背景技术
木聚糖是一种五碳糖，是半纤维素的重要组分，也是自然界中含量仅次于纤维素的多聚糖。木聚糖广泛存在于饲料原料中，如玉米、麦麸、米糠、秸秆、豆粕等，属于饲料中的非淀粉多糖，其在动物消化系统中不能被有效的降解。木聚糖本身难以被单胃动物消化，同时结合大量的水，使采食动物消化道中食糜的体积增大、粘度增加、养分与消化道内源酶的作用降低，从而阻碍营养物质，尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收，降低饲料的利用率。在养殖行业中，通过在饲料中添加木聚糖酶降解抗营养因子木聚糖对提高饲料利用率非常经济有效。
木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚糖或木糖的一类酶的总称，主要包括内切β-1,4木聚糖酶、木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶等，其中内切β-1,4木聚糖酶在这一类酶中发挥主要作用。目前市场上大多数木聚糖酶适宜温度在40～60℃，pH在5.0-7.0。来源于瘤胃真菌的内切木聚糖酶由于其良好的酶解特性，使其在饲料、造纸等行业具有很大的应用潜力。为了使瘤胃真菌内切木聚糖酶广泛应用到众多工业领域中，提高其酶活力、耐热性、耐酸性等性能，降低生产成本是急需解决的问题。
发明内容
本发明提供了木聚糖酶突变体xynH及其与胆汁酸复合的酶制剂和应用。本发明通过大量筛选得到酶活性提高的木聚糖酶突变体xynH1、xynH2、xynH3，并与胆汁酸、多苞桉桉树精油复合成全新的酶制剂，用于提高动物的生长性能。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了木聚糖酶突变体xynH，所述木聚糖酶突变体xynH具有如下的氨基酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；
(3)如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。
进一步的，所述木聚糖酶突变体xynH具体为：由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸得到的xynH1；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸和第126位的缬氨酸变为色氨酸得到的xynH2；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸、第126位的缬氨酸变为色氨酸和第142位的苏氨酸变为谷氨酸得到的xynH3。
本发明还提供了编码所述的木聚糖酶突变体xynH的基因，所述基因具有如下的核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组表达载体，其包含所述的基因。
本发明还提供了一种重组工程菌，其包含所述的基因。
本发明还提供了一种包含所述的木聚糖酶突变体xynH的复合酶制剂，所述复合酶制剂中还包含胆汁酸、多苞桉桉树精油。
进一步的，所述复合酶制剂中，木聚糖酶突变体xynH的粉制剂与胆汁酸、多苞桉桉树精油的质量体积比为1:2～5:1。
本发明还提供了所述的木聚糖酶突变体xynH或者所述的复合酶制剂在制备饲料添加剂中的应用。
进一步的，所述木聚糖酶突变体或者复合酶制剂在的用量为100g/t～500g/t饲料。
进一步的，所述饲料添加剂中含有木聚糖酶突变体xynH1、xynH2、xynH3中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：
本发明以瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因为基础进行突变改良，筛选获得了突变位点分别为单点突变N37D的木聚糖酶突变体xynH1，双点突变N37D/V126W的木聚糖酶突变体xynH2，以及三点突变N37D/V126W/T142E的木聚糖酶突变体xynH3。和原始基因相比，所述木聚糖酶突变体的酶活力分别提高了15％、23％、35％，且发酵条件下产酶水平达到12万U/mL。本发明利用含木聚糖酶突变体的工程菌经发酵、过滤干燥制得的粉制剂与胆汁酸、多苞桉桉树精油复合成全新的酶制剂，其能够提高保育猪养殖中的饲料转化率，提高生产性能，对保育猪的养殖具有很好的效果，并节约了生产成本，促进了其在饲料等领域的开发和应用。
附图说明
图1是木聚糖酶突变体酶活力比较。
图2是木聚糖酶突变体蛋白胶电泳结果。
图3是木聚糖酶突变体在15L发酵罐中的发酵曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合附图及实施例对本文发明做更全面、详细地说明，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
本发明所用培养基配方如下：
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；
MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；
BSM培养基：26.7mL 85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mL PMT1。
以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。
酶活力测定：参照《GBT 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法》中的测定方法。
实施例1：木聚糖酶突变体基因构建和筛选
参考瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶xyn(GenBank:AKN90969.1)的氨基酸序列，翻译成对应的核苷酸序列，并经过基因序列优化后，由人工合成，得到的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其对应核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据序列设计引物如下，在5’端设计EcoR I限制性酶切位点，3’端设计Not I限制性酶切位点。
xyn-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCAGC(SEQ ID NO：9)；
xyn-R：ATAAGCGGCCGCCTAATCACCAATGTAAACCT(SEQ ID NO：10)。
用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以人工合成的基因为模版，利用上述设计的引物序列进行随机突变。将扩增好的随机突变PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-xynMx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+)载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-xyn0。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入2个表达xyn0的单菌落为对照。每孔装入300uL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm震荡培养4小时后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃、200rpm摇床培养10h诱导表达木聚糖酶。
将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，然后检测木聚糖酶的酶活性。将酶活力高于对照的突变体基因进行测序。
经过测序后获得木聚糖酶突变体xynH1，其突变方式为N37D，氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
实施例2：以木聚糖酶突变体xynH1基因为模板进行随机突变
以实施例1中筛选到的突变体xynH1为模版，使用与实施例1相同的随机突变方法，进行第二轮突变和筛选，筛选时以xynH1为对照，检测木聚糖酶的酶活力，将酶活力明显提高的突变体基因进行测序。
经过大量筛选测定后获得酶活力明显提高的两株突变体xynH2和xynH3：
xynH2突变方式为N37D/V126W，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
xynH3突变方式为N37D/V126W/T142E，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
实施例3：木聚糖酶突变体转化毕赤酵母GS115
将上述的木聚糖酶突变体基因用EcoR I和Not I双酶切位点连接到pPIC9K质粒上并转化至大肠杆菌DH5α中，获得表达载体，测序验证。将表达载体用Sal I酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115中，MD平板筛选得到转化子并转接到YPD平板中活化(一般挑24-48个转化子)。活化后的转化子接于摇瓶进行发酵(每瓶含20mL BMGY培养基)，30℃振荡培养18h后，加1％甲醇诱导，继续振荡培养，此后每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定发酵液上清的平均酶活性。
结果如图1所示，木聚糖酶突变体酶活力分别提高了15％、23％、35％。
实施例4：木聚糖酶突变体xynH3在15L发酵罐中发酵和制备
将表达木聚糖酶突变体xynH3的基因工程菌分别划线于YPD平板上，30℃培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mL BMGY培养基中，30℃、200rpm培养24h。以2％的接种量接种到300mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养至OD600为5，用作种子液接种发酵罐。发酵生产工艺：BSM培养基，pH 4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理后经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。
发酵液进行蛋白胶分析结果如图2所示，可以看到明显且较宽的蛋白条带，说明表达量较高；发酵过程曲线如图3所示：每隔8h取样，测定产酶水平，发酵168h后酶活力水平达到最高点。
实施例5：复合酶制剂的制备和其在保育猪养殖中的应用实验
将实施例4制备的木聚糖酶突变体的粉制剂以1:3:1的质量体积比混入胆汁酸、多苞桉桉树精油中，得到复合酶制剂。其中，木聚糖酶突变体的酶活力不少于5万U/g。
胆汁酸的有效成分组成包括猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸，所述猪胆酸和猪去氧胆酸之和的重量百分比为78.0％，鹅去氧胆酸的重量百分比为20.0％，其余为水分和灰分(重量百分比总和以100％计算)。在多苞桉桉树精油中包含1,8-桉树脑(83.8％)、β-甲基异丙基苯(3.43％)、柠檬烯(2.5％)、α-蒎烯(1.8％)、别香橙烯(1.08％)、松油烯-4-醇(0.88％)、α-松油醇(0.58％)、蓝桉烯(0.54％)、P-甲基异丙基苯(0.51％)等。
选用健康体重在12kg左右的良种保育猪180头，随机分为6组，每组3栏，每栏10头猪，即每组3个重复。对照组饲喂普通基础日粮，阳性组饲喂添加200g/t的胆汁酸、多苞桉桉树精油(体积比为3:1)混合液；试验组分别饲喂添加200g/t含木聚糖酶突变体的复合酶制剂的基础日粮，各组饲料其它成分基本无差异。
通过检测饲喂过程中猪的体重、平均采食量、平均日增重和腹泻频率等指标，来评价木聚糖酶在保育猪养殖中的应用效果。
试验结果如下表1所示，添加复合酶制剂后，保育猪的采食量和日增重都有所提高；料重比和对照组相比，分别降低了2.86％、3.43％、4.0％和2.29％；并且试验组的效果均比阳性组好。以上结果说明，添加了含有木聚糖酶xyn0以及其突变体xynH1、xynH2和xynH3的复合酶制剂能够提高保育猪养殖中的饲料转化率，提高生产性能，对保育猪的养殖具有很好的效果。
表1木聚糖酶突变体在保育猪养殖中的应用
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.木聚糖酶突变体xynH，其特征在于，所述木聚糖酶突变体xynH具有如下的氨基酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；
(2)如SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；
(3)如SEQ ID No.7所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynH，其特征在于，所述木聚糖酶突变体xynH具体为：由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸得到的xynH1；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸和第126位的缬氨酸变为色氨酸得到的xynH2；由氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的木聚糖酶的第37位的天冬酰胺变为天冬氨酸、第126位的缬氨酸变为色氨酸和第142位的苏氨酸变为谷氨酸得到的xynH3。
3.编码权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynH的基因，其特征在于，所述基因具有如下的核苷酸序列之一：
(1)如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；
(3)如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，其包含权利要求3所述的基因。
5.一种重组工程菌，其特征在于，其包含权利要求3所述的基因。
6.一种包含权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynH的复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂中还包含胆汁酸、多苞桉桉树精油。
7.根据权利要求6所述的复合酶制剂，其特征在于，所述复合酶制剂中，木聚糖酶突变体xynH的粉制剂与胆汁酸、多苞桉桉树精油的质量体积比为1:2～5:1。
8.权利要求1所述的木聚糖酶突变体xynH或者权利要求6所述的复合酶制剂在制备饲料添加剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述木聚糖酶突变体或者复合酶制剂在的用量为100g/t～500g/t饲料。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂中含有木聚糖酶突变体xynH1、xynH2、xynH3中的至少一种。
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