CN109997970A - 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 - Google Patents

一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，具体是在篮状菌属Talaromyces来源的酸性木聚糖酶XYNTF0的基础上通过大量突变和筛选获得的木聚糖酶突变体XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05；相比于未突变的木聚糖酶，本发明得到的木聚糖酶突变体的酶活和耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的开发和应用。

Description

一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因 和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一类酶活和耐热提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用。
背景技术
木聚糖是存在于植物细胞壁上一种多聚五碳糖，是半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的15％～35％。木聚糖由木糖单体通过β-1，4-糖苷键聚合而成。内切-1，4-β-D-木聚糖酶，简称木聚糖酶(xylanase)，通过随机的内切水解木聚糖主链的1，4-β-D-糖苷键，产生木糖或低聚木糖，是木聚糖降解过程中的关键酶。
在养殖行业中，饲料中的木聚糖在动物消化系统中不能被有效的降解，同时还会影响其他营养成分的吸收利用，大大降低了饲料的转化效率。因此，通过在饲料中添加木聚糖酶转化抗营养因子木聚糖对提高饲料转化率非常经济有效。
饲料生产时，酶制剂与饲料混匀后要经过高温造粒，在此过程中酶易变性失活；同时添加到饲料中的酶制剂通常需要在胃肠道中发挥作用，胃液的酸性环境极易使得中性木聚糖酶变性失活，影响使用效果；因此开发耐热的酸性木聚糖酶有利于其在饲料行业的应用。目前市场上大多数木聚糖酶最适反应温度在 40-70℃之间，最适pH在5.0-7.0之间，在经历高温和胃酸后极易失活，解决这类问题的一种方法是利用包被剂和载体来提高酶的稳定性，但这无疑会增加酶制剂的生产成本，而且采用包被处理酶制剂会严重影响其生物利用率；另一种经济有效的方法就是通过改良酶的基因提高其稳定性。从酶的基因和结构入手，筛选得到耐热的酸性木聚糖酶对降低目前饲用木聚糖酶的生产成本，提高其利用效率具有重要的意义。
易错PCR技术是通过PCR反应扩增目的片段时，通过调整反应条件增加扩增时的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变，构建突变体库，从而筛选需要的正向突变体。为了获得更好的突变效果，可以将一次突变筛选得到的正突变基因作为下一次易错PCR的模板，连续进行随机突变，从而使得正向突变得到积累，增加有益突变的效率。易错PCR技术可以很好地应用于蛋白质的分子改造中。
发明内容
本发明提供了一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用，通过人工基因突变和大量筛选的方法，对篮状菌来源的酸性木聚糖酶 (Genbank ID：BAO51921.1)进行改良，筛选得到热稳定性提高的突变体，从而有利于提高其在饲料工业中的应用效果。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF01，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 4所示。
本发明提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF02，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 6所示。
本发明提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF03，其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 8所示。
本发明提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF04，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 10所示。
本发明提供了一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF05，其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 12所示。
本发明还提供了包含所述木聚糖酶突变体编码基因的重组表达载体。
本发明提供了包含所述木聚糖酶突变体编码基因的的基因工程菌，所述基因工程菌为毕赤酵母GS115和毕赤酵母X33。
本发明提供了氨基酸序列如SEQ NO：1所示的天然木聚糖酶XYNTF0在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
本发明提供了所述木聚糖酶突变体在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
所述动物为鸡、鸭、猪、牛、鱼。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明以木聚糖酶XYNTF0 为基础，提供了分别包含P84T的单点突变体XYNTF01，分别包含S14R/P84T、 P84T/L121E的双位点突变体XYNTF02和XYNTF03，以及分别包含 S14R/T55P/P84T、S14R/P84T/S200A的三位点突变体XYNTF04和XYNTF05。
本发明改造后的突变体XYNTF01，XYNTF02，XYNTF03、XYNTF04和 XYNTF05的酶活比原始酸性木聚糖酶分别提高了54.9％、97.1％、117.5％、146.0％和126.9％；同时在80℃处理3分钟时的热稳定性分别提高了38％、57％、39％、 32％和71％。
通过本发明技术方案得到的酸性木聚糖酶突变体的酶活力和热稳定性较野生型有较大提高，使其在食品、饲料添加、化工等领域有很好的应用潜力。
附图说明
图1为本发明中木聚糖酶蛋白电泳图(泳道：1，9为蛋白质Marker；2为XYNTF0重组菌株发酵液上清；3为XYNTF01重组菌株发酵液上清；4为 XYNTF05重组菌株发酵液上清；5为XYNTF04重组菌株发酵液上清；6为 XYNTF03重组菌株发酵液上清；7为XYNTF02重组菌株发酵液上清；8为未表达木聚糖酶的阴性对照；)；
图2为本发明中木聚糖酶突变体平均酶活比较；
图3为本发明中木聚糖酶突变体在80℃水浴3min耐热性比较；
图4为本发明中木聚糖酶在30L发酵罐中的发酵数据。
具体实施方式
为了便于理解本发明，以下将结合较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可以参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。具体实施例中使用的试剂和生物材料如无特殊说明均可从商业途径获得。
1.菌株和载体
毕赤酵母GS115，质粒pPIC9K，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21，质粒pET 21a(+)购自Invitrogen公司。
2.试剂与培养基
质粒提取试剂盒，片段纯化回收试剂盒，限制性内切酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；GeneMorph II随机突变PCR试剂盒购自Stratagene公司；氨苄青霉素，IPTG等购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl；
MD培养基：1.34％YNB，0.4mg/L生物素，2％葡萄糖；
YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖；
BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液 (pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甘油；
BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液 (pH6.0)，1.34％YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇；
BSM培养基：26.7mL 85％的磷酸，0.93g二水硫酸钙，14.9g二水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，18.2g硫酸钾，40g甘油，4.0mlL PMT1。
以上培养基为固体时加入2％的琼脂粉。
3.实验方法
菌株培养条件：大肠杆菌37℃培养，酵母30℃培养。液体培养时摇床转速为200rpm。
毕赤酵母GS115转化方法：将活化的毕赤酵母GS115接种到含有20mL YPD 液体培养基中，30℃摇瓶培养至OD600为1.2～1.5后低温离心收集菌体，依次用 20mL冰冷无菌水和5mL浓度为1mol/L的冰冷山梨醇溶液清洗菌体，最后用1mL 山梨醇溶液重悬菌体制得酵母感受态悬液。将100μL酵母感受态与10μL线性化载体混匀后转移到预冷的电转杯中电击转化，电转化的条件为1.5kV，6msec。电击后加入1mL山梨醇溶液，转移至1.5mL离心管中30℃温育1h。5000rpm离心5min，收集菌体涂布于MD筛选平板上倒置培养，直至长出阳性单克隆。
木聚糖酶活性检测根据中华人民共和国国家标准《GB/T 23874-2009》进行；木聚糖酶活性定义是指样品在温度37℃、pH值5.5的条件下，每分钟从5.0mg/mL 木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量，即为一个木聚糖酶活性单位，以U表示。
实施例1：易错PCR构建酸性木聚糖酶XYNTF0的突变库
参考酸性木聚糖酶XYNTF0的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，根据毕赤酵母密码子偏好性优化其DNA序列(SEQ ID NO：2)，合成优化的基因，并在5’端设计EcoR I限制性酶切位点，3’端设计Not I限制性酶切位点。
SEQ ID No：1
SEQ ID No：2
用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒，以木聚糖XYNTF0的基因为模版，进行随机突变，使用的引物序列如下：
XYNTF0F：AGAATTCTTCCCTTCAGAATTG；
XYNTFOR：AGCGGCCGCTCATGAGACAGTG。
将扩增好的随机突变PCR产物用EcoR I和Not I双酶切，纯化回收后连接到pET-21a(+)载体上，转化大肠杆菌BL21-DE3，氨苄青霉素抗性LB平板筛选阳性克隆，得到pET-XYNTFx。同样方法将合成的原始基因连接到pET-21a(+) 载体上并转化大肠杆菌BL21-DE3，得到pET-XYNTF0。
将筛选的单菌落接种到96孔深孔板。每个平板接入2个表达XYNTF0的单菌落为对照。每孔装入300uL LB液体培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)， 37℃200rpm震荡培养4小时后，转移50uL菌液到新的96孔平板保种，在平板剩余菌液中添加200uL含有IPTG的LB-Amp培养基，使IPTG终浓度为1mM，氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，37℃200rpm摇床培养10h诱导表达木聚糖酶。
将诱导完成的菌液反复冻融进行破碎，将破碎后的细胞液离心取上清，进行热处理(80℃水浴3min)，然后检测木聚糖酶的剩余活性。将剩余酶活高于对照的突变体基因进行测序。
筛选到以XYNTF0为出发模板的酶活和耐热性同时提高的突变体P84T(命名为XYNTF01)，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码的核苷酸序列如 SEQ ID NO：4所示。
SEQ ID No：3
SEQ ID No：4
实施例2：第二轮易错PCR构建木聚糖酶XYNTF01的突变库
以实施例1中筛选到的木聚糖酶基因XYNTF01为模版，进行第二轮随机突变，突变库构建过程以及使用材料试剂和操作条件等均同实施例1；突变体培养和筛选时以XYNTF01为对照，经过热处理(80℃水浴3min)后检测木聚糖酶突变体的剩余活性，将剩余酶活高于XYNTF01的突变体基因进行测序。
最终筛选到酶活和耐热性提高的以下突变体：
XYNTF02突变方式为P84T/S14R，氨基酸序列如SEQ ID No：5所示；
XYNTF03突变方式为P84T/L121E，氨基酸序列如SEQ ID No：7所示；
XYNTF04突变方式为P84T/S14R/T55P，氨基酸序列如SEQ ID No：9所示；
XYNTF05突变方式为P84T/S14R/S200A，氨基酸序列如SEQ ID No：11所示。
SEQ ID No：5
SEQ ID No：6
SEQ ID No：7
SEQ ID No：8
SEQ ID No：9
SEQ ID No：10
SEQ ID No：11
SEQ ID No：12
实施例3：酶活和耐热提高的木聚糖酶突变体在毕赤酵母中的表达验证
上述筛选到的木聚糖酶突变体基因用EcoR I和Not I双酶切位点连接到pPIC9K质粒上并转化至大肠杆菌DH5α中，筛选到各突变体在毕赤酵母中的表达载体pPIC-XYNm，测序验证。将各突变体的表达载体用Sal I酶切线性化后电转入毕赤酵母GS115中，MD平板筛选得到各突变体表达菌株的转化子并转接到YPD平板中活化(每个突变体挑48个转化子)。活化后的转化子接于48 深孔板中(每孔含1mLBMGY培养基)，30℃振荡培养18h后，加1％甲醇诱导，继续振荡培养，此后每24h添加培养体积1％的甲醇。诱导表达96h后，将培养液离心获得上清，测定每个突变体发酵液上清的平均酶活(无酶活的不计算在内)，结果如图2。突变后得到的木聚糖酶XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04 和XYNTF05的摇瓶酶活较XYNTF0分别提高了54.9％、97.1％、117.5％、146.0％和126.9％。
取每个突变体中酶活最高的转化子发酵上清液，在80℃水浴处理3min后比较酶活保留率，结果如图3。XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和 XYNTF05的耐热性较XYNTF0分别提高了0.38倍、0.57倍、0.39倍、0.32倍和0.71倍。
XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05发酵液的蛋白电泳情况如图1。
以上结果表明将XYNTF0第84位的Pro突变为Thr能提高其酶活和耐热。在此基础上将其第14位的Ser突变为Arg得到的突变体，或将其121位Leu突变为Glu得到的突变体；或将其第14位的Ser突变为Arg，同时将其第55位的 Thr突变为Pro得到的突变体；或将其第14位的Ser突变为Arg，同时将其第200 位的Ser突变为Ala得到的突变体，其酶活或耐热性有进一步提高。
实施例4：木聚糖酶突变体在30L发酵罐中发酵和制备
将表达上述实施例中的木聚糖酶突变体XYNTF0、XYNTF01、XYNTF02、 XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05的基因工程菌分别划线于YPD平板上，30℃培养3天长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在YPD平板上划线培养，如此活化三代得到的毕赤酵母单菌落接种于20mLBMGY培养基中，30℃、200rpm 培养24h。以2％的接种量接种到300mLBMGY培养基中，30℃、200rpm培养至 OD600为5，用作种子液接种发酵罐。
发酵生产工艺：BSM培养基，pH4.8、温度30℃、搅拌速率500rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上
发酵过程分为三个阶段：(1)菌体培养阶段：按8％比例接入种子液，30℃培养20～24h，使发酵液中甘油耗尽；(2)饥饿阶段：当碳源甘油耗尽后，暂不补加任何碳源，待溶氧上升至80％饥饿阶段结束；(3)诱导表达阶段：用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加甲醇诱导，并且保持溶氧在20％以上，诱导时间为160～200h；待发酵结束后，发酵液通过板框过滤机处理得到粗酶液经喷塔喷干成粉制剂，用于应用测试。
实施例5：本发明中木聚糖酶突变体在肉鸡养殖中应用实验
试验产品：木聚糖酶XYNTF0、XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04 和XYNTF05(10万U/g)
试验设计：试验过程选择体况相似、健康无病的肉雏鸡，分为7组，每组3800 只，每组设置2个重复，每个重复1900只鸡，饲养期41天，具体分组见表1。饲养41天出栏后，检测各组肉鸡的生长指标，结果如表2。
表1试验分组设计
表2不同分组的肉鸡生产性能对比
注：1.“料肉比”是根据屠宰场提供“出肉吨数”和养殖场统计耗料量计算得出。
2，欧洲效率指数＝(成活率*体重)/(料肉比*出栏天数)*10000是综合反应养殖水平的指标。
根据数据显示，试验组和对照组成活率差别不大，但添加木聚糖酶XYNTF0、XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04和XYNTF05后肉鸡出栏体重有所提高；平均料肉比比对照组分别降低2.31％、3.46％、5.25％、4.27％、5.48％和3.87％；同时添加木聚糖酶的试验组EEF相比对照组有所提高，分别提高6.49％、 12.16％、15.53％、15.64％、10.76％和13.88％。
在添加本发明中的木聚糖酶后，肉鸡在出栏重、料肉比以及欧洲效率方面都优于空白对照组，说明木聚糖酶XYNTF0、XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、 XYNTF04和XYNTF05的添加能够提高肉鸡养殖中的饲料转化率，提高生产性能。
实施例6：本发明中木聚糖酶突变体在仔猪养殖中应用实验
试验产品：木聚糖酶XYNTF0、XYNTF01、XYNTF02、XYNTF03、XYNTF04 和XYNTF05(8万U/g)
试验设计：选取日龄、窝仔数及胎次相近的健康断奶仔猪，随机分为7组，每组 80头。其中对照组饲喂全价料，其余试验组饲喂添加0.02％相应的木聚糖酶的全价料。试验周期为30天。
试验测定指标计算：
仔猪日增重＝(试验后平均体重-试验前平均体重)/试验天数；
日均耗料量＝(试验后日耗料量-试验前日耗料量)/试验天数；
料肉比＝日均耗料量/平均日增重。
养殖30天后，测定仔猪生长情况如表3。
表3仔猪生产性能对比
与对照组相比，添加了本发明中木聚糖酶的试验组的日均采食量、日增重和相应的料肉比有所变化，其中日增重普遍提高，平均提高了6.42％，料肉比普遍降低，平均降低了5.14％，说明添加本发明的木聚糖酶增加了仔猪饲料的转化率。
本实施例5和实施例6为了便于体现本发明所述木聚糖酶的应用，并不局限于在肉鸡和仔猪养殖中的应用，所述的木聚糖酶可以添加到基础日粮中，并应用于其它畜禽养殖或水产养殖中，可以在鸭、鹅、牛以及鱼类等养殖过程中配合饲料添加饲喂。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 青岛红樱桃生物技术有限公司
<120> 一类酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体及其编码基因和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 206
<212> PRT
<213> 篮状菌(Talaromyces)
<400> 1
Phe Pro Ser Glu Leu Ala Gln Arg Ala Ala Gly Asp Leu Ser Lys Arg
1 5 10 15
Gln Ser Ile Thr Thr Ser Gln Thr Gly Thr Asn Asn Gly Tyr Tyr Tyr
20 25 30
Ser Phe Trp Thr Asn Gly Gly Gly Glu Val Thr Tyr Thr Asn Gly Asp
35 40 45
Asn Gly Glu Tyr Ser Val Thr Trp Val Asp Cys Gly Asp Phe Thr Ser
50 55 60
Gly Lys Gly Trp Asn Pro Ala Asn Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ser Gly
65 70 75 80
Glu Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Val Tyr Gly Trp Thr
85 90 95
Thr Asp Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Leu Glu Ser Tyr Gly Thr Tyr
100 105 110
Asn Pro Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Gly Gln Val Thr Ser Asp Gly
115 120 125
Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Ser Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Thr Ser Thr Phe Asn Gln Tyr Trp Ser Val Arg Thr Glu Lys
145 150 155 160
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Claims (10)

1.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF01，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF02，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
3.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF03，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。
4.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF04，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示。
5.一种酶活和耐热性提高的酸性木聚糖酶突变体木XYNTF05，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
6.包含权利要求1-5任一项所述木聚糖酶突变体编码基因的重组表达载体。
7.包含权利要求1-5任一项所述木聚糖酶突变体编码基因的的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为毕赤酵母GS115和毕赤酵母X33。
8.氨基酸序列如SEQ NO: 1所示的天然木聚糖酶XYNTF0在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述木聚糖酶突变体在用于制备动物饲料添加剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述动物为鸡、鸭、猪、牛、鱼。
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