CN110218731B - 一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用，所述重组植酸酶基因的核苷酸酸序列为SEQ ID NO.1所示。产朊假丝酵母是饲料加工、动物养殖、食品发酵和酿造、谷胱甘肽、维生素B等多个应用生产中的重要的酵母菌，但是该菌没有植酸酶活性，不能对含有大量植酸的玉米、豆粕等饲料、食品、发酵工业的植物性原料中的植酸进行有效的降解和利用，不但造成磷资源的浪费，同时引起环境污染。本发明构建了表达植酸酶的产朊假丝酵母基因工程菌，能够对上述含植酸磷的植物性原料进行加工处理，促进磷的释放和吸收，节约磷资源，提高经济效益并减少环境污染。

Description

一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组植酸酶基因，工程菌及水解植酸磷的应用。

(二)背景技术

植酸又名肌醇六磷酸或环己六醇磷酸酯，广泛存在于植物籽实中，是植物性饲料中磷元素的主要储存形式，但植酸磷不能被动物直接吸收利用，必须在消化道内先水解为无机磷酸盐。猪、鸡等单胃动物以及水产动物尤其是鱼类消化系统中缺乏内源性植酸酶，无法利用饲料中的植酸磷，大部分随粪便排出，造成严重的环境污染，还造成磷的浪费。同时，植酸和矿物质，蛋白质，淀粉等物质结合，阻止动物对这些物质的吸收。

植物种子等食品、饲料原料中以植酸的形式储存着大量的磷，约占每年肥料中磷总量的65％(Lott J et al.Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits:aglobal estimate[J].Seed Sci Res,2000,10:11-33.30)。特别是家禽饲料含有植酸磷2.5-4.0g/kg(Ravindran V.Phytases in poultry nutrition:An overview[J].ProcAustPoultSciSymp,1995,7:135-139.)。如果充分利用这些植酸磷，将大幅减少全球的磷矿石这种不可再生资源的消耗。很多豆类和谷类食品中含有植酸，而植酸会抑制人体对金属离子的吸收导致人体金属离子的缺乏。研究表明在食品中添加植酸酶可以提高人体矿物质吸收率，铁的利用率提高达67-98％。

植酸酶可以水解植酸和植酸盐中磷酸单酯键，生成肌醇与磷酸(或磷酸盐)，从而促进植酸磷的释放和动物吸收。因此，将植酸酶作为饲料添加剂可以提高动物对于这些营养物质的消化吸收。近年来，植酸酶添加到饲料中，可以显著降低外源无机磷的使用，也同时降低了畜牧生产区域的无机磷污染。

为解决上述问题，利用基因工程开发表达植酸酶的转基因植物、微生物工程菌成为研究和应用的热点。相关的一些专利如下：

1、一种高耐热性植酸酶酵母工程菌及其构建方法(CN103205443B)

2、一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌(CN201710913139)

3、一株表达植酸酶的酿酒酵母工程菌及其应用(CN201510189521)

4、甲醇利用型植酸酶高效表达酵母工程菌的构建方法(CN200410009775)

这些专利都是以毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)为宿主，进行植酸酶转基因工程菌构建。在饲料发酵生产中，毕赤酵母很少应用，基因工程菌的毕赤酵母以甲醇为诱导物进行基因表达，但是甲醇有毒性，发酵过程中不能被毕赤酵母彻底利用，不能用于饲料原料的发酵生产。酿酒酵母及其基因表达系统比较安全，可以应用于饲料原料加工，但是酿酒酵母繁殖慢、生物量较低，工业化生产中的培养基成本高，产生的活性物质含量低。

产朊假丝酵母(Candida utilis)又叫产朊圆酵母或食用圆酵母，是公认的生物安全菌，广泛应用于食品发酵、饲料生产。该菌产生的蛋白质、B族维生素、核酸、谷胱甘肽等重要营养及活性物质的含量都比酿酒酵母高，它能以尿素、硫酸铵等作为氮源，能利用五碳糖和六碳糖，既能利用造纸工业的亚硫酸废液，还能利用糖蜜、木材水解液等非常廉价的原料生产出人畜可食用的蛋白质。

产朊假丝酵母是饲料生产用的重要酵母菌(宋洋洋,等.饲用产朊假丝酵母优化培养研究[J].饲料研究,2017(12):18-23.)。但是，该菌和其他酵母菌一样，不产植酸酶，如果构建植酸酶的产朊假丝酵母基因工程菌，将在饲料生产加工中具有显著的优势，降低成本，带来经济效益，同时因为高效减磷而带来生态效益。构建的产朊假丝酵母工程菌也可以用于食品发酵生产。

至今尚未见有转植酸酶基因的产朊假丝酵母的报道，本发明对产朊假丝酵母进行植酸酶基因工程菌构建，并应用于含植酸的饲料原料的加工。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种重组植酸酶及水解植酸的应用，本发明对植酸酶的基因序列进行人工优化设计，添加信号肽，完整的植酸酶基因序列经化学合成后转入到产朊假丝酵母中，获得工程菌进行培养获得粗酶液用于饲料发酵，降低原料中的植酸磷。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种重组植酸酶基因，所述重组植酸酶基因的核苷酸酸序列为SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供一种重组植酸酶基因构建的产朊假丝酵母植酸酶工程菌，所述工程菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示重组植酸酶基因通过酶切位点Xba I、BamHⅠ克隆到产朊假丝酵母的表达载体pGAPURA的相应位点，形成重组表达载体pGAPURA-yk1，转化大肠杆菌，提取pGAPURA-yk1质粒，转化至产朊假丝酵母，获得产朊假丝酵母植酸酶工程菌。所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC 1314(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)。

本发明还提供一种所述重组植酸酶基因在水解植酸磷中的应用，具体所述的应用为：以含所述重组植酸酶基因的产朊假丝酵母植酸酶工程菌经发酵培养获得的发酵液为酶源，加入含植酸磷的原料和水，在28～37℃条件下进行水解(自然pH下进行，优选4.5-7.5，更优选6.5-7.0)，实现对原料中植酸磷的降解；所述原料包括植物性饲料或食品原料，优选为豆粕；所述酶源加入量以植酸酶酶活计为0.3～1.5U/g原料，优选1.2U/g原料，所述水体积用量以原料重量计为0.5L/kg。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：

(1)含重组植酸酶基因的产朊假丝酵母植酸酶工程菌接种至YPD固体培养基上，28℃培养2天，获得活化单菌落；YPD固体培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH自然；

(2)挑取YPD平板培养基上活化的单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，28-30℃、200rpm过夜培养，获得种子液；YPD液体培养基是将YPD固体培养基中琼脂去除；

(3)将种子液以体积浓度1-5％(优选1％)的接种量接种于YPD液体培养基中，28-30℃、200rpm发酵培养至OD₆₀₀为0.7-1.2(优选0.8)，获得发酵液。

本发明所述豆粕为市场购买的豆粕(中粮集团，黄海豆粕)。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

产朊假丝酵母是饲料加工、动物养殖、食品发酵和酿造、谷胱甘肽、维生素B等多个应用生产中的重要的酵母菌，但是该菌没有植酸酶活性，不能对含有大量植酸的玉米、豆粕等饲料、食品、发酵工业的植物性原料中的植酸进行有效的降解和利用，不但造成磷资源的浪费，同时引起环境污染。

本发明构建了表达植酸酶的产朊假丝酵母基因工程菌，能够对上述含植酸磷的植物性原料进行加工处理，促进磷的释放和吸收，节约磷资源，提高经济效益并减少环境污染，本发明工程菌释放无机磷含量为582.6mg/kg豆粕，对豆粕中植酸磷的降解释放率为84.2％。

(四)附图说明

图1产朊假丝酵母的表达载体pGAPURA图谱。

图2转化子的电泳图，泳道M是DNA分子量标准；泳道1、2、3指三个转化子中扩增出目标基因，即获得了植酸酶基因工程菌。

图3为释放无机磷含量测定(*代表差异的显著性)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

1、基因合成和载体构建

选择GenBank收录号为EU203664的植酸酶基因，根据产朊假丝酵母的密码子偏好性对该植酸酶基因ORF序列进行优化，在前面加上产朊假丝酵母分泌性酶的分泌信号肽的基因序列(GenBank登录号Y12659.1，位置766-843)，组成新的重组植酸酶基因序列(下划线为信号肽序列)，记为重组植酸酶基因yk1，核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

ATGTCGTTGACAAAAGATGCCTCAGAGGACCAAGAAGACATCAAGAGTCTCACGATGAACACTAGTTT AGTTGATTCCACAATCGCCAAAGAATACCTAAGATTATCCATTTTGACCTTGGTGTTGAGCTCCTTTACCTTGAGCGCTGCCCCATTGGCCGCACAATCTACTGGTTACACATTGGAAAGAGTTGTGATTCTAAGTAGACATGGCGTTAGATCTCCTACGAAACAAACTCAGTTGATGAATGATGTTACTCCAGACAAATGGCCTCAATGGCCAGTCAAAGCTGGCTATTTAACTCCAAGAGGTGCTGGCTTGGTAACATTGATGGGTGGCTTCTATGGAGATTATTTTAGGTCCTATGGTTTGTTGCCAGCTGGTTGTCCAGCAGATGAATCTATTTATGTTCAGGCTGACGTTGATCAGAGAACTAGGTTGACGGGTCAAGCTTTTTTGGATGGTATTGCTCCTGATTGTGGTTTGAAGGTTCATTATCAGGCTGATTTAAAGAAGATTGATCCTTTGTTCCATACAGTTGAAGCTGGTGTGTGTAAGTTGGACCCTGAAAAGACTCATCAAGCCGTTGAAAAACGTTTGGGTGGTCCATTAAATGAATTGTCTCAGAGATATGCTAAGCCATTTGCTCTTATGGGTGAGGTTTTGAATTTTTCTGCTTCTCCTTATTGCAATTCTCTACAACAAAAAGGAAAGACTTGTGATTTCGCAACTTTTGCTGCCAATGAAATTGAAGTCAATAAGGAAGGTACTAAAGTTTCTTTGTCTGGTCCTTTGGCTTTATCTTCTACTTTGGGTGAAATATTTCTGTTGCAGAATTCTCAGGCTATGCCTGATGTTGCTTGGAATAGGTTGTCTGGTGAAGAAAATTGGATTTCTTTGTTGTCTTTGCATAACGCTCAATTTGACTTGATGGCTAAGACTCCTTATATAGCTAGGCATAAAGGTACTCCTTTGTTGCAACAAATTGATACTGCTTTGGTTTTGCAAAGAGATGCTCAGGGTCAGACTTTGCCATTATCTCCACAGACCAAACTGTTGTTTTTGGGCGGTCATGATACTAATATTGCTAATATTGCTGGTATGTTGGGTGCTAATTGGCAGCTACCACAACAACCAGATAATACTCCTCCAGGCGGTGGTTTAGTTTTTGAATTGTGGCAGAATCCAGATAATCATCAAAGATATGTTGCTGTTAAGATGTTTTACCAAACAATGGAACAACTAAGAAACGCCGATAAATTGGATCTAAAAAATAATCCAGCTAGAATTGTTCCAATTGCTATTGAAGGTTGTGAAAATGAAGGTGATAATAAATTGTGTCAATTGGAAACTTTTCAAAAAAAAGTTGCTCAAGTTATTGAACCAGCTTGTCATATTTAA。

该序列两端添加限制性内切酶位点Xba I、BamHⅠ，完整的序列委托基因合成公司(常州基宇生物科技公司)进行化学合成。合成后的序列通过酶切位点Xba I、BamHⅠ克隆到产朊假丝酵母的表达载体pGAPURA(图1)的相应位点，形成重组表达载体pGAPURA-yk1，在大肠杆菌中繁殖并提取质粒：

重组表达载体pGAPURA-yk1对大肠杆菌转化方法：

1)购买上海生工公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞，取50μL冰浴10min。

2)加入5μL重组表达载体pGAPURA-yk1质粒，冰浴30min。

3)混合液于42℃热激90s，立即冰上放置2min。

4)加入450μL LB液体培养基(1L：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶剂为水，pH 7.2)，使终体积为500μL。37℃，150rpm培养1h。

5)取100μL涂布于LB(含100μg/mL氨苄青霉素)平板(1L上述LB液体加琼脂15g，pH7.2)，37℃培养箱中培养12h。

6)挑取转化子菌落进行质粒测序，选择序列和构建正确的克隆进行繁殖，提取pGAPURA-yk1质粒后保存，用于产朊假丝酵母进行转化。

2、产朊假丝酵母植酸酶工程菌的构建

1)产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC 1314(中国工业微生物菌种保藏管理中心)单菌落接种至YPD固体培养基上，28℃培养2天，获得活化单菌落；YPD固体培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH自然；

2)挑取YPD固体培养基上活化的单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，获得种子液；YPD液体培养基是将YPD固体培养基中琼脂去除；

3)取2.5mL种子液接种于50mL YPD液体培养基中，28℃、200rpm培养4h至OD₆₀₀为0.6；将50mL菌液(OD₆₀₀为0.6)在6000rpm、4℃离心5min；沉淀用20mL无菌水洗涤一次，离心去上清，再用0.1mol/L LiAc溶液1mL充分悬浮细胞，并将悬液转移至1.5mL EP管中，12000rpm、4℃离心1min，弃上清。细胞沉淀加入400μL 0.1mol/L LiAc，震荡悬浮获得菌悬液，取50μL菌悬液于1.5mL EP管中备用。

表1加样体系

4)在冰上配制表1所述加样体系(按照从上到下的顺序依次加入，注意冰上操作)，剧烈振荡1min，将体系充分混合，28℃保温30min。42℃水浴热激25min。12000rpm、4℃离心1min，弃上清液。加1mL无菌水到1.5mL离心管中，用移液枪轻轻悬浮，尽量避免剧烈振荡。取200μL菌液涂布于含100μg/mL潮霉素的YPD固体培养基平板上，放置在30℃培养箱培养3～4d，获得转化子，即候选产朊假丝酵母植酸酶工程菌；获得的转化子进一步用PCR进行分子鉴定筛选产朊假丝酵母植酸酶工程菌。设计植酸酶基因序列内部引物(扩增产物约1kb，F引物：5-CATTGATGGGTGGCTTCTATG-3；R引物：5-CAACCTTCAATAGCAATTGGAA-3)，利用菌落PCR方法进行扩增，反应体系见表2，反应程序见表3，PCR反应完成后用琼脂糖凝胶电泳检测，获得了预期长短的扩增片段(图2)。图2中，泳道M是DNA分子量标准；泳道1、2、3指三个转化子中均扩增出目标基因，即获得了植酸酶基因工程菌。

表2菌落PCR反应体系

表3 PCR反应程序

5)这些转化子确定为产朊假丝酵母植酸酶工程菌，选择1号转化子进行下一步应用实验。

3、工程菌植酸酶酶活测定

植酸酶酶活性测定采用钼蓝法，测定原理是：植酸酶在一定温度和pH值条件下，水解底物植酸钠生成无机磷与肌醇衍生物，无机磷在酸性环境中与钼酸铵显色剂反应生成蓝色复合物，在700nm处有特征吸收峰，根据700nm处吸光值变化可计算得植酸酶活性。酶活性定义：在37℃，pH 5.5的条件下，每毫升液体每分钟从5mmol/L的植酸钠溶液中释放出1μmol的无机磷为一个酶活力单位U。测定步骤如下：

1)将步骤2获得的产朊假丝酵母植酸酶工程菌接种至YPD液体培养基，在37℃，pH5.5的条件下培养24h，培养液离心去除菌体细胞后，上清液即为分泌表达的植酸酶液样品。取上清液用两倍体积的NaAc缓冲液(pH 4.5)进行稀释，室温(25-30℃)放置，待测。

2)将50μL步骤1)植酸酶液样品加入离心管中，37℃恒温水浴预热5min，加入950μL、1.5mmol/L植酸钠水溶液混匀，37℃反应15min，加入1mL终止液三氯乙酸(TCA)混匀，再加入钼酸铵显色液2mL(称取1g钼酸铵，7.32g硫酸亚铁用少量水溶解，向其中加3.2mL浓硫酸，加蒸馏水用100mL容量瓶定容)，室温静置10min，用酶标仪测定700nm波长处样品的吸光值。

同样条件下，50μL步骤1)植酸酶液样品加入离心管中，加入1mL终止液三氯乙酸(TCA)混匀，37℃恒温水浴预热5min，加入950μL、1.5mmol/L植酸钠水溶液混匀，37℃反应15min，再加入钼酸铵显色液2mL，室温静置10min，用酶标仪测定700nm波长处样品的吸光值，作为对照。

按下式(1)计算植酸酶的活性：

式(1)中：

X—植酸酶的活性，单位为酶活性单位每毫升(U/mL)；y─根据实际样液的吸光值由磷标准曲线计算出的无机磷的量，单位为微摩尔(μmol)；t─酶解反应时间，单位为分钟(min)；n─植酸酶液样品的稀释倍数；m─植酸酶液样品量，单位为毫升(mL)。

磷标准曲线制作：称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾于100mL容量瓶中，用0.25mol/L乙酸缓冲液(pH5.5)溶解，并定容至100mL，终浓度为50mmol/L。稀释成系列不同浓度(1.56，3.12，6.25，12.5，25mmol/L)，37℃反应15min，加入1mL终止液三氯乙酸(TCA)混匀，再加入钼酸铵显色液2mL(称取1g钼酸铵，7.32g硫酸亚铁用少量水溶解，向其中加3.2mL浓硫酸，加蒸馏水用100mL容量瓶定容)，室温静置10min，用酶标仪测定700nm波长吸光值，以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出磷标准曲线回归方程，y＝0.103x+0.018，R²＝0.9978。通过上述方法，测定的发酵液中的植酸酶酶活为13.25U/mL。

实施例2利用产朊假丝酵母植酸酶工程菌发酵制备粗酶

选取实施例1构建的产朊假丝酵母植酸酶工程菌进行发酵，通过重组酶的信号肽进行植酸酶的分泌表达，获得的发酵液就是具有植酸酶活性的粗酶液。

1)将产朊假丝酵母植酸酶工程菌接种在YPD固体培养基上，28℃活化培养2天，获得活化菌体；

2)挑取活化菌体单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200rpm，摇床培养24h，获得OD₆₀₀为0.8的发酵液。取发酵液于离心管中，10000rpm离心3min，弃菌体，保留上清液，即粗酶液，备用。

3)对酶活进行测定。粗酶液酶活测定同实施例1。结果证明，重组植酸酶在产朊假丝酵母中成功表达，粗酶液中的植酸酶酶活为12U/mL，可以进行进一步的浓缩制取酶制剂或进行直接应用。

实施例3利用产朊假丝酵母植酸酶工程菌进行饲料原料豆粕发酵处理去除植酸

1、产朊假丝酵母植酸酶工程菌发酵液的获得：

1)将产朊假丝酵母植酸酶工程菌接种在YPD固体培养基上，28℃活化培养2天，获得活化菌体；

2)挑取活化菌体5个单菌落接种于YPD液体培养基(250mL摇瓶装液量100mL)中，30℃，200rpm，摇床培养24h，获得种子液。

3)将上述种子液以体积浓度1％的接种量接种至YPD液体培养基进行扩大培养，30℃，200rpm，摇床培养24h，获得OD₆₀₀为0.8发酵液，植酸酶酶活为12.82U/mL。

2、利用产朊假丝酵母植酸酶工程菌发酵液体外水解豆粕，具体发酵条件如下：

发酵原料：豆粕(黄海豆粕，中粮集团生产，含水量12.8％)。料水比：豆粕(kg)：水(L)，1:0.5。

取10kg豆粕，按照上述料水比和5L自来水混匀，100℃高压湿热灭菌5min，待温度降到到40℃以下后，接种步骤1制备的1L发酵液，充分混匀后，置于清洗干净的不锈钢托盘(50x30cm)，铺料厚度15cm，用两层无菌纱布覆盖，28℃下进行豆粕固态发酵48h，pH自然(即6.5-7.0)。

同样条件下，以接种未转植酸酶基因的产朊假丝酵母出发菌株、未发酵的豆粕(无菌水代替发酵液，相同料水比)为对照，28℃发酵48h，测定植酸降解情况。

3、植酸测定：取上述各处理豆粕100g，80℃干燥箱烘干至恒重。各取10g，在研钵中研磨，过40目筛后，取0.1g加入试管中，加入1mL、0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 6.0)，加入1ml钼酸铵显色液，室温静置10min，用酶标仪测定700nm波长处样品的吸光值，根据实施例1磷标准曲线测定所释放的无机磷含量。

对未发酵处理、出发菌处理、植酸酶工程菌处理的释放无机磷含量进行差异性分析，发现工程菌释放无机磷含量为582.6mg/kg豆粕，比出发菌株明显高(P<0.01，图3)。此外，未发酵处理豆粕中无机磷含量为692.3mg/kg豆粕，因为豆粕中无机磷主要是植酸磷形式存在，因此，植酸酶工程菌处理豆粕对植酸磷的降解释放率为84.2％。该实验表明获得的产朊假丝酵母植酸酶工程菌可以有效地水解豆粕中的植酸并释放出无机磷，在动物饲料中显示出较高的应用价值。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组植酸酶基因、产朊假丝酵母植酸酶工程菌及应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1401

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atgtcgttga caaaagatgc ctcagaggac caagaagaca tcaagagtct cacgatgaac 60

actagtttag ttgattccac aatcgccaaa gaatacctaa gattatccat tttgaccttg 120

gtgttgagct cctttacctt gagcgctgcc ccattggccg cacaatctac tggttacaca 180

ttggaaagag ttgtgattct aagtagacat ggcgttagat ctcctacgaa acaaactcag 240

ttgatgaatg atgttactcc agacaaatgg cctcaatggc cagtcaaagc tggctattta 300

actccaagag gtgctggctt ggtaacattg atgggtggct tctatggaga ttattttagg 360

tcctatggtt tgttgccagc tggttgtcca gcagatgaat ctatttatgt tcaggctgac 420

gttgatcaga gaactaggtt gacgggtcaa gcttttttgg atggtattgc tcctgattgt 480

ggtttgaagg ttcattatca ggctgattta aagaagattg atcctttgtt ccatacagtt 540

gaagctggtg tgtgtaagtt ggaccctgaa aagactcatc aagccgttga aaaacgtttg 600

ggtggtccat taaatgaatt gtctcagaga tatgctaagc catttgctct tatgggtgag 660

gttttgaatt tttctgcttc tccttattgc aattctctac aacaaaaagg aaagacttgt 720

gatttcgcaa cttttgctgc caatgaaatt gaagtcaata aggaaggtac taaagtttct 780

ttgtctggtc ctttggcttt atcttctact ttgggtgaaa tatttctgtt gcagaattct 840

caggctatgc ctgatgttgc ttggaatagg ttgtctggtg aagaaaattg gatttctttg 900

ttgtctttgc ataacgctca atttgacttg atggctaaga ctccttatat agctaggcat 960

aaaggtactc ctttgttgca acaaattgat actgctttgg ttttgcaaag agatgctcag 1020

ggtcagactt tgccattatc tccacagacc aaactgttgt ttttgggcgg tcatgatact 1080

aatattgcta atattgctgg tatgttgggt gctaattggc agctaccaca acaaccagat 1140

aatactcctc caggcggtgg tttagttttt gaattgtggc agaatccaga taatcatcaa 1200

agatatgttg ctgttaagat gttttaccaa acaatggaac aactaagaaa cgccgataaa 1260

ttggatctaa aaaataatcc agctagaatt gttccaattg ctattgaagg ttgtgaaaat 1320

gaaggtgata ataaattgtg tcaattggaa acttttcaaa aaaaagttgc tcaagttatt 1380

gaaccagctt gtcatattta a 1401

Claims (6)

1.一种重组植酸酶基因构建的植酸酶工程菌，其特征在于，所述重组植酸酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

所述植酸酶工程菌以产朊假丝酵母为宿主；

所述植酸酶工程菌按如下方法构建：将SEQ ID NO.1所示重组植酸酶基因通过酶切位点Xba I、BamH Ⅰ克隆到产朊假丝酵母的表达载体pGAPURA的相应位点，形成重组表达载体pGAPURA-yk1，转化大肠杆菌，提取pGAPURA-yk1质粒，转化至产朊假丝酵母，获得产朊假丝酵母植酸酶工程菌；

所述产朊假丝酵母为产朊假丝酵母(Candida utilis)CICC 1314。

2.一种权利要求1所述重组植酸酶基因构建的植酸酶工程菌在水解植酸磷中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含所述重组植酸酶基因的植酸酶工程菌经发酵培养获得的发酵液为酶源，加入含植酸磷的原料和水，在28～37℃、pH4.5～6.5条件下进行水解，实现对原料中植酸磷的降解。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述原料包括豆粕。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述酶源加入量以植酸酶酶活计为0.3～1.5U/g原料，所述水体积用量以原料重量计为0.5L/kg。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：

(1)含重组植酸酶基因的工程菌接种至YPD固体培养基上，28℃培养2天，获得活化单菌落；YPD固体培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/L，溶剂为去离子水，pH自然；

(2)挑取YPD平板培养基上活化的单菌落接种于5mL的YPD液体培养基中，28-30℃、200rpm过夜培养，获得种子液；YPD液体培养基是将YPD固体培养基中琼脂去除；

(3)将种子液以体积浓度1-5％的接种量接种于YPD液体培养基中，28-30℃、200rpm发酵培养至OD600为0.7-1.2，获得发酵液。

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