CN100432213C - 一种编码高温植酸酶基因的重组菌和该基因及其合成、克隆和表达 - Google Patents

Abstract

一种编码高温植酸酶基因的重组菌和该基因及其合成、克隆和表达，属于微生物基因工程领域。本发明提供了经化学和生物合成以及体外人工进化方法获得的、编码一种耐高温植酸酶基因NcphyN，提供了NcphyN的核苷酸序列，提供了含有NcphyN的重组质粒pUC-NcphyN和酵母表达载体pNCphyN，以及用酵母表达载体pNCphyN构建重组酵母，获得重组菌CCTCC M206008。本发明可用于植酸酶工业化生产的基因工程菌的构建和现有植酸酶基因的分子改造，可用于植酸酶的高密度发酵制备以提高微生物发酵法生产植酸酶的水平和质量，还可以用于动植物的基因转化并达到改善物种品质的目的。

Description

一种编码高温植酸酶基因的重组菌和该基因及其合成、克隆和表达

技术领域

一种编码高温植酸酶基因的重组菌和该基因及其合成、克隆和表达，属于微生物基因工程领域。具体地说是通过基因工程的手段设计一套编码新型高温植酸酶的寡核苷酸，再运用基因全合成方法获得编码新型高温植酸酶基因NcphyN，将其克隆到酵母表达载体中，通过同源重组的原理获得重组菌，进而可实现在酵母中高效表达和制备重组蛋白质。

技术背景

植酸(phytic acid)化学名称为环己六醇六磷酸酯，又称六磷酸肌醇，是由一分子的肌醇和六分子的磷酸组成。分子式为C₆H₁₈O₂₄P₆，分子量为660.08。

植酸广泛存在于植物中，特别是在谷类、豆类和油料作物种子中含量丰富。植物籽实中的磷主要是以植酸磷的形式贮存。植酸容易同许多二价金属离子，如Ca²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺等结合形成植酸盐(复合盐或者是单盐)，降低自由离子的浓度。

植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase；EC 3.1.3.8)是一类可以水解植酸的酸性磷酸酶，能催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇。这一性质使得植酸酶在饲料工业中具有很重要的应用意义。植物来源组分在饲料中占很大的比重，而植物中的磷元素又主要是以植酸的形式存在。有些谷物、油料作物中的植酸含量甚至高达1％-3％。由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸的酶系，因此植酸不能被单胃动物分解生成无机磷，而是随着粪便被排出体外，进入到环境中。这样既造成磷元素的大量浪费，需要人们在饲料中额外添加磷元素，同时大量的磷元素被排放到环境中，加剧了环境污染。此外，植酸还是强抗营养因子，能螯合Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺等金属离子形成难溶性植酸盐络合物，能与带正电荷的蛋白质、维生素等形成难溶复合物，影响蛋白质、维生素的吸收并降低了饲料的营养价值。作为单胃动物的饲料添加剂，植酸酶的饲喂效果已经得到充分的确证：它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，减少了饲料中无机磷的添加量，动物粪便中无机磷排出量减少40％，减轻了环境的磷污染量；植酸酶还能解除植酸对金属离子和蛋白质的螯合作用，提高单胃动物对金属离子尤其是微量金属离子的吸收，提高蛋白质的利用率。

植酸酶大多是单亚基糖蛋白，其糖基组成及比例为甘露糖∶半乳糖∶N-乙酰葡萄糖胺＝9∶1∶3，分子量一般在40-120kDa，它们的最适pH范围在4.5-6.0，最适温度在45-60℃之间。现已知的植酸酶有3种类型，肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-Phytase，EC3.1.3.8)、肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-Phytase，EC3.1.3.26)和非特征性的正磷酸单酯磷酸水解酶(EC 3.1.3.2)。通常所说的植酸酶是指肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，编码它的基因称之为phyA(Wyss 1999，Appl.Environ.Microbiol)。PhyA的高级结构中有5对二硫键。二硫键的作用主要是参与酶活性中心空间结构的形成，因此任何破坏二硫键的变性剂都将导致酶活力的丧失。此外，二硫键还与植酸酶的耐热性有关。PhyA的晶体结构由一个大的α’结构域和一个较小的α结构域组成。α’结构域的中心是一个由6个相对应的氨基酸序列组成的β折叠片。α结构域中则共有14个α螺旋构成。在两个结构域的内表面有一很深的凹套，凹套中有酶活性中心的必需氨基酸——Arg58和His59，它们是植酸酶活性位点保守序列RHG×R×P中的前两个氨基酸。酶蛋白分子共有19个Arg。RHG×R×P序列中Arg58直接涉及其酶活性，Arg58在其晶体结构中的位置也与它的功能相吻合。底物结合部位RHG×R×P中的Arg58被认为是维持酶活所必需的残基，即底物结合部位利用其带正电荷的残基与带有负电荷的底物通过静电吸附作用形成具有特定构象的ES复合物，再借助催化部位功能，将底物水解。酶活力的丧失是由于底物结合部位中RHG×R×P的精氨酸R基被修饰。微生物中PhyA的晶体结构与鼠的低分子酸性磷酸酶的晶体结构有很高的相似性，说明它属于组氨酸族酸性磷酸酶。微生物中PhyB虽然属于组氨酸酸性磷酸酶家族，也有活性位点保守序列RHG×R×P，但它的最适底物不是植酸盐，因而只能看作是具备植酸酶活性的酸性磷酸酶。细菌植酸酶编码基因phyC较短，基因全长1152，编码383个氨基酸，N端前26个氨基酸为信号肽，所编码的酶蛋白分子量也较小，它的核苷酸序列及编码的氨基酸序列与phyA和phyB及已报道的磷酸酶基因没有同源性，也不具有phyA和phyB编码的氨基酸序列活性位点RHG×R×P保守序列，说明它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。phyA基因含1个内含子，2个最适pH；phyB基因含3个内含子，1个最适pH。

植酸酶作用于植酸，植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物IP₅、IP₄、IP₃、IP₂，终产物为肌醇和磷酸。按作用起始位点的不同，植酸酶可分为两类：3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。3-植酸酶先从植酸的第3碳位点开始水解酯键释放无机磷，然后依次水解其他位点的酯键，这类酶需要二价镁离子作为辅基，主要存在于微生物中。6-植酸酶则先从植酸的第6碳位点开始水解酯键，这类酶主要存在于植物中。植酸酶并不能彻底分解肌醇磷酸酯，要彻底分解肌醇磷酸酯，则需要酸性磷酸酶的帮助。植酸酶作用机理研究最透彻的是假单胞菌植酸酶，此外对麦麸植酸酶、无花果曲霉植酸酶的作用机理也有初步了解。理论上1g植酸完全分解可释放出281.6mg无机磷。

植酸酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中均有发现。据报道目前注册的植酸酶蛋白序列接近200种，其中大部分是从自然界发现的，也包括许多人工改造过的，还不断有新的天然酶被发现。然而能应用于饲料工业的天然植酸酶并不是很多。这主要是以下两因素起到了限制作用：一、饲喂单胃动物的植酸酶的最适pH值最好能与动物消化系统如胃、肠等器官的pH环境一致，这样才有利于被摄入的植酸酶较好的发挥作用。据报道(韩正康，1991)，猪胃中食糜pH值在1.8-3.6之间，十二指肠食糜pH值在3.9-7.0之间。鸡的胃糜pH则在4.5-4.8之间，十二指肠在5.7-6.0之间。因此，当植酸酶的最适pH范围越宽，对猪、鸡等动物消化道pH环境适应性越强。二、饲料加工过程中的热处理，如制粒、膨化等工艺对植酸酶的活性有直接影响，许多植酸酶不能经受比较高的加工温度(通常是75℃-93℃)，因而也限制了它的应用(王红宁2000，四川农业大学学报)。

目前植酸酶的研究重点为微生物来源的植酸酶，尤其是真菌来源的植酸酶已经有许多的报道，像Aspergillus ficuum，A.fumiga tus，A.niger，A.terrus，A.oryzae，Emericella nidulans，Mycleiophthora thermophila，Neurosporacrassa，Thermomyces lanuginose(Berka 1998，Appl.Environ.Microbiol；Mitchell 1997，Microbiology；Zhou，et al 2006，FEMS Microbiol Lett)等等。与植物来源的植酸酶相比，微生物植酸酶具有较大的pH值范围，有的pH值在2.5-5.5之间，与单胃动物的肠胃生理条件接近。而植物来源的植酸酶作用pH值在5.0-7.5之间，且耐热性能不好，在饲料加工过程中不能耐受80℃制粒温度(Simons 1990，Br J Nutr)。现在用于工业生产植酸酶的微生物主要是黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉等，它们能分泌较高活性的胞外酶，并且作用pH在酸性范围内。这些酶在37℃时具有较好的酶活性，但也不大能经受制粒时的高温。而从嗜温微生物M.thermophila，A.terreus等分离到的高温植酸酶最适温度在70-80℃，虽然有很好的耐温性，但它在37℃(植酸酶在动物体内的作用温度)时酶的活性极低，没有使用价值。所以如何使得酶能短暂的耐高温且在动物正常体温下具有高酶活性是目前包括植酸酶在内的饲用酶制剂急需解决的一个问题。此外，饲喂单胃畜禽的植酸酶属酸性植酸酶，并不适用于淡水养殖的鲤鱼科鱼类，因为鲤鱼科鱼类无胃，只有pH呈中性的肠道，要使添加在鱼饲料中的植酸酶发挥作用必需使用最适pH为中性的中性植酸酶。目前开发中性植酸酶也成为研究的热点。近年报道的芽孢杆菌植酸酶具有近乎中性的最适pH值，酶活性高，热稳定性好，有可能广泛应用于鱼类饲料(Choi 2001，J ProteinChem)。

植酸酶的研究已有近40年历史。20世纪70年代中期，限制养殖业的磷排泄量成为欧共体成员国实施的环境保护议会指引的核心内容之一。欧洲开始致力于寻找全面解决无机磷污染的方案。直到1980年，荷兰Wageningen大学找到植酸酶基因，Gist-brocades公司(DSM的前身)确认了植酸酶的功能，植酸酶的开发成为可能。德国巴斯夫(BASF)和Gist-brocades率先利用基因转移技术，于1989年首次成功地用A.niger工业化规模生产商品植酸酶。1990年获得欧洲饲料添加剂管理机构的全面批准认可，酶他富(Natuphos)为商品名上市。从此，各国以大学、研究所和各类商业研究机构为主纷纷投入了大量的人力物力资源从事开发研究。如今，在国际市场上至少已有几家公司生产的近10个品种，在中国国内至少有3-5家企业已经开发出植酸酶产品。还有更多的企业和研究机构正在从事植酸酶的开发工作。

对植酸酶的研究开发大致有两条途径：一、通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二、通过基因工程的手段克隆性能优良的植酸酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。以上两种途径都有成功的例子报道。如1994年Marisa等人对无花果曲霉NRLL3115进行紫外诱变，选育出产酶量为野生型菌株3.3倍的突变株。1997年陈红歌等人对黑曲霉MAO21进行紫外、亚硝基胍诱变获得一株植酸酶高活性菌株，其酶活力是原始菌株的3.6倍。1991年Van Gorcom等将无花果曲霉的植酸酶基因phyA在淀粉葡萄糖苷酶的启动子的控制下，克隆到黑曲霉CBS513.88中表达，产酶量提高1400倍。1998年姚斌等将筛选的高产植酸酶的黑曲霉的植酸酶基因克隆到毕赤氏酵母中，表达量比原菌株高3000倍。并同时开发了利用生物反应器大规模、低成本生产饲料添加剂植酸酶的工艺。但是，该植酸酶存在一个不容忽视的缺陷：不能耐受较高的温度，在加工过程中酶活力单位大量丧失(Kim 1998，Enz Microbial Tech)。从A.fumiga分离的植酸酶能够耐受90-100℃高温，而且能在较宽的pH范围内降解植酸，因此具有很大的市场潜力(Vall Loon 1998，Appl Environ Microbiol)。根据A.fumigatus的植酸酶基因序列，用化学合成和体外基因重排等技术在酵母中高效表达了此酶，酶活力为130,000u/ml。表达量是野生型基因的13倍。经高密度发酵，蛋白表达量为每升5.6g。但此酶的不足之处是：经过基因重排后重组植酸酶的比酶活也仅为23,000u/mg(中国发明专利02136531.8)，仅为野生型A.niger植酸酶的四分之一。

本实验室先前从粗糙脉胞霉(N.crassa)CICIM F00021克隆出编码植酸酶的基因Ncphy(GenBank AY536581)并在毕赤酵母中进行了初步表达及酶学性质的分析(Zhou et al 2006，FEMS Microbiol Lett；沈微等2006，微生物学通报)。此酶的特性适合饲料工业的应用如具有明显的耐高温性能，80℃和20min，保留58％的酶活，同等条件下，黑曲霉植酸酶仅保存28％的酶活；具有广pH有效性和稳定性，在pH2.0-8.0之间有植酸酶活性，在pH3.5-9.5之间，有较好的pH稳定性；对环境因子具有较好的抗性，Mg²⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺和EDTA等对其酶活影响很小。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码高温植酸酶基因的重组菌和该基因及其合成、克隆和表达，采用化学合成和分子体外组合技术寻找一种在酵母中高效表达的高温植酸酶基因，通过同源重组的原理获得重组菌，进而可实现在酵母中高效表达和制备重组蛋白质。

本发明技术方案：提出了一种编码高温植酸酶基因的重组菌，其命名为Pichia pastoris CICIM MMY0018，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M206008。该植酸酶基因的重组菌CCTCC M206008的制备方法是将构建的重组质粒pNCphyN据同源重组原理，通过电转化的方法转入毕赤酵母ACCC2124中，所获得的重组菌CCTCC M206008最终实现高温植酸酶基因NcphyN在其中的表达。以tRNA分析软件分析酿酒酵母和毕赤酵母基因组，获得tRNA编码基因特征和密码子使用频率参数。以粗糙脉孢菌(N.crassa)CICIM F00021植酸酶编码基因(GenBank AY536581)的核苷酸序列为基础，使用DNAMAN软件，设计了一组80条用于新基因合成的寡核苷酸，运用DNA合成仪经化学合成获得这组寡核苷酸，该组寡核苷酸在同一条链上是相邻的，而与其互补的链有若干碱基是重叠的，重叠区域的解链温度控制在45-50℃。用两步体外拼接和扩增技术进行全基因的合成，获得全长基因NcphyN(详见实施例2)。将基因NcphyN克隆入pUC19的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-NcphyN。重组质粒pUC-NcphyN用于对NcphyN的序列测定和提供后续实验用NcphyN。EcoRI酶切重组质粒pUC-NcphyN、电泳分离、割胶回收获得全长NcphyN，在其5’端上游连接上经合成获得的甲醇诱导型启动子和MFα信号肽序列，将此组合基因片段克隆入酵母整合型载体pRS303K(Christof Taxis and Michael Knop.Biotechnique 40：73-78)的多克隆位点中，获得高温NcphyN的酵母表达载体pNCphyN；重组质粒pNCphyN依据同源重组原理，通过电转化的方法转入毕赤酵母ACCC 2124，构建含基因NcphyN的重组菌毕赤酵母CCTCC M206008和制备重组酶。

基因NcphyN的核苷酸序列如下：

gaattcatgt taagggttct atctccaaat ccagctagtt gcgactctcc agaattgggg 60

tatcagtgca attctgaaac tacacatact tggggccaat acagcccttt tttttctgtc 120

ccgagtgaaa tcagcccaag cgtgccagag ggttgcagac tgactttcgc gcaagtactg 180

agtagacatg gcgccagatt ccccactcca ggcaaagctg ccgccatttc cgctgtttta 240

accaagatta agacgtctgc tacttggtat gcgcccgatt ttgaatttat caaggattat 300

aactatgtat tgggtgtaga tcacctaaca gctttcggtg agcaggaaat ggttaactct 360

ggtattaagt tctaccagcg ttatgctagt ctgattagag attatacaga tcctgaatct 420

ctgcctttta tcagagcatc aggtcaggaa agggtaattg cgtcggcaga aaatttcact 480

accggatttt actctgcgtt gcttgccgat aagaaccctc ctccaagctc tctgccactt   540

ccacgtcaag aaatggtcat tatatcggaa tcccctacgg caaacaatac tatgcatcat   600

ggtttgtgta gagcgttcga ggattctaca acaggtgatg ctgcccaagc taccttcatc   660

gctgcaaact ttccacctat cactgctaga ctgaacgcac aaggttttaa aggagtgacg   720

ttatctgata ccgatgtcct ttcattgatg gacctaaggc ccttcgatac tgtcgcctac   780

ccaccttcat cgagcttaac aacctcaagc tcaccatccg ggggcagtaa actatctccc   840

ttctgtagtc tttttacggc gcaggatttt accgtttatg actatttaca atccctaggc   900

aaattttacg gctacgggcc aggtaactct ttggcagcta ctcagggtgt cggctacgtc   960

aacgagttac tagcgagatt gacagtctca ccggtcgtag ataacactac tacaaattct  1020

acactggatg gaaatgaaga tactttccca ttatcgagaa atcgtactgt ttttgcagat  1080

tttagtcacg acaacgatat ggtcggtata ttgactgccc taaggatctt cgaaggtgtc  1140

gatgccgaga agatgatgga caatacaact atcccaagag agtatggtga gacgggcgac  1200

gatcctgcta acttgaagga aagggagggg ctatttaagg taggttgggt tgtcccattt  1260

gcagctagag tttattttga gaaaatgata tgcgatggtg atggaagtgg tgagatggtt  1320

caatctgagg aggaacagga caaagagtta gtacgtatac tagtcaacga tcgtgtggtt  1380

aagttgaatg gatgtgaagc tgacgagctg gggagatgca aacttgataa gttcgtagaa  1440

tctatggaat ttgcaaggag aggtggtgat tgggacaaat gttttgctta atgaattc    1498

其中，ta atga为终止密码子。

本发明的有益效果：

1、本发明的植酸酶具有明显的高比酶活，比酶活为125,000u/mg。是黑曲霉野生型植酸酶的1.2倍，A.fumigatus重组植酸酶的5.1倍。

2、本发明的重组菌表达植酸酶得到很大的提高，比野生菌株的产酶水平提高了3050倍。本发明中的植酸酶在制备过程中损失量得到有效的改善。

附图说明

图1构建成的细菌克隆植酸酶载体。

图2酵母表达植酸酶载体。

图3重组酵母表达植酸酶的蛋白电泳图谱。lane 1：protein molecularweight markers comprising rabbit phosphorylase b(97,400)，bovine serumalbumin(66,200)，rabbit actin(43,000)，bovine carbonic anhydrase(31,000)，trypsin inhibitor(20,100)，hen egg white lysozyme(14,400)；lane 2：purified phytase；lane 3：unpurified phytase。

生物材料样品保藏

含有编码高温植酸酶基因的重组菌Pichia pastoris CICIM MMY0018，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2006年1月14日，保藏编号为CCTCCM206008。

具体实施方式

实施例1：高温植酸酶基因全合成用的寡核苷酸序列的设计和寡核苷酸的化学合成。

以粗糙脉胞霉(N.crassa)CICIM F00021(AS 3.1604)植酸酶编码基因(GenBank AY536581)的核苷酸序列为基础，使用DNAMAN软件，设计了一组80条寡核苷酸，运用DNA合成仪经化学合成获得这组寡核苷酸，80条寡核苷酸的核苷酸序列为：

F0  catgaattca tgttaagggt tctatctcca aatccagcta gttgc

R0  ccccaattct ggagagtcgc aactagctgg atttgg

F1  gactctccag aattggggta tcagtgcaat tctgaaac

R1  ggccccaagt atgtgtagtt tcagaattgc actgata

F2  tacacatact tggggccaat acagcccttt tttttctg

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F3  tcccgagtga aatcagccca agcgtgccag agg

R3  cgaaagtcag tctgcaaccc tctggcacgc ttgg

F4  gttgcagact gactttcgcg caagtactga gtagac

R4  gggaatctgg cgccatgtct actcagtact tgcg

F5  atggcgccag attccccact ccaggcaaag ctg

R5  acagcggaaa tggcggcagc tttgcctgga gtg

F6  ccgccatttc cgctgtttta accaagatta agacgtc

R6  gcgcatacca agtagcagac gtcttaatct tggttaaa

F7  tgctacttgg tatgcgcccg attttgaatt tatcaagga

R7  tctacaccca atacatagtt ataatccttg ataaattcaa aatcgg

F8  ttataactat gtattgggtg tagatcacct aacagctttc g

R8  taaccatttc ctgctcaccg aaagctgtta ggtga

F9  gtgagcagga aatggttaac tctggtatta agttctacc

R9  tcagactagc ataacgctgg tagaacttaa taccagagt

F10 agcgttatgc tagtctgatt agagattata cagatcctga a

R10 ctctgataaa aggcagagat tcaggatctg tataatctct aa

F11 tctctgcctt ttatcagagc atcaggtcag gaaagg

R11 ctgccgacgc aattaccctt tcctgacctg atg

F12 gtaattgcgt cggcagaaaa tttcactacc ggatttta

R12 ggcaagcaac gcagagtaaa atccggtagt gaaatttt

F13 ctctgcgttg cttgccgata agaaccctcc tcca

R13 gaagtggcag agagcttgga ggagggttct tatc

F14 agctctctgc cacttccacg tcaagaaatg gtca

R14 cgtaggggat tccgatataa tgaccatttc ttgacgtg

F15 ttatatcgga atcccctacg gcaaacaata ctatgcatca

R15 acgctctaca caaaccatga tgcatagtat tgtttgc

F16 tggtttgtgt agagcgttcg aggattctac aacagg

R16 tagcttgggc agcatcacct gttgtagaat cctcga

F17 tgatgctgcc caagctacct tcatcgctgc aaa

R17 gcagtgatag gtggaaagtt tgcagcgatg aagg

F18 ctttccacct atcactgcta gactgaacgc acaag

R18 ataacgtcac tcctttaaaa ccttgtgcgt tcagtcta

F19 gttttaaagg agtgacgtta tctgataccg atgtcctttc

R19 ggccttaggt ccatcaatga aaggacatcg gtatcag

F20 attgatggac ctaaggccct tcgatactgt cgcc

R20 ctcgatgaag gtgggtaggc gacagtatcg aag

F21 tacccacctt catcgagctt aacaacctca agctca

R21 tactgccccc ggatggtgag cttgaggttg ttaag

F22 ccatccgggg gcagtaaact atctcccttc tgtagt

R22 tcctgcgccg taaaaagact acagaaggga gatagtt

F23 ctttttacgg cgcaggattt taccgtttat gactatttac a

R23 cgtaaaattt gcctagggat tgtaaatagt cataaacggt aaaa

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R25 caatctcgct agtaactcgt tgacgtagcc gacacc

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R26 tgtagaattt gtagtagtgt tatctacgac cggtgagact gt

F27 gataacacta ctacaaattc tacactggat ggaaatgaag atact

R27 cgatttctcg ataatgggaa agtatcttca tttccatcca g

F28 ttcccattat cgagaaatcg tactgttttt gcagatttta gt

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F35 gagatggttc aatctgagga ggaacaggac aaagagt

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F36 tagtacgtat actagtcaac gatcgtgtgg ttaagttgaa

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F37 tggatgtgaa gctgacgagc tggggagatg caa

R37 tagattctac gaacttatca agtttgcatc tccccagct

F38 acttgataag ttcgtagaat ctatggaatt tgcaaggaga g

R38 tttgtcccaa tcaccacctc tccttgcaaa ttcca

F39 gtggtgattg ggacaaatgt tttgcttaat gaattcgc

R39 ctgccaagtt caagactagc gaattcatta agcaaaaca

实施例2.高温植酸酶基因NcphyN的全合成和克隆

高温植酸酶基因NcphyN的全合成采用寡核苷酸体外拼接和扩增技术分两步进行。第一步，在50μl反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L dNTPs4μl，1-20μmol/L的全部80条寡核苷酸和0.5 U的Pfu DNA聚合酶加双蒸水补足50μl。寡核苷酸拼接PCR扩增条件是1×(95℃ 2min)；35×(94℃ 30s，45-52℃ 30s，70 ℃2min 30s)；1×(70℃ 10min)。第二步，在50μl反应体系中，加入上述寡核苷酸拼接产物2μl，10X PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTPs 4μl，1mmol/L引物F0 1μl，1mmol/L引物R39 1μl和0.5U的Pfu DNA聚合酶，加双蒸水补足到50μl。PCR扩增条件是1×(95℃2min)；35×(95℃30s，52℃ 30s，70℃ 2min30s)；1×(70℃ 10min)。引物F0序列的下划线部分为人工引入的EcoRI酶切位点，引物R39序列的下划线部分为人工引入的EcoRI酶切位点。

合成NcphN设计的寡核苷酸，密码子为酵母偏好性密码子，寡核苷酸长度为28-41个碱基不等，相邻寡核苷酸的两端含有15-25个碱基的互补序列。

NcphyN的克隆：合成的基因NcphyN通过引物F0和引物R39在基因的两端都人工引入了EcoRI酶切位点。将获得的合成基因纯化后，用EcoRI酶切并克隆入pUC19的EcoRI位点中，获得克隆载体pUC-NcphyN，序列测定确认基因合成成功，如图1所示。合成获得的基因NcphyN与粗糙脉胞霉(N.crassa)CICIMF00021植酸酶编码基因(GenBank AY536581)的同源性为73.7％。

实施例3：酵母表达植酸酶载体构建

用EcoRI酶切pUC-NcphyN，电泳分离，割胶回收NcphyN全长，在其5’端上游连接上经合成获得的甲醇诱导型启动子和MFα信号肽序列(gccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaaagtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaggatccaaacgatgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagcttacgtagaattc)，将此组合基因片段克隆入酵母整合型载体pRS303K的多克隆位点中，获得高温NcphyN的酵母表达载体pNCphyN；如图2所示。

实施例4：表达植酸酶重组酵母的构建

将活化的毕赤氏酵母菌株Pichia pastoris ACCC 2124于500ml YPD(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中30℃培养18h，至OD₆₀₀＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500ml，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清液，用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，作为感受态细胞用于电击转化。

大量抽提酵母表达载体pNCphyN，在50μl P.pastoris ACCC 2124感受态细胞中加入0.1μg纯化pNCphyN，冰浴5min，用Bio-Rad GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25uF。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/L山梨醇，取200ul涂布于YPD-G418(YPD培养基中补加2mg/ml抗生素G418，购自Sigma公司)，良好生长的菌落通过酵母菌落PCR的方法鉴定转化子，阳性重组酵母Pichia pastoris CICIM MMY0001-MMY0081用于产植酸酶发酵试验。

重组酵母菌菌株的高密度发酵：将获得的5株重组毕赤氏酵母分别接种于20mL YPD液体培养基，30℃振荡培养至稳定期。离心收集菌体，转入100mL MGY培养基(1.34％YNB，1％甘油，4×10^-5％生物素)中30℃、200r/min剧烈振荡培养48h，离心收集菌体，转入30mL MM培养基(1.34％ YNB，0.5％甲醇，4×10^-5％生物素)液体培养基中30℃剧烈振荡培养至7d，每隔12h进行植酸酶活性测定。重组菌发酵液酶活在10,000～56,000u/mL不等。其中，重组酵母CICIM MMY0018(CCTCC M206008)最高产植酸酶水平为56,800u/mL，比野生菌株粗糙脉孢菌(N.crassa)CICIM F00021的产酶水平提高了3050倍。

实施例5：植酸酶的制备和纯化

8,000r/min×10min冷冻离心收集重组酵母CICIM MMY0018(CCTCCM206008)的发酵液，装入透析带中透析脱盐，透析带悬浮在生理盐水中，透析时保持温度在4℃，透析2d后至发酵液基本透明无色。取透析后的发酵液15mL用Amicon Ultrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)在4500g转速下离心25min，获得终体积约为500μL的液体，浓缩倍数大约为30倍。然后以0.25M、pH5.5的乙酸钠溶液为洗脱液，将得到的500μL的浓缩液通过Superdex 200column(Pharmacia Biotech)进行分离。洗脱液分步收集，每管收集1mL液体。根据测得的蛋白质峰对应的试管编号，进行植酸酶活的测定。将具有酶活的洗脱液合并，上样于阴离子交换层析柱DEAE-52，用0-1.0mol/L NaCl，0.25mol/L NaAc，pH6.0梯度洗脱。测出有明显酶活的收集管，用AmiconUltrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)浓缩后进行SDS-PAGE电泳。采用Bradford法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准。重组菌发酵液比空载体对照明显多出一条蛋白条带。电泳图谱结果见图3，重组酶分离纯化后达电泳均一，分子量接近60kDa，为单亚基蛋白。比酶活为125,000u/mg。

实施例6：植酸酶酶学性质分析

重组酶的最适pH

pH缓冲液：0.2mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH 2.0、2.5、3.0、3.5)，0.2mol/L乙酸钠缓冲液(pH 4.0、4.5、5.0、5.5)，0.2mol/L咪唑-盐酸缓冲液(pH 6.0、6.5)，0.2mol/L Tri s缓冲液(pH 7.0、8.0)。将重组酶纯酶(30μg/mL)120μL稀释到480μL，取40μL分别在pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0测定酶活。计算相对酶活确定最适pH。测定条件下，重组酶的最适pH为3.5-5.5，pH5.5时酶活达到最大值。pH2.0-8.0之间具有活性。

重组酶的最适反应温度的测定

将重组酶纯酶(30μg/mL)120μL稀释到480μL，取40μL分别在25、37、45、50、55、60、65、70、80℃温度下测定酶活，计算相对酶活确定最适温度。测定条件下，重组酶的最适温度为60℃。25-70℃之间维持较好活性。

重组酶对温度的稳定性测定

将重组酶纯酶(30μg/mL)70μL稀释到280μL，取15μL分别在30、40、50、60、70、80、90℃温浴10、20、60min，立即取出，冰浴30min后在37℃测酶活。计算相对酶活比较重组酶对温度的稳定性。重组酶对温度的稳定性的研究表明重组酶在70-90℃加热20min后，相对酶活仍然剩余39％-58％，与文献报道的毕赤氏酵母表达的黑曲霉植酸酶相比要高些。

重组酶与商品植酸酶热稳定性的比较

在80℃时，将重组酶与商品酶分别加热5、10、15、20min立即取出，冰浴30min后在37℃测酶活，并计算相对酶活。重组酶在80℃加热后出现了热激活现象。重组酶与商品酶在80℃热稳定性比较发现，当加热到15、20min时重组酶比商品酶酶活下降幅度要小。

重组酶pH稳定性的测定

将重组酶纯酶(30μg/mL)70μL稀释到280μL，取15μL在pH 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5室温放置24h。然后再在37℃、pH5.5的条件下测定酶活，计算相对酶活比较重组酶对pH的稳定性。该酶在pH3.5-9.5之间，稳定性较好。

重组酶动力学参数K_m与V_max值的测定

将重组酶纯酶(30μg/mL)70μL稀释到280μL，取20μL置于不同浓度(5、2.5、1.25、1、0.5、0.25mM)的底物植酸钠中测定酶活，反应速度用每min生成的无机磷的量(μmol)表示，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算K_m与V_max值。K_m与V_max值分别为228M、128mol/mg·min。

不同金属离子对重组酶酶活的影响

将20μL重组酶纯酶(30μg/mL)分别加入到280μL 1mM浓度的Zn²⁺、Mn²⁺、M²⁺、Ca²⁺、Al³⁺等金属盐溶液中，室温放置30min。再加200μL NaAc，至体积为500μL再测酶活，酶活测定方法同前，并计算相对酶活。Mg²⁺、Ca²⁺、Al³⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Zn²⁺和EDTA等对其酶活影响很小。

Claims (5)

1、一种编码高温植酸酶基因的重组菌，其命名为Pichia pastoris CICIMMMY0018，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M206008。

2、如权利要求1所述植酸酶基因的重组菌CCTCC M206008的制备方法，其特征是将构建的重组质粒pNCphyN依据同源重组原理，通过电转化的方法转入毕赤酵母ACCC 2124中，所获得的重组菌CCTCC M206008最终实现高温植酸酶基因NcphyN在其中的表达。

3、一种在权利要求1中所述重组菌CCTCC M206008中实现表达的人工合成的高温植酸酶基因NcphyN，其核苷酸序列为：

gaattcatgt taagggttct atctccaaat ccagctagtt gcgactctcc agaattgggg  60

tatcagtgca attctgaaac tacacatact tggggccaat acagcccttt tttttctgtc  120

ccgagtgaaa tcagcccaag cgtgccagag ggttgcagac tgactttcgc gcaagtactg  180

agtagacatg gcgccagatt ccccactcca ggcaaagctg ccgccatttc cgctgtttta  240

accaagatta agacgtctgc tacttggtat gcgcccgatt ttgaatttat caaggattat  300

aactatgtat tgggtgtaga tcacctaaca gctttcggtg agcaggaaat ggttaactct  360

ggtattaagt tctaccagcg ttatgctagt ctgattagag attatacaga tcctgaatct  420

ctgcctttta tcagagcatc aggtcaggaa agggtaattg cgtcggcaga aaatttcact  480

accggatttt actctgcgtt gcttgccgat aagaaccctc ctccaagctc tctgccactt  540

ccacgtcaag aaatggtcat tatatcggaa tcccctacgg caaacaatac tatgcatcat  600

ggtttgtgta gagcgttcga ggattctaca acaggtgatg ctgcccaagc taccttcatc  660

gctgcaaact ttccacctat cactgctaga ctgaacgcac aaggttttaa aggagtgacg  720

ttatctgata ccgatgtcct ttcattgatg gacctaaggc ccttcgatac tgtcgcctac  780

ccaccttcat cgagcttaac aacctcaagc tcaccatccg ggggcagtaa actatctccc  840

ttctgtagtc tttttacggc gcaggatttt accgtttatg actatttaca atccctaggc  900

aaattttacg gctacgggcc aggtaactct ttggcagcta ctcagggtgt cggctacgtc  960

aacgagttac tagcgagatt gacagtctca ccggtcgtag ataacactac tacaaattct  1020

acactggatg gaaatgaaga tactttccca ttatcgagaa atcgtactgt ttttgcagat  1080

tttagtcacg acaacgatat ggtcggtata ttgactgccc taaggatctt cgaaggtgtc  1140

gatgccgaga agatgatgga caatacaact atcccaagag agtatggtga gacgggcgac  1200

gatcctgcta acttgaagga aagggagggg ctatttaagg taggttgggt tgtcccattt  1260

gcagctagag tttattttga gaaaatgata tgcgatggtg atggaagtgg tgagatggtt  1320

caatctgagg aggaacagga caaagagtta gtacgtatac tagtcaacga tcgtgtggtt  1380

aagttgaatg gatgtgaagc tgacgagctg gggagatgca aacttgataa gttcgtagaa  1440

tctatggaat ttgcaaggag aggtggtgat tgggacaaat gttttgctta atgaattc    1498

其中，ta at ga为终止密码子。

4、如权利要求3所述高温植酸酶基因NcphyN的合成、克隆和表达方法，其特征是

(A)NcphyN的合成：以克隆的粗糙脉胞霉(N.crassa)CICIM FO0021(AS 3.1604)植酸酶编码基因的核苷酸序列(GenBank AY536581)为基础，使用DNAMAN软件，设计了一组80条寡核苷酸，运用DNA合成仪经化学合成获得这组寡核苷酸，80条寡核苷酸的核苷酸序列为：

F0  catgaattca tgttaagggt tctatctcca aatccagcta gttgc

R0  ccccaattct ggagagtcgc aactagctgg atttgg

F1  gactctccag aattggggta tcagtgcaat tctgaaac

R1  ggccccaagt atgtgtagtt tcagaattgc actgata

F2  tacacatact tggggccaat acagcccttt tttttctg

R2  gctgatttca ctcgggacag aaaaaaaagg gctgtatt

F3  tcccgagtga aatcagccca agcgtgccag agg

R3  cgaaagtcag tctgcaaccc tctggcacgc ttgg

F4  gttgcagact gactttcgcg caagtactga gtagac

R4  gggaatctgg cgccatgtct actcagtact tgcg

F5  atggcgccag attccccact ccaggcaaag ctg

R5  acagcggaaa tggcggcagc tttgcctgga gtg

F6  ccgccatttc cgctgtttta accaagatta agacgtc

R6  gcgcatacca agtagcagac gtcttaatct tggttaaa

F7  tgctacttgg tatgcgcccg attttgaatt tatcaagga

R7  tctacaccca atacatagtt ataatccttg ataaattcaa aatcgg

F8  ttataactat gtattgggtg tagatcacct aacagctttc g

R8  taaccatttc ctgctcaccg aaagctgtta ggtga

F9  gtgagcagga aatggttaac tctggtatta agttctacc

R9  tcagactagc ataacgctgg tagaacttaa taccagagt

F10 agcgttatgc tagtctgatt agagattata cagatcctga a

R10 ctctgataaa aggcagagat tcaggatctg tataatctct aa

F11 tctctgcctt ttatcagagc atcaggtcag gaaagg

R11 ctgccgacgc aattaccctt tcctgacctg atg

F12 gtaattgcgt cggcagaaaa tttcactacc ggatttta

R12 ggcaagcaac gcagagtaaa atccggtagt gaaatttt

F13 ctctgcgttg cttgccgata agaaccctcc tcca

R13 gaagtggcag agagcttgga ggagggttct tatc

F14 agctctctgc cacttccacg tcaagaaatg gtca

R14 cgtaggggat tccgatataa tgaccatttc ttgacgtg

F15 ttatatcgga atcccctacg gcaaacaata ctatgcatca

R15 acgctctaca caaaccatga tgcatagtat tgtttgc

F16 tggtttgtgt agagcgttcg aggattctac aacagg

R16 tagcttgggc agcatcacct gttgtagaat cctcga

F17 tgatgctgcc caagctacct tcatcgctgc aaa

R17 gcagtgatag gtggaaagtt tgcagcgatg aagg

F18 ctttccacct atcactgcta gactgaacgc acaag

R18 ataacgtcac tcctttaaaa ccttgtgcgt tcagtcta

F19 gttttaaagg agtgacgtta tctgataccg atgtcctttc

R19 ggccttaggt ccatcaatga aaggacatcg gtatcag

F20 attgatggac ctaaggccct tcgatactgt cgcc

R20 ctcgatgaag gtgggtaggc gacagtatcg aag

F21 tacccacctt catcgagctt aacaacctca agctca

R21 tactgccccc ggatggtgag cttgaggttg ttaag

F22 ccatccgggg gcagtaaact atctcccttc tgtagt

R22 tcctgcgccg taaaaagact acagaaggga gatagtt

F23 ctttttacgg cgcaggattt taccgtttat gactatttac a

R23 cgtaaaattt gcctagggat tgtaaatagt cataaacggt aaaa

F24 atccctaggc aaattttacg gctacgggcc aggtaac

R24 ctgagtagct gccaaagagt tacctggccc gtagc

F25 tctttggcag ctactcaggg tgtcggctac gtcaa

R25 caatctcgct agtaactcgt tgacgtagcc gacacc

F26 cgagttacta gcgagattga cagtctcacc ggtcgta

R26 tgtagaattt gtagtagtgt tatctacgac cggtgagact gt

F27 gataacacta ctacaaattc tacactggat ggaaatgaag atact

R27 cgatttctcg ataatgggaa agtatcttca tttccatcca g

F28 ttcccattat cgagaaatcg tactgttttt gcagatttta gt

R28 accatatcgt tgtcgtgact aaaatctgca aaaacagta

F29 cacgacaacg atatggtcgg tatattgact gccc

R29 gacaccttcg aagatcctta gggcagtcaa tataccg

F30 taaggatctt cgaaggtgtc gatgccgaga agatgatg

R30 tcttgggata gttgtattgt ccatcatctt ctcggcatc

F31 gacaatacaa ctatcccaag agagtatggt  gagacgggc

R31 caagttagca ggatcgtcgc ccgtctcacc atactc

F32 gacgatcctg ctaacttgaa ggaaagggag gggc

R32 caacccaacc taccttaaat agcccctccc tttcctt

F33 tatttaaggt aggttgggtt gtcccatttg cagctagag

R33 cgcatatcat tttctcaaaa taaactctag ctgcaaatgg ga

F34 tttattttga gaaaatgata tgcgatggtg atggaagtgg t

R34 cctcagattg aaccatctca ccacttccat caccat

F35 gagatggttc aatctgagga ggaacaggac aaagagt

R35 tcgttgacta gtatacgtac taactctttg tcctgttcct

F36 tagtacgtat actagtcaac gatcgtgtgg ttaagttgaa

R36 cgtcagcttc acatccattc aacttaacca cacga

F37 tggatgtgaa gctgacgagc tggggagatg caa

R37 tagattctac gaacttatca agtttgcatc tccccagct

F38 acttgataag ttcgtagaat ctatggaatt tgcaaggaga g

R38 tttgtcccaa tcaccacctc tccttgcaaa ttcca

F39 gtggtgattg ggacaaatgt tttgcttaat gaattcgc

R39 ctgccaagtt caagactagc gaattcatta agcaaaaca

NcphyN的全合成采用寡核苷酸体外拼接和扩增技术分两步进行：第一步，在50μl反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，1-20μmol/L的全部80条寡核苷酸和0.5U的Pfu DNA聚合酶，加双蒸水补足50μl；PCR扩增条件是95℃2min；94℃30s，45-52℃30s和70℃2min 30s，35次循环；70℃10min；第二步，在50μl反应体系中，加入上述寡核苷酸拼接产物2μl，10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，1mmol/L引物FO 1μl，1mmol/L引物R391μl和0.5U的PfuDNA多聚酶，加双蒸水补足50μl；PCR扩增条件是95℃2min；95℃30s，52℃30s和70℃2min 30s，35次循环；70℃10min；引物FO序列的下划线部分为人工引入的EcoRI酶切位点，引物R39序列的下划线部分为人工引入的EcoRI酶切位点；

(B)NcphyN的克隆：合成的NcphyN两端都人工引入了EcoRI酶切位点，通过EcoRI酶切，将NcphyN克隆入pUC19的EcoRI位点中，获得克隆载体pUC-NcphyN；

(C)NcphyN的表达：EcoRI酶切克隆载体pUC-NcphyN、电泳分离、割胶回收获得全长NcphyN，在其5’端上游连接上经合成获得的甲醇诱导型启动子和MFα信号肽序列，将此组合基因片段克隆入酵母整合型载体pRS303K的多克隆位点中，获得高温NcphyN的酵母表达载体pNCphyN；

所述甲醇诱导型启动子和MFα信号肽序列组合基因片段为：

gccatccgacatccacaggtccattctcacacataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactag

cagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcctcttctcctcaacacccacttttgccatcgaaaa

accagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaattccttctattaggctactaacacc

atgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgtttatttccgaatgcaa

caagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtcaaatagtttc

atgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcgtg

atctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaactt

ccaaaagtcgccataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaa

tgcttagcgcagtctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaac

acccgctttttggatgattatgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactg

ctgatagcctaacgttcatgatcaaaatttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaaca

gaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttttatcatcattattagcttactttcataattgcgac

tggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaacgacaacttgagaagatcaaaaaacaac

taattattcgaaggatccaaacgatgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcc

tccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgt

catcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaata

acgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgag

aaaagagaggctgaagcttacgtagaattc。

5、根据权利要求4所述高温植酸酶基因NcphyN的合成、克隆和表达方法，其特征是NcphyN的合成：设计寡核苷酸，密码子为酵母偏好性密码子，寡核苷酸长度为28-41个碱基不等，相邻寡核苷酸的两端含有15-25个碱基的互补序列。

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