KR100381374B1

KR100381374B1 - 신규한 파이테즈 유전자 발현벡터 및 그를 이용한 재조합파이테즈를 생산하는 형질전환된 피치아 파스토리스효모균주

Info

Publication number: KR100381374B1
Application number: KR10-2000-0034477A
Authority: KR
Inventors: 최윤재; 복진덕; 강승하; 조재순
Original assignee: 주식회사 중앙바이오텍
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2003-04-23
Also published as: KR20020000935A

Abstract

본 발명은 피치아 아노말라(Pichia anomala) 유래의 파이테즈(phytase) 유전자를 클로닝하여 만든 신규한 재조합 플라스미드 pGP1를 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris(pho1)) 효모균주에 도입하여 형질전환하는 것으로, 프라이머를 이용하여 상기 피치아 아노말라의 파이테즈 유전자를 PCR로 증폭하고 클로닝하여 재조합 파이테즈를 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드 pGP1의 제조, 이 재조합 플라스미드를 자체 인분해효소가 발현되지 않는 돌연변이체 피치아 파스토리스(pho1)에 주입하여 형질전환시킨 피치아 파스토리스(Pichia pastoris(pho1))-pGP1를 선발하고 이 형질전환체를 배양 후 얻은 재조합 파이테즈를 정제하여 SDS-PAGE 겔로 전기영동한 결과 상기 재조합 플라스미드 벡터로부터 다량의 재조합 파이테즈가 발현됨을 확인함으로써 다량의 신규한 파이테즈를 분비하는 형질전환된 균주를 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

신규한 파이테즈 유전자 발현벡터 및 그를 이용한 재조합 파이테즈를 생산하는 형질전환된 피치아 파스토리스 효모균주 {Expression vector(pGP1) for a novel phytase and Pichia pastoris-pGP1 transformant producing recombinant phytase}

본 발명은 피치아 아노말라(Pichia anomala)의 파이테즈(phytase) 유전자 발현 벡터 및 그를 이용한 신규한 재조합 파이테즈를 생산하는 효모균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 피치아 아노말라 유래의 파이테즈 유전자가 삽입된 재조합 벡터를 피치아 파스토리스 효모 균주에 도입해 형질 전환시키고 이를 발효 배양하여 재조합 파이테즈를 생산하는 형질전환된 신규한 효모균주에 관한 것이다.

최근 가축의 분뇨로 인한 환경 및 수질 오염의 문제가 심각히 대두되고 있기 때문에 이를 줄이기 위한 연구가 필요하다. 축산에서 환경 및 수질 오염의 원인이 되는 많은 요소들 가운데 특히 인은 생체 내 구성 물질 중에서 중요한 성분 중의 하나로 동물에 필수적인 영양소이지만, 사료 내 존재하는 인의 이용률이 매우 낮아 환경 오염의 주범이 되고 있다. 동물의 사료에 존재하는 인의 이용률을 보면, 20-30%의 유기태 인만을 이용하고 나머지는 모두 배설하기 때문에 심각한 수질오염을 야기시킬 뿐 아니라 낮은 인의 이용률 때문에 사료에 무기태 인을 첨가해 주어 사료비용을 높이고 또한 곡물의 피틴태 인은 다른 영양소나 필수 광물질과 결합하여 항 영양인자로도 작용하는 등 문제점이 있다. 그러므로 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 가축 사료 내의 잠재적 오염원이며 항 영양인자로 작용하는 인을 최대한 이용할 수 있도록 하는 저공해 사료의 개발이 시급한 실정이다.

효모는 전통적으로 술과 빵의 역사와 더불어 인류의 생활에 기여해 왔으며, 주류와 빵의 발효에 있어서 가장 중요한 역할을 해 왔다. 최근 자연과학의 진보로 효모의 균체성분과 그 대사의 신비가 밝혀짐에 따라 효모의 균체가 고등 동물의 우수한 영양원이 될 뿐만 아니라 중요한 생화학적 물질의 보고이며 또한 효모의 대사에 의한 각종 유용 물질의 생산이 가능하다는 것 등이 규명되어 효모의 유용성은 점차 증가되고 있는 실정이다.

효모의 유용성으로는 첫째, 효모는 단백질의 구조 보존(structural integrity), 용해도, 생물학적 활성(biological activity) 등에 중요한 역할을 하는 당쇄부가(glycosylation)를 행할 수 있고, 둘째, 효모는 비 병원성이며 무해한 GRAS(generally recognized as safe) 미생물이어서 식품 및 의약품 생산에 안정성이 입증되었으며, 셋째, 효모는 단백질을 세포 외로 분비 생산하여 정제 공정의 수율 향상에 기여할 수 있다. 메틸자화(methylotropic) 효모 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris)는 메탄올(methanol)에 의해 발현이 정교하게 잘 조절되며 높은 발현율을 가지는 프로모터(promotor)인 AOX1 프로모터를 사용할 수 있다는 장점과 고농도의 세포 배양을 할 수 있다는 장점을 가지고 있어서 최근 외래 단백질 대량 발현을 위한 숙주로써 많은 연구가 되고 있다.

파이틱 산(Phytic acid, myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate)은 가금 및 돼지 사료의 대부분의 공급원인 곡물의 주요 구성 성분이다. 파이틱 산의 형태로 존재하는 인은 파이테즈(myo-inositol hexaphosphate phosphohydrolase) 효소의 작용에 의해서 미오-이노시톨(myo-inositol)과 무기태 인으로 가수분해되어 가축이 이용할 수 있는 무기태 인의 형태로 전변시킬 뿐만 아니라 여러 광물질의 이용성을 증가시킨다. 그러나 이들 사료 내 2/3 이상 존재하는 피틴태 인은 단위 동물에서 분해효소인 파이테즈의 부재로 이용할 수 없었다.

이런 이유로 파이테즈효소 또한 다른 효소들처럼 단위 가축 사료에 효소 첨가제로 사용되고 있다. 파이테즈의 사료 내 첨가로 인해 인 이용성의 증진 뿐 아니라 가축 분뇨로 배설되는 유기태 인의 함량이 감소된다는 많은 연구가 보고되었으며, 이러한 파이테즈의 첨가로 인한 유기태 인의 감소는 환경문제 해결뿐만 아니라, 값비싼 광물질의 대체 물질로서의 역할을 충분히 담당할 것으로 사료된다. 따라서 본 발명은 유기태 인을 감소시키기 위해 파이테즈를 효과적으로 생산하기 위한 발현 벡터를 구축하고 이들 재조합 벡터를 숙주세포 피치아 파스토리스에 주입하여 파이테즈를 효과적으로 생산하기 위해 실시되었다.

본 발명자들은 최근 가축 분뇨로 인한 환경의 수질오염 문제를 감소시키기 위해 곡물 내 피틴태 인을 분해하는 효소인 파이테즈를 생산하는 생균제를 만들기 위한 방법의 일환으로 유전자 재조합 기법을 사용하여 파이테즈 발현 벡터를 구축하고 이를 피치아 파스토리스 균주에 형질전환시켜 재조합 파이테즈를 생산하는 균주를 만들었다. 현재 대부분의 연구자들이 사용하는 프로모터로는 gal 프로모터 (Saccharomyces)나 AOX1 프로모터(P. pastoris)등 유도성 프로모터들을 사용하는데 본 발명에서는 목적상 사료 첨가제로 사용하기 위한 것이고 또 갈락토오스 (galactose)나 메탄올(methanol)등은 사료나 동물체 내에서 만나기 어려운 유도 인자이므로 피치아(Pichia)균이 동물체 내에서 생존시 발현이 안 되는 단점이 있어 연속적으로 발현되는 연속적 프로모터(constitutive promotor)인 GAP(glyceraldeh-yde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터를 사용하였고 피치아 아노말라 파이테즈의 분비 인자(signal peptide)를 그대로 사용하여 발현시 세포 밖으로 분비되도록 하였다.

본 발명은 기존의 연구자들이 피치아(Pichia)에서 연구한 효소 역가가 높다고 보고한 인분해효소의 염기서열(sequence)을 바탕으로 프라이머를 제작하고 이 프라이머를 바탕으로 여러 가지 다른 피치아에서 genomic DNA를 추출하여 PCR로 증폭된 절편(fragment)을 효모용 벡터에 삽입(ligation)시킨 후 인분해효소 (phosphatase)를 발현 할 수 없는 돌연변이된 피치아 파스토리스에 형질 전환시켜 파이테즈 활성도(activity)를 측정하였다. 종래에는 효소를 대량 생산하기 위해 유도성 프로모터를 사용한 후 정제하여 사료에 첨가하는 방법을 사용하였으나, 본 발명은 효소를 정제하는 과정 없이 형질 전환된 효모 배양액 자체를 사료에 첨가하는 방법으로 배양액 내에서 생산되는 파이테즈 뿐만 아니라 효모의 일부가 동물의 위장을 통과해 소장, 대장에서 살아 남았을 때 연속적으로 파이테즈를 발현할 수 있는 효소 생균제를 생산하는 장점이 있고 또한 생산 효율적인 면에서도 정제 비용을 절감할 수 있어서 효율적인 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 피치아 아노말라(Pichia anomala)로부터 유래한 파이테즈 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 파이테즈 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 도입하여 형질 전환된 신규한 피치아 파스토리스 효모 균주를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 효모균주가 생산하는 재조합 파이테즈 효소를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 피치아 아노말라(Pichia anomala) 유래의 파이테즈 (phytase) 유전자를 PCR을 이용하여 정확한 부분만을 증폭시켜 이것을 효모용 벡터에 삽입하여 파이테즈 발현을 위한 벡터를 구축한 후 인분해효소가 돌연변이되어 발현하지 않는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모균주에 도입하여 형질 전환시킨 후 배양하여 형질전환체를 얻고 다시 그 형질전환체를 배양하여 파이테즈 유전자 발현에 따른 단백질의 생성을 조사하고 형질 전환된 효모균주를 배양하여 생산함으로써 달성하였다.

도 1은 본 발명의 피치아 아노말라(Pichia anomala)파이테즈(phytase)를 발현하는 플라스미드 벡터 pGP1 의 제조 모식도이다.

도 2는 본 발명의 피치아 파스토리스-pGP1에서 발현 정제된 재조합 파이테즈를 SDS-PAGE겔에서 분석하여 나타난 결과이다.

본 발명은 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)-GS115 균주를 외래 단백질 생산을 위한 숙주로서 선택하고 자체 인분해효소(phosphatase)가 발현하지 않는 돌연변이체인 피치아 파스토리스(pho1) 를 만드는 단계 ; 프라이머를 이용하여 피치아 아노말라(Pichia anomala)의 genomic DNA로부터 파이테즈(phytase)유전자를 PCR 증폭하는 단계 ; 상기 증폭한 파이테즈 유전자를 벡터 pGAPZαA에 삽입시켜E.coliTop10F' 균주에 도입하여 형질 전환시킨 후 이 형질전환체로부터 파이테즈를 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드 pGP1를 분리하는 단계 ; 상기 재조합 플라스미드 pGP1로 피치아 파스토리스(pho1) 효모균주에 형질 전환시키는 단계 ; 상기 형질 전환시킨 피치아 파스토리스(pho1)-pGP1 효모균주 콜로니(colony)들을 항생제인 제오신(Zeocin)이 포함된 배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하고 상기 피치아 파스토리스(pho1)-pGP1 효모균주 콜로니들이 형질전환체임을 검정하는 단계 ; 상기 형질전환체 피치아 파스토리스(pho1)-pGP1 효모균주를 배양한 후 배양액을 파이테즈 선별 용액(phytase screening solution(PSS))으로 파이테즈 발현을 확인하고 발현량을 측정하는 단계로 구성된다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 피치아 파스토리스( Pichia pastoris)- GS115 균주를 외래 단백질 생산을 위한 숙주로서 선택하고 자체 인분해효소(phosphatase)가 발현하지 않는 돌연변이체(mutant) 피치아 파스토리스( Pichia pastoris(pho1)) 균주의 개발

문헌조사와 KCTC, ATCC등의 미생물 기탁 기관을 통하여 히스티딘 탈수소효소(histidine dehydrogenase) 활성이 결여된 영양소 요구 균주 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)-GS115 균주를 공시균주로 이용하였다. 피치아 파스토리스-GS115 균주는 YPD 배지에서 배양한 세포를 50mM EDTA로 2번 세척하고 증류수로 1번 세척한 후 15,000개의 세포를 YPD 평판배지에 깔고 UV에서 30초, 1분, 1분 30초, 2분 간격으로 노출시켜 30℃에서 배양해 벨벳천을 사용하여 다른 YPD 평판배지에 복제본(replica)을 뜬 후 그 배지에 PSS 용액을 부어 갈색으로 변하지 않는 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니는 다시 YPD 배지에 키운 후 야생균주(wild type) 피치아 파스토리스- GS115와 함께 인분해효소 및 파이테즈 분석을 실시하여 인분해효소가 돌연변이(mutation)된 피치아 파스토리스(pho1)를 선발하였다.

실시예 2 : 피치아 아노말라 유래의 파이테즈를 생산하기 위한 재조합 벡터 및 형질전환된 균주제조

제1단계 : 프라이머를 이용한 피치아 아노말라 파이테즈 유전자의 PCR 증폭

피치아 앙구스타(Pichia angusta(=Hansenula polymorpha))의Pho1 서열(sequence)을 바탕으로 아래와 같이 프라이머를 제작하고 그 프라이머를 이용하여 PCR 증폭(PCR amplification)을 실시하였다.

파이테즈의 PCR 증폭을 위한 프라이머

HPPN : 5'-TTTTTCGAAACGATGTTTTCC-3'(21mer)

SfuI

HPPC : 5'-TTTTCTCGAGTTTAGTTGTTCT-3'(22mer)

XhoI

각각의 프라이머는 pGAPZαA 벡터의SfuI와XhoI 부위에 삽입될 수 있도록SfuI/XhoI 인식 부위를 인위적으로 부가하였다. PCR 조건은 94℃에서 3분간 디내츄레이션(denaturation)시킨 다음 30 사이클(cycle)의 PCR 증폭을 실시하였다. 디내츄레이션(Denaturation)은 95℃에서 30초간, 어닐링(annealing)은 58℃에서 30초, 신장(extension)은 72℃에서 100초간 그리고 마지막 사이클(cycle)에서 마지막 신장(last extension)은 72℃에서 5분간 실시하였다. PCR을 통해 증폭된 DNA는 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)과 유전자 염기서열을 결정하여 확인하였다. 피치아 아노말라 유래의 파이테즈 염기서열은 기존에 알려진 피치아 앙구스타(=Hansenula polymorpha)의Pho1 서열과 95% 상동성을 보여 동류의 효소임을 알 수 있다. 그러나 피치아 앙구스타Pho1은 인분해효소(phosphatase)로만 알려져 있어 본 발명을 위한 연구에서 밝혀진 내용과는 상당한 차이가 있다.(6단계 참조)

제2단계 : 상기 증폭한 파이테즈 유전자를 벡터 pGAPZ αA에 삽입(ligation)하여 발현 벡터 구축

PCR를 이용하여 증폭한 파이테즈 유전자를SfuI/XhoI 제한효소처리를 하고, 마찬가지로 pGAPZαA 벡터도 동일한 제한 효소인SfuI/XhoI 제한 효소로 처리한 다음 삽입시켰다. 삽입 산물(ligation product)을 100㎕의 콤페턴트 세포(competent cell)에 섞은 후 0.2cm 큐벳에 넣은 후 400 ohms, 25㎌, 6.25KV/cm로 전기천공하여 형질 전환을 실시하였다. 형질전환 후E. coli의 배양은 low salt LB medium(10g 트립톤(tryptone), 5g 염화나트륨(NaCl), 5g 효모추출물 per liter)을 10N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 7.5로 조정하고 항생제 제오신(Zeocin)을 ml당 25㎍이 배지에 첨가되도록 하여 agar 배지에서 배양하였다. 형질전환체로부터 플라스미드 DNA를 추출한 뒤 DNA 염기서열을 확인하여 파이테즈를 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드 pGP1 벡터를 최종 선발하였다(도 1).

제3단계 : 피치아 파스토리스 (pho1) 의 형질 전환

정제한 pGP1 DNA 10 ug을 가지고 호스트로 사용할 효모인 피치아 파스토리스(pho1)에 형질 전환을 실시하였다. 먼저 DNA는AvrI 제한 효소로 소화시켜 선형으로(linear) 만들어 준 후 실행한다. 숙주균주인 피치아 파스토리스(pho1)는 YPD 배지 50mL에 접종하여 30℃에서 하룻밤 배양한 다음 500mL의 YPD 배지에 0.5mL의 종균(culture)을 접종하고 OD₆₀₀이 1.3이 될 때까지 배양하였다. 그리고, 4℃에서 1,500 ×g로 5분간 원심분리한 후 500mL의 냉각 멸균 증류수로 현탁하여 동일한 조건으로 원심분리하고 다시 250mL의 냉각 멸균 증류수로 같은 과정을 반복하여 최종 부피가 1.5mL이 되는 컴페턴트 세포(competent cell)을 만들었다. 이 컴페턴트 세포 80 ㎕과 선형(linearized) DNA 10 ㎍을 섞어 0.2 cm 전기천공용 큐벳(electroporation cuvette)에 넣고 얼음에서 5분간 정치 후 1500 volt, 200 Ω에서 전기천공을(electroporation)하여 형질전환시켰다. 그후, 즉시 1 mL의 1 M 솔비톨(sorbitol)을 붓고 멸균된 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 옮긴 후 YPD 플레이트에 깔고 30℃에서 콜로니가 형성될 때까지 배양하였다.

제4단계 : 피치아 파스토리스 형질전환체의 선별

본 단계에서는 상기 3단계에서 형성한 콜로니가 형질전환체인지 여부를 확인하기 위하여 상기 1단계의 선별 과정을 거쳤다. 벡터 내에 포함되어 있는 제오신 내성 유전자(Zeocin resistant gene)가 배지 내에 존재하는 제오신에 대해 저항성을 주는 점을 이용하여 YPD/zeosin 배지에 도말하여 살아 남은 형질전환체를 선발하였다. 다음으로 형질전환된 콜로니에 파이테즈 선별용액(PSS ; α-naphtyl phosphate 0.1%(W/V), Fast Garnet GBC salts 0.2%(W/V), 0.6M acetate buffer(pH5.5))을 부어서 갈색으로 변하는 콜로니를 선발하고 이를 피치아 파스토리스-pGP1으로 명명하였다. 본 발명자들은 이 균주를 한국과학기술연구원 생명공학연구소내 미생물기탁센터에 2000년 6월 19일자로 기탁번호 KCTC 18024P로 기탁하였다.

제5단계 : 피치아 파스토리스 pGP1의 파이테즈 발현 여부 조사

본 단계에서는 Hartingsveldt W. V., et al(1987)의 방법을 응용하여 파이테즈 분석 실험(phytase assay)을 실시하였다. 파이테즈 배양 샘플(sample)을 0.25M Na·acetate pH 5.0와 1mM Na·phytate(Sigma)가 함유된 시약에 넣어 1ml이 되게 하여 40℃에서 30분간 반응시킨 후 2ml의 시약(reagent)(10mM ammonium molybdate : 5N H₂SO₄: acetone 을 1 : 1 : 2 비율로 사용 직전 섞어 만듬) 을 첨가하여 반응시키고 200㎕ 1M citric acid를 첨가하여 반응을 중지시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

제6단계 : 피치아 파스토리스 pGP1 파이테즈의 정제 및 효소학적 특성 조사

피치아 파스토리스-pGP1를 YPD 100ml에 접종하여 30℃에서 36시간 키운 후 원심분리하여 상층액 100ml을 50mM Na. acetate buffer pH4.5로 완충시킨 음이온 교환수지인 Q6-컬럼(column)에 부착시킨 다음 두 볼륨의 같은 버퍼로 세척한 뒤 0.3M NaCl로 용출(elution)하여 순수하게 정제하였다(표 1 참조). 정제된 단백질을 음이온 세제인 SDS를 포함하는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 통해분석한 결과 67kDa의 분자량을 갖고 있음을 확인하였고 순수하게 정제되었음을 확인하였다(도 2).피치아 파스토리스-pGP1에서 발현정제된 파이테즈의 SDS-PAGE 레인 1-3 ; 3개의 클론체로부터 독립적으로 파이테즈를 Q6-column에 주입하여 10% SDS-PAGE겔에서 분석하였다. 겔에 넣은 단백질의 양은 우측이 좌측의 2배였다. 본래 피치아 파스토리스-GS115 균주가 갖고 있는Pho1효소는 분자량이 80 - 100 kDa 으로 피치아 파스토리스-pGP1에서 분리한 효소보다 크고 또한 본 발명에 사용한 숙주는Pho1을 발현하지 못하는 변종이어서 위에 정제한 효소는 피치아 아노말라에서 분리하여 형질전환된 재조합 파이테즈임이 확실하였다. 본 발명 상기 균주는 1L YPD 배지에서 배양시 배지 속으로 7,700 unit의 파이테즈를 분비하고 12,600 unit을 세포벽에 갖고 있어 총 20,300 unit을 발현하여 형질전환 전의 피치아 파스토리스-GS115 균주보다 약 20배 정도 높게 파이테즈를 발현하였다. 분리한 파이테즈의 최적 pH는 5.0이고 최적 온도는 60∼65℃ 이다. 또한 YPD 배지처럼 인이 풍부하게 존재하는 배지에서도 다량으로 파이테즈를 발현하는 점이 일반 효모와는 확연하게 달라서 인이 충분하게 함유된 배지를 이용해야 하는 산업적 규모의 대량 배양 시에도 다량으로 본 효소를 분비하므로 경제적 가치가 크다고 할 수 있다. 또한 본 발명 효모균주는 연속적으로 파이테즈를 생산하며 사료 첨가제로 동물에 제공시 장내에서도 생산이 가능한 장점이 있다. 또한 같은 종인 피치아(Pichia)에서 유래하는 파이테즈를 피치아에 형질전환시킴으로써 기존의 박테리아(bacteria)에서 유래하는 파이테즈를 피치아에 형질전환시킨 것보다 효소 생산이나 안정성 면에서 매우 우수하다고 말할 수 있다.

본 발명P. pastorispGP1에서 발현된 재조합 파이테즈(phytase)의 정제

구 분	단백질농도	효소 역가	특이적 활성도	정제 배수	회수율
상층액	0.1mg/ml	7.7U/ml(680U/total)	77U/mg	1	100%
정제후	0.74mg/ml	244U/ml(610U/total)	329U/mg	4.2	89%
[주] pH 5.0, 60℃에서 30분간 반응 시켰으며 1unit은 무기인을 1분에1μmol 분리해 낼 수 있는 효소의 양으로 정의한다.

이상의 실시예를 통하여 맹백한 바와 같이 본 발명은 상기 pGP1 벡터를 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모균주에 도입하여 형질전환시킴으로써 다량의 안정성이 뛰어난 재조합 파이테즈 효소를 생산하는 효과가 있다. 또한 상기의 효모균주를 직접 사료에 첨가하여 단위 동물에 제공함으로써 장내에서도 효소의 생산이 가능해져 파이테즈 효소 정제비용을 절감시키는 효과가 있고, 본 발명 효모균주를 사료 첨가물로 사용시 단위 동물의 분뇨 내 인의 배설량을 감소시켜 환경오염을 감소시키는 뛰어난 효과가 있으므로, 본 발명은 동물 사료 산업 및 환경보전 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

피치아 아노말라(Pichia anomala)를 하기에 기재된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 얻어진 염기단편을SfuⅠ과XhoⅠ으로 제한효소 처리하여 5'말단이SfuⅠ으로 잘리고 3'말단이XhoⅠ으로 잘린 파이테이즈 유전자를 포함한 염기단편을 pGAPZ αA에 삽입하여 제조한 재조합 플라스미드 벡터 pGP1.

HPPN : 5'-TTTTTCGAAACGATGTTTTCC-3'

HPPC : 5'-TTTTCTCGAGTTTAGTTGTTCT-3'
제 1항 기재의 재조합 플라스미드 벡터 pGP1을 함유하는 형질변환된 효모Pichia-(pastoris(pol1))-pGP1(기탁번호 KCTC 18024P).
삭제
제 2항 기재의 형질전환된 효모Pichia-(pastoris(pol1))-pGP1(기탁번호 KCTC 18024P)를 함유한 단위동물 사료.