CN1281049A

CN1281049A - 巨大芽孢杆菌青霉素g酰化酶的枯草芽孢杆菌表达元件

Info

Publication number: CN1281049A
Application number: CN 99113885
Authority: CN
Inventors: 袁中一; 杨晟; 李士云; 黄晓冬
Original assignee: Shanghai Institute of Biochemistry
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 1999-07-16
Publication date: 2001-01-24
Anticipated expiration: 2019-07-16
Also published as: CN1121498C

Abstract

一种巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢杆菌表达元件,包含枯草芽孢杆菌启动子和巨大芽孢杆菌来源青霉素G酰化酶的核糖体结合位点及其结构基因。该表达元件转入枯草芽孢杆菌宿主,获得稳定表达巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株,提高了巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达量,产酶速度快,不需诱导,传代稳定,使生产工艺简化,生产周期大为缩短,适宜于工业化生产和应用。

Description

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢杆菌表达元件

本发明涉及枯草芽孢杆菌表达系统，具体涉及到巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的枯草芽孢杆菌表达元件。

青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase EC3．5．1．11，简称PGA)能催化β-内酰胺类抗生素发生脱酰基作用而生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)，6-APA在半合成青霉素中有广泛用途，因而PGA在工业生产中越来越重要。PGA广泛存在于各种微生物中，目前都应用大肠杆菌分泌的PGA，但巨大芽孢杆菌能将PGA分泌至胞外，在工业提取上更有利。但巨大芽孢杆菌天然菌株有缺陷：在菌培养过程中需频繁加入苯乙酸诱导酶产生，且需变温发酵，即在28℃培养2天，再在25℃培养1天以诱导酶的产生，发酵周期较长，这些对于大规模发酵都是不利的。利用基因工程方法构建高产和分泌型的产酶菌，将促进其在工业上的应用。

文献报道[张兰芳等，生物工程学报，1991，7(1)，47-53；Martin L et al，FEMS Microbiology Letters，1995，125：287-92]分别克隆到巨大芽孢杆菌pga，并在大肠杆菌中作了表达。Martin等筛选到的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因在E．coli HB101中表达不需苯乙酸的诱导，但表达量十分微弱，且在胞外检测不到酶活性。张兰芳等克隆到巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因(包括结构基因及调节基因)，在E．coli MC1061中表达，表达只能在28℃进行。此外，苯乙酸的诱导对产酶是必须的。

枯草芽孢杆菌作为表达系统有以下优点：(1)能够把有功能的蛋白质直接分泌到胞外；(2)非致病性；(3)没有明显的偏爱密码子。与枯草芽孢杆菌相比，大肠杆菌属革兰氏阴性菌，由于同巨大芽孢杆菌亲缘关系较远，可能不能正确完成后加工。许多革兰氏阳性菌的蛋白质在其自身表达信号控制下可在枯草芽孢杆菌表达。当产某种蛋白的原始菌的生长条件较为苛刻时，将其基因克隆到一个多拷贝质粒中，表达水平通常能提高。此外还发现某些在枯草芽孢杆菌中表达的蛋白较之原始菌所产蛋白有更好的热稳定性或更宽的pH范围。而枯草芽孢杆菌能将不断产生的可能有害的蛋白质分泌到体外的培养基中。避免了对细胞的毒害，故可能获得高活性的青霉素G酰化酶。Kang等曾在枯草芽孢杆菌中表达巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶，但表达量较低[Kang J H etal，Journal of Biotechnology，1991，17(2)：99-108]。我们实验室对PGA在枯草芽孢杆菌中的表达做了深入广泛的研究，也曾发表过文章[黄艳红等，中国生物化学与分子生物学报，1999，15(1)：169-71]，在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中都作了表达，但是酶活水平较低，LB培养基中＜0．8U／ml。

为此，本发明目的是提供改进的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶表达元件，转入枯草芽孢杆菌宿主，获得稳定高效分泌表达PGA的枯草芽孢杆菌基因工程菌株；可使生产工艺简化，发酵周期缩短，适宜工业化生产和应用。

本发明提供改进的PGA表达元件(图1)，PGA表达元件包含枯草芽孢杆菌启动子和巨大芽孢杆菌来源PGA的核糖体结合位点及其结构基因。作为启动子序列，可使用任何一种适于在枯草芽孢杆菌中表达所需蛋白质的启动子，选用能在不同时间启动表达的重叠启动子效果更好。表达元件中的核糖体结合位点序列为GGAGGTGGAAATGTA。将启动子、核糖体结合位点和PGA结构基因以重组DNA技术按照图1所示连接得到PGA的枯草芽孢杆菌表达元件。以T4 DNA连接酶将表达元件和表达载体(表达质粒或染色体整合载体)连接，转化到枯草芽孢杆菌宿主中，获得包含上述表达元件的表达PGA的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因及其核糖体结合位点来源于巨大芽孢杆菌(如Bacillus megaterium CA4098，ATCC14945等)基因组。本发明根据已报道序列设计两端引物，直接以PCR方法扩增到结构基因和核糖体结合位点。也可以根据已报道的巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的上下游序列，用限制性内切酶建立次级文库结合菌落原位杂交的方法(需合成一段寡聚核苷酸探针)从基因组DNA中获得。

作为启动子序列，可使用任何一种适于在枯草芽孢杆菌中表达所需蛋白质的启动子，例如：P43、HpaⅡ、veg、rrnT2等。重叠启动子P43效果最佳，该启动子可在枯草芽孢杆菌生长期和静止期分别启动基因转录。表达载体可以为枯草芽孢杆菌质粒或枯草芽孢杆菌染色体整合载体，为提高表达量，采用质粒载体更具优势。枯草芽孢杆菌中构建表达质粒应首先考虑的因素是质粒的稳定性。表达质粒一般采用最稳定的pUB110或pUB110的衍生质粒(本发明实施例中的pPZW103即是包含P43启动子的pUB110衍生质粒)。选择适当的酶切位点，将巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因及其核糖体结合位点序列以T4 DNA连接酶连接于表达载体的启动子之后，即获得包含PGA表达元件的枯草芽孢杆菌表达质粒。

最后，以SP法或原生质体法或电转化法等将表达质粒导入枯草芽孢杆菌宿主细胞Bacillus subtilis 168(其它如BR151，BCL1050，DB104或WB600等均可)，获得表达PGA的枯草芽孢杆菌基因工程菌株pga-SIBAS205(于1999年6月7日保藏在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No．0398)。表达温度为37℃最佳。在LB培养基中培养24小时，上清测得PGA活力3-6U／ml，无需苯乙酸的诱导。酶活测定采用NIPAB法[上海第三制药厂等，医药工业，1978，7：22-4]。在不含抗生素选择压力的条件下，经过连续10天传代实验，产酶量无明显下降(见图3)，证明了pga-SIBAS205传代稳定。

优点：本发明提供的PGA表达元件通过优选枯草芽孢杆菌启动子来代替PGA在巨大芽孢杆菌中的原有启动子，在枯草芽孢杆菌的生长期和静止期分别启动转录，提高了转录水平，并得以避开变温发酵和苯乙酸诱导(苯乙酸的调控发生在转录水平)；通过沿用巨大芽孢杆菌原来的核糖体结合位点来保证翻译起始效率；大大提高了PGA在枯草芽孢杆菌中的表达量，产酶速度快，不需诱导，传代稳定，使生产工艺简化，生产周期大为缩短，适宜于工业化生产和应用。

附图说明：

图1：巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶的枯草芽孢杆菌表达元件示意图。

图2：青霉素G酰化酶表达质粒pEES102的构建示意图。

图3：PGA表达元件稳定性曲线图。

本发明通过以下实施例进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1 巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的克隆

1．巨大芽孢杆菌基因组的抽提

选择培养14小时的巨大芽孢杆菌CA4098抽提基因组。取3ml菌液，6000r/min离心5分钟，取400μl TE(pH8．0，10mmol／L Tris，1mmol／L EDTA)悬浮菌体，加入溶菌酶至终浓度7mg／ml菌液，37℃消化1小时，酚抽提一次，酚／氯仿抽提二次，最后由氯仿抽提一次，吸取上清，2倍体积乙醇沉淀，12，000rpm离心5分钟，沉淀用70％乙醇洗涤一遍，12，000rpm离心，弃上清，沉淀自然干燥，溶于100μl TE溶液中，加入2μl 10mg/ml RNA酶A，室温放置半小时，0．7％Agarose电泳检验。

2．引物设计及PCR反应

根据文献报道的巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶基因的序列(Martin L etal，FEMS Microbiology Letters，1995，125：287-92)，设计了两段引物进行PCR反应，PCR引物由Sangon合成：

引物1 5’GCCGAATTCGGAGGTGGAAATGTAAT3’

引物2 5’ATGGATCCTTACTTACTCATATTTAA3’

在设计基因5’端引物(引物1)包含了核糖体结合位点，同时引入了一个EcoRI酶切位点。基因3’端引物(引物2)包含了终止密码子TAG附近的序列，并引入一个BamHI酶切位点。

以巨大芽孢杆菌染色体DNA为模板，加入一定量的引物1、引物2、TaqDNA聚合酶及dNTP混合物，于92℃变性7分钟，然后按下列步骤进行30个循环：92℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，最后一次循环在72℃延伸10分钟。产物经PCR纯化试剂盒纯化，0．7％Agarose电泳检验。

3．PCR产物的克隆

PCR产物用酚／氯仿抽提除去蛋白，酒精沉淀回收DNA，抽干后重新用10μl TE溶解；pBluescript SK(+)1μg以EcoRI和BamHI消化完全，将酶切液进行0．7％Agarose电泳，回收2．96kb片段。将以上二种片段按4∶1比例混合，16℃连接过夜，转化E．coli XL1-Blue。构建的质粒称为pPGA(图2)。

实施例2青霉素酰化酶基因表达质粒pEES102的构建(图2)

将连接有青霉素酰化酶基因的pPGA质粒5μg用EcoRI消化完全，加入2μl dNTP混合物及2UKlenow酶，室温反应30分钟。用酚／氯仿抽提除去蛋白，酒精沉淀回收DNA，抽干后重新用20μl TE溶解，再用BamHI完全酶切，将酶切液进行0．7％Agarose电泳，回收2．6kb片段。同时用SmaI和BamHI酶切表达载体pPZW103(由中国科技大学生物系王培之提供)2μg，将以上二种片段按4∶1比例混合，16℃连接过夜，转化枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168。

实施例3 表达质粒在枯草芽孢杆菌中的转化

于第一天下午取一满环枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168甘油菌划平板，37℃培养箱培养过夜。第二天挑单菌落至1ml SPI培养基中(SPI培养基：SP盐加入1％体积浓度为50％(W／V)葡萄糖溶液，1％体积100×CAYE溶液；SP盐溶液：0．2％(NH₄)₂SO₄，1．4％K₂HPO₄，0．6％KH₂PO₄，0．02％MgSO₄·7H₂O，0．1％柠檬酸钠)，37℃，250rpm培养3小时。取0．1ml培养液至5ml SPⅠ培养基中，同样条件培养4小时。转移其中1．2ml至12mlSPⅡ培养基中(SPⅡ培养基：SPⅠ培养基加入1％体积50mmol·L^-1CaCl₂溶液，1％体积250mmol·L^-1MgCl₂溶液)，37℃，100rpm培养90分钟。分装成0．5ml每管，各加入5μl 10mmol／L EGTA，再于37℃，100rpm培养10分钟。加入5μl连接液，再于37℃，240rpm培养90分钟，取菌液涂布卡那霉素(50mg／L)LB平板，得转化子即是枯草芽孢杆菌基因工程菌株pga-SIBAS205。

实施例4巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶表达

从含卡那霉素60μg/ml的LB平板(LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0．5％，NaCl 1％，平板加1．5％Agar)上接SIBAS 205单菌落在LB液体培养基中，于37℃，250r／min培养24小时。离心取20μl上清。加入980μl磷酸缓冲液里，37℃温浴。再加入2ml 37℃预热的0．9mg/ml NIPAB(6-硝基-3-(苯乙酰氨基)苯甲酸)溶液。反应4分钟，取出加入2ml 95％乙醇终止反应。空白对照先加2ml 95％乙醇，后加酶液。于405nm测定吸光度。酶活力定义为：1分钟内水解产生1μmol的6-硝基-3-氨基-苯甲酸所需青霉素酰化酶的量为1单位。

发酵液上清的PGA活力为3-6u／ml。

实施例5 pEES102质粒稳定性的检测

从含卡那霉素60μg／ml LB平板上接pga-SIBAS205单菌落于3ml LB培养基中，于37℃，250rpm培养24小时。菌液离心取上清测定活力。同时取30μl菌液作为种子菌转接至3mlLB培养基中，同样条件进行传代及活力测定。

由图3可看出在不含抗生素选择压力的条件下，经过连续10天传代实验，产酶量无明显下降。

Claims

1．一种巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢杆菌表达元件，其特征在于该表达元件包含枯草芽孢杆菌启动子和巨大芽孢杆菌来源青霉素G酰化酶的核糖体结合位点及其结构基因。

2．根据权利要求1所述的表达元件，其特征在于所述启动子为枯草芽孢杆菌重叠启动子P43。

3．根据权利要求1所述的表达元件，其特征在于所述巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的核糖体结合位点的序列为GGAGGTGGAAATGTA。

4．一种包含权利要求1所述表达元件的保藏登记号为CGMCC No．0398的表达巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌株，其特征在于该菌株是将所述表达元件转化到枯草芽孢杆菌168中得到的基因工程菌株pga-SIBAS205。