CN105018452B - 溶栓酶qk基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用 - Google Patents

溶栓酶qk基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种溶栓酶QK基因、由其构建的重组表达载体、重组菌以及应用。本发明通过套叠PCR技术优化得到的溶栓酶QK基因序列可以更好地被毕赤酵母GS115识别，同时选用pHBM905A载体与优化后的溶栓酶QK基因构建形成新的重组表达载体和制备表达蛋白的重组菌，最终获得酶活性高的溶栓酶QK。该方法操作简便，降低了生产成本，具有更好的实用性。

Description

溶栓酶QK基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用
技术领域
本发明涉及一种溶栓酶QK基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用，属于生物技术领域。
背景技术
溶栓酶QK是一种来源于枯草杆菌的丝氨酸蛋白酶，类似于日本传统发酵食品——纳豆激酶。研究表明，溶栓酶QK具有较强的纤溶活性，是一种潜在的溶栓药物。与其他溶栓药物相比，溶栓酶QK在肠道中活性相当稳定，能够专一溶解血栓，对纤维蛋白原没有降解活性，大量使用不会引起出血，可以预防和辅助治疗一下病症：脑血栓、脑梗塞、心肌梗塞、血栓后遗症、血栓静脉炎、脉管炎等，具有体内作用时间长、无毒副作用等优点。
目前，溶栓酶QK主要来源于野生枯草芽孢杆菌发酵的纳豆、豆豉等，但是纳豆、豆豉的风味还不能被广泛接受，此外，从发酵液中分离纯化出的溶栓酶QK通常活性较低、生产成本高，进一步限定了溶栓酶的开发和利用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有溶栓酶活性低、生产成本高的缺陷， 提供一种能够高效表达活性较高的溶栓酶QK的溶栓酶QK基因及含有该基因的重组表达载体、重组菌及应用。
为实现上述目的，首先，本发明提供一种溶栓酶QK基因，其核苷酸序列或核苷酸序列的互补链如SEQ ID NO:1所示。
本发明所提供的溶栓酶QK基因是将原始溶栓酶QK核酸序列通过套叠PCR扩增优化得到，其中套叠PCR所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、Q ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31所示。通过套叠PCR优化后的溶栓酶QK基因序列可以更好地被毕赤酵母GS115识别，有助于目的蛋白的表达。
本发明还提供了上述溶栓酶QK基因在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
第二，本发明提供了一种含有溶栓酶QK基因的重组载体，由pHBM905A载体和核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶栓酶QK基因经过CpoⅠ和NotⅠ酶切后重组而成。
本发明还提供了上述含有溶栓酶QK基因的重组载体在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
第三，本发明提供了一种表达溶栓酶QK的重组菌，是上述含有溶栓酶QK基因的重组载体通过化学转化的方法导入毕赤酵母GS115中所得到的重组菌。含有重组载体的毕赤酵母重组菌具有强有力的乙醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。
本发明还提供了上述表达溶栓酶QK的重组菌在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
第四，本发明提供了一种溶栓酶QK的制备方法，挑取表达溶栓酶QK重组菌的单菌落接种至含BMGY的摇瓶中，置于摇床中培养，生长至OD600为20～30，离心后将菌体转接至含BMMY的培养基中，再置于摇床中进行诱导培养，每隔24h加入甲醇，诱导培养后离心发酵液，上清即为含有溶栓酶QK的粗酶液，经纯化得到溶栓酶QK。
本发明还提供了上述溶栓酶QK的制备方法在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
针对本发明的设计原理作出如下说明
因为毕赤酵母GS115对基因序列具有一定的密码子偏爱性，因此常规方法得到的基因序列表达蛋白质的量并不高。而套叠PCR技术可以将序列进行优化，从而解决这个问题。套叠PCR技术，又称重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension，gene SOEing)，是利用PCR技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，而且不需要内切酶消化和连接酶处理。该技术使用简易，可利用这一技术很快获得其他依靠内切酶消化方法根本难以做到的产物。SOEing法的基本原理是向PCR产物内掺入一段新的、在原模板内不存在的序列。引物只需与其模板有效结合而不必完全匹配，特别是5’端序列。任何与原模板不匹配的碱基都将掺入到PCR产物中，这为创造定点突变提供了简便易行的方法。
本发明的有益效果，提供了一种溶栓酶QK基因、及由其构建的重组表达载体、重组菌以及应用，本发明通过套叠PCR技术优化得到的溶栓酶QK基因序列可以更好地被毕赤酵母GS115识别，同时选用pHBM905A载体与优化后的溶栓酶QK基因构建形成新的重组表达载体和制备表达蛋白的重组菌，最终获得酶活性高的溶栓酶QK。该方法操作简便，降低了生产成本，具有更好的实用性。
附图说明
图1为套叠PCR合成优化后的溶栓酶QK基因的原理图。
图2为套叠PCR合成优化后溶栓酶QK基因琼脂糖凝胶电泳照片。
图3为溶栓酶QK表达载体重组质粒琼脂糖凝胶电泳照片。
图4为琼脂糖—纤维素平板法筛选高表达溶栓酶QK重组菌照片。
图5为表达溶栓酶QK重组菌诱导不同时间梯度后的溶栓酶QK SDS-PAGE电泳图照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有引物合成及测序工作均由上海生工完成。
实施例1溶栓酶QK基因的优化
在GenBank中原始溶栓酶QK的氨基酸序列的编号为AEV91244.1，在不改变溶栓酶QK溶栓活性的前提下，按照毕赤酵母密码子偏爱性利用DNAWORKERS工具对原始溶栓酶QK基因序列进行优化。优化后的核酸序列与原始核酸序列相比，261个核酸发生了改变，核苷酸的同源性为75.42％，同时为了使溶栓酶QK在毕赤酵母中高效稳定地分泌表达，优化后的溶栓酶QK基因少了编码5’端信号肽序列的28氨基酸。
实施例2优化后溶栓酶QK基因的合成
根据优化的序列设计基因合成的引物，设计的引物序列见表1，其中每条引物的长度在39～60nt之间，相邻引物之间有17～20nt重叠序列，Tm值为55～60℃。为了便于后续构建毕赤酵母表达载体，分别在NAT-1和NAT-30引物5’端引进gtca和ggcca的序列，引进的序列用下划线表示。
表1套叠PCR方法的引物序列
利用套叠PCR的方法合成优化的溶栓酶QK基因，引物套叠合成基因原理如图1所示。具体的合成方法如下：把所有的引物稀释到10μmol/L，然后每条稀释后的引物取0.5μl放到一个反应体系中，50μl反应体系包括：0.5ul稀释后的引物、5XPrimeSTAR Buffer10μL、2.5nmol/L dNTPs 4μL、0.5μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase，最后加水补至50ul。引物之间相互为模板退火，然后以退火产物为模板，利用PCR扩增。PCR扩增的条件为：变性98℃，30s；退火56℃，30s；延伸72℃，70s，25个循环；最后72℃，5min。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2(M为DNA marker，1为套叠PCR合成的优化后的溶栓酶QK基因)。
实施例3溶栓酶QK表达载体的构建
优化后的溶栓酶QK基因片段用T4DNA Polymerase处理，并加dATP保护，16℃反应20min回收后和pHBM905A载体都经CpoⅠ、NotⅠ双酶切，片段经胶回收后与载体置于16℃连接过夜。将连接产物转化到DH5α细胞中，经菌落PCR方法鉴定阳性的重组子，再进 一步进行测序，得到测序正确溶栓酶QK表达载体的重组质粒。提取溶栓酶QK表达载体的质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3(M为DNA marker，1为溶栓酶QK表达载体的重组质粒)。
实施例4表达溶栓酶QK重组菌的构建
上述溶栓酶QK表达载体的重组质粒经SalⅠ线性化之后用化学转化法导入毕赤酵母GS115中，再将构建好的重组菌落接种在加有酪素的BMMY平板上，从中筛选出水解圈最大的菌株，筛选结果如图4。表达溶栓酶QK的重组菌具有乙醇氧化酶基因的强启动子，可严格调控外源蛋白的表达。
实施例5溶栓酶QK的制备
挑取上述表达溶栓酶QK重组菌的单菌落接种至含100ml BMGY的摇瓶中，置于温度为28～30℃，转速为250～300rpm的摇床中培养46～48h，生长至OD600为20～30，离心后将菌体转接至50ml BMMY培养基中，置于温度为28～30℃，转速为250～300rpm的摇床中进行诱导培养，每隔24h加入0.5ml的100％甲醇，至甲醇终浓度为1％，诱导培养6天，离心发酵液，上清即为含有溶栓酶QK的粗酶液。分别取诱导12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h的发酵上清液，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图5(M为蛋白质marker，1-7泳道分别为诱导12h，24h，36h，48h，60h，72h，84h的发酵上清，每泳道上样量为10μL发酵上清)。再将含有溶栓酶QK的粗酶液进行纯化，得到溶栓酶QK。
其中BMGY配方为1％酵母抽提物、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％ 硫酸铵、1％甘油、100mM的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)。BMMY培养基配方为1％酵母抽提物、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％硫酸铵、100mM的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)。
利用琼脂糖—纤维素平板法测定利用上述方法得到的溶栓酶QK的活性，测定结果≥80000IU。

Claims (6)

1.一种溶栓酶QK基因，其核苷酸序列或核苷酸序列的互补链如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的溶栓酶QK基因在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
3.一种含有溶栓酶QK基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体由pHBM905A载体和核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的溶栓酶QK基因经过CpoⅠ和NotⅠ酶切后重组而成。
4.权利要求3所述含有溶栓酶QK基因的重组载体在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
5.一种表达溶栓酶QK的重组菌，是将权利要求3所述的重组载体通过化学转化的方法导入毕赤酵母GS115中所得到的重组菌。
6.权利要求5所述表达溶栓酶QK的重组菌在制备溶栓酶QK及相关药物中的应用。
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