CN114806912A

CN114806912A - 高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用

Info

Publication number: CN114806912A
Application number: CN202210355386.2A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 姜宏; 司先懂; 梁星星; 董格菲; 任泽林; 陈鹏
Original assignee: Beijing Enhalor International Tech Co ltd; Ocean University of China
Current assignee: Beijing Enhalor International Tech Co ltd; Ocean University of China
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2022-07-29

Abstract

本发明公开了一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。其构建方法为：在菌丝霉素N端加6×His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以此种方式构建菌丝霉素的四倍串联体；将重组表达载体转化至宿主感受态细胞，得到重组工程菌。所述高效表达菌丝霉素的重组工程菌在制备菌丝霉素中的应用，在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂中的应用。本发明重组工程菌可高效表达菌丝霉素，具有良好的应用前景。

Description

高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

抗菌肽是机体天然免疫系统的重要组成部分，通常是一道抵抗病原体的关键防线。抗菌肽以其高抗菌活性、安全性和独特的作用机制等优势被认为是传统抗生素的最佳替代品，对它的研究与开发受到广泛关注，人们期望抗菌肽成为抗生素的理想替代品之一。直接从自然资源中获得的抗菌肽提取分离工艺复杂、成本高，抗菌肽产品产率低且杂质含量高，因此寻求一种高效的表达抗菌肽的方法至关重要。

目前已经成功实现菌丝霉素在毕赤酵母GS115中的表达，但其表达量并未达到理想水平，因此有必要研发一种能高效表达菌丝霉素的方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其构建方法与应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，所述菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。

所述编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述菌丝霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如下所示（SEQ ID NO.1）：

5’-

GGTTTCGGCTGTAACGGACCTTGGGACGAGGACGACATGCAATGTCACAACCACTGTAAATCTATCAAGGGATACAAGGGTGGCTACTGTGCTAAGGGAGGTTTTGTTTGCAAGTGCTAC-3’。

菌丝霉素的氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO.2）：

GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGGFVCKCY。

所述编码T2A肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述T2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

编码T2A肽的基因的核苷酸序列如下所示（SEQ ID NO.3）：

5’-GAAGGACGTGGATCCCTTTTGACCTGCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCT-3’。

T2A肽的氨基酸序列如下所示（SEQ ID NO.4）：EGRGSLLTCGDVEENPGP。

进一步地，所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母菌。

所述高效表达菌丝霉素的重组工程菌的构建方法为：在菌丝霉素N端加6×His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以这种方式构建菌丝霉素的四倍串联体；将重组表达载体转化至宿主感受态细胞，得到重组工程菌。

所述高效表达菌丝霉素的重组工程菌在制备菌丝霉素中的应用，在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂中的应用。

本发明的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，可高效表达菌丝霉素，可用于菌丝霉素的制备，菌丝霉素可用于抑制金黄色葡萄球菌。具体应用时，制备菌丝霉素的方法为：培养上述高效表达菌丝霉素的重组工程菌，离心收集上清液，冻干，即得。

进一步地，具体方法为：将高效表达菌丝霉素的重组工程菌接入YPD液体培养基中，30℃、220 rpm培养16 h，制备种子液；取种子液，按10%（v/v）的接菌量接入BMGY培养基中，30℃、220 rpm培养至OD₆₀₀为2.0～6.0；菌液离心（4000×g，离心10 min），用BMMY培养基将菌体重悬，置于发酵罐中，30℃发酵培养，每24 h补加一次甲醇使其终浓度为1%（体积比），发酵24 h以上；发酵液离心，收集上清液，冻干，即得菌丝霉素粉制剂。

一种菌丝霉素的重组表达载体，为菌丝霉素的四倍串联体，是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。其构建方法为：在菌丝霉素N端加6×His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以这种方式构建菌丝霉素的四倍串联体。

所述菌丝霉素的重组表达载体在制备表达菌丝霉素的重组工程菌中的应用。

本发明的重组工程菌，基于T2A肽组装将四个菌丝霉素单体用T2A肽连接，构建菌丝霉素的四倍串联体。T2A肽来源于明脉扁刺蛾病毒，是一种能够“自裂解”小肽，T2A肽是目前发现的序列最短的 2A 肽，但其剪切效率接近100%。基于T2A肽构建的菌丝霉素四倍串联表达载体，转入毕赤酵母GS115中诱导表达后，在转录翻译后T2A肽可进行“自裂解”，得到高表达量的菌丝霉素单体。菌丝霉素具有很好的温度稳定性和pH稳定性，即使在100℃的高温下，活性在4 h内仍能保持50%以上，为喷雾干燥等工业应用提供了基础。菌丝霉素对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶具有较高的耐受性，在120 h内仍能保持良好的活性，这保证了菌丝霉素在进入动物胃肠道后不会立即被水解，这极利于其在饲料领域的发展。

本发明的重组工程菌，将菌丝霉素四倍串联体转入宿主中，可使菌丝霉素的表达量得到明显提高，具有良好的应用前景。实验表明，由T2A组装的菌丝霉素串联中菌丝霉素的表达水平是单倍体的2.3倍，四个菌丝霉素基因通过T2A肽串联后，菌丝霉素在总分泌蛋白中的含量明显增加，由计算结果分析得到，以菌丝霉素4倍串联的基因表达倍数约是单倍体的4771倍，表明从基因转录水平上来看T2A肽起到了非常显著的提升效果，而且菌丝霉素4倍串联菌株菌丝霉素的分泌量显著高于单倍体菌丝霉素菌株。此外，菌丝霉素4倍串联菌株的抑菌活性是单倍体菌株的1.5倍。菌丝霉素在总分泌蛋白中的含量是单倍体表达的2.3倍。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：pPIC9k-4Plectasin的质粒图谱。

图2：基于T2A肽组装的菌丝霉素四倍串联体基因表达框示意图。

图3：阳性克隆子PCR扩增产物的核酸电泳图。

图4：发酵液上清的抑菌活性示意图，其中，左：菌丝霉素4倍串联对S. aureusATCC 26001的抑制效果；右：菌丝霉素单倍体对S. aureus ATCC 26001的抑制效果。

图5：温度变化对菌丝霉素活性的影响示意图。

图6：pH变化对菌丝霉素活性的影响示意图。

图7：菌丝霉素在5L发酵罐水平最佳发酵时间示意图。

图8：菌丝霉素蛋白酶解耐受性示意图。

图9：不同甲醇浓度诱导菌丝霉素4倍串联发酵过程中的细胞湿重变化示意图。

图10：不同甲醇浓度诱导菌丝霉素4倍串联发酵过程中的蛋白浓度变化示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明所用毕赤酵母菌，为现有技术中的常见菌种。

实施例1 设计基于T2A肽组装的菌丝霉素四倍串联体

基于已获得菌丝霉素的基因序列以及T2A肽的基因序列（GenBank: UER86417.1）。在每一个菌丝霉素N端加6×His标签用于纯化。在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以这种方式构建菌丝霉素的四倍串联体（构建图如图1、2所示）。根据毕赤酵母的密码子使用偏好性对碱基序列进行优化，由北京华大基因科技有限公司进行全基因合成。优化后的四倍串联体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中，菌丝霉素的基因如SEQID NO.1所示，编码40个氨基酸，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.5：

5’-ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCATCATCACCACCATGGATTCGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAGTGTCATAACCACTGCAAGTCCATTAAGGGTTACAAGGGTGGATACTGCGCTAAGGGTGGTTTCGTTTGTAAGTGCTACGAAGGTAGAGGTAGTTTGCTAACTTGCGGTGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCATCATCACCACCATGGATTCGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAGTGTCATAACCACTGCAAGTCCATTAAGGGTTACAAGGGTGGATACTGCGCTAAGGGTGGTTTCGTTTGTAAGTGCTACGAAGGTAGAGGTAGTTTGCTAACTTGCGGTGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCATCATCACCACCATGGATTCGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAGTGTCATAACCACTGCAAGTCCATTAAGGGTTACAAGGGTGGATACTGCGCTAAGGGTGGTTTCGTTTGTAAGTGCTACGAAGGTAGAGGTAGTTTGCTAACTTGCGGTGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCATCATCATCACCACCATGGATTCGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCAGTGTCATAACCACTGCAAGTCCATTAAGGGTTACAAGGGTGGATACTGCGCTAAGGGTGGTTTCGTTTGTAAGTGCTACGAAGGTAGAGGTAGTTTGCTAACTTGCGGTGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCA-3’。

实施例2 菌丝霉素基因的克隆

以上述合成的菌丝霉素四倍串联体基因片段为模板，在菌丝霉素基因的上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增菌丝霉素基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-GCTTACGTAGAATTCGGTTTCGGTTGTAAC-3’，如SEQ ID NO.6所示；

下游引物：5’-CGCTTAATGATGATGATGATGATGGTAGCACTTACAGACG-3’，如SEQ IDNO.7所示。

在上、下游设计用于无缝连接的引物，进行PCR扩增pPIC9k克隆载体基因片段。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-CATCATCATTAAGCGGCCGCGAATTA-3’，如SEQ ID NO.8所示；

下游引物：5’-GAATTCTACGTAAGCTTCAGCCTCTC-3’，如SEQ ID NO.9所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50 μl。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸为1 kb/60 s，反应40个循环，72℃后延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳（如图3所示）后分别回收正确的PCR产物片段。

实施例3 菌丝霉素基因的表达载体构建

菌丝霉素四倍串联体基因片段与pPIC9k克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有50 μg/m L卡那霉素的(LB)培养基固体平板上。37℃温箱中培养15 h后，挑取单克隆至含有50 μg/m L卡那霉素LB液体培养基，转速220rpm的37℃摇床培养过夜，阳性验证后测序，所得表达载体命名为pPIC9k-Plectasin。

实施例4 菌丝霉素4倍串联基因的重组质粒及工程菌的构建

提取测序正确的重组质粒，设计引物将质粒线性化，并转化至宿主（毕赤酵母菌）感受态细胞中，构建好的工程菌在组氨酸缺陷型（SD-His）的平板上长出。

引物的序列如下所示：

上游引物：5’-CGAAGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’，如SEQ ID NO.10所示；

下游引物：5’-CATGTCTAAGGCGAATTAATTCGCG-3’，如SEQ ID NO.11所示。

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix （Dye Plus）12.5μl ，引物各1μl，模板2μl，无菌水8.5μl，总体系25μl。

PCR反应条件为：94℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1 min/kb，反应35个循环，72℃后延伸5min。

实施例5 利用酵母工程菌制备菌丝霉素

将经筛选得到验证正确的高拷贝酵母转化子挑取菌落接入10 mL YPD液体培养基中，30℃、220 rpm培养16 h制备种子液。取种子液按10%（v/v）的接菌量接入BMGY培养基中，30℃、220 rpm培养至OD₆₀₀为6.0。将菌液转移到50 mL离心管中，4000 ×g离心10 min，超净台内弃上清，用BMMY培养基将菌体重悬后转接至其中（菌体与BMMY培养基的用量比例为1:5），置于5L发酵罐中，30℃培养，每24 h补加1%（v/v）甲醇。将发酵液离心，收集上清液，冻干，获得菌丝霉素粉制剂。

实施例6 菌丝霉素的抑菌活性测定

收集实施例5中甲醇诱导120 h的菌液，6000 ×g离心10 min取上清。-80 ℃预冻3h，真空冷冻干燥30 h，得到冻干粉末。按浓缩10倍比例加无菌水（即无菌水的添加量为原始菌液体积的1/10）复溶得浓缩液，测定抑菌活性。

测试菌S. aureus ATCC 26001用接种环从甘油管中少量蘸取在固体LB 平板上划线，37℃倒置恒温培养24 h。挑单菌落接入5 mL LB液体培养基，37℃，220 rpm培养至OD₆₀₀为0.4，取100 μL涂布于LB平板，在平板上用打孔器打孔，每个孔中加入100 μL浓缩液，4℃扩散12 h，在37℃培养18 h，抑菌效果显著，有明显的抑菌圈产生。

本发明筛选到了多株酵母转化子，经上述抑菌实验验证，抑菌圈直径多数在2.5～3.0 cm，有的可达4.2 cm，最高的达到了4.6 cm。

同时，本发明还构建了菌丝霉素单倍体的重组表达载体、重组工程菌（构建方法同上，不同之处在于将菌丝霉素四倍串联体替换为编码菌丝霉素的基因片段），筛选得到了多株酵母转化子，其抑菌圈直径大多在1.5～2.0cm，其中效果最佳的一株达到了2.8 cm，如图4所示。

从上述筛选到的多株菌丝霉素四倍串联体酵母转化子中选择其中一个菌株（抑菌圈直径为4.2 cm，如图4所示），命名为4ple-61，进行后续的实验验证（实施例7～11）。

实施例7 测定菌丝霉素的温度稳定性

将纯化后的菌丝霉素（实施例6中得到的浓缩液）置于不同的温度梯度20℃、40℃、60℃、80℃及100℃水浴中，分别在0、1、2、4、8、16、32、48、60、72、84、96、108、120 h后取样，以S. aureus ATCC 26001为受试菌，琼脂扩散法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径以0 h样品的抑菌圈直径为100%，各温度在不同时间段的样品对应的抑菌圈直径/0 h的抑菌圈直径*100%即为某一时刻的抑菌活性，实验结果（如图5所示）显示菌丝霉素在80℃下48 h内可保持60%的抑菌活性，即使在100℃的高温下4 h时仍可保留34%的抑菌活性，温度稳定性良好。

实施例8 菌丝霉素pH稳定性

将菌丝霉素（实施例6中得到的浓缩液）置于不同浓度梯度pH的缓冲液（浓缩液与缓冲液的体积比为1:5）中：甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.0）、柠檬酸缓冲液（pH 3.0）、柠檬酸缓冲液（pH 4.0）、柠檬酸缓冲液（pH 5.0）、磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、磷酸盐缓冲液（pH 8.0）、甘氨酸缓冲液（pH 9.0）、甘氨酸缓冲液（pH 9.0）、甘氨酸缓冲液（pH 10.0），37 ℃条件下恒温水浴，分别在0、1、2、4、8、16、32、48、60、72、84、96、108、120 h后取样，以S. aureus ATCC 26001为受试菌，琼脂扩散法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径，以0 h样品的抑菌圈直径为100%，各pH值在不同时间段的样品对应的抑菌圈直径/ 0 h的抑菌圈直径*100%即为某一时刻的抑菌活性，结果（如图6所示）显示，菌丝霉素的pH稳定性良好，总体而言，菌丝霉素对pH的耐受范围较广，48 h内在pH 2.0到pH 10.0的范围均可保持有抑菌活性。

实施例9 菌丝霉素在5L发酵罐中的最佳发酵时间

菌丝霉素4倍串联表达菌株在YPD平板划线，30℃恒温培养至菌落生长。挑取单菌落到50 mL YPD培养基中，30 ℃、220 rpm培养至OD₆₀₀达到6.0，按10%的接菌量将种子液以火焰接种法转移至5 L发酵罐中，发酵罐初始装3 L BMGY发酵培养基。当培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升时，补加500ml的50%的甘油溶液直到细胞湿重达到125 g/L后停止补加甘油，饥饿培养2 h使甘油完全消耗，下一阶段要以甲醇为唯一碳源诱导蛋白分泌。开始补加甲醇，甲醇添加量为1%（终浓度），溶氧始终保持在20%～40%之间。每24 h取样测细胞湿重，蛋白浓度和抑菌活性。分别在0、24、48、72、96、120、144 h取发酵液上清，由图7可以看出，细胞湿重和分泌的总蛋白水平在发酵过程中呈持续上升，最高在144 h时分别可达92.87 g/L和118.54 mg/L，不过从120 h到144 h细胞湿重和分泌的总蛋白增长幅度并不大。用“打孔法”进行抑菌实验，即在LB平板上均匀涂抹100μl金黄色葡萄球菌菌液，用打孔器在平板上打孔，并在孔中加入100μl上清样品，将LB平板放入37℃培养箱观察抑菌圈。从抑菌效果来看，在诱导48 h后就有较明显的抑菌效果，48 h、72 h、96 h的抑菌活性相差不大，在120 h是抑菌效果显著增加，可能是在这一段时期内菌丝霉素的分泌大量累积呈现出较好的抑制效果，但144 h的抑菌效果与120 h相比相差不大，所以综合考虑时间等因素，120 h为最佳发酵时间。

实施例10 测定菌丝霉素蛋白酶解耐受性

将胃蛋白酶（3000 U/mg，pH 2.0）、木瓜蛋白酶（500 U/mg，pH 6.0）和胰蛋白酶（250 U/mg，pH 8.0）分别与菌丝霉素（实施例6中得到的浓缩液）按1:10 （v/v）的比例（各蛋白酶以酶液的形式与菌丝霉素浓缩液混合）混合，在37℃恒温水浴反应，分别在0、1、2、4、8、16、32、48、60、72、84、96、108、120 h 后取样，以S. aureus ATCC 26001为受试菌，琼脂扩散法测定抑菌活性，记录抑菌圈直径，以0 h样品的抑菌圈直径为100%，在各蛋白酶作用的不同时间段的样品对应的抑菌圈直径/ 0 h的抑菌圈直径*100%即为某一时刻的抑菌活性。结果显示（如图8所示）菌丝霉素的蛋白酶解耐受性良好，胃蛋白酶处理120 h保留32%抑菌活性，木瓜蛋白酶处理120 h可保留49%的抑菌活性。

实施例11 测定产物菌丝霉素发酵的最佳甲醇诱导浓度

为了确定甲醇诱导的最适浓度，分别按照甲醇终浓度为0.5%、1.0%、1.5%和2.0%进行添加（即：实施例5中，每24 h补加一次甲醇），从发酵过程中的细胞湿重和总分泌蛋白来看（如图9、10所示），均是在甲醇终浓度为1.0%时达到最高，分别为94.5 g/L和126.02 mg/L，其次是按1.5%的甲醇终浓度诱导，当甲醇添加量为2.0%时，细胞湿重和总分泌蛋白均最低，这表明当甲醇过多时反而会对菌体生长有抑制作用。甲醇添加量为1.0%和1.5%时抑菌效果相差不大，甲醇添加量为0.5%时的抑菌效果略低于前者，甲醇添加量为2.0%的抑菌圈大小明显减小了。所以结合菌体生长情况，总分泌蛋白浓度和抑菌效果确定甲醇的最佳诱导浓度为1.0%。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

北京英惠尔生物技术有限公司

<120> 高效表达菌丝霉素的重组工程菌及其应用

<141> 2022-04-06

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggtttcggct gtaacggacc ttgggacgag gacgacatgc aatgtcacaa ccactgtaaa 60

tctatcaagg gatacaaggg tggctactgt gctaagggag gttttgtttg caagtgctac 120

<210> 2

<211> 40

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gln Cys His

1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser Ile Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr

35 40

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gaaggacgtg gatccctttt gacctgcgga gatgtcgaag agaatcctgg acct 54

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 5

<211> 1836

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagctcat catcatcacc accatggatt cggttgtaac 300

ggtccatggg atgaagatga tatgcagtgt cataaccact gcaagtccat taagggttac 360

aagggtggat actgcgctaa gggtggtttc gtttgtaagt gctacgaagg tagaggtagt 420

ttgctaactt gcggtgacgt tgaggaaaac cctggaccaa tgagatttcc ttcaattttt 480

actgcagttt tattcgcagc atcctccgca ttagctgctc cagtcaacac tacaacagaa 540

gatgaaacgg cacaaattcc ggctgaagct gtcatcggtt actcagattt agaaggggat 600

ttcgatgttg ctgttttgcc attttccaac agcacaaata acgggttatt gtttataaat 660

actactattg ccagcattgc tgctaaagaa gaaggggtat ctctcgagaa aagagaggct 720

gaagctcatc atcatcacca ccatggattc ggttgtaacg gtccatggga tgaagatgat 780

atgcagtgtc ataaccactg caagtccatt aagggttaca agggtggata ctgcgctaag 840

ggtggtttcg tttgtaagtg ctacgaaggt agaggtagtt tgctaacttg cggtgacgtt 900

gaggaaaacc ctggaccaat gagatttcct tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca 960

tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact acaacagaag atgaaacggc acaaattccg 1020

gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca 1080

ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg tttataaata ctactattgc cagcattgct 1140

gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa agagaggctg aagctcatca tcatcaccac 1200

catggattcg gttgtaacgg tccatgggat gaagatgata tgcagtgtca taaccactgc 1260

aagtccatta agggttacaa gggtggatac tgcgctaagg gtggtttcgt ttgtaagtgc 1320

tacgaaggta gaggtagttt gctaacttgc ggtgacgttg aggaaaaccc tggaccaatg 1380

agatttcctt caatttttac tgcagtttta ttcgcagcat cctccgcatt agctgctcca 1440

gtcaacacta caacagaaga tgaaacggca caaattccgg ctgaagctgt catcggttac 1500

tcagatttag aaggggattt cgatgttgct gttttgccat tttccaacag cacaaataac 1560

gggttattgt ttataaatac tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct 1620

ctcgagaaaa gagaggctga agctcatcat catcaccacc atggattcgg ttgtaacggt 1680

ccatgggatg aagatgatat gcagtgtcat aaccactgca agtccattaa gggttacaag 1740

ggtggatact gcgctaaggg tggtttcgtt tgtaagtgct acgaaggtag aggtagtttg 1800

ctaacttgcg gtgacgttga ggaaaaccct ggacca 1836

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcttacgtag aattcggttt cggttgtaac 30

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgcttaatga tgatgatgat gatggtagca cttacagacg 40

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

catcatcatt aagcggccgc gaatta 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaattctacg taagcttcag cctctc 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cgaaggatcc aaacgatgag atttc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

catgtctaag gcgaattaat tcgcg 25

Claims

1.一种高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：其基因组中包含有菌丝霉素四倍串联体，所述菌丝霉素四倍串联体是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。

2.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述编码菌丝霉素的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述编码T2A肽的基因的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述菌丝霉素四倍串联体的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌，其特征在于：所述重组工程菌的宿主菌为毕赤酵母菌。

5.权利要求1～4中任一项所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌的构建方法，其特征在于：在菌丝霉素N端加6×His标签用于纯化，在菌丝霉素的C端添加T2A肽序列与下一组基因表达盒连接，以此种方式构建菌丝霉素的四倍串联体；将重组表达载体转化至宿主感受态细胞，得到重组工程菌。

6.权利要求1～4中任一项所述的高效表达菌丝霉素的重组工程菌在制备菌丝霉素中的应用，或在抑制金黄色葡萄球菌中的应用，或在制备抑制金黄色葡萄球菌的制剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：具体应用时，培养高效表达菌丝霉素的重组工程菌，离心收集上清液，冻干，即得菌丝霉素制剂。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，培养高效表达菌丝霉素的重组工程菌的具体方法为：将高效表达菌丝霉素的重组工程菌接入YPD液体培养基中，30℃、220 rpm培养，制备种子液；取种子液，接入BMGY培养基中，30℃、220 rpm培养至OD₆₀₀为2.0～6.0；菌液离心，用BMMY培养基将菌体重悬，置于发酵罐中，30℃发酵培养，每24 h补加一次甲醇使其终浓度为1%，发酵24 h以上；发酵液离心，收集上清液，冻干，即得菌丝霉素制剂。

9.一种菌丝霉素的重组表达载体，其特征在于：为菌丝霉素的四倍串联体，是由4个编码菌丝霉素的基因片段依次通过编码T2A肽的基因片段串联在一起而成的。

10.权利要求9所述的菌丝霉素的重组表达载体在制备表达菌丝霉素的重组工程菌中的应用。