CN102191255A - 重组菌丝霉素的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开重组菌丝霉素的制备及其应用，按毕赤酵母偏爱密码子设计的菌丝霉素基因具有序列表SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，构建重组表达载体pPICPlectasin和基因工程菌毕赤酵母X33pPICPlectasin(CGMCC No.3564)，经高密度发酵，上清中总蛋白浓度达到729μg/mL，上清透析冻干依次进行凝胶过滤层析和反相高效液相色谱，获得高纯度重组菌丝霉素，重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的pH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长，可用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌，具有潜在的抗菌药物开发价值。

Description

重组菌丝霉素的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组菌丝霉素的制备方法及其应用，具体涉及酵母基因工程菌制备重组菌丝霉素及其在治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域的应用。

背景技术

菌丝霉素(Plectasin)是Mygind等从真菌(腐生子囊菌，the saprophytic ascomycetePseudoplectania nigrella)中分离得到首例防御素(Mygind et al.，Nature，2005，437：975～980)。菌丝霉素基因开放阅读框编码一个95个残基长的肽，由一个信号肽序列(残基1-23)，一个前片断(残基23-55)和一个40个残基的C端区域(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50-55％序列相似性。与哺乳动物的α-或β-防御素没有序列相似性。菌丝霉素，有六个半胱氨酸和五个赖氨酸，和一个区别的四肽(DEDD)模式。它的净电荷在+1到+3之间变化，取决于它的两个组氨酸的离子状态。其高级结构包含一个α-β模型，由一个α-螺旋和两个反平行的β一折叠组成，由三个二硫键稳定(Cys4-Cys30，Cys15-Cys37，Cys19-Cys39)。菌丝霉素高抗革兰氏阳性菌、无细胞毒性、无溶血性及脑脊液渗透性好，在治疗革兰氏阳性菌病方面具有相当大的潜力，是具有治疗潜能的新的肽抗生素。

直接从P.nigrella菌丝体中提取天然菌丝霉素时，分离提纯存在一定的困难，而且产量有限。化学合成和基因工程法是获得菌丝霉素的主要手段，但化学合成菌丝霉素不仅成本高，而且空间结构难以与天然菌丝霉素完全一致，其分子内含有3对二硫键，难以保证多肽正确配对，限制其抗微生物活性的发挥。通过基因工程在微生物中表达抗菌肽基因是获得菌丝霉素的有效途径。Mygind等2005年从P.nigrella菌丝体中克隆到菌丝霉素的cDNA，将其转化将到Aspergillus oryzae表达系统中，分泌出具有抗菌活性的菌丝霉素(Mygind et al.，Nature，2005，437：975～980)。目前菌丝霉素的表达仅限于在黑曲霉中异源表达，迄今未见其在酵母中的表达研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组菌丝霉素的制备及应用方法，该方法利用酵母真核表达系统对菌丝霉素基因进行表达，所制备的重组菌丝霉素应用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域。

本发明采用如下技术方案，其特征在于该方法，包括以下步骤：

(一)菌丝霉素基因的设计和合成

所述的菌丝霉素基因为编码菌丝霉素成熟肽的任何核苷酸序列，优选编码序列可根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱性(http://www.kazusa.or.jp/codon/)优化设计，所得菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，通过人工方法直接合成获得。

(二)重组菌丝霉素表达载体的构建

所述的表达载体衍生于pPIC系列表达载体，优选的，所述的表达载体采用pPICZαA。

在菌丝霉素基因的5′-端设计限制性内切酶XhoI酶切位点，并保留了XhoI酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割获得重组Plectasin，在基因3′-端设计TAATAA终止子序列及Xba I酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，菌丝霉素基因片段经Xho I和Xba I双酶切后克隆至经相同酶切后的表达载体pPICZαA上，构建重组表达载体pPICPlectasin。

(三)重组菌丝霉素酵母的构建

所述的酵母优选为毕赤酵母，所述的毕赤酵母优选毕赤酵母X-33。

重组表达载体pPICPlectasin经内切酶Pme I线性化处理，电击转化毕赤酵母X-33，将电击后的混合液涂布在含100μg/ml Zeocin的YPDS平板上，29℃培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子。

(四)重组菌丝霉素的表达

将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至OD＝5-6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其OD值达到1.0，在29℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为0.5％，在摇瓶水平筛选表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌进行高密度发酵。

所述的高表达重组菌丝霉素酵母菌株为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为CGMCC No.3564。

将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌Pichia pastoris X33 pPICPlectasin用5L发酵罐进行高密度发酵：挑取单菌落到YPD培养基中培养至菌体浓度OD₆₀₀在4～6之间，得到一级种子培养液；按1％接种量(V/V)转接至YPD培养基中培养至菌体浓度OD₆₀₀约3.3，得到二级种子培养液；按照10％接种量接入到2 L上罐基料培养基中。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5.0，温度29℃，通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽。进入补料生长阶段：流速35％，补加50％葡萄糖(含12‰PMT1)，转速调至1000rpm，pH调至5.5，温度29℃，通气量8L/min，添加时间5h，共补加200mL。补料结束后，饥饿1h后，进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的1ml/h/L逐渐增加到第六小时的5.9ml/h/L，接着以恒定的流速(5.9ml/h/L)，在转速1100rpm，pH 5.5，温度29℃，通气量8L/min，溶氧约40％，连续诱导120h，发酵结束上清中总蛋白浓度达到729μg/mL，收集上清透析冻干备用。

(五)重组菌丝霉素的纯化

重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离步骤：色谱柱材为葡聚糖凝胶Sephadex G-25，纯化条件：柱床体积40mL，径高比1∶10，上样量为1mg/mL，用去离子水进行洗脱，流速为0.5mL/min，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干。

将凝胶过滤层析分离所得的重组菌丝霉素冻干物溶解在超纯水中(1mg/mL)，使用C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以含0.1％TFA的乙腈水溶液为流动相，以梯度洗脱模式进行分离(8％～80％，0.8mL/min)，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干，获得高纯度的重组菌丝霉素，MALDI-TOF质谱仪测定其分子量是否与理论分子量吻合。

(六)重组菌丝霉素的应用

重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的pH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生长，与万古霉素具有相同抗肺炎链球菌活性，优于青霉素，因此，在治疗革兰氏阳性菌病尤其是链球菌病方面具有相当大的潜力，具有抗菌药物开发价值。

通过附图和实施例对本发明具体实施方式进行说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

附图说明

图1摇瓶水平下重组菌丝霉素表达的Tricine-SDS-PAGE检测图

泳道1-6：分别为诱导0，24，48，72，96，120h样品；

泳道7：protein marker分子量从上至下依次为：94.0，66.2，45.0，35.0，26.0，20.0，14.4kDa

图2.纯化的重组菌丝霉素的MALDI-TOF MS图

图3.不同pH处理对重组菌丝霉素的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响

1-5：重组菌丝霉素分别在Glycin-HCl buffer(pH 2.0)，sodium acetate buffer(pH 4.0)，sodiumphosphate buffer(pH 6.0)，tris-HCl buffer(pH 8.0)和Glycin-NaOH buffer(pH 10.0)下的抑菌活性

6-10：分别为对应缓冲液Glycin-HCl buffer(pH 2.0)，sodium acetate buffer(pH 4.0)，sodiumphosphate buffer(pH 6.0)，tris-HCl buffer(pH 8.0)和Glycin-NaOH buffer(pH 10.0)的抑菌活性

图4.不同温度处理对重组菌丝霉素的的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响

1-4：重组菌丝霉素分别在30，60，80，100℃中处理1小时下的抑菌活性

5-8：是缓冲液分别在30，60，80，100℃中处理1小时下的抑菌活性

图5.不同蛋白酶处理重组菌丝霉素的抑金黄色葡萄球菌ATCC 25923活性影响

1-3：分别为用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理后的菌丝霉素的抑菌活性

4：未处理的对照；5-7：为分别只含胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的对照

图6.菌丝霉素对兔血红细胞的溶血测验结果

图7.Plectasin表达产物对金黄色葡萄球菌抑菌活性

A：20μL重组表达产物(1280μg/mL)；B：10μL青霉素标准品(80μg/mL)；C：10μL氨苄青霉素钠盐(80μg/mL)；D：对照20μL无菌水

图8.Plectasin表达产物对表皮葡萄球菌抑菌活性

A：20μL重组表达产物(1280μg/mL)；B：40μL重组表达产物(1280μg/mL)；C：10μL青霉素标准品(320μg/mL)；D：10μL氨苄青霉素钠盐(320μg/mL)E：对照20μL无菌水

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如“分子克隆：实验室手册”(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

本发明的实施例中使用的毕赤酵母X33及pPIC系列表达载体pPICZαA均购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN)，限制性内切酶购自NEB公司(New England Biolabs)。

实施例1菌丝霉素基因工程菌的构建

1.1基于酵母偏爱密码子设计Plectasin的基因

根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子使用的偏爱性(http://www.kazusa.or.jp/codon/)人工设计Plectasin的基因，所得序列如SEQ ID NO.1所示。

1.2重组菌丝霉素表达载体的构建

在Plectasin基因的5’-端设计了Plectasin基因中不具备但载体多克隆位点上具有的限制性内切酶XhoI酶切位点，并保留了XhoI酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割，获得重组Plectasin，在基因3’-端设计TAATAA终止子序列及XbaI酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建所设计用于表达的Plectasin基因，由上海生工生物工程技术服务有限公司直接合成，Xho I和Xba I双酶切后克隆至XhoI和Xba I双酶切后的表达载体pPICZαA上，构建重组表达载体pPICPlectasin，测序正确后转化并保存在大肠杆菌DH5α中。

1.3重组毕赤酵母的转化和筛选

将鉴定正确的重组表达载体pPICPlectasin经内切酶Pme I线性化处理，电击转化(1.2KV，25μF，400Ω)处理好的感受态毕赤酵母X-33，电击结束后，加入冰预冷的1M山梨醇，混匀后转入离心管中，30℃静止2h；取适量样品涂YPDS平板(含100μg/mL Zeocin)，29℃倒置培养至出现菌落。

根据优化的菌丝霉素基因序列设计上下游引物：

F1，5`-GTTTTGGTTGTAACGGTCCATGGGATGAAGATGATATGCA-3`；

R1，5`-ACCACCCTTAGCACAGTAACCACCCTTGTAACCCTTAATA-3`。

煮冻煮菌落PCR法检测转化子。琼脂糖凝胶(1％)电泳检测PCR结果，甘油管保存阳性转化子。

实施例2重组菌丝霉素的诱导表达

2.1摇瓶水平下的诱导表达

将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌用以甘油为碳源的BMGY培养基29℃下250rpm振荡培养至OD₆₀₀为2-6时；5000rpm离心5min，收集菌体，用含甲醇的BMMY培养基重悬菌体至OD₆₀₀为1.0，29℃下250rpm进行诱导培养；每24h加甲醇至终浓度为0.5％，诱导120h时取发酵液离心，收集上清冻干备用。

如图1所示，诱导表达后Tricine-SDS-PAGE电泳表明，分泌蛋白中含有4.4kDa肽。

2.2 5L发酵罐水平下的诱导表达

使用Sartorius Bplus 5L发酵罐(德国赛多利斯公司)对摇瓶水平筛选的高表达菌株进行高密度发酵。

取冻存的甘油保藏菌株，YPDS平板(含100μg/mL Zeocin)划线，挑取Pichia pastoris X33pPICPlectasin单菌落到YPD培养基中，29℃，250rpm，活化培养至菌体浓度OD₆₀₀在4～6之间，制备一级种子培养液；按1％接种量(V/V)转接至YPD培养基中，29℃，250rpm，培养至OD₆₀₀约3.3，制备二级种子培养液；

按照10％接种量接入到2L上罐基料培养基中(每升基料培养基含45g葡萄糖，50g磷酸二氢铵，15g七水硫酸镁，6g磷酸二氢钾，0.4g硫酸钙，1.5g氢氧化钾，并含有4.8ml/L微量元素溶液PMT1(每升微量元素溶液含65g七水硫酸铁，20g氯化锌，6g五水硫酸铜，3g五水硫酸锰，0.5g氯化钴，0.2g钼酸钠，0.08g碘化钾，0.02g硼酸，0.2g生物素，5ml浓硫酸)，发酵初始体积为2.2L。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5.0，温度29℃，通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽(DNS法检测，约17h)，此时菌体湿重为87mg/ml。进入补料生长阶段：流速35％，补加50％葡萄糖(含12‰ PMT1)，转速调至1000rpm，pH调至5.5，温度29℃，通气量8L/min，添加时间5h，共补加200ml。补料结束后，饥饿1h后，菌体湿重为：186mg/ml。进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的1ml/h/L逐渐增加到第六小时的5.9ml/h/L，接着以恒定的流速(5.9ml/h/L)，在转速1100rpm，pH 5.5，温度29℃，通气量8L/min，溶氧维持在40％左右的条件下，连续诱导120h，发酵结束时菌体湿重为330mg/ml，上清中蛋白浓度达到729μg/mL收集上清透析冻干备用。

实施例3重组菌丝霉素的纯化

3.1重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离

色谱柱材为葡聚糖凝胶Sephadex G-25(购自华美生物工程公司)，分离范围1000-5000Da，纯化条件：柱床体积40mL，径高比1∶10，用去离子水进行洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长：280nm，纯化后经抑菌试验检测，收集抑菌活性最高的组分进一步进行反相高效液相色谱。

3.2重组菌丝霉素的反相高效液相色谱

色谱柱为XBridge^TM BEH300 C18(5μm，4.6mm×250mm)，使用含TFA的水和乙腈为流动相，以梯度洗脱模式进行分离，将样品溶解在超纯水中(1mg/mL)，0.45μm滤膜过滤，上样量为20μL，以含0.1％TFA的乙腈水溶液，逐渐增加乙腈的体积百分比，从8％到80％按0.8mL/min的流速洗脱，收集纯化的重组肽，冻干后，进行抑菌检测，收集抑菌活性最高的组分进一步进行MALDI-TOF质谱分析(中国科学院生物物理研究所蛋白质组学平台)，测定纯化的Plectasin分子量(4404.256Da)与Plectasin的理论分子量(4407.9Da)相同(图2)，获得高纯度的重组菌丝霉素。

实施例4重组菌丝霉素的性质

4.1重组菌丝霉素的pH稳定性

将纯化的重组菌丝霉素分别溶解到100mM不同pH的缓冲液中：Glycin-HCl buffer(pH2.0)，sodium acetate buffer(pH 4.0)，sodium phosphate buffer(pH 6.0)，tris-HCl buffer(pH 8.0)and Glycin-NaOH buffer(pH 10.0)。采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的pH稳定性，将保存的金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于30mL MHB培养基中，37℃摇床培养过夜；取培养物0.5mL转接入新鲜的50mL MHB中，继续37℃培养2.5h至对数生长中期；用新鲜无菌MHB培养基调整OD₅₀₀至0.4(1.44×10⁹CFU/mL)，事先准备好灭菌的42℃的MHA培养基，向50mL该培养基中加入上述菌液500μL，立即轻轻混匀，到入培养皿中；待培养基凝固后，在培养基表面放置牛津杯，加入溶解纯化重组菌丝霉素的不同pH缓冲液样品，将平板正面向上37℃培养12～24h，观察抑菌效果。结果发现，重组菌丝霉素具有较好的pH稳定性，不同的pH缓冲液对纯化产物抑菌活性的影响不大(图3)。

4.2重组菌丝霉素的热稳定性

将重组菌丝霉素分别溶解于的100mM磷酸缓冲液(pH 6.0)中，分别在30℃、60℃、80℃和100℃下处理1h，采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的热稳定性，鉴定的模式菌采用金黄色葡萄球菌(S.aureus)，结果发现，重组菌丝霉素具有较高的热稳定性，菌丝霉素在30℃和60℃处理1h可保持高的抑菌活性，在80℃处理后活性有所降低，大约是原抑菌活性的80％，即使是在100℃下处理1h，具有原抑菌活性50％(图4)。

4.3重组菌丝霉素的抗蛋白酶消化稳定性

将重组菌丝霉素分别于含有胃蛋白酶pH2.0的Glycin-HCl缓冲液，木瓜蛋白酶pH 6.0sodium phosphate缓冲液，pH 8.0 tris-HCl缓冲液中37℃温浴4h，采用琼脂扩散抑菌试验鉴定重组菌丝霉素的抗蛋白酶消化稳定性，鉴定的模式菌采用金黄色葡萄球菌(S.aureus)，未用蛋白酶处理的纯化产物和只加蛋白酶的缓冲液作为对照。结果发现，菌丝霉素对胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的降解具有较强的抗性，处理4h后依然保持较高的抑菌活性，而用胰蛋白酶处理4小时后发现，菌丝霉素的抗菌活性基本丧失(图5)。

实施例5重组菌丝霉素的溶血性

使用10mL真空采血管(含有肝素钠作为抗凝剂)在日本长耳白兔的耳边缘静脉采血，10mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.3)重复洗涤细胞三次，然后于4℃，1500rpm，离心10min，至上清无色透明。取180μL红细胞10mM PBS悬浮液(红细胞的浓度大约为2％)，与20μL不同倍比稀释的纯化重组菌丝霉素混合，混合体系在37℃保温30min后，1500rpm离心5min。取上清转移至96孔板，使用酶标仪在540nm下测定吸光值。溶血百分比0％和100％的值分别使用10mM PBS和0.1％(v/v)Triton X-100在相同条件下同步测定。每个测试做三个平行，取测定值的平均值。结果发现与对照相比，菌丝霉素无溶血性(图6)。

实施例6重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌的抑菌活性实验

采用琼脂扩散法测定重组菌丝霉素对革兰氏阳性菌的抑菌活性，测试菌种：金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 25923、表皮葡萄球菌S.epidermidis 26069；培养基：MH肉汤培养基、MH肉汤琼脂培养基。取经过透析，G-25葡聚糖凝胶纯化的Plectasin发酵产物溶于无菌水水中(1280μg/ml)，同时配制浓度相同浓度(1280μg/ml)的氨苄青霉素钠盐、青霉素溶液，将配置的抗生素及肽溶液进行2倍梯度稀释，其浓度分别为：1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/ml。挑取金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌的单菌落至MH培养基中，37度摇培至OD_600nm为0.4，向15mL两种菌相应的培养基里加入150μL的上述菌液，轻轻混匀，倒入培养皿中，待培养基凝固，在培养基表面放置牛津杯，加入20μL(1280μg/ml)的肽溶液，其余加入10μL的(80μg/ml)抗生素作为对照，其中金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌分别用氨苄青霉素钠盐、青霉素作为对照，37度培养16-18小时，观察抑菌活性。结果表明：对重组表达的菌素霉素进行抑菌圈实验表明其对金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC25923(图7)、表皮葡萄球菌S.epidermidis 26069(图8)均存在抑菌活性。

实施例7重组菌丝霉素的应用

本发明的重组菌丝霉素可应用于治疗或预防革兰氏阳性菌尤其是链球菌领域。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要书及其等同物界定。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>重组菌丝霉素的制备及其应用

<160>1

<210>SEQ ID NO.1

<211>126

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<222>

<223>

<400>1

ggttttggtt gtaacggtcc atgggatgaa gatgatatgc aatgtcataa ccattgtaag   60

tctattaagg gttacaaggg tggttactgt gctaagggtg gttttgtttg taagtgttac   120

Claims (7)

1.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素基因的设计。根据菌丝霉素成熟肽氨基酸序列，按毕赤酵母偏爱密码子，优化设计出的菌丝霉素基因具有如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素表达载体的构建。在如1所述的菌丝霉素基因的5′-端设计限制性内切酶Xho I酶切位点，并保留了Xho I酶切位点后的酵母Kex2切割位点(KR)编码序列，以便分泌表达后信号肽的切割，在基因3′-端设计TAATAA终止子序列及XbaI酶切位点，以便多肽表达的终止及载体构建，经Xho I和Xba I双酶切后克隆至经相同双酶切后的表达载体pPICZαA上，构建重组表达载体pPICPlectasin，经测序正确。

3.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素酵母的构建。重组表达载体pPICPlectasin经内切酶Pme I线性化处理，电击转化毕赤酵母X-33，将电击后的混合液涂布在含100μg/ml Zeocin的YPDS平板上，29℃培养至出现菌落，经菌落PCR鉴定阳性转化子，甘油管保存阳性转化子，摇瓶水平筛选高表达重组菌丝霉素毕赤酵母。

4.如权利3所述的高表达重组菌丝霉素毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X33pPICPlectasin，该菌株已于2010年1月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国.北京.朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，其保藏号为CGMCCNo.3564。

5.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的高密度发酵表达。将筛选获得的表达量高的重组菌丝霉素毕赤酵母菌Pichia pastoris X33 pPICPlectasin用5L发酵罐进行高密度发酵：挑取单菌落到YPD培养基中培养至菌体浓度OD₆₀₀在4～6之间，得到一级种子培养液；按1％接种量(V/V)转接至YPD培养基中培养至菌体浓度OD600约3.3，得到二级种子培养液；按照10％接种量接入到2L上罐基料培养基中。菌体初生长阶段转速为900rpm，pH 5.0，温度29℃，通气量8L/min，生长至葡萄糖基本耗尽。进入补料生长阶段：流速35％，补加50％葡萄糖(含12‰ PMT1)，转速调至1000rpm，pH调至5.5，温度29℃，通气量8L/min，添加时间5h，共补加200mL。补料结束后，饥饿1h后，进入甲醇过渡诱导阶段，甲醇的添加量由第一小时的1ml/h/L逐渐增加到第六小时的5.9ml/h/L，接着以恒定的流速(5.9ml/h/L)，在转速1100rpm，pH 5.5，温度29℃，通气量8L/min，溶氧约40％，连续诱导120h，发酵结束上清中总蛋白浓度达到729μg/mL，收集上清透析冻干备用。

6.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的纯化。重组菌丝霉素的凝胶过滤层析分离步骤为：色谱柱材为葡聚糖凝胶Sephadex G-25，纯化条件：柱床体积40mL，径高比1∶10，上样量为1mg/mL，用去离子水进行洗脱，流速为0.5mL/min，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干。将凝胶过滤层析分离所得的重组菌丝霉素冻干物溶解在超纯水中(1mg/mL)，使用C18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，以含0.1％TFA的乙腈水溶液为流动相，以梯度洗脱模式进行分离(8％～80％，0.8mL/min)，得到的各组分进行抑菌检测，收集抑菌活性最高组分进行冻干，MALDI-TOF质谱仪验证其分子量与菌丝霉素理论分子量吻合。

7.重组菌丝霉素，其特征在于重组菌丝霉素的应用。重组菌丝霉素无溶血性，具有较好的pH稳定性、热稳定性和抗胃蛋白酶活性，可以有效的抑制革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和肺炎链球菌和的生长，因此，重组菌丝霉素在治疗革兰氏阳性菌病尤其是链球菌病方面具有相当大的潜力，具有潜在的抗菌药物开发价值。

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