CN100345865C - 一种抗菌二肽及其化学修饰物、制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗菌二肽及其化学修饰物、制备方法与应用。本发明的抗菌二肽，DNA序列为TCTAAT，氨基酸序列为Ser Asn。在酵母表达时具有一个丝氨酸糖基化位点，转化子的发酵产物及合成的二肽具有抗枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌等的效果。经过α-氨基端乙酰化的二肽分子式为Ac-Ser-Asn。抗菌二肽α-氨基端乙酰化修饰物Ac-Ser-Asn对枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。本发明发现的二肽能够作为先导化合物，以开发出对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等有效的新型抗生素。另外，由于其对嗜水气单胞菌的强烈抑制作用，可以在水产养殖领域得到应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗菌二肽及其化学修饰物、制备方法与应用。
背景技术
青霉素作为最早的抗菌药物成功解决了临床上金黄色葡萄球菌感染的难题，随后问世的大环内酯类、氨基糖苷类抗生素又使肺炎、肺结核的死亡率降低了80％。迄今为止已经发现许多种抗生素，它们在治疗感染性疾病中发挥巨大作用，大大延长了人类的预期寿命。
绝大多数抗生素由微生物合成，其中三分之二由链霉菌产生。根据抗生素的抗菌机理和性质，可将其分为五大类：β-内酰胺类抗生素，大环内酯类，氨基糖甙类，喹诺酮类和氯霉素类、克林霉素四环素类。各种抗生素的抗菌效果，多数呈抑菌作用，少数具杀菌作用或溶菌作用。抗生素的作用机理可归纳为：抑制核酸的合成；抑制蛋白质的合成；改变细胞膜的通透性；干扰细胞壁的形成；作用于能量代谢系统或作为抗代谢物。
早期细菌耐药的表现主要为某种细菌对某类药物耐药。自80年代后期至90年代，革兰氏阳性球菌中出现了非常难治疗的多重耐药菌感染，这种高度耐药的多重耐药革兰氏阳性球菌除个别抗生素外几乎对所有抗菌药物都耐药，对临床形成了很大的威胁，已引起全球的震惊和高度的重视。细菌耐药性的遗传机制和分子基础可以归纳为以下六个方面：一、细菌生产的抗菌药物钝化酶而致耐药；二、细菌生产的酶(蛋白)保护抗菌药物作用靶位而耐药；三、细菌获得功能取代蛋白(酶)而耐药；四、细菌细胞膜通透性改变导致耐药；五、细菌的主动泵出功能而致耐药；六、细菌的抗菌药物作用靶位改变而致耐药。
许多生物的基因组中编码抑制或杀灭细菌的一些短肽，称为抗菌肽。抗菌肽具有抗菌活性强、分布广等特点。但抗菌肽一般长度超过10个氨基酸，具有一定的免疫原性和较差的生物可及性。一般生物可及性好的药物分子量都在500道尔顿以下。如果能够开发小分子抗菌寡肽，则能够充分发掘出新的抗生素的资源。所以，开发抗菌寡肽对人类的健康、畜牧生产、水产养殖等具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有抗生素存在耐药性的问题，提供一种抗菌活性高的抗菌二肽。
本发明的另一个目的是提供上述抗菌二肽在制备抗菌药物上的应用。
本发明的进一步目的是提供上述抗菌二肽的化学修饰物。
本发明的再进一步目的是提供上述抗菌二肽的化学修饰物在制备抗菌药物上的应用。
本发明的目的是通过以下技术措施实现的：构建酵母α交配因子前导肽与二肽的融合DNA片段，用于二肽的分泌表达；插入用EcoRI和XbaI双酶切的含有诱导型启动子的酿酒酵母载体；为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，用核酸外切酶III和绿豆芽核酸酶对其进行消化处理；纯化后电激转化酿酒酵母；转化子转接至半乳糖诱导表达平板，过夜生长后用含细菌的上层培养基覆盖，观测抑菌圈；或用液体培养基诱导表达后测抑菌率；对阳性克隆进行PCR扩增，测序；化学合成部分抗菌肽，用琼脂糖扩散法检测活性。
本发明的抗菌二肽，DNA序列为TCTAAT，氨基酸序列为Ser Asn。在酵母表达时具有一个丝氨酸糖基化位点，转化子的发酵产物具有抗枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌等的效果。本发明利用多肽自动合成仪合成了未经修饰和经过修饰的上述二肽。未经修饰和经过α-氨基端乙酰化的二肽分子式分别为Ser-Asn、Ac-Ser-Asn。抗菌二肽α-氨基端乙酰化修饰物Ac-Ser-Asn对枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
本发明的有益效果：本发明分离的抗菌二肽具有抗枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌等的效果。目前临床上多重耐药的金黄色葡萄球菌只剩下万古霉素可用，而目前也出现了对该抗生素耐药的菌株。本发明发现的二肽能够作为先导化合物，以开发出对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等有效的新型抗生素。另外，由于其对嗜水气单胞菌的强烈抑制作用，可以在水产养殖领域得到应用。
附图说明
图1a为阳性转化子诱导表达后覆盖金黄色葡萄球菌的抗菌效果图；
图1b为空载体转化子诱导表达后覆盖金黄色葡萄球菌的效果图，为负对照；
图2a为阳性转化子诱导表达后覆盖枯草杆菌的抗菌效果图；
图2b为空载体转化子诱导表达后覆盖枯草杆菌的效果图，为负对照；
图3a为阳性转化子诱导表达后覆盖嗜水气单胞菌的抗菌效果图；
图3b为空载体转化子诱导表达后覆盖嗜水气单胞菌的效果图，为负对照；
图4为纯度为95.4％的抗菌二肽Ac-Ser-Asn点样100μg在含枯草杆菌的培养基所形成的抑菌圈图；无菌水作为负对照；
图5为全自动合成的、纯度为95.4％的抗菌二肽Ac-Ser-Asn点样100μg在含金黄色葡萄球菌的培养基所形成的抑菌圈图；0.1μl 100mg/ml氨苄青霉素作为正对照，无菌水作为负对照。
具体实施方式
实施例1
(1)构建酵母α交配因子前导肽与二肽的融合DNA片段，用于二肽的分泌表达。5’引物为<1>GCGAATTCAAAAATGAGATTTCCTTCAA。编码Ser-Asn的3’引物为<2>CGTCTAGATCAATTAGATCTTTTCTCGAGAGAT，编码其它二肽的3’引物按类似原理设计。用具有高保真活性的Pfu DNA聚合酶扩增。扩增模板使用量为每1ml PCR反应液50ng质粒pPICZαA(Invitrogen产品，含酵母α交配因子前导肽DNA序列)。扩增条件为：94℃5分钟预变性；94℃30秒，46℃30秒，72℃20秒，30个循环；72℃5分钟补平。扩增产物用1/10pH5.22.5M NaAc，和2.5倍绝对乙醇于13000rpm沉淀7分钟。用70％乙醇洗涤，13000rpm沉淀3分钟。电吹风吹干。悬浮在无菌蒸馏水里。用EcoR I和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。
(2)5μgpYES2/CT(Invitrogen产品)用EcoRI和Xba I双酶切过夜，总体积为30μl。70℃热失活20分钟。取6.5μl双酶切的pYES2/CT，加入6μl双酶切的PCR产物，1.5μl 10X连接酶缓冲液，1μl T4 DNA连接酶，16℃连接过夜。
(3)为避免未连接的线状DNA在转化后与酵母基因组DNA发生重组，需用核酸酶对其进行消化处理。连接产物用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化(见产品说明书)。用30μl H2O洗脱。加3.5μl 10X核酸外切酶III缓冲液和1μl(20单位)核酸外切酶III，37℃处理1小时。70℃失活15分钟。加入3.5μl 10X绿豆芽核酸酶缓冲液和30μl H2O，再加入1μl(20单位)绿豆芽核酸酶，37℃处理1小时20分钟。用Qiagen公司的PCR纯化柱纯化，用13μl H2O洗脱。取10μl做电激。
(4)首先制备酵母感受态细胞。用过夜培养的酿酒酵母菌种INVSc1接种200ml YPD。30℃摇瓶培养到OD值1.3，将培养物分装在50ml离心管，5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液中，25℃保温1小时。重悬在总体积200ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在总体积100ml冰预冷的无菌水中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬在20ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。5000rpm，4℃离心5分钟。去上清。重悬于0.2ml冰预冷的1mol/L山梨醇中。冰浴。每个无菌管中加80μl酵母悬浮液和100ng的DNA(总体积为10μl)及20μg ssDNA(鲑鱼精DNA)，轻轻混匀，转移至0.2-cm无菌电激杯，10℃水浴5分钟。1.8千伏、25微法、200欧姆做电激。立刻加入650μl 1mol/L山梨醇到电激杯中。轻轻混匀，转移到培养管，加650μl 2X YPD/1mol/L山梨醇，混匀之后30℃摇床培养1小时。
(5)将电激混合物涂布葡萄糖/山梨醇选择平板，于30℃生长3天。转接至不含山梨醇的葡萄糖选择平板。
(6)转接至甘油/半乳糖诱导表达平板，于30℃生长1天。提前一天接种用于检测抗菌肽活性的金黄色葡萄球菌等多种细菌，于37℃过夜生长。
(7)分别将5μl过夜生长的金黄色葡萄球菌等细菌加至10ml 50℃高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB。轻轻倒在长有酵母转化子的甘油/半乳糖诱导表达平板上。静置10分钟凝固。在没有转化子的地方用枪头尖打一个小孔，加入0.5μl50mg/ml氨苄青霉素作为正对照，置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。阳性克隆融合表达的DNA序列为TCTAAT，氨基酸序列为Ser-Asn，抑菌效果见图1、2、3。这说明抗菌二肽Ser-Asn对嗜水气单胞菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
(8)从酵母转化子扩增插入片段。取生长于葡萄糖选择培养基的对数生长晚期的酵母菌1.5ml，13000rpm离心15秒，去上清。用双蒸水洗涤一次，13000rpm离心15秒。沉淀悬浮于30μl TE缓冲液。在沸水上煮3min。13000rpm离心1min。将上清储存在-20℃。取3μl用来做PCR。根据载体pYES2/CT序列设计上下游引物。<3>CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCG。<4>GGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCG。扩增条件为：95℃5分钟预变性；94℃30秒，68℃2分钟，72℃30秒，4个循环；94℃30秒，68℃40秒，72℃30秒，41个循环；72℃5分钟补平。选用上海博亚公司的Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。100μl反应加5单位Taq DNA聚合酶和2单位Pfu DNA聚合酶。扩增片段长为570bp。测序。
所用的醋酸锂/二硫苏糖醇预处理液配方为(每100ml)：0.1M醋酸锂(终浓度)，10mM Tris(终浓度)，pH7.5，1mM EDTA(终浓度)，高压灭菌后加入过滤灭菌的10ml 0.1M二硫苏糖醇至90ml上述溶液(终浓度为l0mM)。
所用的葡萄糖/山梨醇选择平板培养基配方为(每升)：1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，1M 山梨醇，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。倒平板。
所用的不含山梨醇的葡萄糖选择平板配方为(每升)：1.7g YNB(无氨基酸酵母氮源，Amresco，Inc.)，10g葡萄糖，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。倒平板。
所用的甘油/半乳糖诱导表达平板配方为(每升)：1.7g YNB(Amresco，Inc.)，调pH值为4.1，30ml甘油，30mg亮氨酸，20mg组氨酸，30mg色氨酸，20g琼脂。高压灭菌。加入过滤除菌的终浓度为0.5％的半乳糖。倒平板。
所用的LB配方为(500ml)：5g蛋白胨，2.5g酵母抽提物，5g氯化钠，蒸馏水，pH7.0。
实施例2
在上海博亚公司用多肽合成仪合成二肽Ser-Asn。利用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成。用20％六氢吡啶、二甲基甲酰胺脱Fmoc。二甲基甲酰胺，甲醇，二氯甲烷洗涤。粗品经制备HPLC纯化，冷冻，得纯品。称取适当重量的二肽，加水，煮沸8分钟。
实施例3
经过氨基端乙酰化的二肽Ac-Ser-Asn由吉尔生化(上海)有限公司利用Fmoc/tBu固相多肽合成法合成。使用Fmoc-Asn(trt)-Wang resin。用20％六氢吡啶、二甲基甲酰胺脱Fmoc。二甲基甲酰胺，甲醇，二氯甲烷洗涤。粗品经制备HPLC纯化，冷冻，得纯品。称取适当重量的二肽，加水，煮沸8分钟。
实施例4
将5μl过夜生长的菌种(枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，一个小孔加入100μg二肽Ac-Ser-Asn(ACSN)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的一个小孔加入0.1μl 50mg/ml氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，记录，拍照。结果见图4，5。
实施例5
将5μl过夜生长的菌种(绿脓杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，两个小孔分别加入100μg二肽Ser-Asn和Ac-Ser-Asn(ACSN)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的个小孔加入0.1μl 50mg/ml氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，测抑菌圈直径。如表1所示。这说明了Ac-Ser-Asn能够有效抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌等等菌种的生长，具有较好的抗菌活性。Ser-Asn对枯草杆菌、绿脓杆菌也具有抗菌活性。
表1
实施例6
将5μl过夜生长的菌种(绿脓杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌)分别加至10ml 50℃左右高压灭菌过的0.7％琼脂糖/LB，倒平板，静置10分钟凝固。用枪头尖打多个小孔，两个小孔分别加入150μg二肽Ser-Asn和Ac-Ser-Asn(ACSN)，一个小孔加入水作为负对照，部分平板的一个小孔加入0.1μl 50mg/ml氨苄青霉素作为正对照。置超净台5分钟。在37℃培养箱倒置过夜生长。观察抑菌圈，测抑菌圈直径。
表2
如表2所示。这说明了Ac-Ser-Asn能够有效抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、绿脓杆菌等等菌种的生长，具有很好的抗菌活性。Ac-Ser-Asn用量大的抗菌效果优于用量小的抗菌效果。Ser-Asn对枯草杆菌、绿脓杆菌也具有抗菌活性。
Claims (6)
1、一种抗菌二肽，其氨基酸序列为Ser-Asn。
2、权利要求1所述抗菌二肽的化学修饰物，其特征在于所述化学修饰物为氨基端乙酰化的抗菌二肽，氨基酸序列为：Ac-Ser Asn。
3、权利要求1所述抗菌二肽在制备抗菌药物中的应用。
4、权利要求2所述抗菌二肽的化学修饰物在制备抗菌药物中的应用。
5、如权利要求3所述的应用，其特征在于所述抗菌二肽在制备抗嗜水气单胞菌、枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
6、如权利要求4所述的应用，其特征在于所述抗菌二肽的化学修饰物在制备抗枯草杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的药物中的应用。
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