CN113321708B - 一种人工设计抗菌肽的制备及其在水产上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于已有模板抗菌肽序列Ala Pro Lys Ala Met Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln Lys Lys Gly Ile（NCBI数据库收录号：AJN45154）设计合成的新抗菌肽JSKJ01，本发明同时提供人工设计合成抗菌肽JSKJ01的制备方法，本发明还提供抗菌肽JSKJ01的应用方法；人工设计合成抗菌肽JSKJ01具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对耐药细菌有很好的抑制作用；与设计模板比较，在保留模板抗菌活性的同时，针对部分细菌菌株新设计抗菌肽JSKJ01的活性优于设计模板；人工设计合成抗菌肽JSKJ01具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点；其显著特点在于无药物残留，对多种水产细菌性病害的预防和治疗效果显著；可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗，特别是在水产上的应用。

Description

一种人工设计抗菌肽的制备及其在水产上的应用
技术领域
本发明提供了一个人工设计合成的抗菌肽（JSKJ01），本发明还涉及抗菌肽（JSKJ01）的制备及其在水产上的应用，属生物医学领域。
背景技术
抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽通常由l5～45个氨基酸残基组成，大部分带正电荷。抗菌肽广泛地分布在两栖类、昆虫、植物和哺乳动物中。绝大多数抗菌肽分子含有较多的碱性氨基酸残基，因此又被称为阳离子抗菌肽。抗菌肽具有广谱抗微生物活性，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和被膜病毒都有抑杀作用，特别对一些耐药菌，如伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌等同样敏感。其作用机制主要是带正电的抗菌肽与带负电的微生物细胞膜发生作用，按作用特点可分为膜结构破坏型和非膜结构破坏型。与目前广泛使用的抗生素相比，肽类抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物活性；不易产生耐药性；热稳定、水溶性好；对局部感染和全身感染都有效等。
长期以来，抗生素在治疗畜禽水产养殖动物病害时见效快、疗效显著，成为畜禽水产养殖领域治疗细菌性疾病的首选药物。然而，随着抗生素在畜禽水产养殖领域应用规模的不断扩大，人们发现，常用抗生素的治疗效果逐渐减弱，与之对应的是，病原菌耐药性不断增强，导致抗生素的单位用药量不断加大，抗生素在畜禽水产品中的残留问题也愈发严重，威胁食品安全，抗生素在环境中的广泛残留也威胁着人类健康。由于抗生素耐药性和残留问题的日益突出，2018年6月，农业农村部公布2018年全国兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018～2021），即到2021年饲料中禁止添加抗生素。抗生素的危害日趋显现，抗生素替代品的发展与应用势在必行，抗菌肽作为一种抗生素的替代物备受关注，加强对抗菌肽功能的了解，并在此基础上设计新型的抗菌肽以替代抗生素有着重要的理论和实际意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于已有模板抗菌肽序列Ala Pro Lys Ala Met LysLeu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln Lys Lys Gly Ile（NCBI数据库收录号：AJN45154）设计合成的新抗菌肽JSKJ01，本发明同时提供人工设计合成抗菌肽JSKJ01的制备方法，本发明还提供抗菌肽JSKJ01的应用方法。人工设计合成抗菌肽JSKJ01具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，尤其是对耐药细菌有很好的抑制作用。与设计模板比较，在保留模板抗菌活性的同时，针对部分细菌菌株新设计抗菌肽JSKJ01的活性优于设计模板。人工设计合成抗菌肽JSKJ01具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点。可以应用于人或动物感染性疾病的预防和治疗，特别是在水产上的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
人工设计合成抗菌肽JSKJ01，所述抗菌肽具有以下序列：
SEQ ID NO:1：丙氨酸－赖氨酸－赖氨酸－丙氨酸－甲硫氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－赖氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－赖氨酸－亮氨酸－缬氨酸－赖氨酸－赖氨酸－甘氨酸－异亮氨酸 (Ala Lys Lys Ala Met Lys Phe Phe Lys Lys PhePhe Lys Leu Val Lys Lys Gly Ile)
人工设计合成抗菌肽JSKJ01的制备方法：采用全自动多肽合成仪合成，抗菌肽全序列符合SEQ ID NO:1。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)。
人工设计合成抗菌肽JSKJ01作为制备抗微生物物质的应用。
本发明以特定抗菌肽为模板，设计合成了新的抗菌肽JSKJ01，与其它来源抗菌多肽相比，该抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广的有益特点，无药物残留。
具体实施方式
实施例 1 人工设计合成抗菌肽JSKJ01的制备
1、分别用全自动多肽合成仪利用不同氨基酸残基为原料合成抗菌肽JSKJ01的全序列。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。
2、分子量测定采用快原子轰击质谱法（Fast atom bombardment massspectrometry，FAB-MS），以甘油：间硝基苄醇：二甲亚砜（1:1:1, V:V:V，体积比）为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1 mA，发射电压为25 Kv。
用于设计的抗菌肽模板序列为：
AJN45154（NCBI数据库收录号：AJN45154）：
丙氨酸－脯氨酸－赖氨酸－丙氨酸－甲硫氨酸－赖氨酸－亮氨酸－亮氨酸－赖氨酸－赖氨酸－亮氨酸－亮氨酸－赖氨酸－亮氨酸－谷氨酰胺－赖氨酸－赖氨酸－甘氨酸－异亮氨酸 （Ala Pro Lys Ala Met Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln LysLys Gly Ile）
基于模板人工设计合成抗菌肽，所述抗菌肽为选自序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
JSKJ01 （SEQ ID NO:1）：丙氨酸－赖氨酸－赖氨酸－丙氨酸－甲硫氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－赖氨酸－赖氨酸－苯丙氨酸－苯丙氨酸－赖氨酸－亮氨酸－缬氨酸－赖氨酸－赖氨酸－甘氨酸－异亮氨酸 （Ala Lys Lys Ala Met Lys Phe Phe LysLys Phe Phe Lys Leu Val Lys Lys Gly Ile）
实施例2 人工设计合成抗菌肽JSKJ01对人红细胞的溶血活性
实验方法：健康人红细胞购自昆明市中心血站，人红细胞与0.38%柠檬酸钠按1:9（v/v）的比例混合后，2000 r/min离心5min，弃上清。然后用生理盐水充分洗涤人红细胞至不再呈红色为止。将上述洗涤好的人红细胞加生理盐水稀释成约108个细胞/ml浓度的悬浮液。上述稀释好的悬浮液与溶解于生理盐水的不同浓度的样品于37°C保温1h，2000 r/min离心5min后于540nm测定上清液的吸收值，溶血活性根据各样品与加入1%的Triton X-100得到的最大溶血值相比而确定，结果见表1。
Figure 407402DEST_PATH_IMAGE001
由表1可见，人工设计合成抗菌肽在浓度为200 ug/ml时，基本不具有对人红细胞的溶血活性，有利于其应用推广。
实施例3 人工设计合成抗菌肽JSKJ01抑制细菌生长的作用
抗菌活性检测，按常规倍比稀释法进行。96孔板每孔加菌液90 ul，（终浓度106CFU/ml），每孔设3个复孔，以pH7.0 LB培养基（每升含10g胰蛋白胨，Oxoid公司生产；5g酵母提取物，Oxoid公司生产；10g氯化钠，国产分析纯试剂）为阴性对照。加入不同浓度的用无菌超纯水配制的抗菌肽10ul，使终浓度成倍比下降。37 oC孵育14-16 h，测定各孔600nm的吸光度，吸光度无变化的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。此试验重复三次，取平均值，结果如表2。
Figure 167547DEST_PATH_IMAGE002
实验所用细菌以及真菌菌株说明：
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 43300，是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌ATCC标准株，对青霉素类，β-内酰胺类耐药，对万古霉素敏感。
大肠杆菌（Escherichia coli）临床耐药株1和2，均为产超广谱β-内酰胺酶的临床分离株，对青霉素，头孢1代、2代、3代以及4代耐药，对泰能、氨基糖甙类敏感。
绿脓杆菌（Bacillus pyocyaneus）临床耐药株，为多药耐药临床分离株，对目前临床使用各类抗生素均耐药，包括泰能、MEM。
真菌类的白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231为标准株。
其余所用菌株采用细菌16S rDNA菌种鉴定方法：提取培养单克隆菌株DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序，进化树分析精确鉴定到种。
由表2可见，人工设计合成抗菌肽JSKJ01针对革兰氏阴性菌具有比模板抗菌肽AJN45154更为优良的抗菌活性。本发明抗菌肽JSKJ01具有显著的抑制细菌以及真菌生长的作用，可作为抗微生物物质用于制备抗微生物感染制剂。
实施例4 对水产常见细菌的抑制作用与抗生素对比
实验方法：实验分为抗菌肽JSKJ01、头孢哌酮、钠硫酸新霉素3组，将3mm直径的圆片分别浸入超纯水稀释的抗菌肽JSKJ01（200 ug/ml）、头孢哌酮和钠硫酸新霉溶液的浓度均为200 ug/ml。120s后取出，上述制备的圆片无菌条件下置于37oC干燥2h备用。抗菌活性检测采用琼脂糖扩散法进行。培养基配方为：1％低熔点琼脂糖(Sigma A6013)， 0.3 mg/ml胰蛋白胨（Oxoid产品）溶于10 mM pH 7.4 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。制备的培养基20ml于42oC时分别加入过夜培养对数生长期水产常见细菌菌株（终浓度105 CFU/ml），摇匀后使其在直径76mm培养皿中均匀摊布。待凝固后，在培养基上分别加入制备好的圆片，37oC继续孵育16h，然后测量无菌生长的透明环直径进行抗菌活性的测定。抗菌活性的计算：抗菌活性单位U＝（抗菌环的直径mm－3）×10，实验结果见表3。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表3可见，人工设计合成抗菌肽JSKJ01对水产常见细菌的抑菌效果与头孢哌酮钠、硫酸新霉素等抗生素相当。
实施例4 人工设计合成抗菌肽JSKJ01对水产致病菌维氏气单胞菌感染的治疗效果
实验方法：取健康斑点叉尾鮰实验鱼80尾，体重100-120 g，体长15-20cm，养殖缸为55 cm×40cm×30cm的有机玻璃缸，每缸养殖10尾实验鱼，水温 25-28℃，使用气石曝气增氧。实验鱼停食暂养48h后开始进行实验。
实验用维氏气单胞菌菌株获取自国家水生动物病原库（上海海洋大学），于LB液体培养基中培养24 h，培养温度28 ℃，将菌液在4 ℃下5500 r/min离心10 min，弃去上清液，取菌体沉淀加9 mL生理盐水振荡重悬后再次离心，重复3次后，加入生理盐水比浊，制成浓度为6×108 CFU/mL的菌悬液备用。
各缸实验鱼腹腔注射0.5 ml维氏气单胞菌菌悬液进行人工感染，同时随机选取6个缸为实验组，实验组斑点叉尾鮰腹腔注射2mg/L、5mg/L、10mg/L的抗菌肽JSKJ01溶液0.5ml，各设1个重复；另2个缸为对照组，对照组斑点叉尾鮰腹腔注射等量的无菌生理盐水（0.85%）。暂养观察实验鱼情况。
Figure 434580DEST_PATH_IMAGE004
观察发现，实验组斑点叉尾鮰在人工感染后，腹腔注射10mg/L的抗菌肽JSKJ01组斑点叉尾鮰未见异常情况，腹腔注射5mg/L的抗菌肽JSKJ01组斑点叉尾鮰第2日出现轻微腹腔肿胀情况，第3日症状即减轻并恢复正常，腹腔注射2mg/L的抗菌肽JSKJ01组斑点叉尾鮰第2-3日出现头部充血、腹腔肿胀情况，但第4日症状减轻并恢复正常，至第7日，实验组无死亡。对照组斑点叉尾鮰在人工感染后，第2日均出现头部充血、腹腔肿胀情况，第3日症状加重，腹部肿胀严重，浮于水面，游动困难，第4日对照组斑点叉尾鮰大量死亡，至第5日，对照组斑点叉尾鮰全部死亡。
结果表明：抗菌肽JSKJ01对斑点叉尾鮰维氏气单胞菌急性感染具有强效保护作用，可有效治疗维氏气单胞菌感染导致的肠炎及败血症。
实施例5 人工设计合成抗菌肽JSKJ01对水产致病菌嗜水气单胞菌感染的治疗效果
实验方法：取健康黄颡鱼实验鱼80尾，体重80-90 g，体长12-18cm，养殖缸为55 cm×40cm×30cm的有机玻璃缸，每缸养殖10尾实验鱼，水温 25-28℃，使用气石曝气增氧。实验鱼停食暂养48h后开始进行实验。
实验用嗜水气单胞菌菌株获取自国家水生动物病原库（上海海洋大学），于LB液体培养基中培养24 h，培养温度28 ℃，将菌液在4 ℃下5500 r/min离心10 min，弃去上清液，取菌体沉淀加9 mL生理盐水振荡重悬后再次离心，重复3次后，加入生理盐水比浊，制成浓度为6×108 CFU/mL的菌悬液备用。
各缸实验鱼腹腔注射0.5 ml嗜水气单胞菌菌悬液进行人工感染，同时随机选取6个缸为实验组，实验组黄颡鱼腹腔注射2mg/L、5mg/L、10mg/L的抗菌肽JSKJ01溶液0.5ml，各设1个重复；另2个缸为对照组，对照组黄颡鱼腹腔注射等量的无菌生理盐水（0.85%）。暂养观察实验鱼情况。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
观察发现，实验组黄颡鱼在人工感染后，腹腔注射10mg/L的抗菌肽JSKJ01组黄颡鱼未见异常情况，腹腔注射5mg/L的抗菌肽JSKJ01组黄颡鱼第2日出现轻微肛门红肿情况，第3日症状即减轻并恢复正常，腹腔注射2mg/L的抗菌肽JSKJ01组黄颡鱼第2-3日出现肛门红肿情况，但第4日症状减轻并恢复正常，至第7日，实验组无死亡。对照组黄颡鱼在人工感染后，第2日均出现肛门红肿情况，第3日症状加重，肛门红肿外突，腹腔肿胀，黄颡鱼游动缓慢，第4日对照组黄颡鱼大量死亡，至第5日，对照组黄颡鱼全部死亡。
结果表明：抗菌肽JSKJ01对黄颡鱼维氏气单胞菌急性感染具有强效保护作用，可有效治疗维氏气单胞菌感染导致的肠道炎症。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏亢钧生物科技有限公司
<120> 一种人工设计抗菌肽的制备及其在水产上的应用
<130> 20220616
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> PRT
<213> 抗菌肽JSKJ01
<400> 1
Ala Lys Lys Ala Met Lys Phe Phe Lys Lys Phe Phe Lys Leu Val Lys
1 5 10 15
Lys Gly Ile

Claims (4)

1.一种人工设计合成抗菌肽JSKJ01，其特征在于所述抗菌肽JSKJ01的氨基酸序列为：AKKAMKFFKKFFKLVKKGI。
2.根据权利要求1所述的一种人工设计合成抗菌肽JSKJ01的制备方法，其特征在于：所述人工设计合成抗菌肽JSKJ01采用固相化学法合成。
3.根据权利要求1所述的一种人工设计合成抗菌肽JSKJ01的应用，其特征在于：用于在制备治疗水产养殖中因维氏气单胞菌感染导致的肠炎或败血症的药物中的应用。
4.根据权利要求1所述的一种人工设计合成抗菌肽JSKJ01的应用，其特征在于：用于制备治疗水产养殖中因嗜水气单胞菌感染导致的肠道炎症的药物中的应用。
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