CN101392027A - 一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法。本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白。本发明还提供表达上述融合蛋白的核酸序列。本发明还进一步提供一种表达载体，所述表达载体含有上述核酸序列。本发明更进一步提供了包含上述表达载体的重组病毒，所述重组病毒是指中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No.1795的重组病毒。本发明提供的融合蛋白经动物口服试验，能产生高水平的抗体，成为一种制备治疗阿尔茨海默病口服药物的新型方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又称老年痴呆症，是老年人中一种最为常见的严重的中枢神经系统退行性疾病，目前中国约有老年痴呆症患者500万人之多，占世界总病例数的四分之一强，而且每年平均还有30万老年人加入这个行列。随着我国人口老龄化问题的突出，对老年痴呆症的预防和治疗已显得越来越重要。临床上主要表现为中枢神经系统的全面衰退，认知功能、记忆逐渐丧失，造成生活自理能力的障碍和精神行为的异常，最终导致死亡。AD最显著的神经病理组织学特征：老年斑的形成、神经原纤维缠结和神经细胞的大量死亡，AD晚期还伴有乙酞胆碱水平降低。其中老年斑主要是由41-43个氨基酸片段的β淀粉样蛋白沉积而成的，Aβ是β淀粉样前体蛋白经由β和γ分泌酶分解产生的，具有高度的成纤维性和神经毒性。以Aβ42及其亚单位片段为靶的免疫治疗已在临床试验中取得显著效果(Janus et al，2000；Morgan et al，2000；Weiner et al，2000)。2000年，惠氏公司和爱尔兰一家生物制药企业Elan制药公司开始着手一只阿尔茨海默病疫苗的临床试验，该疫苗可以刺激β-淀粉样蛋白抗体。研究人员指出，在试验中，病人认知能力的下降确实得到了很大的减缓。但是，这项试验后来停止了，原因是参与试验的几位病人出现了严重的脑部炎症。有证据表明，口服疫苗不会引起鼠脑发炎或出血，大大减少了毒副作用，在老鼠身上具有疗效。
为此，本研究运用分子克隆技术获得CTB与人Aβ42融合基因，应用昆虫杆状病毒系统在家蚕幼虫和蛹中表达该融合蛋白，经动物试验表明，口服家蚕幼虫和蛹表达的CTB与人Aβ42融合蛋白对治疗阿尔茨海默病有明显效果。本文中的CTB是否指霍乱毒素B亚单位，Aβ是否是指Aβ-淀粉肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的融合蛋白(CTB-AB42)，如SEQID No：1所示。
本发明还提供表达上述融合蛋白的核酸序列，如SEQ ID No：2所示。
本发明还进一步提供一种表达载体，所述表达载体含有SEQ ID No.2所示的核酸序列，具体的讲，所述的表达载体是指pBac-TNS。
本发明更进一步提供包含上述表达载体的重组病毒，具体的讲，所述重组病毒是指中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市海淀区中关村北一条13号)保藏，保藏编号为CGMCC No.1795的重组病毒(保藏日期：2006年8月30日)，分类命名：杆状病毒家蚕核型多角体病毒。
本发明还提供上述表达载体的制备方法，包括如下步骤：
(1)构建重组质粒pBac-AB：根据人Aβ42基因序列设计4条引物(SEQID No：3-SEQ ID No：6)。其中AD-F1、F2为正向引物，AD-R1、R2反向引物，F1的5’端加有BamHI位点，R1的5’端加有XhoI位点。通过一次链延伸反应加一次PCR的方法获得目的序列后将其连接在转移载体pBacPAK8上，获得重组质粒pBac-AB。
AD-F1：5’GGGGATCCGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCA3’
AD-F2：5’GATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGT3’
AD-R1：5’GGCTCGAGCTACGCTATGACAACACCGCCCACCATGAGTCCAATGATTG3’
AD-R2：5’ATGAGTCCAATGATTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAA3’
(2)构建融合基因pBac-TNS：设计3条引物(SEQ ID No：7-SEQIDNo：9)。以pBacCTBINS质粒(Gong等，2005，Journal of Biotechnology，119：93-105)为模板、进行PCR扩增，CTB-AB42-N和P1为引物进行扩增，获得片段CTB-GPGP。以pBac-AB质粒为模板、P1和AD-R1为引物，通过扩增获得AB-GPGP。以CTB-GPGP和AB-GPGP互为引物和模板进行链延伸反应，得到产物记为Seq-1，再以Seq-1为模板，CTB-AB42-N和AD-R1为引物进行扩增，使CTB基因与人Aβ42基因之间以柔性四肽(GPGP)连接，获得大小约为510bp左右的融合基因TNS。融合基因序列如SEQ IDNO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。将PCR获得的目的片段经BamHI和XhoI双酶切后，连接在同样被BamHI和XhoI双酶切的转移载体pBacPAK8上，构建含CTB与人Aβ42基因的杆状病毒转移质粒pBac-TNS，其构造见图1；
CTB-AB42-N：5’GGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTG3’
P1：5’GGGGATCCATAAATATGCCGAATATTAAATTAAAATTTGGTGT3’
AD-CTB-2：5’GGGGCCGGGGCCATTTGCCATACTAATTG3’
本发明还提供上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
将CGMCC No.1795重组病毒感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增；
步骤(1)扩增得到的CGMCC No.1795重组病毒注射至家蚕幼虫或蛹体内，取家蚕幼虫或蛹的淋巴血。
本发明还提供上述CGMCC No.1795重组病毒的制备方法，步骤如下：
将所述表达载体pBac-TNS与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞BmN，进行3轮空斑和Southern点杂交筛选，筛选出含CTB与人Aβ42融合基因的重组杆状病毒所述重组病毒，命名为BmBacTNS。
本发明提供的融合蛋白经动物口服试验，能产生高水平的抗体，成为一种制备治疗阿尔茨海默病口服药物的新型方法。
本发明的有益效果是：用家蚕高效表达CTB与人Aβ42融合蛋白，比直接从原核生物中表达的蛋白活性高，家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养，而且不会造成公害，蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；可以家蚕生产的融合蛋白可以作为口服药物，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
附图说明
图1：含CTB与人Aβ42融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-TNS：
AcMNPV：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子5’端/3’端旁侧序列；
P：苜蓿银纹夜蛾多角体病毒多角体启动子；
M13 ori：M13噬菌体复制起始点；
Amp：氨苄青霉素基因；
ori：pUC复制起始点。
图2：家蚕表达产物的GM1-ELISA分析。
具体实施方式
实施例1：CTB与人Aβ42融合基因的重组表达载体的构建
通过一次链延伸反应和两次PCR的方法获得人Aβ42基因：(1)链延伸：反应体系含有引物F2和R2，1单位的Taq酶和其他常规PCR试剂；反应条件为94℃变性10分钟，55℃退火5分钟后让F2和R2互为引物和模板在72℃延伸5分钟，得到产物记为SegI；(2)第一次PCR：以SegI为模板，F1和R1为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，反应30个循环，最后72℃保温5分钟，此时产物记为Seg II，并用DNA清洁试剂盒纯化该产物；用BamHI和XhoI双酶切低熔点琼脂糖凝胶回收基因片段，与同样经BamHI和XhoI双酶切的pBacPAK8载体片段连接，经过酶切和PCR鉴定获得重组质粒pBac-AB，通过测序证明核苷酸序列完全正确。
为构建融合基因，再设计3条引物CTB-AB42-N、P1和AD-CTB-2，使CTB基因与人Aβ42基因之间以柔性四肽(GPGP)连接。以pBacCTBINS质粒(Gong等，2005，Journal of Biotechnology，119：93-105)为模板、进行PCR扩增，CTB-AB42-N和P1为引物进行扩增，使CTB基因与人Aβ42基因之间以柔性四肽(GPGP)连接，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃ 1分钟，59℃ 1分钟，72℃ 1分钟，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，获得片段记为CTB-GPGP。以pBac-AB质粒为模板、P1和AD-R1为引物，反应条件为94℃预变性5分钟，扩增时94℃ 1分钟，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，反应30个循环，最后72℃保温10分钟，通过扩增获得AB-GPGP。以CTB-GPGP和AB-GPGP互为引物和模板进行链延伸反应，反应条件为94℃变性10分钟，59℃退火5分钟，72℃延伸5分钟，得到产物记为Seq-1，再以Seq-1为模板，CTB-AB42-N和AD-R1为引物进行扩增，获得大小约为510bp左右的融合基因TNS。将PCR获得的目的片段经BamHI和XhoI双酶切后，连接在同样被BamHI和XhoI双酶切的转移载体pBacPAK8上，构建含CTB与人Aβ42基因的杆状病毒转移质粒pBac-TNS，其构造见图1。
实施例2：CTB与人Aβ42融合基因的重组杆状病毒的获得
取5ul含CTB与人Aβ42融合基因的昆虫杆状病毒转移质粒pBac-TNS和6ul野生家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染。取6ulLipofectin(Invitrogen公司)加入100ul无血清的TC-100培养基混均。将事先培养在35mm Dish中的BmN细胞用无血清的TC-100(Invitrogen公司)培养基洗涤两次，并逐滴加入转移质粒和Lipofectin混合物，27℃培养4-5天，收取上清进行第一轮空斑筛选。取5ul上清感染35mm Di sh中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖。4-5天后挑取空斑，感染Bm N细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern杂交，取阳性克隆的上清进行3轮空斑筛选。取阳性克隆的上清感染Bm N细胞扩增。即可得到大量的含CTB与人Aβ42融合基因的重组杆状病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCC No.1795。
实施例3：CTB与人Aβ 42融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达
取扩增的含CTB与人Aβ42融合基因的重组杆状病毒注射到五龄家蚕(Bombyx mori)幼虫和蛹中，每头注射2ul左右(滴度为1×107/ml)，分别取24、48、72、96、120和144小时表达的家蚕淋巴和蛹血，6000rpm10min离心后取上清，用PBS pH7.4稀释10倍后，加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(100Mm Tris.HCl，4％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，取10ul进行SDS-PAGE分析。结果表明，CTB与人Aβ42融合蛋白在家蚕和蛹中获得高效表达，经Western杂交表明表达产物分子量约为20kD。将家蚕幼虫和蛹体含有表达的融合蛋白的血淋巴，高速冷冻离心，取上清。稀释后包被酶标板，同时以CTB为标准品，按照常规的ELISA步骤操作，其中兔抗CT—抗(购自SIGMA公司)稀释5000倍，山羊抗兔二抗稀释1000倍，用OPD(购自上海化学试剂公司)显色，于492nm处测定OD值，结果表明幼虫和蛹体表达的目的蛋白有很强的免疫活性，表达量分别达到220μg/ml和275μg/ml。
实施例4：家蚕幼虫蚕蛹中表达的CTB与Aβ42融合蛋白的动物试验。
在家蚕幼虫和蛹体表达CTB与Aβ42融合蛋白，经过12000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。将ICR小鼠随机分成2组，每组10只，剂量为50μg/鼠，隔天给药，连续喂4周。以口服给正常的蚕血淋巴为阴性对照，第10周处死小鼠，测定CTB和Aβ42抗体。结果表明给药组的小鼠CTB和Aβ42抗体分别为(OD为0.81±0.31和0.74±0.23)，显著高于对照组(OD为0.21±0.11和0.25±0.12)。
由于已经根据其特殊的实施方案描述了本发明，某些修饰和等效变化对于精通此领域的技术人员是显而易见的且包括在本发明的范围内。
序列表
<110>浙江大学
<120>治疗阿尔茨海默病的融合蛋白及其制备方法
<130>Janus et al，2000
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>170
<212>PRT
<213>artifical
<400>1
<210>2
<211>513
<212>DNA
<213>artifical
<400>2
<210>3
<211>49
<212>DNA
<213>artifical
<400>3
<210>4
<211>50
<212>DNA
<213>artifical
<400>4
<210>5
<211>49
<212>DNA
<213>artifical
<400>5
<210>6
<211>50
<212>DNA
<213>artifical
<400>6
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>artifical
<400>7
<210>8
<211>43
<212>DNA
<213>artifical
<400>8
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>artifical
<400>9
Claims (8)
1.治疗阿尔茨海默病的融合蛋白，如SEQ ID No:1所示。
2.表达权利要求1所述融合蛋白的核酸序列，如SEQ ID No:2所示。
3.含有权利要求2所述核酸序列的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的重组病毒。
5.根据权利要求4所述重组病毒，其特征在于，所述重组病毒为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏编号为CGMCCNo.1795的重组病毒。
6.权利要求3所述表达载体的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)以SEQ ID No:3-SEQID No:6为引物，PCR反应扩增得到的序列连接到pBacPAK8上，获得重组质粒；
(2)SEQ ID No:7-SEQ ID No:9为引物，pBacCTBINS质粒为模板进行PCR扩增，扩增产物链接到pBacPAK8上。
7.权利要求1所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法为将CGMCC No.1795重组病毒注射至家蚕幼虫或蛹体内进行表达。
8.权利要求5所述CGMCC No.1795重组病毒的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：
将权利要求3所述表达载体与家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞BmN，进行3轮空斑和Southern点杂交筛选。
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