CN104531736A - 一种防治ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症蛋白药物的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种防治Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症蛋白药物的制备和应用。本发明利用CTB基因与两倍的人Aβ42基因构建融合基因,将该融合基因表达的融合蛋白饲喂小鼠,不仅能显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况,在连续监测,25周后,阴性对照组有86.7%小鼠患病,而饲喂融合蛋白的小鼠只有53.3%患病;还能显著提高阿尔茨海默症模型小鼠Aβ42抗体水平,降低大脑内Aβ42的含量,提示该融合蛋白能用于制备Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症的防治药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物药物开发技术领域,具体涉及一种防治Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症蛋白药物的制备和应用。
背景技术
糖尿病是一种由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍所导致的以血糖高为特征的代谢性疾病,目前已经成为世界上影响人体健康的重大疾病之一。糖尿病分为Ⅰ型和Ⅱ型,其中,Ⅰ型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病,IDDM)是由于胰岛β细胞受到破坏导致胰岛素分泌缺陷的自身免疫性疾病,而Ⅱ型糖尿病患者体内分泌胰岛素的能力并未完全丧失,有的患者体内胰岛素甚至产生过多,但胰岛素的作用效果较差,导致体内胰岛素相对缺乏。
Ⅰ型糖尿病占全国糖尿病总数的5-10%,全国Ⅰ型糖尿病的患者至少有100万,目前还呈上升趋势。Ⅰ型糖尿病患者必须长期服用胰岛素以维持生命,给家庭和社会带来了严重的精神压力和经济负担,且糖尿病引起的各种并发症是导致残疾和死亡的主要原因,因此糖尿病的防治迫在眉睫。现有技术中治疗糖尿病的药物多数针对Ⅱ型糖尿病,用于治疗Ⅰ型糖尿病的药物则相对较少。
Ⅰ型糖尿病的抗原包括胰岛素及其前体、谷氨酸脱羧酶(Glutnmic aciddecarnoxylase,GAD)蛋白、热休克蛋白、羧基肽酶H等多种抗原。研究表明,仅给动物口服一种自身抗原如胰岛素,就能诱导免疫耐受,对机体产生保护作用(Science,1994,265:1237)。这是由于口服抗原能够诱导调节性T细胞分泌抑制性细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β,降低自身免疫疾病病灶由IL-2、IFN-γ和TNF-α导致的炎症反应。这种由相互间无关的各种抗原诱导的,在同一特定器官发生的所有病理免疫反应进行抑制,被称为抗原驱动旁观者抑制(Antigen-driven Bystander Supression)。抗原驱动旁观者抑制的诱导是抗原特异性的,而效应是非特异性的,这为防预Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病提供了一条新途径(Immunol Today,1998,19:173)。
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)俗称老年痴呆症,是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上主要表现为中枢神经系统的全面衰退,认知功能,记忆逐渐丧失,造成生活自理能力的障碍和精神行为的异常,最终导致死亡。目前中国阿尔茨海默症患者1000万人之多,而且平均每7秒就会有一名患者加入这个行列。阿尔茨海默症患者需要长期护理,全球护理费用超6000亿美元,占全球GDP的1%。随着我国人口老龄化问题的突出,对阿尔茨海默症的预防和治疗已显得越来越重要。AD最显著的神经病理组织学特征:老年斑的形成,神经元纤维缠结和神经细胞的大量凋亡。其中老年斑主要是由41-43个氨基酸片段的β淀粉样蛋白沉积而形成,Aβ是β淀粉样前体蛋白经由β和γ分泌酶分解产生的,具有高度的成纤维性和神经毒性。以Aβ42及其亚单位片段为靶点的免疫治疗已在临床试验中取得显著效果(Janus et al,2000)。2000年,美国生物制药企业Elan制药公司着手的阿尔茨海默症疫苗在临床试验中,患者的认知和记忆能力得到显著的改善。但是,在Ⅱ期临床最终因为参与试验的患者中有几位患者出现了严重的脑膜炎而被停止。有证据表明,口服疫苗不会引起小鼠脑发炎或出血,大大减少了毒副作用。
同时,研究表明霍乱病毒B亚基(CTB)可作为诱导口服耐受的强大粘膜运载系统,并且CTB偶联抗原可能涉及到与传统大量口服自身抗原产生免疫耐受效应明显不同的免疫调节机制,可能涉及到发炎细胞的移动行为的变化(Nat Biotechnol,1998,16,292),暗示CTB偶联自身抗原不仅使应用口服耐受防治Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病更具实际应用价值,而且还有潜在的治疗前景(Proc Natl Acad Sci USA,1997,94:4610)。
目前还未见CTB与Aβ42的融合蛋白的在Ⅰ型糖尿病的防治方面的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种融合基因,该融合基因表达的融合蛋白可用于制备Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症防治药物。
一种融合基因及其表达的融合蛋白,所述融合基因由CTB基因和Aβ42基因重组而成,所述融合蛋白由CTB和Aβ42融合而成。
为保证Aβ42基因的表达量,作为优选,所述融合基因中,Aβ42基因的拷贝数为2;即融合基因CTB-(Aβ42)2是由CTB基因和两倍的Aβ42基因重组而成。
作为优选,所述融合基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示;如SEQ IDNo.1所示融合基因的制备方法为:
(a)以pBac-CTB-Aβ42质粒为模板,以aF/aR为引物进行扩增,获得目的片段CTB-Aβ42-GPGP;
上游引物aF的碱基序列如SEQ ID No.3所示,下游引物aR的碱基序列如SEQ ID No.4所示;
(b)以pBac-CTB-Aβ42质粒为模板,以bF/bR为引物进行扩增,获得目的片段GPGP-Aβ42;
上游引物bF的碱基序列如SEQ ID No.5所示,下游引物bR的碱基序列如SEQ ID No.6所示;
(c)以CTB-Aβ42-GPGP和GPGP-Aβ42互为引物和模板进行链延伸反应,获得产物S1,以S1为模板,以aF/bR为引物进行扩增,获得融合基因CTB-(Aβ42)2。
由SEQ ID No.1所示的融合基因表达的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
本发明还提供了含有所述融合基因的表达载体和转化子。作为优选,所述转化子为重组家蚕杆状病毒。该重组家蚕杆状病毒的制备方法为:
(i)用BamH 1和Xho1对融合基因CTB-(Aβ42)2进行双酶切,将酶切片段连接到经同样处理的转移载体上,构建含目的基因的家蚕杆状病毒转移质粒;所述转移载体可选用pFast Bac1;
(ii)将家蚕杆状病毒转移质粒转化大肠杆菌,通过蓝白斑筛选获得重组病毒质粒;
(iii)将重组病毒质粒转染家蚕卵巢细胞,获得重组家蚕杆状病毒。
本发明还提供了一种所述融合蛋白的制备方法,包括:
(1)将上述制备的重组家蚕杆状病毒感染家蚕卵巢细胞,进行病毒扩增;
(2)将扩增得到的重组家蚕杆状病毒注射至家蚕幼虫或蚕蛹体内,经5-6d后取蚕幼虫或蚕蛹淋巴血,离心取上清,分离纯化获得所述融合蛋白。
利用被重组家蚕杆状病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹高效表达融合蛋白,比直接用原核生物表达的活性高,比通过转基因植物表达的产率高;家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫,可以低成本、大规模饲养,而且不会造成公害;蚕体中有多重天然蛋白质保护剂,对表达产物有保护作用,使基因表达产物更加稳定。
本发明还提供了所述融合蛋白在制备Ⅰ型糖尿病治疗药物中的应用。试验表明,该融合蛋白能够显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况,在连续监测25周后,阴性对照组有86.7%小鼠患病,而饲喂融合蛋白的小鼠只有53.3%患病。
本发明还提供了所述融合蛋白在制备阿尔茨海默症防治药物中的应用。试验表明,该融合蛋白能够显著提高阿尔茨海默症模型小鼠Aβ42抗体水平,降低大脑内Aβ42的含量。
由此可见,本发明的融合蛋白可作为活性成分,用以制备Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症防治药物。作为优选,所述Ⅰ型糖尿病防治药物以及阿尔茨海默症防治药物均为口服药物,为患者解除注射痛苦和感染威胁。
本发明将二倍的人Aβ42基因插入CTB基因的下游,构建融合基因及含有融合基因的重组家蚕杆状病毒,最后将重组家蚕杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹,通过家蚕幼虫或蚕蛹高效表达融合蛋白。该融合蛋白中,人Aβ42与CTB融合表达,CTB能够强化Aβ42的免疫原性。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明利用CTB基因与两倍的人Aβ42基因构建融合基因,将该融合基因表达的融合蛋白饲喂小鼠,不仅能显著改善受试小鼠的胰岛炎患病状况,在连续监测25周后,阴性对照组有86.7%小鼠患病,而饲喂融合蛋白的小鼠只有53.3%患病;还能显著提高阿尔茨海默症模型小鼠Aβ42抗体水平,降低阿尔茨海默症模型小鼠大脑内Aβ42的含量,提示该融合蛋白能用于制备Ⅰ型糖尿病和阿尔茨海默症防治药物。
附图说明
图1为杆状病毒转移质粒pBac-CTB-(Aβ42)2的图谱;
图2为家蚕表达的融合蛋白的Westren杂交分析结果图;
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1、融合基因的构建
(1)以pBac-CTB-Aβ42质粒为模板,以aF/aR为引物进行扩增,获得目的片段CTB-Aβ42-GPGP;
上游引物aF:5′-CGGGATCCATGATTAAATTAAAATTTGG-3′;
下游引物aR:5′-GGGGCCGGGGCCCGCTATGACAACACCG-3′;
反应条件为:94℃预变性5min,扩增时94℃30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,反应30个循环,最后72℃延伸10min;
(2)以pBac-CTB-Aβ42质粒为模板,以bF/bR为引物进行扩增,获得目的片段GPGP-Aβ42;
上游引物bF:5′-GGCCCCGGCCCCGATGCAGAATTCCGAC-3′;
下游引物bR:5′-GGCTCGAGCTACGCTATGACAACACCGC-3′;
反应条件为:94℃预变性5min,扩增时94℃30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,反应30个循环,最后72℃延伸10min;
(3)以CTB-Aβ42-GPGP和GPGP-Aβ42互为引物和模板进行链延伸反应,获得产物S1;
反应条件为:94℃变性10min,60℃退火5min,72℃延伸5min;
以S1为模板,以aF/bR为引物进行扩增,获得融合基因CTB-(Aβ42)2;
反应条件为94℃预变性5min,扩增时94℃30s,60℃退火30s,72℃延伸1min,反应30个循环,最后72℃延伸10min。
获得的融合基因CTB-(Aβ42)2大小约为651bp。
实施例2、重组质粒的构建
将获得的融合基因CTB-(Aβ42)2进行BamH 1和Xho1双酶切后连到同样被BamH 1和Xho1双酶切的转移载体pFast Bac1上,构建含融合基因的杆状病毒转移质粒pBac-CTB-(Aβ42)2,质粒图谱如图1所示,经酶切鉴定和PCR分析正确后,经过自动序列测定表明构建的融合基因完全正确,融合基因序列及其编码的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示。
实施例3、重组杆状病毒的构建
将杆状病毒转移质粒pBac-CTB-(Aβ42)2转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,转化条件为:
(1)取10μl杆状病毒转移质粒pBac-CTB-(Aβ42)2加入到DH10Bac感受态细胞,冰上放置30min,42℃水浴90s,冰上放置2min;
(2)然后加入700μl LB培养基(LB培养基:蛋白胨10g,酵母浸出粉5g,氯化钠10g,水1000ml)中,37℃摇床230rpm摇菌1.5h;
(3)再于4000rpm离心3min,浓缩菌液至200μl,涂NA平板(NA平板含:牛肉浸膏1g,蛋白胨5g,酵母膏2g,氯化钠5g,蔗糖10g,琼脂20g,水1000ml,卡纳霉素50μg/ml,庆大霉素7μg/ml,四环素10μg/ml,X-gal 100μg/ml,IPTG 40μg/ml),于37℃培养箱正向放置30min后,倒置培养2d;
(4)通过蓝白斑筛选获得重组病毒质粒Bacmid CTB-(Aβ42)2;
(5)将重组病毒质粒Bacmid CTB-(Aβ42)2转染家蚕卵巢细胞,获得家蚕重组杆状病毒BmNPV-CTB-(Aβ42)2。
实施例4、融合蛋白的表达
(1)取扩增的上述重组杆状病毒注射到五周龄家蚕幼虫和蚕蛹中,每头注射2μl左右(滴度为1×107/ml),分别取表达24、48、72、96、120和144h后的蚕幼虫或蚕蛹淋巴血,5000rpm离心5min后取上清;
(2)将上清用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释10倍后,加入等体积的2×蛋白质上样缓冲液(10Mm Tris-HCl,4%SDS,0.1%溴酚蓝,10%甘油),取200μl进行SDS-PAGE分析,结果表明,融合基因CTB-(Aβ42)2在家蚕幼虫和蛹中获得高效表达,经Westren杂交(图2)表明表达产物分子量为24KDa。
将含有表达产物的蚕幼虫或蚕蛹淋巴血高速冷冻离心,取上清,稀释1000倍后包被酶标板,同时以CTB为标准品按照常规操作进行ELISA检测,其中兔抗CT一抗(购自SIGMA公司)稀释5000倍,山羊抗兔二抗(购自华美生物工程公司)稀释1000倍,用OPD(购自上海化学试剂公司)显色,于492nm处测定OD值。检测结果表明,幼虫和蛹表达的CTB-(Aβ42)2融合蛋白均有很强的免疫活性,表达量分别达到360μg/ml和470μg/ml。而CTB-Aβ42在幼虫和蛹中的表达量相对较低,仅60μg/ml和86μg/ml。
实施例5、检测融合蛋白对Ⅰ型糖尿病的防治效果
将5周龄雌性NOD小鼠随机分为2组:第一组为对照组,喂食接种有野生型家蚕杆状病毒的蚕幼虫或蚕蛹淋巴,第二组为试验组,喂食含融合蛋白CTB-(Aβ42)2的蚕幼虫或蚕蛹淋巴;每组15只,从第5周开始给药,剂量为30μg/鼠,每周给药3-4次;连续给药5周后,各组分别取5只NOD小鼠做病理切片分析(连续饲喂10周后处死),其余NOD小鼠做糖尿病监测(连续饲喂25周)。
病理学分析:饲喂第10周时处死NOD小鼠,取眼球后取小鼠静脉全血作抗体滴度测定,检测对照组和试验组小鼠的胰岛素抗体水平,同时取小鼠胰岛做组织切片,观察胰岛炎发生情况,并做相应评分。
糖尿病监测:从第10周起,检测NOD小鼠尿液的尿糖情况,阳性小鼠继续检测血糖,如果连续两周血糖含量大于或等于16.7nmol/L,则判定为该小鼠患糖尿病。分别对对照组和试验组中小鼠患病率进行比较、统计分析。
胰岛组织切片分析结果表明,试验组小鼠的胰岛炎发生水平显著低于对照NOD小鼠。同时,糖尿病监测分析结果显示,25周后对照组有86.7%的NOD小鼠患病,而喂食含融合蛋白CTB-(Aβ42)2试验组仅有53.3%的NOD小鼠患病,NOD小鼠的发病率显著降低。可见,本发明的融合蛋白可用于制备口服Ⅰ型糖尿病防治药物。
实施例6、检测融合蛋白对阿尔茨海默症的防治效果
将8周龄雄性B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)小鼠随机分为2组:第一组为对照组,喂食接种有野生型家蚕杆状病毒的蚕幼虫或蚕蛹淋巴,第二组为试验组,喂食含融合蛋白CTB-(Aβ42)2的蚕幼虫或蚕蛹淋巴;每组15只,从第8周开始给药,剂量为50μg/鼠,每周给药3-4次,连续给药5个月,各组分别取5只取眼球后取小鼠静脉全血作抗体滴度测定,检测试验组和对照组B6C3-Tg小鼠的Aβ42抗体水平,结果显示试验组小鼠血清中Aβ42抗体滴度为225,对照组为56。
病理学分析:给药至小鼠第7月龄时,脱颈法处死B6C3-Tg小鼠,每组5只迅速取脑,其中取左半侧大脑组织进行称重,按大脑重量加入9倍体积冰冷的生理盐水,4℃下,匀浆器匀浆(10s每次,间隔30s,连续3-5次),然后3000r/min离心10min,取上清分装于离心管中用于检测小鼠大脑中Aβ42含量。
小鼠大脑Aβ42含量检测结果表明,试验组B6C3-Tg小鼠大脑内Aβ42含量显著低于对照组(试验组:15μg/g大脑,对照组:110μg/g大脑),可见,本发明的融合蛋白可用于制备口服阿尔茨海默症防治药物。
Claims (10)
1.一种融合基因,其特征在于,由CTB基因和Aβ42基因重组而成。
2.如权利要求1所述的融合基因,其特征在于,所述Aβ42基因的拷贝数为2。
3.如权利要求1或2所述的融合基因,其特征在于,碱基序列如SEQID No.1所示。
4.含有如权利要求1~3任一所述融合基因的表达载体。
5.含有如权利要求1~3任一所述融合基因的转化子。
6.如权利要求5所述的转化子,其特征在于,所述转化子为重组家蚕杆状病毒。
7.如权利要求1~3任一所述融合基因表达的融合蛋白。
8.如权利要求7所述的融合蛋白,其特征在于,氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
9.如权利要求7或8所述融合蛋白在制备Ⅰ型糖尿病治疗药物中的应用。
10.如权利要求7或8所述融合蛋白在制备阿尔茨海默症防治药物中的应用。
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