CN103304670B - 结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗ab及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB及其制备和应用，该融合蛋白疫苗AB由Ag85A蛋白抗原表位和Ag85B蛋白抗原表位依次连接形成，蛋白疫苗AB的氨基酸序列如序列表中序列3所示。通过基因工程技术由Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位，构建AB/pET-30a重组质粒转入大肠杆菌，其表达的融合蛋白将A和B两种蛋白的抗原表位依次连接构成。本发明所制备的结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB，可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核模型可使其脏器组织细菌数显著减少，可用于制备预防或治疗结核病的药物或疫苗中。
Description
技术领域
本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB及其制备和应用，具体涉及一种应用基因工程技术制备的新型结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB和应用，属于结核病医学免疫学治疗技术领域。
背景技术
结核病(Tuberculosis,TB)一直是人们关注的一个全球性健康问题。全世界约有1/3人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuerculosis，Mtb)，每年新发结核病800-1000万以及超过200万人死于结核病(世界卫生组织2006年结核病事实)。我国的结核病人数位居世界第二，仅次于印度。2010年全国第五次结核病流行病学调查显示我国现有肺结核病人500－600万，每年新增结核病患者超过140万，每年约13万人死于结核病，位于各种传染病之首。我国约有三分之一人口感染了结核菌，其中5％可能早期发病，5％在其一生中的任何时候可能发病，而且耐药结核病人多。因此，结核感染人群的预防治疗可有效减少肺结核的发病率，结核病患者的早期诊断、有效化疗将控制结核病及结核菌的传播。
结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性呼吸道传染病，合理、规律的化疗一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗3～4个月，甚至更长时间。由于耐药菌株的传播，耐药结核病(尤其是耐多药结核病和广泛耐药结核病)的治疗是我国未来结核病控制重点关注的问题。目前在临床使用的十几种抗结核药物已数十年，初治结核病化疗方案通常需3-4个药物治疗6个月以上，而复治或耐药结核病通常需5－6种药物治疗1年以上，再加上药物的毒副作用，二线药物价格昂贵，部分病人难以坚持。由于研制新的抗结核药物，不仅投入大，周期长，比新的治疗性疫苗的研制更困难，而且新药也可能很快产生耐药性。而疫苗治疗在几个月中只注射几针，远比每天服药方便，且副作用较少，费用低。抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，疫苗治疗可以通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的潜力，来达到治疗疾病的目的。因此，近年来通过免疫调节治疗结核病成为研究的热点之一，治疗性疫苗的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。
目前国内外结核病疫苗研究的种类主要有下列三种：活疫苗、亚单位疫苗和灭活疫苗。亚单位疫苗只用结核分枝杆菌的一部分成份引起机体产生免疫保护反应，主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗或多肽疫苗(加佐剂)、多肽以外的其它纯化的主要成份(如枝菌酸、糖脂，等)，它可作为卡介苗的加强疫苗，也可作为治疗性疫苗。蛋白疫苗是将保护性蛋白抗原纯化后制成的疫苗，其优点是产量大、纯度高、安全性好、无组织损伤，使其可反复使用、增强注射以维持效应T细胞记忆，但其免疫效果较差，需添加佐剂以增强其免疫原性。该疫苗研制的关键在于保护性抗原和佐剂的选择、剂量的确定，抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，选择抗原作为亚单位疫苗的主要标准是它们能否诱导保护性T细胞反应，保护人群抗结核，亚单位疫苗可能比减毒活疫苗在安全性方面更容易被接受。
在结核分枝杆菌早期培养滤液(简称CFP)中有100多种蛋白，动物实验已证明结核分枝杆菌CFP可部分保护小鼠抵抗结核分枝杆菌攻击。单一蛋白成分也能够介导Th1型的T细胞反应，如ESAT6蛋白含多个抗原决定簇，在结核分枝杆菌感染早期可被大多数病人分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞强烈识别。最近Brandt等的研究表明重组ESAT6蛋白与佐剂单磷酰基脂质A(monophosphoryl lipid A，简称MPL)组成亚单位疫苗，免疫小鼠可诱生强烈的ESAT6特异的T细胞应答，获得与卡介苗相当的保护效力。Coler等用Mtb8.4重组蛋白免疫小鼠可诱导强的CD4+T细胞和CD8+CTL反应，并能保护小鼠抵抗结核分枝杆菌攻击。重组抗原85复合物、38kDa脂蛋白、65kDa热休克蛋白抗原也都可以诱导人T细胞增殖反应，诱导Th 1型T细胞反应。然而，并非所有的蛋白免疫后都诱导保护性免疫，如α-晶状体球蛋白在休眠期增加表达，尽管具有免疫原性但无保护作用。因此，抗原的筛选和构建至关重要。
目前的研究证明结核分枝杆菌多种保护性抗原混合、融合或嵌合的蛋白疫苗刺激的CD4+T细胞反应及获得的保护效力、治疗效果和长期存活能力均比单一蛋白成分强，而且制备一个融合蛋白要比同时制备两个重组蛋白成本低、工艺简单，临床应用也较价廉。格兰素公司研制的Mtb72f/AS02A是一种由具有高度免疫原性的Mtb39和Mtb32基因重组构建的72kDa嵌合蛋白，加入油水融合的MPL和QS21免疫刺激剂作为佐剂，豚鼠和猴子实验结果表明BCG免疫后再用Mtb72f/AS02A疫苗加强，诱导的保护效力强于单独用BCG。Ag85A不仅可以刺激机体产生体液免疫,尚可激发较强Th1型细胞免疫,引起CD8+T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升。Ag85B可诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，产生高浓度IFN-γ和TNF-α，其抵抗结核分枝杆菌再感染的能力优于BCG。丹麦研制的Ag85B-ESAT6融合蛋白可刺激PPD阳性的健康者T细胞增殖并分泌IFN-γ，可能是因为融合蛋白增加了ESAT6抗原决定簇的稳定性，它在不同的佐剂系统中已证明比其单独的蛋白更有效，小鼠和豚鼠实验显示在延长小动物的存活期和减少肺、脾细菌数方面与BCG相当；它还可减少猴子肺中结核分枝杆菌播散至肺外，并使细菌数减少。小动物实验表明该疫苗作为BCG免疫后的增强剂，保护效力明显强于单独BCG接种。虽然上述两种重组蛋白疫苗均已进入I、II期临床试验，但是国外专利产品，而且其中ESAT6是结核分枝杆菌的保护因子，同时也是一个毒力因子，本发明人的研究显示ESAT6DNA免疫结核感染者，有可能引起超敏反应，导致小鼠死亡。因此，有必要开发我国自主知识产权的重组蛋白疫苗，为结核病防控提供有力的技术手段。
本发明人研究显示Ag85A和Ag85B混合免疫小鼠治疗小鼠结核病模型，使其肺肝菌落计数显著减少，病变减轻。因此，本发明提供一种新型结核病重组融合蛋白疫苗AB，可显著刺激机体的细胞免疫应答，可抑制体内结核分枝杆菌的生长，可用于结核病感染的预防和治疗。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种显著刺激机体的细胞免疫应答、抑制体内结核分枝杆菌的生长并且用于结核病感染的预防和治疗的结核分枝杆菌特异性融合蛋白AB。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB，由Ag85A蛋白(简称为A蛋白)抗原表位和Ag85B蛋白(简称为B蛋白)抗原表位依次连接形成，所述Ag85A蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列1所示，所述Ag85B蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列2所示，所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
一种优选技术方案，其特征在于：所述的Ag85A蛋白的抗原表位位于融合蛋白AB的氨基端，Ag85B蛋白的抗原表位位于融合蛋白AB的羧基端。
本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白疫苗AB，是选择结核分枝杆菌两种蛋白Ag85A和Ag85B关键的抗原表位，并将其依次连接，通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化，即通过基因工程技术将Ag85A蛋白抗原表位的核苷酸优化序列与Ag85B蛋白抗原表位的核苷酸优化序列相连接，构建AB/pET-30a重组质粒转入大肠杆菌，其表达的融合蛋白将Ag85A和Ag85B两种蛋白的抗原表位依次连接。
本发明的再一目的是提供一种上述结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB的制备(构建)方法，包括如下步骤：
(1)两个蛋白抗原表位融合的设计：分析结核分枝杆菌Ag85A、Ag85B的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序，所述Ag85A蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列1所示，所述Ag85B蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列2所示；设计出Ag85A和Ag85B蛋白抗原表位依次连接形成的融合蛋白；Ag85A蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Ag85B蛋白的抗原表位位于融合蛋白的羧基端；
(2)两个蛋白融合的克隆
①设计与合成扩增Ag85A抗原表位的一对引物
上游引物(5’端含限制性内切酶Nde I)，
5’－GCAATTCCATATGTTTTCTCGT－3'，
下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I)，
5'－CCGCTCGAGTTTGAGAAAGG－3'，
扩增片段：931bp；
在Ag85A蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在Ag85A蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中，转化到大肠杆菌DH5α受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒A/pET-30a，其核苷酸序列如序列表中序列4所示；
②设计与合成扩增Ag85B抗原表位的一对引物
上游引物(5’端含限制性内切酶Nde I)，
5’－GCAATTCCATATGGGATCCGGTGGTGGCTTTTCTC－3'，
下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I)，
5'－CCGCTCGAGTTTAGCCTGCACCCAGAGAGG－3'，
扩增片段：896bp；
在Ag85B蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在Ag85B蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中，转化到大肠杆菌DH5α受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒B/pET-30a，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
③用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切A/pET-30a质粒和B/pET-30a质粒，通过转接酶将两个片段连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒AB/pET-30a，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，并使Ag85A蛋白抗原表位与Ag85B蛋白抗原表位之间通过连接臂相联接。
结果表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。
多抗原表位融合蛋白的鉴定：AB大肠杆菌基因工程株经过诱导、表达、纯化，SDS-PAGE电泳、鉴定，及蛋白N-端氨基酸序列分析、质谱分析，表明获得的纯化的融合蛋白与实际设计的大小、氨基酸序列相符。
本发明的又一目的是提供上述结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB的应用。
上述结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB在制备预防或治疗结核病的药物或疫苗中的应用。
本发明的融合蛋白AB通过基因工程由Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位，构建AB/pET-30a重组质粒转入大肠杆菌，其表达的融合蛋白将A和B两种蛋白的抗原表位依次连接构成。本发明的AB融合蛋白疫苗作为免疫调节制剂，用于免疫小鼠，可获得较好的免疫调节作用，显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核模型可使其脏器组织细菌数显著减少，其治疗效果与现有商品化的结核病免疫治疗制剂草分枝杆菌F.U.36注射液的治疗效果相当，可用于制备预防或治疗结核病患者的药物或疫苗。因此，本发明在结核病的辅助治疗方面将具有广阔的应用前景。
本发明的有益效果：
本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化新型结核分枝杆菌重组融合蛋白AB，可刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答，抑制体内结核分枝杆菌的生长，能用于结核病感染的预防和治疗。
经本发明研究证明，应用结核分枝杆菌重组融合蛋白疫苗AB免疫小鼠可使其分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数显著增高，小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平明显增高，血清中表达高水平的抗Ag85A和抗Ag85B抗体，其亚型IgG2a/IgG1比值显著增高，呈现Th1型的免疫应答。治疗小鼠结核模型可使其脏器组织细菌数显著减少，与生理盐水组比较，肝脏菌落计数依次减少0.53－0.64log，其治疗效果与现有商品化的结核病免疫治疗制剂草分枝杆菌F.U.36注射液的治疗效果相当(减少0.61log)。
本发明的结核分枝杆菌重组融合蛋白疫苗AB抗原与结核分枝杆菌培养提取蛋白相比，可大规模生产，并无需生物安全III级的生产车间；而且优化基因结构，使其更适合在大肠杆菌中表达，获得较高的表达水平，与天然蛋白具有相同的生物学活性，从而提高了产量，降低了生产成本，产品价格较低廉。与制备两种抗原后再按比例混合免疫，本产品制备两种抗原的融合蛋白成本相对较低，两种抗原的比例准确。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
附图说明
图1为本发明实施例中pET-30a、A/pET-30a、B/pET-30a和AB/pET-30a质粒DNA分别用Nde I和Xho I进行双酶切后的琼脂糖电泳图。
图2为本发明实施例中AB/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后及表达形式的SDS-PAGE电泳图。
图3为本发明实施例中AB/pET-30a大肠杆菌工程菌表达蛋白纯化的SDS-PAGE结果。
图4为本发明实施例中各组小鼠第3次免疫后分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数。
图5为本发明实施例中各组小鼠第3次免疫后脾淋巴细胞培养上清中γ干扰素水平。
图6为本发明实施例中各组小鼠免疫前后血清中抗Ag85A IgG蛋白抗体水平。
图7为本发明实施例中各组小鼠免疫前后血清中抗Ag85B IgG蛋白抗体水平。
图8为本发明实施例中各组小鼠第3次免疫后血清中抗Ag85A抗体IgG2a/IgG1比值。
图9为本发明实施例中各组小鼠第3次免疫后血清中抗Ag85B抗体IgG2a/IgG1比值。
具体实施方式
本发明提出的结核分枝杆菌特异性多抗原表位的融合蛋白疫苗AB，是选择结核分枝杆菌两种蛋白Ag85A和Ag85B关键的抗原表位，分析其基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；设计出A和B蛋白抗原表位依次连接、形成的融合蛋白；A蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，B蛋白的抗原表位位于融合蛋白的羧基端；通过基因工程技术将其克隆、表达、纯化。
上述的融合蛋白AB的制备方法，包括：
(1)两个蛋白抗原表位融合的设计：分析结核分枝杆菌Ag85A、Ag85B的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序；设计出A和B蛋白抗原表位依次连接、形成的融合蛋白；A蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，B蛋白的抗原表位位于融合蛋白的羧基端。
(2)两个蛋白融合的克隆：通过基因工程技术进行克隆。
①在A蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在A蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒A/pET-30a。
②在B蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在B蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中。转化到大肠杆菌DH5α受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒B/pET-30a。
③分别用BamH I和Xho I双酶切A/pET-30a质粒和B/pET-30a质粒，通过转接酶将两个片段连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中。经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒AB/pET-30a，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，并使A蛋白抗原表位与B蛋白抗原表位之间通过连接臂相联接，表明已成功构建了具有多抗原表位的融合蛋白重组表达质粒。
实施例1
一、通过基因工程技术克隆A蛋白抗原表位编码基因：
1、依据序列表中的序列1设计与合成扩增A抗原表位的一对引物
上游引物(5’端含限制性内切酶Nde I，下划线所示)
5’－GCAATTCCATATGTTTTCTCGT－3'
下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I，下划线所示)
5'－CCGCTCGAGTTTGAGAAAGG－3'
扩增片段：931bp
2、A蛋白编码基因合成
根据上面的设计，通过基因合成A蛋白编码基因931bp的PCR产物，将合成的基因片段进行序列分析(进行T7和T7-ter通用引物双向测序验证)，测序结果证明，基因合成的PCR产物就是A蛋白编码基因，具体结果如下。
设计的A蛋白合成基因序列如下，参见序列表中序列1。其中双下划线表示上游引物序列，其中表示限制性内切酶Nde I；GGATCC表示限制性内切酶BamH I；单下划线表示下游引物序列，其中CTCGAG表示限制性内切酶Xho I。
CCAGGTCTGCCAGTTGAATATCTGCAAGTTCCGTCTCCATCTATGGGTCGTGACATCAAAGTTCAGTTCCAGTCTGGTGGTGCTAACTCTCCAGCACTGTATCTGCTTGATGGTCTGCGTGCTCAAGATGACTTCTCTGGTTGGGACATCAACACTCCGGCATTCGAATGGTACGATCAGTCTGGTCTGTCCGTAGTTATGCCAGTAGGTGGTCAGTCTAGCTTCTACTCCGACTGGTATCAACCAGCATGTGGTAAAGCTGGTTGTCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAACTGCCAGGTTGGCTGCAAGCTAATCGTCATGTCAAACCGACTGGTAGCGCAGTTGTCGGTCTGTCCATGGCAGCTTCTTCTGCACTGACTCTGGCTATCTATCATCCGCAACAGTTCGTCTATGCAGGTGCTATGTCTGGTCTGCTCGATCCGTCTCAAGCTATGGGTCCGACTCTGATTGGTCTGGCAATGGGTGATGCTGGTGGTTACAAAGCATCTGACATGTGGGGTCCGAAAGAAGATCCAGCATGGCAACGTAACGATCCGCTGCTGAACGTTGGTAAACTGATTGCTAACAATACTCGTGTATGGGTATACTGCGGTAACGGTAAACCGTCTGATCTGGGTGGTAACAATCTGCCGGCTAAGTTCCTGGAAGGCTTCGTACGTACTAGCAACATCAAGTTCCAAGATGCTTACAACGCTGGTGGCGGTCATAACGGTGTATTCGACTTTCCGGATAGCGGTACTCACTCTTGGGAATACTGGGGTGCTCAACTGAACGCTATGAAACCGGATCTGCAACGTGCACTGGGTGCAACTCCGAACACTGGTCCAGCTCCGCAAGGTGCAGGTGGTGGTGGATCCTTTCTCAAACTCGAGCGG
3、回收目的基因片段：
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于-20℃备用。
4、重组质粒的构建：
用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切纯化后的A基因合成PCR产物和表达载体pET-30a质粒DNA，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，切取A基因片段和pET-30a质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，A基因片段与pET-30a质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：
混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。
5、连接产物的转化：
次日取目的基因片段与载体pET-30a连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。
6、质粒的提取：
根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置-20℃储存备用。
7、鉴定重组质粒：
(1)酶切鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳(结果见图1)，阳性重组质粒命名为A/pET-30a。
如图1所示，为pET-30a、A/pET-30a、B/pET-30a和AB/pET-30a质粒DNA分别用Nde I和Xho I进行双酶切后的琼脂糖电泳图结果，其中A蛋白基因片段的理论长度为919bp，B蛋白基因片段的理论长度为884bp，AB蛋白基因片段的理论长度为1784bp。从图1可以看出，酶切出的各个片段大小与理论长度基本吻合，酶切鉴定结果是正确的。
1：DNA分子量标准(TaKaRa DL2000：2000,1000,750,500,250,100bp)；
2：pET-30a(Nde I+Xho I)
3：pET-30a-Ag85A(Nde I+Xho I)
4：pET-30a-Ag85B(Nde I+Xho I)
5：pET-30a-Ag85AB(Nde I+Xho I)
(2)序列测定：直接挑选一个克隆送基因测序公司进行T7和T7t通用引物双向测序验证。测序结果与设计的基因组序列一致，如序列表中序列4所示。
二、通过基因工程技术克隆B蛋白抗原表位编码基因：
1、依据序列表中的序列2设计与合成扩增B抗原表位的一对引物
上游引物(5’端含限制性内切酶Nde I，下划线所示)
5’－GCAATTCCATATGGGATCCGGTGGTGGCTTTTCTC－3'
下游引物(5’端含限制性内切酶Xho I，下划线所示)
5'－CCGCTCGAGTTTAGCCTGCACCCAGAGAGG－3'
扩增片段：896bp
2、B蛋白编码基因合成
根据上面的设计，通过基因合成B蛋白编码基因896bp的PCR产物，将合成的基因片段进行序列分析(进行T7和T7-ter通用引物双向测序验证)，测序结果证明，基因合成的PCR产物就是B蛋白编码基因，具体结果如下。
设计的B蛋白合成基因序列如下，参见序列表中序列2。其中双下划线表示上游引物，表示限制性内切酶Nde I，表示限制性内切酶BamH I；TAA表示终止密码子，CTCGAG表示限制性内切酶Xho I，单下划线表示下游引物。
GTCCAGGTCTGCCAGTTGAATATCTGCAAGTTCCGTCTCCATCTATGGGTCGTGACATCAAAGTTCAGTTCCAGTCTGGTGGTAATAACTCTCCAGCAGTGTATCTGCTTGATGGTCTGCGTGCTCAAGATGACTACAATGGTTGGGACATCAACACTCCGGCATTCGAATGGTACTATCAGTCTGGTCTGTCCATCGTTATGCCAGTAGGTGGTCAGTCTAGCTTCTACTCCGACTGGTATTCTCCAGCATGTGGTAAAGCTGGTTGTCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAACTGCCGCAATGGCTGTCTGCTAATCGTGCAGTCAAACCGACTGGTAGCGCAGCTATCGGTCTGTCCATGGCAGGTTCTTCTGCAATGATCCTGGCAGCTTATCATCCGCAACAGTTCATCTATGCAGGTTCTCTGTCTGCACTGCTCGATCCGTCTCAAGGTATGGGTCCGTCTCTGATTGGTCTGGCAATGGGTGATGCTGGTGGTTACAAAGCAGCTGACATGTGGGGTCCGTCTTCCGATCCAGCATGGGAACGTAACGATCCGACTCAACAGATTCCGAAACTGGTAGCTAACAATACTCGTCTGTGGGTATACTGCGGTAACGGTACTCCGAACGAACTGGGTGGTGCTAATATTCCGGCTGAGTTCCTGGAGAACTTCGTACGTTCTAGCAACCTGAAGTTCCAAGATGCTTACAACGCTGCAGGCGGTCATAACGCTGTATTCAACTTTCCACCGAACGGTACTCACTCTTGGGAATACTGGGGTGCTCAACTGAACGCTATGAAAGGTGATCTGCAATCCTCTCTGGGTGCAGGCTAAACTCGAGCGG
3、回收目的基因片段：
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳结束后，在长波紫外线照射下，用干净的手术刀片在胶上切下要回收DNA的琼脂块，放入无菌的离心管中。参照琼脂糖DNA回收试剂盒中的说明书回收目的基因片段，定量后，贮存于-20℃备用。
4、重组质粒的构建：
用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切纯化后的B基因合成PCR产物和表达载体pET-30a质粒DNA，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，切取B基因片段和pET-30a质粒DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，B基因片段与pET-30a质粒DNA片段按2:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：
混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。
5、连接产物的转化：
次日取目的基因片段与载体pET-30a连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG4μl，混匀，取出200-400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。
6、质粒的提取：
根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒，定量后，置-20℃储存备用。
7、鉴定重组质粒：
(1)酶切鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳(结果见图1)，阳性重组质粒命名为B/pET-30a。
(2)序列测定：直接挑选一个克隆送基因测序公司进行T7和T7t通用引物双向测序正向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，如序列表中序列5所示。
三、通过基因工程技术克隆融合蛋白AB编码基因：
1.重组质粒的构建：
用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切A/pET-30a质粒和B/pET-30a质粒DNA，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，切取A/pET-30a质粒片段和B/pET-30a质粒片段，用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒纯化。定量后，A/pET-30a质粒DNA片段和B/pET-30a质粒DNA片段按1:1的摩尔比混合，10μl反应体系如下：
混匀后置于16℃连接过夜，75℃灭活10min，冰浴后直接进行转化。
2.连接产物的转化：
次日取A/pET-30a质粒片段和B/pET-30a质粒片段连接产物5μl加入含有100μl大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的离心管中，冰浴0.5h；放入42℃水浴箱热休克90s，迅速取出冰浴2min；加入LB培养液400μl，37℃恒温摇床培养1h；加入X-Gal 60μl，IPTG 4μl，混匀，取出200－400μl涂布于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB平板上。倒置平板，放37℃恒温培养箱培育14h。
3.质粒的提取：
根据蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落6个，分别接种于5ml含有60μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；根据《分子克隆》碱裂解方法，小量提取质粒。
4.鉴定重组质粒：
(1)酶切鉴定：以挑选的菌落质粒DNA为模板，分别用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶中电泳(结果见图1)，阳性重组质粒命名为AB/pET-30a。
(2)序列测定：直接挑选一个克隆送基因测序公司进行T7和T7t通用引物双向测序正向测序验证测序。测序结果与设计的基因组序列一致，其核苷酸序列如下，在序列表中如序列6所示，其中，CATATG为Nde I酶切位点，ATG为起始密码，单下划线序列为A蛋白编码基因序列，GGTGGTGGTGGATCCGGTGGTGGC为编码连接臂GGGGSGGG的核酸序列，其中的GGATCC序列为BamH I酶切位点序列，双下划线序列为B蛋白编码基因序列，TAA为终止密码，CTCGAG为Xho I酶切位点。
重组质粒AB/pET-30a基因序列如下，如序列表中序列6所示：
GCTGGACGTAATTCCGTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTTTTCTCGTCCAGGTCTGCCAGTTGAATATCTGCAAGTTCCGTCT CCATCTATGGGTCGTGACATCAAAGTTCAGTTCCAGTCTGGTGGTGCTAACTCT CCAGCACTGTATCTGCTTGATGGTCTGCGTGCTCAAGATGACTTCTCTGGTTGG GACATCAACACTCCGGCATTCGAATGGTACGATCAGTCTGGTCTGTCCGTAGTT ATGCCAGTAGGTGGTCAGTCTAGCTTCTACTCCGACTGGTATCAACCAGCATGT GGTAAAGCTGGTTGTCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAAC TGCCAGGTTGGCTGCAAGCTAATCGTCATGTCAAACCGACTGGTAGCGCAGTT GTCGGTCTGTCCATGGCAGCTTCTTCTGCACTGACTCTGGCTATCTATCATCCG CAACAGTTCGTCTATGCAGGTGCTATGTCTGGTCTGCTCGATCCGTCTCAAGCT ATGGGTCCGACTCTGATTGGTCTGGCAATGGGTGATGCTGGTGGTTACAAAGC ATCTGACATGTGGGGTCCGAAAGAAGATCCAGCATGGCAACGTAACGATCCGC TGCTGAACGTTGGTAAACTGATTGCTAACAATACTCGTGTATGGGTATACTGCG GTAACGGTAAACCGTCTGATCTGGGTGGTAACAATCTGCCGGCTAAGTTCCTG GAAGGCTTCGTACGTACTAGCAACATCAAGTTCCAAGATGCTTACAACGCTGG TGGCGGTCATAACGGTGTATTCGACTTTCCGGATAGCGGTACTCACTCTTGGGA ATACTGGGGTGCTCAACTGAACGCTATGAAACCGGATCTGCAACGTGCACTGG GTGCAACTCCGAACACTGGTCCAGCTCCGCAAGGTGCAGGTGGTGGTGGATC CGGTGGTGGC TAAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGAAGCTATGATCCA
四、AB工程菌的诱导表达及鉴定
将AB大肠杆菌工程菌接种于6ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养过夜，然后按1％转种到10ml含50μg/ml硫酸卡那霉素的LB培养液中，置37℃恒温振荡器培养至OD600为0.6－0.8时，加入IPTG，诱导3－4hr。
将1×载样缓冲液150μl加入来自1ml菌液的沉淀样本，混悬后，置100℃沸水浴5min，于12000rpm离心10min，取上清液40μl进行SDS-PAGE(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％)，电泳条件为：积层胶恒流10mA，分离胶恒压15mA，待溴酚蓝电泳至凝胶底部，停止电泳。用考马斯亮蓝R250染色液染色6h；用脱色液脱色至条带清晰。AB大肠杆菌工程菌菌体在相对分子质量63kDa位置附近有浓重的表达条带出现，诱导3-4小时表达量最多。
将100mlAB大肠杆菌工程菌菌液离心后重悬于5ml 10mMTris(pH8.0)缓冲液中，超声破碎后，12000转/分离心10分钟，吸出上清，用5ml 10mM Tris(pH8.0)缓冲液重悬沉淀，分别取上清和沉淀制备上清和包涵体样品。用SDS-PAGE分析表达形式，可见重组融合蛋白AB在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。
如图2所示，为AB/pET-30a大肠杆菌工程菌IPTG诱导前后及表达形式的SDS-PAGE(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％)结果，其中：
1：蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A:97.2,66.4,44.3,29.0,20.1kD)；
2：基因工程菌诱导前；
3：基因工程菌诱导后1小时；
4：基因工程菌诱导后2小时；
5：基因工程菌诱导后3小时；
6：基因工程菌诱导后4小时；
7：基因工程菌超声上清；
8：基因工程菌超声沉淀(包涵体)；
9：初步纯化的融合蛋白AB。
五、重组融合蛋白AB的纯化
1.AB包涵体的洗涤：将离心收集的表达菌体用适量(大约相当于表达菌液1/20体积)的20mM Tris(pH8.0)重悬，超声破碎后，于8000转/分离心5分钟；重复4次。然后用适量体积的含8M尿素的20mM Tris(pH8.0)溶解洗涤包涵体，作为起始样品用于DEAE阴离子交换纯化。
2.AB包涵体蛋白的纯化
AB包涵体洗涤后，用DEAE纯化，全部样品结合，分别用100mM、200mM浓度的NaCl洗脱。从图3可看出，包涵体洗涤后，DEAE阴离子交换纯化取得较好效果。
如图3所示，为AB/pET-30a大肠杆菌工程菌表达蛋白纯化的SDS-PAGE结果，其中：
1：洗涤后的AB包涵体样品，5ul
2：蛋白质分子量标准(TaKaRa-D530A：97.2,66.4,44.3,29.0,20.1kD)；
基因工程菌诱导前；
3：洗涤后的AB包涵体样品，20μl
4：DEAE-100mMNaCl洗脱样品，前面(大部分)20μl
5：DEAE-100mMNaCl洗脱样品，后面(小部分)20μl
6：DEAE-200mMNaCl洗脱样品，20μl
7：DEAE-100mMNaCl洗脱样品，前面(大部分)5μl
8：DEAE-100mMNaCl洗脱样品，后面(小部分)5μl
9：DEAE-200mMNaCl洗脱样品，5μl
六、纯化的重组融合蛋白AB的鉴定
将纯化的重组融合蛋白AB送军事医学科学院进行鉴定。
(1)N端15个氨基酸分析：结果为MFSRP GLPVE YLQVP，与设计的AB融合蛋白N端的A蛋白的15个氨基酸序列完全一致。
(2)质谱测定分子量：为63.041kDa，与理论计算的分子量62.9373kDa非常接近。
应用实例1：用于免疫小鼠
将本发明实施例1所构建、纯化的融合蛋白疫苗AB用于免疫小鼠，以其作为免疫调节制剂，获得了较好的免疫调节作用。小鼠免疫免疫调节过程如下所示：
一、实验方法和材料
1.动物选择：
从北京维通利华实验动物技术有限公司院购进有合格证的体重为17-19g的6-8周龄雌性BALB/c小鼠30只，同批试验体重差异不超过2g。
2.融合蛋白疫苗AB的免疫原性
(1)动物免疫:
将小鼠分为下列3组，每组10只。PBS组：每只小鼠肌肉注射100μl PBS；佐剂组：每只小鼠肌肉注射20μg/100μl佐剂77-1；AB融合蛋白联合佐剂组：每只小鼠肌肉注射100μg融合蛋白疫苗AB和20μg佐剂/100μl 77-1。各组小鼠每2周肌肉注射1次，共注射3次。
(2)通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数：
BDTMELISPOT Mouse IFN-γSET试剂盒和BDTMELISPOT AEC(3-Amino-9-ethylcarbazole)(3-氨基-9-乙基吡咯)试剂盒购自BD公司BiosciencePharmingen(Sam Diego,CA,USA)，按试剂盒说明书进行操作。小鼠第3次免疫后14天杀鼠取脾脏，分离脾细胞，调节脾淋巴细胞浓度为106/ml。在测试板中，分别加入培养液、重组AB蛋白(终浓度为5μg/ml)、刀豆蛋白A(ConA)(终浓度为10μg/ml)，脾淋巴细胞为105/孔，置CO2温箱中于37℃温育48h，用ELISPOT方法检测各组分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数
(3)通过ELISA检测小鼠脾培养上清γ干扰素和IL－4的水平：
BD Opt EIATM Mouse IFN-γ(AN-18)ELISA SET和BD Opt EIATM Mouse IL-4ELISA SET购自BD公司Bioscience(Sam Diego,CA,USA)，按试剂盒说明书进行操作。小鼠第3次免疫后14天杀鼠取脾脏，分离脾细胞，调节脾淋巴细胞浓度为106/ml。在24孔板中，分别加入30μl培养液、30μl刀豆蛋白A(ConA)(终浓度为10μg/ml)、30μl重组AB蛋白(终浓度为10μg/ml)、脾淋巴细胞270μl/孔，置CO2温箱中于37℃温育72h，收集培养上清液，置－80℃冻存。用ELISA方法检测各组脾淋巴细胞分泌IFN-γ和IL－4的水平。
(4)通过ELISA检测小鼠血清中抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体水平：
分别于小鼠第一次免疫前、第一次免疫后8天、第二次免疫后8天从小鼠眶后静脉丛采血，以及第三次免疫后2周杀鼠时取血，分离血清，于-20℃冻存。用ELISA方法同时检测小鼠血清中抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体水平。
3.统计学分析:
应用SAS6.12软件处理数据，正态分布的定量资料用单因素方差分析，两两比较用Dunnett’s t检验；偏态分布的定量资料用秩和(Kruskal-Wallis)检验，两两比较用q(Student-Newman-Keuls)检验。
二、结果
1.通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数
PBS组未见AB特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞；佐剂组均可见少量AB特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞；而融合蛋白疫苗AB联合佐剂组可见大量AB特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞，结果见图4。与对照组相比，AB融合蛋白联合佐剂能诱导产生大量的分泌IFN-γ的T淋巴细胞(P<0.05)。
2.通过ELISA检测小鼠脾细胞培养上清γ干扰素和IL－4的水平：
小鼠第3次免疫后14天杀死小鼠，取脾脏，研磨后分离脾淋巴细胞，经抗原刺激后，通过ELISA方法检测各组分泌的IFN-γ和IL－4，计算各组小鼠检测孔的细胞因子分泌量，融合蛋白疫苗AB联合佐剂组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的水平明显高于佐剂组和PBS组(P<0.05)，结果见图5。各组均未检测出IL－4。
3.通过ELISA检测小鼠血清中抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体水平：
小鼠免疫前、第1次至第2次免疫后8天取血清，第3次免疫后14天取血清，通过ELISA方法检测各组小鼠抗A蛋白抗体和抗B蛋白抗体水平及其亚型。以各组小鼠免疫前抗体水平为对照，PBS组在第1次至第3次免疫后，抗A和抗B蛋白抗体及亚型均无显著增高(P>0.05)；佐剂组在第1次至2次免疫后，抗A和抗B蛋白抗体及亚型无显著增高(P>0.05)，在第3次免疫后，抗A和抗B蛋白抗体及亚型略有增高(P<0.05)。融合蛋白疫苗AB联合佐剂组，在第1次至第3次免疫后，抗A和抗B蛋白抗体及亚型均显著增高(P<0.01，P<0.05)，结果见图6和图7。第3次免疫后，与对照组相比，融合蛋白疫苗AB联合佐剂组血清中抗A和抗B抗体IgG2a/IgG1比值显著增高(P<0.01)，结果见图8和图9。
应用实例2：用于小鼠结核病
将本发明实施例1所构建、纯化的融合蛋白疫苗AB应用于小鼠结核病模型的治疗，以其作为治疗制剂，获得了较好的治疗效果，与现有商品化的结核病免疫治疗制剂草分枝杆菌F.U.36注射液的治疗效果相当。小鼠结核病模型免疫治疗过程如下所述：
一、实验方法和材料
1.动物选择：
从北京维通利华实验动物技术有限公司购进有合格证的体重为17-19g的6-8周龄雌性BALB/c小鼠30只，同批试验体重差异不超过2g。
3.疫苗的治疗作用
(1)小鼠结核病感染模型的制备：
每只小鼠经尾静脉注射0.4ml含1.1×105的结核分枝杆菌标准株H37Rv悬液，制备结核病模型。
(2)实验分组:
小鼠感染后，将小鼠随机均匀地分为7组，每组10只，小鼠感染后第7d开始治疗。①PBS组：每只小鼠肌肉注射100μl PBS；②佐剂组：每只小鼠肌肉注射20μg/100μl佐剂77-1；③利福平组：每只小鼠口服利福平0.02mg/(g.d)；④草分枝杆菌组：每只小鼠肌肉注射0.172μg/100μl草分枝杆菌F.U.36注射液；⑤20微克AB融合蛋白治疗组:每只小鼠肌肉注射20μg/100μl AB融合蛋白和20μg/100μl佐剂；⑥40微克融合蛋白疫苗AB治疗组:每只小鼠肌肉注射40μg/100μl融合蛋白疫苗AB和20μg/100μl佐剂；⑦60微克融合蛋白疫苗AB治疗组：每只小鼠肌肉注射60μg/100μl融合蛋白疫苗AB和20μg/100μl佐剂。各治疗组每2周肌肉注射1次，共注射3次。
(3)肝菌落计数:
在治疗结束后2周，取部分肝称重，加生理盐水研磨，倍比稀释后取100μl接种于改良罗氏鸡卵平皿培养基上，置37℃温箱培养4周，将得到部分肝的菌落数根据其重量和全肝的重量换算为全肝菌落数。
4.统计学分析:
应用SAS6.12软件处理数据，正态分布的定量资料用单因素方差分析，两两比较用Dunnett’s t检验；偏态分布的定量资料用秩和(Kruskal-Wallis)检验，两两比较用q(Student-Newman-Keuls)检验。
二、结果
1.小鼠体重变化：
各组小鼠在结核分枝杆菌攻击后，小鼠体重缓慢增长；各治疗组小鼠体重均高于生理盐水对照组，但无显著差异。
2.肝组织活菌计数：
免疫治疗3次后，佐剂组、利福平治疗组、草分枝杆菌苗组、20微克融合蛋白疫苗AB治疗组、40微克融合蛋白疫苗AB治疗组、60微克融合蛋白治疗组肝脏菌落计数平均值的对数值分别为6.14±0.24、6.05±0.27、2.66±0.7、5AB.53±0.3、5.5±0.72、5.5±0.37、5.61±0.21；与生理盐水组比较，依次减少0.09log、3.48log、0.61log、0.64log、0.64log、0.53log。与阴性对照组相比，各剂量蛋白治疗组和草分枝杆菌组肝脏菌落数均有明显减少。
上述实验结果表明融合蛋白疫苗AB联合佐剂可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能,主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核模型可使其脏器组织细菌数显著减少，其治疗效果与现有商品化的结核病免疫治疗制剂草分枝杆菌F.U.36注射液的治疗效果相当。因此，本发明在结核病的辅助治疗方面将具有广阔的应用前景。
Claims (4)
1.一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB，由Ag85A蛋白抗原表位和Ag85B蛋白抗原表位依次连接形成，蛋白疫苗AB的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB，其特征在于：所述的Ag85A蛋白抗原表位位于融合蛋白AB的氨基端，所述的Ag85B蛋白抗原表位位于融合蛋白AB的羧基端。
3.一种结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB的制备方法，包括如下步骤：
(1)两个蛋白抗原表位融合的设计：分析结核分枝杆菌Ag85A、Ag85B的基因序列和蛋白质结构，确定两个蛋白抗原表位融合的区域、组合和顺序，所述Ag85A蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列1所示，所述Ag85B蛋白抗原表位的核苷酸优化序列如序列表中序列2所示；依次将Ag85A和Ag85B蛋白抗原表位连接形成融合蛋白；Ag85A蛋白的抗原表位位于融合蛋白的氨基端，Ag85B蛋白的抗原表位位于融合蛋白的羧基端；
(2)两个蛋白融合的克隆
①设计与合成扩增Ag85A抗原表位的一对引物
上游引物：
5’－GCAATTCCATATGTTTTCTCGT－3'，
下游引物：
5'－CCGCTCGAGTTTGAGAAAGG－3'，
在Ag85A蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在Ag85A蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中，转化到大肠杆菌DH5α受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒A/pET-30a；
②设计与合成扩增Ag85B抗原表位的一对引物
上游引物：
5’－GCAATTCCATATGGGATCCGGTGGTGGCTTTTCTC－3'，
下游引物：
5'－CCGCTCGAGTTTAGCCTGCACCCAGAGAGG－3'，
在Ag85B蛋白编码基因的上游引物添加Nde I酶切位点，在Ag85B蛋白编码基因的下游引物添加Xho I酶切位点，将PCR扩增产物用Nde I和Xho I双酶切后，插入用Nde I和Xho I双酶切后的pET-30a质粒载体中，转化到大肠杆菌DH5α受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒B/pET-30a；
③用限制性内切酶BamH I和Xho I分别双酶切A/pET-30a质粒和B/pET-30a质粒，通过转接酶将两个片段连接后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，经过质粒提取，经T7和T7t双向测序验证，获得核苷酸序列与设计完全一致的重组质粒AB/pET-30a，融合蛋白的编码序列如序列表中序列6所示，并使Ag85A蛋白抗原表位与Ag85B蛋白抗原表位之间通过连接臂相联接。
4.权利要求1或2所述的结核分枝杆菌特异性融合蛋白疫苗AB在制备预防或治疗结核病的药物或疫苗中的应用。
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| 结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达;江山等;《第四军医大学学报》;20031231;第24卷(第21期);1973-1975 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103304670A (zh) | 2013-09-18 |
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