CN102268446B - 结核杆菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

提供一种嵌合基因，包含编码结核杆菌蛋白Ag85a的基因和嵌合在Ag85a基因第245-250位Kpn I识别序列和/或第430-435位Acc I识别序列的编码结核杆菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因。提供包含上述嵌合基因的嵌合型结核杆菌基因疫苗，其中Ag85a基因连接于真核表达载体中。还提供该嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，包括PCR扩增所述的Ag85b基因片段；将扩增的Ag85b基因片段插入到包含Ag85a基因的真核表达载体中；然后用连接酶进行连接。本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗可用于治疗耐药结核杆菌感染，也可与佐剂左旋咪唑联用，诱导产生更强的抗结核细胞免疫应答。

Description

结核杆菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域的新型疫苗技术，具体涉及采用嵌合基因技术研制的可用于预防或治疗结核病的结核杆菌嵌合基因疫苗，尤其是治疗耐药结核杆菌感染结核病人的嵌合型基因疫苗。

技术背景

迄今已知卡介苗虽能预防儿童结核病，包括严重的脑结核和粟粒性结核病，但不能有效地预防成人肺结核病，故美国、加拿大等国一直不常规接种卡介苗。自上世纪80年代以来，由于结核杆菌耐药问题越来越严重，以及艾滋病、移民和贫困等社会问题使得结核病发病率在世界范围内重新回升。世界卫生组织(WHO)2004年报告全球每年新增结核病人900多万，每年有200多万人死于结核病。我国的结核病疫情和耐药情况也相当严重，结核病人数居世界第二，仅次于印度，每年新发活动性肺结核病人150多万人，现有肺结核病人450多万，每年约13万人死于此病，为全国各种传染病之首。耐药结核病人多，结核分枝杆菌总耐药率为27.8％，其中初始耐药率为18.6％，获得性耐药率为46.5％，耐多药率为10.7％。结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性传染病，经合理的抗痨药物治疗不耐药结核菌感染一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗至少6个月，甚至更长时间。由于耐多药结核病的流行、化疗药物长期治疗产生的毒副作用，以及艾滋病毒的感染、免疫抑制剂的使用和老年结核病等原因导致的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战，尤其是耐多药结核病(MDR-TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)面临无药可治的困难局面。因此，研制新的抗结核药物面临更大的需求。

但是，研制新的抗结核药物投入大、周期长，而且结核杆菌对新药也可能很快产生耐药性，故新的有效抗结核药物开发进展缓慢，近年来只开发了采用免疫调节剂来辅助治疗结核病的方法。目前用于结核病辅助治疗的已获得批准的细胞免疫调节剂产品主要有二类。一类是细胞因子如IFN-γ、IL-2等，其半衰期短，需反复注射，费用高。另一类是用结核分枝杆菌的同类菌制成的非特异性免疫调节剂，如(1)母牛分枝杆菌菌苗(商品名微卡菌苗)，系母牛分枝杆菌经高温灭活纯化后制成的无细胞免疫调节剂，其活性成分主要为细胞壁，还含有蛋白质细胞因子诱导物质，及具有较强免疫活性的DNA聚合体，能部分增强肺结核患者的细胞免疫功能，与化疗联用能缩短疗程，不良反应少且较轻微，使用安全，复发率低；(2)草分枝杆菌制剂(商品名乌体林斯utilin’s)，系灭活的草分枝杆菌制成的免疫调节剂，可部分提高肺结核患者的细胞免疫功能，促进肺结核病灶的吸收好转；(3)卡介苗多糖核酸注射液(商品名斯奇康)，系采用热酚法去掉了卡介苗菌体可诱导迟发型超敏反应的菌体蛋白质、再用乙醇沉淀提取的免疫活性较强的菌体脂多糖成分，可部分增强肺结核患者的细胞免疫和体液免疫功能，提高诱生IL-2、IL-2受体表达和IFN-γ的水平，促进细菌阴转和结核病灶的吸收好转而提高联合化疗的疗效。但这三种调节剂都是非特异性细胞免疫增强剂，不能诱导针对结核杆菌的特异性强效细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。

如果能采用疫苗治疗结核病，几个月中只需注射几针，远比每天服药打针方便，且副作用较少费用低，故治疗性疫苗已成为重要的研究与开发方向。

治疗性疫苗的应用对象与预防性疫苗不同，前者用于结核菌感染者或结核病患者，而后者用于正常人群。有效的预防性疫苗不一定能用作治疗性疫苗，如研究证明卡介苗用于治疗结核病不仅无效可能还会加重病情。抗体应答对抗结核无效，而现有的多种蛋白质铝佐剂疫苗主要是诱导体液抗体免疫应答因而效果不佳。要开发的预防和治疗性结核病疫苗必须能诱导细胞介导为主的免疫应答，通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的细胞免疫力来达到治疗疾病的目的，因此需选择适当类型的疫苗。自上世纪90年代以来全世界研发的新型核酸(基因)疫苗的优点就是主要诱导机体产生保护性细胞免疫应答。采用各种结核杆菌保护性抗原的编码核酸(基因)疫苗预防结核感染的动物实验已有许多成功研究，但采用特异性核酸疫苗联合抗痨药物治疗结核病的研究论文只有几篇，如(1).Lowrie et al.，Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination.Nature 400：269-271，1999.(2).S-J Ha et al.，Therapeutic effect of DNAvaccines combined with chemotherapy in a latent infection model afteraerosol infection of mice with Mycobacterium tuberculosis.Gene Therapy10：1592-1599，2003.(3).S-J Ha et al.，Protective effect of DNA vaccineduring chemotherapy on reactivation and reinfection of Mycobacteriumtuberculosis.Gene Therapy(2005)12：1-5，2005.(4).D-H YU，X-D and H Cai(北大蔡宏等)，Efficient tuberculosis treatmemt in mice usingchemotherapy and immunotherapy with combined DNA vaccine encodingAg85B，MPT-64 and MPT-83.gene Therapy(2008)，1-8。这些论文主要涉及小鼠接种标准(非耐药)结核杆菌H37Rv株后，肺肝脾均有细菌生长，单独给予利福平等抗痨药物治疗3个月后，若用地塞米松抑制小鼠的免疫反应，至6个月时细菌感染复发，但给予利福平同时注射单基因或混合基因核酸疫苗的动物感染不复发，这是由于核酸疫苗诱导了Th1型免疫应答为主的细胞免疫应答而致。然而，关于耐药结核杆菌感染的治疗却鲜有研究，而结核杆菌易产生耐药性，耐药结核杆菌感染的治疗难度大，正是该技术需要开发的新领域。

目前认为结核病单基因DNA疫苗在大动物实验中的预防免疫效果不够理想(Gregorialdis等，“Genetic vaccines：strategies for optimization”，Pharmaceutical Research，15：661-670，1998)；采用将两个抗原编码基因融合构建的双基因疫苗能够达到用一种载体表达两种不同抗原的目的，但两种表达抗原之间没有协同增效作用，也即融合基因疫苗诱导的免疫应答并不比单基因疫苗效果好(Stevenson et al；DNA fusion gene vaccinesagainst cancer：from laboratory to the clinic.Immunology Research，199：156-180，2004.和师长宏等，“结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化”，中华结核和呼吸杂志，27(2)：89-92，2004.)。近年的研究发现将来源于同一病原微生物的两种抗原基因正确嵌合在一起产生的嵌合性基因疫苗有较好效果(Domingo et al；“Immunological properties of aDNA plasmid encoding a chimeric protein of herpes simplex virus type 2glycoprotein B and glycoprotein D”，Vaccine，21(25-26)：3565-3574，2003)。研究发现将一种免疫原性较弱的小抗原基因正确嵌合于另外一种免疫原性较强的大抗原基因中可提高小抗原的免疫原性，此即异源性嵌合基因技术。其成功的例子有在乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的编码基因中嵌合艾滋病病毒V3表位的编码基因。艾滋病病毒外壳蛋白抗原的V3表位含有非常重要的保护性抗原表位，但其分子量很小，单用时难以诱导免疫应答。然而，将编码HIV V3的基因嵌合在编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基因中，使表达的HBsAg成为V3表位的载体蛋白，这种嵌合基因即能诱导出特异性抗HIV V3的体液和细胞免疫应答(Bryder etal；“Improved immunogenicity of HIV-1 epitopes in HbsAg chimeric DNAvaccine plasmids by structural mutations of HbsAg”，DNA and Cell Biology，18(3)：219-225，1999.)。嵌合位点和嵌合方式的正确选择十分重要，应使插入的小基因不破坏作为载体蛋白的大基因构型，从而表达时能保持二者原有的抗原表位和免疫原性。

本发明者在中国发明专利ZL 2004100843761(2008年3月28日授权)及以其为优先权的国际申请PCT/CN2005/001914“结核杆菌嵌合基因疫苗及其制备方法”中，揭示了将编码最小结核杆菌保护性抗原的ESAT6基因嵌合到编码最具免疫保护效果的结核杆菌较大抗原结构蛋白Ag85a基因中，得到了结核杆菌嵌合基因Ag85a-ESAT6。其中，在Ag85a基因第245-250(GGTACC)位的Kpn I限制性内切酶识别位点或第430-435(GTCTAC)位的Acc I限制性内切酶识别位点的嵌合，分别产生的两种新型结核杆菌嵌合基因(HG856K和HG856A)疫苗在动物实验中均显示出优于单基因疫苗的免疫效果，即既保留了Ag85a的免疫原性又增强了ESAT6的免疫原性(Li Z，Song D，Zhang H，et al.Improvedhumorol immunity against Tuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNAprime and protein boost strategy.DNA Cell Biol，2006，25(1)：25-29)。这是迄今结核杆菌嵌合基因疫苗构建的一个成功例子。

这两种嵌合基因疫苗在预防结核杆菌感染的动物实验中显示了良好效果，但是，后来我们发现当将其用于结核杆菌(尤其是治疗耐药结核杆菌)感染的动物进行实验治疗时，这种嵌合基因疫苗虽能有效减少感染组织中的结核杆菌数，但对减轻结核杆菌导致的病理损伤(如实验动物结核病产生的结核结节等病理损伤)不能尽如人意。

我们在上述发明专利的基础上，不断地进行探索，在研究思路和实验设计上均作了重大改进，构建了结核杆菌最具保护性免疫原性的Ag85a与Ag85b两种蛋白(这两种蛋白卡介苗菌均有所表达)编码基因的嵌合基因疫苗HGAg85ab，本发明的HGAg85ab嵌合基因疫苗不仅可用于预防，更重要的是可用于治疗结核病，尤其是治疗耐药结核杆菌感染的结核病人。从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种嵌合基因Ag85ab。

本发明的第二个目的在于提供一种包含Ag85ab嵌合型基因的结核杆菌基因疫苗。

本发明的第三个目的在于提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法。

本发明的第四个目的还在于提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

发明概述

本发明提供一种嵌合基因，包含序列1所示编码结核杆菌蛋白Ag85a的基因和序列2所示编码结核杆菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85a基因的序列中，嵌合位点为Ag85a基因的第245-250位限制性内切酶Kpn I识别序列或第430-435位内切酶Acc I识别序列。

本发明进一步提供一种嵌合型结核杆菌基因疫苗，包含序列1所示编码结核杆菌蛋白Ag85a的基因和序列2所示编码结核杆菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85a基因的序列中，嵌合位点为Ag85a基因的第245-250位限制性内切酶Kpn I识别序列或第430-435位内切酶Acc I识别序列，编码结核杆菌蛋白Ag85a基因连接于真核表达载体中。

本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗中，真核表达载体可以是JW4303，或pcDNA3.1，或pVAX1系列。优选的是pVAX1系列。

本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)选择Ag85a基因中的第245-250位Kpn I酶切位点，或第430-435位Acc I酶切位点，分别用内切酶Kpn I或内切酶Acc I消化真核表达载体中的Ag85a基因，使该表达载体线性化，并用碱性磷酸酶去磷酸化；

(2)分别用带有内切酶Kpn I识别序列的引物对，或带有内切酶AccI识别序列的引物对，通过聚合酶链反应扩增编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；

(3)用连接酶分别连接步骤(1)的去磷酸化线性Ag85a基因载体与步骤(2)的编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA扩增片段，获得含Ag85ab嵌合基因的质粒载体疫苗。

本发明方法中，采用的真核表达载体优选pVAX1。

本发明方法中，采用的引物对优选序列3所示的引物P1和序列4所示的引物P2。

本发明方法中，采用的引物对优选序列6所示的引物P3和序列7所示的引物P4。

本发明还提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

用本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗，加或不加左旋咪唑佐剂免疫动物，诱导了比单基因质粒更强的Th1型免疫应答。与抗痨药联用，本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗与单基因质粒疫苗相比，在耐药结核杆菌感染动物的治疗中诱导了相当或更强的抗结核细胞免疫应答和更佳治疗效果。

发明详述

文献检索显示结核杆菌Ag85a与Ag85b抗原蛋白的1-125位氨基酸序列二者彼此差异不大，而125-282位氨基酸序列之间有较大差异，约有40个左右氨基酸不相同，此区段二者的编码核酸序列中共有90多个碱基不同。在此区段中Ag85b存在有重要的可诱导Th1型应答反应细胞因子IFN-γ和IL-2的表位(S.D′Souza，V.Rosseels，M.Romano，A et al；Mapping ofMurine Th1 Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A，Ag85B，and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis.Infection and Immunity，January2003，71(1)：483-493)。

本发明者通过计算机软件服务公司Intenet-Based AppliedBioinformatics Company的Epitope Informatics软件对结核杆菌结构蛋白Ag85a基因的抗原表位进行搜索，发现其抗原表位主要集中在Ag85a的氨基端和羧基端(S.D′Souza，V.Rosseels，M.Romano，A et al；Mapping ofMurine Th1 Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A，Ag85B，and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis.Infection and Immunity，January2003，71(1)：483-493)。在不含抗原表位的Ag85a母体基因中间区段第245-250位含有Kpn I酶切位点(GGTACC)，第430-435位含有Acc I酶切位点(GTCTAC)，故设计在此嵌合插入编码Ag85b的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段。

本发明提供的嵌合基因包含序列1所示编码结核杆菌蛋白Ag85a的基因和序列2所示编码结核杆菌Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在Ag85a基因的序列中，嵌合位点为Ag85a基因的第245-250位限制性内切酶KpnI识别序列和/或第430-435位内切酶Acc I识别序列。

本发明提供包含编码结核杆菌保护性抗原Ag85a全部与保护性抗原Ag85b的125-282位氨基酸的嵌合型结核杆菌基因疫苗，包括在以下序列1所示的结核杆菌保护性结构蛋白Ag85a基因的第245-250(GGTACC)位Kpn I酶切位点，或第430-435(GTCTAC)位Acc I酶切位点嵌合插入以下序列2所示的编码Ag85b的125-282位氨基酸的核苷酸序列片段，这种重组的Ag85ab嵌合基因连接于真核表达载体中。真核表达载体可选用JW4303，或pcDNA3.1，或pVAX1系列。优选pVAX1系列。

序列1：Ag85a基因序列

1    TTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGT

61  GACATCAAGG TCCAATTCCA AAGTGGTGGT GCCAACTCGC CCGCCCTGTA CCTGCTCGAC

121 GGCCTGCGCG CGCAGGACGA CTTCAGCGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGG

181 TACGACCAGT CGGGCCTGTC GGTGGTCATG CCGGTGGGTG GCCAGTCAAG CTTCTACTCC

241 GACTGGTACC AGCCCGCCTG CGGCAAGGCC GGTTGCCAGA CTTACAAGTG GGAGACCTTC

301 CTGACCAGCG AGCTGCCGGG GTGGCTGCAG GCCAACAGGC ACGTCAAGCC CACCGGAAGC

361 GCCGTCGTCG GTCTTTCGAT GGCTGCTTCT TCGGCGCTGA CGCTGGCGAT CTATCACCCC

421 CAGCAGTTCG TCTACGCGGG AGCGATGTCG GGCCTGTTGG ACCCCTCCCA GGCGATGGGT

481 CCCACCCTGA TCGGCCTGGC GATGGGTGAC GCTGGCGGCT ACAAGGCCTC CGACATGTGG

541 GGCCCGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC AACGACCCGC TGTTGAACGT CGGGAAGCTG

601 ATCGCCAACA ACACCCGCGT CTGGGTGTAC TGCGGCAACG GCAAGCCGTC GGATCTGGGT

661 GGCAACAACC TGCCGGCCAA GTTCCTCGAG GGCTTCGTGC GGACCAGCAA CATCAAGTTC

721 CAAGACGCCT ACAACGCCGG TGGCGGCCAC AACGGCGTGT TCGACTTCCC GGACAGCGGT

781 ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCGCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAACGG

841 GCACTGGGTG CCACGCCCAA CACCGGGCCC GCGCCCCAGG GCGCCTAG    887

序列2：编码Ag86b蛋白125-282位氨基酸的基因片段序列，

G

TCTACTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCC CAGCAGTTCA

TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA GGGGATGGGG CCTAGCCTGA

TCGGCCTCGC GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AGACATGTGG GGTCCCTCGA

GTGACCCGGC ATGGGAGCGC AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCCAAGCTG GTCGCAAACA

ACACCCGGCT ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGC GGTGCCAACA

TACCCGCCGA GTTCTTGGAG AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTC CAGGATGCGT

ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT TCAACTTCCC GCCCAACGGC ACGCACAGCT

GGGAGTACTG GGGCGCTCAG CTCAACGCCA TGAAGGGTGA CCTGCAGAGT TCGTTAG TCTAC

在一个优选实施方案中，本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)选择在Ag85a基因中可插入外源DNA片段的第245-250位KpnI酶切位点，或第430-435位Acc I酶切位点，分别用内切酶Kpn I或内切酶Acc I消化先前构建好的含有Ag85a基因的真核表达载体pVAX1，使之线性化，并用碱性磷酸酶去磷酸化；

(2)分别用一对带有内切酶Kpn I识别序列GGTACC的引物，或一对带有内切酶Acc I识别序列GTCTAC的引物，通过聚合酶链反应扩增编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；

(3)用连接酶分别连接步骤(1)的去磷酸化线性Ag85a基因载体与步骤(2)的编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA扩增片段，选择获得两种连接方向正确的嵌合基因疫苗HG85abA和HG85abK载体质粒。

为扩增编码Ag85b基因125-282位氨基酸的核苷酸序列，本发明者设计了针对该序列5’端的上游引物P1序列和3’端的下游引物P2序列(序列3和序列4)，二者均带有Acc I酶切位点(GTCTAC)；或上游引物P3序列和下游引物P4序列(序列5和序列6)，二者均带有Kpn I酶切位点(GGTACC)。合成这两对引物后，用PCR技术扩增结核杆菌Ag85b基因的PET28A-85B质粒中的该片段(S.D′Souza，V.Rosseels，M.Romano，A etal：Mapping of Murine Th1 Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl TransferasesAg85A，Ag85B，and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis.Infection andImmunity，January 2003，71(1)：483-493)并通过凝胶电泳回收。同时用AccI酶或Kpn I酶酶切含结核杆菌Ag85a基因的pVAX-Ag85A质粒载体(Li Z，Song D，Zhang H，et al.Improved Humoral Immunity of Tuberculosis ESAT-6antigen by Chimeric DNA Prime and Protein Boost Strategy”，DNA Cell Biol，2006，25(1)：25-29)使之线性化，继而用碱性磷酸酶对其作去磷酸化处理并通过凝胶电泳回收。然后将两者用T4 DNA连接酶连接起来，将所得质粒转化大肠杆菌后在卡那霉素抗性培养基平皿上培养生长出菌落。挑选单个菌落分别小试管培养后，分别抽提质粒作电泳鉴定，再作酶切和电泳鉴定，初步选出正确者经测序确认，重组的Ag85ab嵌合型基因疫苗构建成功。据专利文献和学术期刊检索，均未发现关于这种Ag85a与Ag85b的嵌合基因的报导。

本发明制备的嵌合基因质粒所表达的嵌合蛋白分子量约为40kD，符合Ag85a全部与Ag85b的125-282位氨基酸相加的分子量，既保留了Ag85a和Ag85b的抗原性表位，又提供了Ag85b的IFN-γ和IL-2诱导表位。

本发明的嵌合基因质粒单独使用或与佐剂左旋咪唑联用，免疫小鼠，诱生的血清特异性抗体IgG亚类分析和活化淋巴细胞表达的细胞因子(mRNA)类型检测分析表明，其主要诱导了Th1型免疫应答，水平显著优于Ag85a和Ag85b单基因质粒诱导的。采用本发明的嵌合质粒疫苗联用利福平，治疗利福平耐药结核杆菌感染的小鼠，效果相当于或优于单基因质粒疫苗联用利福平。显示了临床上用于治疗结核杆菌感染者，尤其是耐药结核杆菌感染者的应用前景。

附图简要说明

图1A是本发明含有结核杆菌Ag85abA嵌合型基因的真核表达载体HG85abA质粒的构建图。

图1B是用于构建HG85abA质粒的pVAX 1载体质粒。

图2显示初步筛选的含嵌合型HG85abA基因质粒(C1质粒)的电泳图。泳道1.C3质粒；泳道2.C2质粒；泳道3.C1质粒；泳道4.pVAX1-Ag85a质粒

图3显示PCR扩增的Ag85b基因片段(0.5kb)与用Acc I酶酶切C1质粒产生预期的0.5kb片段的电泳图。泳道1.2000DL标志；泳道2.PCR扩增的Ag85b片段    (0.5kb大小与预期相符)；泳道3.C1质粒经AccI酶酶切产生的二片段，

图4显示C1质粒用Acc I和KpnI双酶切产生了预期的三个片段的电泳图。泳道1和7.λ-EcoT14-I digest；泳道2-4.C1质粒经Acc I和KpnI  双酶酶切产生了预期大小的三个片段0.2kb+0.5kb+3.7kb；泳道5.100bp marker；泳道6.2000DL标志

图5A-I显示用利福平抗药性结核杆菌HB361菌株攻击后，分别采用对照或几种不同质粒和/或利福平治疗小鼠的肺组织切片病理学检查的代表性显微照片。

具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：卢圣栋主编“现代分子生物学实验技术”，(第二版，中国协和医科大学出版社，1999年12月，北京)；和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：“分子克隆实验指南”(第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京)中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均属于本申请书的权利要求范围内。

实施例1：含Ag85ab嵌合基因pVAX1质粒(HG85abA质粒)核酸疫苗的制备

主要实验材料：

pVAX 1载体质粒购自Invitrogen公司

源自pVAX 1质粒载体的含结核杆菌Ag85a基因的pVAX1-85a和含结核杆菌Ag85b基因的PET28A-85B质粒由上海海规生物科技有限公司制备(Li Z，Song D，Zhang H，et al.，Improved humorol immunity againstTuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNA prime and protein booststrategy.DNA Cell Biol，2006，25(1)：25-29)。

碱性磷酸酶、Taq DNA聚合酶为NEB公司产品。

限制性内切酶BamH I、Hind III和dNTP Mix(混合物)为Takara公司产品。限制性内切酶Acc I、Kpn I和T4 DNA连接酶为MBI公司产品。

AXYGEN质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品。

细菌培养用酵母提取物、蛋白胨为OXOID公司产品。

NaCl等化学品购自国药集团化学试剂有限公司。硫酸卡那霉素购自上海新先锋药业有限公司。凝胶成象拍摄处理系统为上海天能公司产品。

制备方法：

(1)引物设计与合成：利用软件PerlPrimer设计用PCR法扩增Ag85b基因(编码125-282位氨基酸)片段含有Acc I酶切位点

的上游引物P1和下游引物P2寡核苷酸的序列如下：

P1：5’-CACATCACGATACCG

TCGATGGCCGGCTCGTC-3’(序列3)

P2：5’-CACATGCGAATACCG

TAACGAACTCTGCAGGTC-3’(序列4)

将此二序列送Invitrogen公司进行合成。

(2)PCR扩增Ag85b基因(编码125-282位氨基酸)片段：用上述P1/P2引物(浓度各为10pmol/μl)、以PET28a-85b质粒DNA为模板，采用高保真pfu DNA聚合酶，按基因工程分子克隆技术的常规方法(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，85-86页，2002年8月，科学出版社出版，北京)进行PCR反应。反应条件为：94℃变性4min；94℃30s、60℃30s、72℃40s共30个循环；72℃延伸5min。反应体系(50μl)为：10x buffer 5μl、Taq DNA聚合酶1μl、MgCl₂ 5μl(Mg²⁺浓度为1.5mM)、dNTP mix(四种dNTP的浓度分别为20μM)1μl、ddH2O 35μl、P1和P2各1μl、PET28a-85b 1μl。同样的反应体系共4管，反应后合并4管内容物用0.6倍异丙醇沉淀，离心10min收集产物用ddH2O重溶解，共得到100μl的Ag85b基因片段的PCR扩增产物，凝胶电泳显示目标条带约为0.5KB，与85b基因片段的大小相符。将此PCR产物取样用Acc I限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系(50μl)为：10x buffer 5μl、Ag85b产物30μl、酶1μl、ddH2O 14μl。37℃水浴过夜。用DNA凝胶回收试剂盒按照说明书(参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，第404-407页，2002年8月，科学出版社出版，北京)操作，回收该基因DNA片段产物。

(3)制备去磷酸化线性pVAX1-Ag85A质粒：用Acc I限制性内切酶酶切消化含Ag85a基因的pVAX1-Ag85A质粒，酶切反应体系(50μl)为：10x buffer 5μl；pVAX1-85A 30μl(5μg)；酶液1μl；ddH₂O 14μl。37℃水浴过夜。酶切产物取样作1％琼脂糖凝胶电泳(见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，387-399页，2002年8月，科学出版社出版，北京)和成像扫描确定酶切完全，用DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒说明书方法回收此线性质粒，再经凝胶电泳和成像扫描，显示回收的DNA条带与预计的3.9KB大小相符。

用碱性磷酸酶对此3.9KB的pVAX1-85A线性化质粒进行去磷酸化处理，反应体系为：碱性磷酸酶1μl，pVAX1-85A线性化载体30μl、ddH2O14μl、10x buffer 5μl。37℃水浴1小时。反应完毕后用DNA凝胶回收试剂盒按照说明书操作，回收此去磷酸化粘性末端的线性pVAX1-85A质粒。

(4)连接Ag85b基因片段与去磷酸化线性pVAX1-Ag85A质粒载体 并转化大肠杆菌：反应体系(20μl)为：10x buffer 2μl、T4 DNA连接酶2μl、Ag85b基因片段14μl、去磷酸化pVAX1-Ag85A线性载体2μl，22℃恒温孵育过夜。将连接产物转化入JM108感受态大肠杆菌细胞，取200μl涂布接种卡那霉素抗性LB平板，置37℃培养过夜。pVAX1载体质粒中含有抗卡那霉素基因，被基因重组HG85abA克隆载体质粒成功转化的大肠杆菌能在卡那霉素抗性培养基平皿上生长成为菌落。次日出现数十个单菌落，挑取3个单菌落(C1、C2和C3)分别接种含卡那霉素抗性LB培养液(约5ml)的三个试管中，37℃摇床200rpm培养过夜。

(5)含Ag85ab嵌合基因重组PVAX1质粒(HG85abA质粒)的提取 与鉴定：分别取三个菌落生长产生的的菌液(分别标号为C1、C2、C3)各1ml用AXYGEN质粒提取试剂盒按说明书操作抽提质粒，取样作凝胶电泳，电泳条带显示C1质粒分子量比pVAX1-85a质粒略大，约为4.4KB，符合预期的大小。如图2所示，C1质粒电泳位置比pVXA1-Ag85a对照质粒略高，表明C1质粒分子量比pVAX1-85a质粒略大，符合预期大小(约4.4KB)，因此初步筛选出此质粒作下一步鉴定。

取C1质粒作Acc I单酶切鉴定。反应体系(10μl)为：Acc I 1μl 10xbuffer1μl、C1质粒8μl，37℃孵育2小时。取样作凝胶电泳成像显示，图3中泳道3为C1质粒经AccI酶酶切产生的二片段，分子量较小片段的大小(0.5kb)与预期的Ag85b扩增片段分子量相符。表明C1可能为阳性克隆子，宜进一步鉴定。

再用Acc I和Kpn I双酶切C1质粒，见图4，泳道2-4为C1质粒经AccI和KpnI  双酶酶切产生了预期大小的三个片段0.2kb+0.5kb+3.7kb，进一步确认其为正确的阳性克隆子

PCR扩增C1质粒作进一步鉴定：反应体系(50μl)为：10x buffer 5μl、Taq DNA聚合酶1μl、MgCl₂ 5μl、dNTP mix 1μl、ddH2O 35μ、引物P1 1μl、引物P2 1μl、C1质粒1μl(0.1μg)。同样的反应体系共3管，阳性对照管为模板Ag85b基因片段，阴性对照无基因片段。反应条件为：94℃变性4min；94℃30s、60℃30s、72℃40s，共30轮循环；72℃延伸5min。

分别取3管PCR产物各3μl进行凝胶电泳，显示均扩增出0.5KB的条带，与设计的Ag85b片段大小吻合，说明其为所要的阳性克隆子，将C1质粒送Invitrogen公司进行基因测序。测序引物为T7启动子通用引物和BGH POLY A通用引物，双向测通。

Invitrogen公司基因测序结果如下(序列5)：

ATG(Ag85A蛋白氨基端编码序列)

GTTTCCCGGC    CGGGCTTGCC    GGTGGAGTAC    CTGCAGGTGC    CGTCGCCGTC    GATGGGCCGT

GACATCAAGG    TCCAATTCCA    AAGTGGTGGT    GCCAACTCGC    CCGCCCTGTA    CCTGCTCGAC

GGCCTGCGCG    CGCAGGACGA    CTTCAGCGGC    TGGGACATCA    ACACCCCGGC    GTTCGAGTGG

TACGACCAGT    CGGGCCTGTC    GGTGGTCATG    CCGGTGGGTG    GCCAGTCAAG    CTTCTACTCC

GACTGGTACC    AGCCCGCCTG    CGGCAAGGCC    GGTTGCCAGA    CTTACAAGTG    GGAGACCTTC

CTGACCAGCG    AGCTGCCGGG    GTGGCTGCAG    GCCAACAGGC    ACGTCAAGCC    CACCGGAAGC

GCCGTCGTCG    GTCTTTCGAT    GGCTGCTTCT    TCGGCGCTGA    CGCTGGCGAT    CTATCACCCC

CAGCAGTTCG    TCTACTCGAT    GGCCGGCTCG    TCGGCAATGA    TCTTGGCCGC    CTACCACCCC

CAGCAGTTCA    TCTACGCCGG    CTCGCTGTCG    GCCCTGCTGG    ACCCCTCTCA    GGGGATGGGG

CCTAGCCTGA    TCGGCCTCGC    GATGGGTGAC    GCCGGCGGTT    ACAAGGCCGC    AGACATGTGG

GGTCCCTCGA    GTGACCCGGC    ATGGGAGCGC    AACGACCCTA    CGCAGCAGAT    CCCCAAGCTG

GTCGCAAACA    ACACCCGGCT    ATGGGTTTAT    TGCGGGAACG    GCACCCCGAA    CGAGTTGGGC

GGTGCCAACA    TACCCGCCGA    GTTCTTGGAG    AACTTCGTTC    GTAGCAGCAA    CCTGAAGTTC

CAGGATGCGT    ACAACGCCGC    GGGCGGGCAC    AACGCCGTGT    TCAACTTCCC    GCCCAACGGC

ACGCACAGCT    GGGAGTACTG    GGGCGCTCAG    CTCAACGCCA    TGAAGGGTGA    CCTGCAGAGT

TCGTTAGTCT    ACGCGGG       AGCGATGTCG    GGCCTGTTGG    ACCCCTCCCA    GGCGATGGGT

CCCACCCTGA  TCGGCCTGGC GATGGGTGAC GCTGGCGGCT ACAAGGCCTC CGACATGTGG

GGCCCGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC AACGACCCGC TGTTGAACGT CGGGAAGCTG ATCGCCAACA

ACACCCGCGT        CTGGGTGTAC  TGCGGCAACG  GCAAGCCGTC  GGATCTGGGT  GGCAACAACC

TGCCGGCCAA  GTTCCTCGAG  GGCTTCGTGC    GGACCAGCAA  CATCAAGTTC  CAAGACGCCT

ACAACGCCGG  TGGCGGCCAC  AACGGCGTGT    TCGACTTCCC    GGACAGCGGT    ACGCACAGCT

GGGAGTACTG GGGCGCGCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAACGG GCACTGGGTG CCACGCCCAA

CACCGGGCCC  GCGCCCCAGG  GCGCCTAG  TAA              GGATCTCGTC     GTTTTGTCGT

TTTGTCGTTG      GATCCACTAG  TCCAGTGTGG  TGGAATTCTG   CAGATATCCA   GCACAGTGGC

GGCCGCTCGA GTCTAGAGTC  CT(Ag85A蛋白羧基端编码序列)

下划线表示AccI酶识别位点。

将以上测定的序列与上文设计的序列在NCBI网站上进行BLAST排列对比检索，结果表明1365个碱基中除结构基因的第一个碱基G与原基因中的T不同外，其余都相同。由于pVAX1载体要求在起始密码子ATG后的第四个碱基必须是G(称Kozak序列)，才能获得基因在真核生物体内较高的表达。此第一个碱基G是先前设计pVAX1-Ag85A时为增强表达而更改，因此，获得的重组HG85abA质粒中的Ag85abA嵌合基因序列正确。

(6)核酸疫苗(HG85abA质粒)的配制与贮存：将用AXYGEN质粒抽提试剂盒纯化的重组HG85abA质粒溶解于磷酸生理盐水(PBS)中，浓度为1mg/ml；或制备为冻干制剂贮存，用前溶解于PBS中。

实施例2：含Ag85ab嵌合基因PVAX1质粒(HG85abK质粒)核酸疫苗的制备

主要实验材料：与实施例1相同

制备方法

(1)引物设计与合成：设计用于PCR扩增Ag85b基因(编码125-282位氨基酸)片段含有Kpn I酶切位点

的以下上游引物P3和下游引物P4寡核苷酸序列：

P3：5’-CACATCACGATACCG

TCGATGGCCGGCTCGTC-3’(序列6)

P4：5’-CACATGCGAATACCG

TAACGAACTCTGCAGGTC-3’(序列7)

将此二序列送Invitrogen公司进行合成。

(2)PCR扩增Ag85b基因(编码125-282位氨基酸)片段：方法与实施例1相同，但采用上述P3/P4引物。

(3)制备去磷酸化线性pVAX1-Ag85A质粒：方法与实施例1相同，但采用Kpn I酶。

(4)连接Ag85b基因片段与去磷酸化线性pVAX1-Ag85A载体并转 化大肠杆菌：方法与实施例1相同。

(5)含Ag85ab嵌合基因重组pVAX1质粒(HG85abK质粒)的提取 与鉴定：方法与实施例1相同，但所得的K1质粒单酶切鉴定采用Kpn I酶，双酶切鉴定采用Nhe I和BamH I酶，单酶切得到一条0.5kb大小的条带，与预期的Ag85b基因片段相符；双酶切产生了3kb的载体pVAX1和1.4kb的HG 85ab嵌合基因两个预期条带，进一步确认K1为正确阳性克隆子。K1质粒的PCR扩增作进一步鉴定采用P3和P4引物，其方法与实施例1相同。K1质粒送Ivitrogen公司测序方法也与实施例1相同。测序结果表明获得的重组HG85abK质粒中的Ag85abK嵌合基因序列正确。

Invitrogen公司基因测序结果如下(序列8)：

ATG(Ag85A蛋白氨基端编码序列)

GTTTCCCGGC    CGGGCTTGCC    GGTGGAGTAC    CTGCAGGTGC    CGTCGCCGTC    GATGGGCCGT

GACATCAAGG    TCCAATTCCA    AAGTGGTGGT    GCCAACTCGC    CCGCCCTGTA    CCTGCTCGAC

GGCCTGCGCG    CGCAGGACGA    CTTCAGCGGC    TGGGACATCA    ACACCCCGGC    GTTCGAGTGG

TACGACCAGT    CGGGCCTGTC    GGTGGTCATG    CCGGTGGGTG    GCCAGTCAAG    CTTCTACTCC

GACTGGTACC  TCGAT  GGCCGGCTCG  TCGGCAATGA  TCTTGGCCGC  CTACCACCCC  CAGCAGTTCA

TCTACGCCGG    CTCGCTGTCG    GCCCTGCTGG    ACCCCTCTCA    GGGGATGGGG    CCTAGCCTGA

TCGGCCTCGC    GATGGGTGAC    GCCGGCGGTT    ACAAGGCCGC    AGACATGTGG    GGTCCCTCGA

GTGACCCGGC    ATGGGAGCGC    AACGACCCTA    CGCAGCAGAT    CCCCAAGCTG    GTCGCAAACA

ACACCCGGCT    ATGGGTTTAT    TGCGGGAACG    GCACCCCGAA    CGAGTTGGGC    GGTGCCAACA

TACCCGCCGA    GTTCTTGGAG    AACTTCGTTC    GTAGCAGCAA    CCTGAAGTTC    CAGGATGCGT

ACAACGCCGC    GGGCGGGCAC    AACGCCGTGT    TCAACTTCCC    GCCCAACGGC    ACGCACAGCT

GGGAGTACTG   GGGCGCTCAG    CTCAACGCCA   TGAAGGGTGA   CCTGCAGAGT   TCGTTAGGTA  CC

AGCCCGCCTG    CGGCAAGGCC    GGTTGCCAGA    CTTACAAGTG    GGAGACCTTC    CTGACCAGCG

AGCTGCCGGG    GTGGCTGCAG    GCCAACAGGC    ACGTCAAGCC    CACCGGAAGC    GCCGTCGTCG

GTCTTTCGAT    GGCTGCTTCT    TCGGCGCTGA    CGCTGGCGAT    CTATCACCCC    CAGCAGTTCG

TCTACGCGGG    AGCGATGTCG    GGCCTGTTGG    ACCCCTCCCA    GGCGATGGGT    CCCACCCTGA

TCGGCCTGGC    GATGGGTGAC    GCTGGCGGCT    ACAAGGCCTC    CGACATGTGG    GGCCCGAAGG

AGGACCCGGC    GTGGCAGCGC    AACGACCCGC    TGTTGAACGT    CGGGAAGCTG    ATCGCCAACA

ACACCCGCGT    CTGGGTGTAC    TGCGGCAACG    GCAAGCCGTC    GGATCTGGGT    GGCAACAACC

TGCCGGCCAA    GTTCCTCGAG    GGCTTCGTGC    GGACCAGCAA    CATCAAGTTC    CAAGACGCCT

ACAACGCCGG    TGGCGGCCAC    AACGGCGTGT    TCGACTTCCC    GGACAGCGGT    ACGCACAGCT

GGGAGTACTG    GGGCGCGCAG    CTCAACGCTA    TGAAGCCCGA    CCTGCAACGG    GCACTGGGTG

CCACGCCCAA    CACCGGGCCC    GCGCCCCAGG    GCGCCTAG TAA  GGATCTCGTC    GTTTTGTCGT

TTTGTCGTTG    GATCCACTAG    TCCAGTGTGG    TGGAATTCTG    CAGATATCCA    GCACAGTGGC

GGCCGCTCGA  GTCTAGAGTC      CT(Ag85A蛋白羧基端编码序列)

(6)核酸疫苗(HG85abK质粒)的配制与贮存：方法与实施例1相同。

实施例3：嵌合型结核杆菌核酸疫苗HG85abA质粒或HG85abK质粒的体外基因表达

采用T_NT体外转录和翻译系统(Promega，Madison，WI，USA)按照美国Promega公司说明书的实验步骤，将每份12.5微升反应系统中含有0.25μg HG85ab质粒DNA和9μl T_NT T7快速反应母液，30℃与每毫升含400uCi[S³⁵]标记的甲硫氨酸液孵育90分钟。将该嵌合基因表达的蛋白质(带有[S³⁵]放射性)作常规10％SDS-PAGE电泳，用放射自显影法观察蛋白质泳动位置，显示所表达的嵌合蛋白分子量约为40kDa，符合Ag85a蛋白分子量(约32kDa)与Ag85b片段(125-282氨基酸)分子量(约18kDa)之和。

实施例4：结核杆菌嵌合基因HG85abA或HG85abK质粒接种小鼠诱导血清特异性抗体应答水平的测定(ELISA法)和Th细胞相关细胞因子mRNA水平的检测(逆转录RT-PCR法)

(1)材料和免疫方法

取8周龄雌性BALB/C小鼠随机分组，每组6只，饲养在上海公共卫生中心的SPF(Specific Pathogen Free)级动物房中。第1组(pVAX1-Ag85a单基因质粒)，第二组(pVAX1-Ag85b单基因质粒，上海海规生物科技有限公司制)，第三组(HG85abA嵌合基因质粒)和第四组(HG85abK嵌合基因质粒)小鼠每次分别于胫前肌注射10μg各质粒液，或各质粒与0.25mg左旋咪唑的混合液，注射后立即用带电极的夹子夹住注射部位，用WJ-2002活体基因导入仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)进行体内电转染(电压：100V；脉冲次数：正反各6次；波宽：60毫秒；间隔：10毫秒)。每隔两周质粒免疫一次，共3次。三次质粒免疫后第10天经小鼠心脏穿刺采血分离血清-20℃保存。

(2)常规ELISA间接法检测各小鼠血清抗Ag85a的IgG亚类抗体 的效价

以纯化的重组Ag85a蛋白(1.25μg/mL)4℃包被96孔酶标板(50μl/孔)过夜，用0.15M PBS-吐温20洗涤3次后每孔用100μl 0.5％牛血清白蛋白封闭1小时。洗涤3次后各孔中分别加入1∶100小鼠血清的2倍倍比(1∶200-1∶102400)稀释液(50μl/孔)37℃孵育2小时。洗涤后分别加入1∶10,000稀释的碱性磷酸标记羊抗小鼠IgG1或羊抗小鼠IgG2a抗体(Sigma，Cat#A3688)37℃孵育1.5小时。再经洗涤后加入底物液显色，30分钟后加入3M NaOH终止反应用酶标仪作OD_405nm检测。结果见表1。

(3)RT-PCR检测相关Th细胞因子mRNA的表达

小鼠心脏穿刺采血后无菌取各小鼠双腹股沟淋巴结同组合并，分离淋巴细胞。各组取等量淋巴细胞以TRIzoL试剂提取总RNA，各取4μlRNA在同样条件下进行逆转录，然后取获得的各cDNA 5μl用以下三对特异性引物作PCR扩增，反应条件为：94℃变性 5min；94℃ 45s、55℃退火1min，72℃ 延伸1min，共35轮循环。各取12μl PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳，用天能公司成象系统拍摄和作相对定量处理。所述引物序列为：

扩增管家基因(GAPDH)的上下游引物：

5’-CTGCACCACCAATGCTTAG-3’(序列9)和

5’-GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3’(序列10)

扩增IL-4基因的上下游引物：

5’-TCCACGGTAGCGACAAAAAT-3’(序列11)和

5’-TGAAATCCAGGCATCGAAAAG-3’(序列12)

扩增IFN-γ基因的上下游引物：

5’-TCTGAGACAATGAACGATAC-3’(序列13)和

5’-GGACCTGTGGGTTGTTGA-3’(序列14)

将得到的IL-4基因与IFN-γ基因mRNA表达量与GAPDH基因表达量作比较，并求得二者比值，结果见表2。

表1：不同结核杆菌基因质粒疫苗接种及相应蛋白质疫苗加强后小鼠血清结核杆菌Ag85a特异性抗体水平检测(ELISA)

表2：各组免疫小鼠淋巴细胞Th分型细胞因子mRNA的表达水平与比值

小鼠的Th1细胞免疫应答主要产生IFN-γ和IgG2a抗体，Th2体液免疫应答主要产生IL-4和IgG1抗体，因此疫苗免疫产生的特异性IgG2a/IgG1抗体水平及IFN-γ/IL-4细胞因子二者的比例可反映其主要诱导那种免疫应答。从表1可见，单单三次质粒疫苗接种各诱导产生了IgG2a抗体/IFN-γ细胞因子，其效价比产生的IgG1抗体/IL-4细胞因子高约1.3-1.5倍，这正是核酸疫苗主要诱导Th1细胞免疫应答的特征。加Th1型佐剂左旋咪唑后，诱导产生Th1免疫应答(抗体IgG2a)更高，这二种比值提高到约2.2-3.0倍，与左旋咪唑佐剂主要增强细胞免疫相符。这4种质粒中，二种HG85ab嵌合基因质粒诱导细胞免疫应答的能力差不多，都比另二种单基因质粒高。分析认为这可能是HG85ab嵌合基因表达的嵌合蛋白中含有诱导IFN-γ和IL-2的表位从而增强了诱导Th1细胞免疫应答的能力所致，这正是治疗结核病所需要的。

实施例5：用HG85ab质粒核酸疫苗治疗耐药结核杆菌感染的小鼠

(1)感染菌株的选择与小鼠攻击用菌量：按《结核病诊断细菌学检验规程》进行分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验，选择表3所示高耐利福平、低耐异烟肼的临床分离结核分枝杆菌HB361菌株。

表3.药物敏感试验

将用改良罗氏鸡卵培养基培养生长良好的结核分枝杆菌HB361菌株用玻璃研磨器研磨成细菌悬液，用生理盐水配制3mg/ml悬浮液后，作10倍系列稀释，将10^-1、10^-2、10^-3、10^-4菌液各取0.1ml接种于2支改良罗氏鸡卵平皿培养基37℃培养4周作菌落计数。动物为从军事医学科学院购进有合格证的体重17-19g、6-8周龄雌性Balb/c小鼠。经动物实验室喂养1天后进行攻击，所用的HB361细菌悬液每毫升含有5.5×10⁵CFU，每只小鼠尾静脉注射0.4ml，即每只小鼠攻击菌量为2.2×10⁵CFU(见表4)。

表4.结核分枝杆菌HB361菌株悬液菌落计数结果

细菌悬液稀释倍数	培养后菌落数	菌落计数(CFU/ml)
			10-1	很多，未予计数	-
10-2	很多，未予计数	-
			10-3	50，60	-
10-4	5，6	5.5×105

(2)动物实验分组：小鼠称重后，随机分为以下7组，每组10只。细菌感染后第3天开始治疗，每只小鼠双侧胫前肌各注射：(A)生理盐水组：注射生理盐水100μg/100μl。(B)pVAX1空载体组：注射pVAX1空载体质粒100μg/100μl。(C)利福平(RFP)治疗组：沈阳红旗制药有限公司RFP胶囊1粒药粉加水187.5ml溶解，利福平浓度为0.8mg/ml，每天每公斤体重20mg(0.02mg/g)给药，小鼠按20克计算，每只小鼠每天喂利福平0.4mg/0.5ml一次。(D)单纯Ag85a核酸疫苗治疗组：注射Ag85a质粒100μg/100μl。(E)单纯HG85abA核酸疫苗组：注射HG85abA嵌合基因质粒100μg/100μl(F)RFP+Ag85a核酸疫苗治疗组：注射核酸疫苗Ag85a质粒100μg/100μl，同时给予上述剂量利福平。(G)RFP+HG85abA质粒治疗组：注射HG85abA质粒100μg/100μl，同时给予上述剂量利福平。(H)RFP+HG85abK质粒治疗组：注射HG85abK质粒100μg/100μl，同时给予上述剂量利福平。各质粒每隔12天注射一次，肌肉注射的深度为2mm，共5次。利福平治疗共50天。

(3)治疗效果观察指标：观察小鼠体重变化；记录实验期间小鼠死亡数、死亡率；实验结束时处死小鼠，取肺、肝、脾测重量指数，观察记录大体病理变化；解剖肉眼观察各组小鼠肺和脾有无水肿、萎缩、病变，病变的严重程度及范围，并取小鼠肺右叶固定于10％中性福尔马林，石蜡包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，镜下观察肺组织病理改变。

将左肺和脾各以3ml和2ml生理盐水研磨成组织悬液，如下作残留活菌培养计数(CFU)：取肺组织悬液加等体积6％NaOH消化30分钟，脾悬液不用消化。然后各用生理盐水制成10^-2、10^-3、10^-4系列稀释液，各取0.1ml接种含两性霉素B的改良罗氏鸡卵培养基平皿，每个稀释度接种2个平皿，37℃培养4周后计数菌落平均数。将得到的肺左叶菌落数根据肺左叶和全肺的重量，脾的上半部分的菌落数根据其重量和全脾的重量换算为全肺或全脾菌落数。

应用SAS 6.12软件处理数据，定量资料用单因素方差分析，两两比较用q检验，进行统计学分析。

(4)结果：

各组小鼠体重增长缓慢，组间无显著差异，各组小鼠无死亡。停止治疗后3周处死小鼠，各组肺、脾重量及重量指数(脏器重量除以小鼠体重)之间无显著差别(P＞0.05)。

病理学检查，小鼠单用结核杆菌HB361菌株攻击后8周，肺组织充血、肺实变严重而广泛，正常肺泡结构破坏消失，有结核肉芽肿和大片干酪样坏死，肺泡腔内有大量浆液纤维素渗出，少量淋巴细胞浸润，全肺平均荷菌量为2.0×10⁶CFU；全脾平均荷菌量为6.8×10⁵CFU，表明成功建立了小鼠结核病模型。

各组小鼠肺组织病理变化如下：对照的A、B和C三组小鼠肺组织病理学变化基本如单用结核杆菌HB361菌株攻击的小鼠，都有肺组织充血、正常肺泡结构破坏消失，肺实质病变严重而广泛，有结核肉芽肿和干酪样坏死；B组肺病变比A组轻，尚存有部分正常肺泡结构；C组肺充血渗出肺实质病损比A组还重。

用构建的含结核杆菌基因的质粒和/或药物治疗的D、E、F、G和H组小鼠大部分区域肺泡结构正常，肺泡轮廓清晰，肺组织病变局限，可见数量不同的由类上皮细胞、多核巨细胞、泡沫细胞和淋巴细胞组成的结核肉芽肿，无干酪样坏死灶或少，呈点状分布范围局限。表明均有不同程度的治疗效果(代表性肺组织切片病理检查见图5的A-H，图5的最后一幅图是小鼠的正常肺组织，可见清晰的肺泡结构)。

各组小鼠肺组织结核病变和肺脾结核杆菌培养计数见表5。

表5.各组小鼠的肺部结核样病变，肺脾组织细菌培养计数

从以上结果可见，单用利福平治疗对耐药菌感染无效，肺脾结核杆菌最多。单用Ag85a质粒或Ag85ab质粒治疗鼠的肺脾结核杆菌数均减少约一半，基本无干酪样坏死灶、病灶范围最小。利福平加Ag85a质粒或加HG85abA质粒联合治疗效果最好，肺脾结核杆菌数比单用利福平减少了80％左右，但二者无统计学差异。表明核酸疫苗对治疗耐药结核杆菌感染有效，联合抗痨药效果更好。

现已通过具体实施方式描述了本发明，显然本领域其他技术人员知道可在不背离本发明的思路和范围条件下设计出其它实施方式和作出各种变化，但所有这些实施方式和相等的变化均包括在本发明附件权利要求书所述的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110>上海海规生物科技有限公司

     中国人民解放军第三0九医院

<120>结核杆菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用

<130>CN101136

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>888

<212>DNA

<213>结核杆菌染色体DNA

<400>1

ttttcccggc cgggcttgcc ggtggagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgt     60

gacatcaagg tccaattcca aagtggtggt gccaactcgc ccgccctgta cctgctcgac    120

ggcctgcgcg cgcaggacga cttcagcggc tgggacatca acaccccggc gttcgagtgg    180

tacgaccagt cgggcctgtc ggtggtcatg ccggtgggtg gccagtcaag cttctactcc    240

gactggtacc agcccgcctg cggcaaggcc ggttgccaga cttacaagtg ggagaccttc    300

ctgaccagcg agctgccggg gtggctgcag gccaacaggc acgtcaagcc caccggaagc    360

gccgtcgtcg gtctttcgat ggctgcttct tcggcgctga cgctggcgat ctatcacccc    420

cagcagttcg tctacgcggg agcgatgtcg ggcctgttgg acccctccca ggcgatgggt    480

cccaccctga tcggcctggc gatgggtgac gctggcggct acaaggcctc cgacatgtgg    540

ggcccgaagg aggacccggc gtggcagcgc aacgacccgc tgttgaacgt cgggaagctg    600

atcgccaaca acacccgcgt ctgggtgtac tgcggcaacg gcaagccgtc ggatctgggt    660

ggcaacaacc tgccggccaa gttcctcgag ggcttcgtgc ggaccagcaa catcaagttc    720

caagacgcct acaacgccgg tggcggccac aacggcgtgt tcgacttccc ggacagcggt    780

acgcacagct gggagtactg gggcgcgcag ctcaacgcta tgaagcccga cctgcaacgg    840

gcactgggtg ccacgcccaa caccgggccc gcgccccagg gcgcctag                 888

<210>2

<211>483

<212>DNA

<213>结核杆菌染色体DNA

<400>2

gtctactcga tggccggctc gtcggcaatg atcttggccg cctaccaccc ccagcagttc     60

atctacgccg gctcgctgtc ggccctgctg gacccctctc aggggatggg gcctagcctg    120

atcggcctcg cgatgggtga cgccggcggt tacaaggccg cagacatgtg gggtccctcg    180

agtgacccgg catgggagcg caacgaccct acgcagcaga tccccaagct ggtcgcaaac    240

aacacccggc tatgggttta ttgcgggaac ggcaccccga acgagttggg cggtgccaac    300

atacccgccg agttcttgga gaacttcgtt cgtagcagca acctgaagtt ccaggatgcg    360

tacaacgccg cgggcgggca caacgccgtg ttcaacttcc cgcccaacgg cacgcacagc    420

tgggagtact ggggcgctca gctcaacgcc atgaagggtg acctgcagag ttcgttagtc    480

tac                                                                  483

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

cacatcacga taccggtcta ctcgatggcc ggctcgtc                            38

<210>4

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

cacatgcgaa taccggtaga ctaacgaact ctgcaggtc                           39

<210>5

<211>1368

<212>DNA

<213>结核杆菌染色体DNA

<400>5

gtttcccggc cgggcttgcc ggtggagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgt    60

gacatcaagg tccaattcca aagtggtggt gccaactcgc ccgccctgta cctgctcgac   120

ggcctgcgcg cgcaggacga cttcagcggc tgggacatca acaccccggc gttcgagtgg   180

tacgaccagt cgggcctgtc ggtggtcatg ccggtgggtg gccagtcaag cttctactcc   240

gactggtacc agcccgcctg cggcaaggcc ggttgccaga cttacaagtg ggagaccttc   300

ctgaccagcg agctgccggg gtggctgcag gccaacaggc acgtcaagcc caccggaagc   360

gccgtcgtcg gtctttcgat ggctgcttct tcggcgctga cgctggcgat ctatcacccc   420

cagcagttcg tctactcgat ggccggctcg tcggcaatga tcttggccgc ctaccacccc   480

cagcagttca tctacgccgg ctcgctgtcg gccctgctgg acccctctca ggggatgggg   540

cctagcctga tcggcctcgc gatgggtgac gccggcggtt acaaggccgc agacatgtgg   600

ggtccctcga gtgacccggc atgggagcgc aacgacccta cgcagcagat ccccaagctg   660

gtcgcaaaca acacccggct atgggtttat tgcgggaacg gcaccccgaa cgagttgggc   720

ggtgccaaca tacccgccga gttcttggag aacttcgttc gtagcagcaa cctgaagttc   780

caggatgcgt acaacgccgc gggcgggcac aacgccgtgt tcaacttccc gcccaacggc   840

acgcacagct gggagtactg gggcgctcag ctcaacgcca tgaagggtga cctgcagagt   900

tcgttagtct acgcgggagc gatgtcgggc ctgttggacc cctcccaggc gatgggtccc   960

accctgatcg gcctggcgat gggtgacgct ggcggctaca aggcctccga catgtggggc  1020

ccgaaggagg acccggcgtg gcagcgcaac gacccgctgt tgaacgtcgg gaagctgatc  1080

gccaacaaca cccgcgtctg ggtgtactgc ggcaacggca agccgtcgga tctgggtggc  1140

aacaacctgc cggccaagtt cctcgagggc ttcgtgcgga ccagcaacat caagttccaa  1200

gacgcctaca acgccggtgg cggccacaac ggcgtgttcg acttcccgga cagcggtacg  1260

cacagctggg agtactgggg cgcgcagctc aacgctatga agcccgacct gcaacgggca  1320

ctgggtgcca cgcccaacac cgggcccgcg ccccagggcg cctagtaa               1368

<210>6

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

cacatcacga taccgggtac ctcgatggcc ggctcgtc                            38

<210>7

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

cacatgcgaa taccgggtac ctaacgaact ctgcaggtc                           39

<210>8

<211>1368

<212>DNA

<213>结核杆菌染色体DNA

<400>8

gtttcccggc cgggcttgcc ggtggagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgt    60

gacatcaagg tccaattcca aagtggtggt gccaactcgc ccgccctgta cctgctcgac   120

ggcctgcgcg cgcaggacga cttcagcggc tgggacatca acaccccggc gttcgagtgg   180

tacgaccagt cgggcctgtc ggtggtcatg ccggtgggtg gccagtcaag cttctactcc   240

gactggtacc tcgatggccg gctcgtcggc aatgatcttg gccgcctacc acccccagca   300

gttcatctac gccggctcgc tgtcggccct gctggacccc tctcagggga tggggcctag   360

cctgatcggc ctcgcgatgg gtgacgccgg cggttacaag gccgcagaca tgtggggtcc   420

ctcgagtgac ccggcatggg agcgcaacga ccctacgcag cagatcccca agctggtcgc   480

aaacaacacc cggctatggg tttattgcgg gaacggcacc ccgaacgagt tgggcggtgc   540

caacataccc gccgagttct tggagaactt cgttcgtagc agcaacctga agttccagga   600

tgcgtacaac gccgcgggcg ggcacaacgc cgtgttcaac ttcccgccca acggcacgca   660

cagctgggag tactggggcg ctcagctcaa cgccatgaag ggtgacctgc agagttcgtt   720

aggtaccagc ccgcctgcgg caaggccggt tgccagactt acaagtggga gaccttcctg   780

accagcgagc tgccggggtg gctgcaggcc aacaggcacg tcaagcccac cggaagcgcc   840

gtcgtcggtc tttcgatggc tgcttcttcg gcgctgacgc tggcgatcta tcacccccag   900

cagttcgtct acgcgggagc gatgtcgggc ctgttggacc cctcccaggc gatgggtccc   960

accctgatcg gcctggcgat gggtgacgct ggcggctaca aggcctccga catgtggggc  1020

ccgaaggagg acccggcgtg gcagcgcaac gacccgctgt tgaacgtcgg gaagctgatc  1080

gccaacaaca cccgcgtctg ggtgtactgc ggcaacggca agccgtcgga tctgggtggc  1140

aacaacctgc cggccaagtt cctcgagggc ttcgtgcgga ccagcaacat caagttccaa  1200

gacgcctaca acgccggtgg cggccacaac ggcgtgttcg acttcccgga cagcggtacg  1260

cacagctggg agtactgggg cgcgcagctc aacgctatga agcccgacct gcaacgggca  1320

ctgggtgcca cgcccaacac cgggcccgcg ccccagggcg cctagtaa               1368

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ctgcaccacc aatgcttag                                                 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

gtctgggatg gaaattgtga                            20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

tccacggtag cgacaaaaat                            20

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

tgaaatcag gcatcgaaaa g                           21

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

tctgagacaa tgaacgatac                            20

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

ggacctgtgg gttgttga                              18

Claims (11)

1.一种嵌合基因，选自序列5所示Ag85abA嵌合基因和序列8所示Ag85abK嵌合基因。

2.一种嵌合型结核杆菌基因疫苗，其特征在于：包含权利要求1所述的嵌合基因，所述嵌合基因连接于真核表达载体中。

3.如权利要求2所述的嵌合型结核杆菌基因疫苗，其中所述真核表达载体为JW4303，或pcDNA3.1，或pVAX1系列。

4.如权利要求2所述的嵌合型结核杆菌基因疫苗，其中所述真核表达载体为pVAX1系列。

5.权利要求2所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)选择Ag85a基因中的第245-250位Kpn I酶切位点，或第430-435位AccI酶切位点，分别用内切酶Kpn I或内切酶Acc I消化真核表达载体中的Ag85a基因，使该表达载体线性化，并用碱性磷酸酶去磷酸化；

(2)分别用带有内切酶Kpn I识别序列的引物对，或带有内切酶AccI识别序列的引物对，通过聚合酶链反应扩增编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA片段；

(3)用连接酶分别连接步骤(1)的去磷酸化线性Ag85a基因载体与步骤(2)的编码Ag85b蛋白125-282位氨基酸序列的DNA扩增片段，获得含Ag85ab嵌合基因的质粒载体疫苗。

6.权利要求5所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，其中所述的引物对为序列3所示的引物P1和序列4所示的引物P2。

7.权利要求5所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，其中所述的引物对为序列6所示的引物P3和序列7所示的引物P4。

8.权利要求2所述嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其中所述结核病是耐药结核杆菌感染的结核病。

10.如权利要求8所述的应用，其中所述嵌合型结核杆菌基因疫苗是单独使用或与抗结核药物联用。

11.如权利要求8所述的应用，其中所述嵌合型结核杆菌基因疫苗在应用中加入佐剂左旋咪唑。

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