CN100457912C - 重组Ag85B卡介苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程领域和结核疫苗领域。近十几年来由于结核耐药株增多和HIV/AIDS的蔓延，结核病发病率增高，成为继HIV之后人类的第二大杀手。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。本发明将结核分枝杆菌最重要的保护性抗原基因插入大肠杆菌—结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点形成重组质粒，并将其转化入BCG中形成重组结核疫苗。实验结果表明，和BCG组相比，该保护性抗原得到了更高效的表达，并且所诱导的脾细胞IFN-γ表达也有显著的增高。这说明本发明的重组结核疫苗可以诱导较BCG高的体液和细胞免疫水平。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明提供了一种新型的重组Ag85B卡介苗。
背景技术
近十几年来由于结核耐药株增多和HIV/AIDS的蔓延，结核病发病率增高，成为继HIV之后人类的第二大杀手。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。然而，BCG的保护效率在不同地区差异很大，对人群的保护效率在0-80％之间。尽管它对预防儿童严重的肺结核有效，但对成人结核则几乎没有保护效果。因此研制新型的结核疫苗刻不容缓，这对于控制结核传染具有非常重大的意义。对结核亚单位疫苗的研究表明，它们的保护效果并未超过BCG。因此BCG仍然是目前首选应用的疫苗。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新型的结核疫苗质粒。
本发明的另一个目的是提供一种新型的重组卡介苗。
本发明的再一个目的是提供上述重组卡介苗的一种制备方法。
在本发明的一个方面，提供了一种新的结核疫苗质粒，即将Ag85B基因序列插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒序列中。
上述重组质粒中，通常将Ag85B插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处，以利于插入基因的稳定表达。
将上述重组Ag85B质粒转化入BCG中即形成重组Ag85B卡介苗。
本发明的重组质粒制备过程中，可采用的大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒有pMV261和pMV361等等。在本发明的一个实施例中，所用大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒为pMV261。
在本发明的另一方面，提供了一种重组Ag85B卡介苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；
(2)Ag85B基因的扩增；
(3)Ag85B基因插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒载体；
(4)将(3)所得的重组子转化入卡介苗。
各种实验参数均按常规操作选择，可视具体的实验条件而定。
检测结果表明，利用该方法可将Ag85B基因成功克隆入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒载体，并转化得到重组Ag85B卡介苗。动物实验表明，本发明的重组Ag85B卡介苗可以引起较BCG强的体液免疫和细胞免疫反应。
BCG是很好的细胞免疫和体液免疫佐剂，利用BCG作为活载体，将一些重要的结核杆菌抗原基因导入BCG，让BCG大量表达保护性抗原，有望诱导比BCG强大的免疫保护力。本研究选择结核分枝杆菌最重要的保护性抗原Ag85B，将可表达该基因的质粒转化入BCG中，构建了重组卡介苗，即rBCG::Ag85B(BCG即卡介苗，“::”表示重组)。我们的研究表明，rBCG::Ag85B菌株可以高效表达Ag85B，用该菌株免疫小鼠，可以引起较BCG强的体液免疫和细胞免疫反应。
附图说明
图1为Western-blot检测rBCG::Ag85B细胞裂解液中Ag85B表达图。
图2为Ag85B抗体水平检测图。其中，1：BCG免疫组；2：rBCG::Ag85B免疫组；3：PBS对照。
图3为脾细胞分泌IFN-γ功能检测图。4、6：BCG免疫组；5、7：rBCG::Ag85B免疫组；4、5：Ag85B刺激浓度2μg/ml；6、7：Ag85B刺激浓度0.2μg/ml。
具体实施方式
实施例1重组卡介苗rBCG::Ag85B构建
设计引物P1，5’GCGAATTCATGACAGACGTGAGCCGAAAGATTC；P2，5’TGTCGACCTAGCCGGCGCCTAACGAACTCTGG。以H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Ag85B基因。PCR反应条件如下：98℃预变性5分钟；98℃变性45秒，62℃复性45秒，72℃延伸2分30秒，30个循环；72℃延伸12分钟。PCR反应产物经纯化后用EcoR I和Sal I酶切，克隆构建入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒pMV261EcoR I和Sal I酶切位点中。测序表明所插入序列和Gene Bank中H37Rv结核全基因组相应基因序列(Ag85B基因登录号BX842578.1：56187..57164；蛋白登录号：CAB10044.1)完全一致。
卡介苗感受态细胞制备与转化，方法如下：卡介苗复苏后，接种至400ml Sauton培养基中培养10-14天，在对数生长期，加入20％甘氨酸100ml至终浓度4％，继续培养24小时，玻璃珠打碎菌膜，摇3小时，冰浴1小时，6000rpm4℃离心10分钟收集细菌，用预冷的10％甘油洗涤4次，重悬于预冷的10％甘油3ml，取200μl菌液加入50-500ng质粒，冰浴30min，转入预冷的2mm电穿孔杯中，在2.3kv/cm，25μF，720欧姆下进行电转化，放电完毕后，冰浴10min，加入50μl 5×sauton培养基(600μl 1×sauton培养基)，37℃培养过夜，离心后取菌液125μl分别涂布于含卡那霉素15μg/ml和20μg/ml的7H10平板上，37℃静置培养。筛选阳性克隆。继续培养该阳性克隆，Western blot分析Ag85B表达，结果表明重组卡介苗rBCG::Ag85B菌苗中，Ag85B得到了高效的表达。(图1)
实施例2 rBCG::Ag85B免疫特性观察
用rBCG::Ag85B菌苗免疫C57BL/c小鼠，同时分别用卡介苗(BCG)和PBS做为对照。免疫6周后取血用ELISA法检测血清抗体表达水平。具体步骤为：分别用5ug/ml Ag85b、10ug/ml ESTA6、10ug/ml PPD包被酶标板，而后用1∶6000小鼠血清特异性吸附，再用HRP酶标山羊抗小鼠二抗标记，最后用OPD显色，490nm测定OD值。结果显示，rBCG::Ag85B菌苗和BCG组相比，所诱导的血清Ag85B抗体水平(图2)有显著的增高。这说明rBCG::Ag85B可以诱导较BCG更高的体液免疫水平。
无菌分离脾脏，应用ELISPOT技术检测脾细胞受到Ag85B蛋白刺激后IFN-γ的表达。具体步骤为：ELISPOT板预先用IFN-γ抗体包被过夜，牛血清白蛋白封闭。无菌摘除脾脏，研磨后经200目筛网过滤，经淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。加适宜数量淋巴细胞入96孔ELISPOT板中，给予Ag85B蛋白刺激。共同孵育48小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、显色，计数斑点数。结果表明：rBCG::Ag85B菌苗和BCG组相比，所诱导的脾细胞IFN-γ表达(图3)有显著的增高。这说明rBCG::Ag85B可以诱导较BCG高的细胞免疫水平。
Claims (5)
1.一种重组质粒，其特征在于，将Ag85B基因序列插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒序列中。
2.如权利要求1所述重组质粒，其特征在于，将Ag85B插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒的多克隆位点处。
3.如权利要求1所述重组质粒，其特征在于，大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒为pMV261。
4.一种结核杆菌的重组疫苗，其特征在于，将如权利要求1所述重组质粒转化入卡介苗，从而得到rBCG::Ag85B重组疫苗。
5.一种重组Ag85B卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；
(2)Ag85B基因的扩增；
(3)Ag85B基因插入大肠杆菌-结核分枝杆菌穿梭质粒载体；
(4)将(3)所得的重组子转化入卡介苗。
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