CN101921801A - 重组卡介苗rBCG::X - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗结核杆菌的重组卡介苗，它是将含有编码HspX蛋白基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒转化入卡介苗中形成的重组卡介苗rBCG::X。该重组卡介苗rBCG::X实现了HspX蛋白的过表达，免疫动物后，可显著地诱导机体产生针对HspX蛋白的细胞免疫反应，并产生稳定和持久的抗感染保护，克服了现有卡介苗保护期短和对成人结核病保护效果不稳定等不足。

Description

重组卡介苗rBCG::X

技术领域

本发明属于基因工程疫苗和结核病疫苗领域。具体地说，本发明提供了一种新型的抗结核杆菌的重组卡介苗，即将结核杆菌或卡介苗的HspX蛋白的基因(acr，Rv2031c)克隆入卡介苗，在卡介苗中过表达，形成重组卡介苗rBCG::X。

背景技术

结核病(TB)是严重影响全球人类健康的重要公共卫生问题之一。最近十几年来，TB的发病率呈持续上升趋势，每年约200万人因TB而死亡。我国感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的人数达到5.5亿，结核病的患病人数和死亡人数均居传染病之首。

卡介苗是目前结核病唯一的预防疫苗，但其保护期短，对成人结核病保护效果不稳定。尽管卡介苗表达少量的HspX蛋白，但免疫后不能产生针对HspX显著的细胞免疫应答。

卡介苗(M.bovis BCG，BCG)是临床上用于婴幼儿免疫接种预防结核病的唯一疫苗，是在1921年通过体外反复传代培养牛型结核分枝杆菌(M.bovis)获得的减毒活疫苗，目前在全球161个国家和地区使用，全球每年90％的婴儿免疫接种。临床研究证实，卡介苗具有安全、价廉，以及可预防婴幼儿重症肺结核等优势；但卡介苗的保护期短，仅5-10年；卡介苗对成人肺结核的预防效果不稳定，效果介于0-80％之间；不能阻止体内潜伏的细菌复发。因此，研究更为有效的疫苗取代现有的卡介苗是结核病控制领域重要而且优先的研究方向，其中重组卡介苗的发展是最为重要和可实践性最强的研制策略。

目前国内外研制重组卡介苗的策略主要包括：过表达细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-13、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α等；表达重要免疫优势抗原，如Ag85A、Ag85B、38kDa、19kDa、ESAT-6、Ag85B-ESAT-6、ESAT-6-CFP10(或RD1区)、Ag85B-MPT64-MTB8.4等；表达溶细胞素；或表达细胞因子与抗原嵌合蛋白，如IL-2-ESAT-6，Ag85B-ESAT-6-IFN-γ等。已证实BCG表达Ag85B(rBCG30，美国加州大学，Horwitz MA，Harth G.A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.Infect Immun.2003Apr；71(4)：1672-9.)和BCG表达溶细胞素(德国柏林马克思布兰克传染病研究所，Live antigen carriers as tools for improved anti-tuberculosis vaccines.Hess J，Kaufmann SH.FEMS Immunol Med Microbiol.1999Feb；23(2)：165-73.Review.)在免疫动物的保护性强于BCG，并分别于2005年和2007年进入I期临床实验。但未见将结核杆菌或卡介苗的HspX蛋白在卡介苗中过表达的报道和专利申请。

结核杆菌HspX，又叫热休克蛋白Hsp16.3，Rv2031c，Acr，alpha-crystallin。HspX是结核杆菌或卡介苗在正常有氧条件下表达水平极低，甚至难以检测出；而在结核杆菌或卡介苗休眠过程中显著增加表达的一种蛋白质，同时结核杆菌或卡介苗在此过程中细胞壁的形成增厚，有利于细菌在机体巨噬细胞内的寄生和长期潜伏。因此认为HspX蛋白是结核杆菌休眠的标志性蛋白之一。HspX蛋白由144个氨基酸组成，分子量16.3kDa。HspX蛋白具有非常强的免疫原性，但在新生儿免疫接种卡介苗后，不能产生针对HspX的细胞免疫应答。在慢性患者体内HspX蛋白可以刺激机体产生强的体液免疫和细胞免疫应答。结核病患者的Th1 CD4和CD8T细胞可以识别HspX蛋白，有效治疗后，针对HspX蛋白的细胞免疫应答由Th0向Th1转变。HspX基因免疫小鼠可诱导强的Th1细胞免疫应答，且免疫的豚鼠可提供抗结核杆菌的感染。因此，HspX蛋白是结核杆菌重要的T细胞免疫抗原和发展抗结核疫苗的重要靶抗原，也是发展重组卡介苗抗结核病重要的靶抗原。但HspX蛋白大量获取较为困难，在前期工作中，我们建立了过表达HspX蛋白的大肠杆菌基因工程系统和纯化技术，并申请国家发明专利(国家发明专利申请号200710051915.5)，为本专利疫苗申请奠定了前期基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的重组质粒。

本发明的另一个目的是提供一种重组卡介苗rBCG::X。

本发明的又一个目的是提供这种重组卡介苗rBCG::X的制备方法。

实现本发明的具体技术方案是：

本发明提供的新的重组质粒，是将编码结核杆菌HspX蛋白的基因克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的序列中，构建成本发明提供的重组质粒，该重组质粒的特征在于：其中编码HspX蛋白的基因包含自身启动子序列、编码序列和调节序列，可指导HspX蛋白的过表达。由于具备HspX自身的启动子和调节序列，因此HspX在卡介苗中的过表达不受大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒携带的启动子和调节序列的影响；同时过表达的这种HspX蛋白的性质和原始卡介苗自身表达的HspX蛋白的性质完全一致。编码HspX蛋白的基因在构建重组质粒时插入的方向为不定向。

在本项目的一个实施例中，将编码结核杆菌HspX蛋白的基因(acr，Rv2031c)的全长序列扩增后，插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中，插入位置为pMV261中的热休克蛋白启动子PHsp60所在之处，即取代了热休克蛋白启动子PHsp60。由于该基因取代了pMV261中的热休克蛋白启动子Hsp60，验证了其可以不定向插入和具有自我启动子的功能特征。

本发明的重组质粒中HspX基因的基因序列，来源于美国NIH GenBank公开数据库。通过Blast同源性比较，结核杆菌HspX蛋白的编码基因与卡介苗相应基因的编码序列完全一致。因此，HspX蛋白的编码基因的来源的策略，可以通过设计引物，利用PCR技术从以下菌株的基因组中扩增获得，菌种可以是结核杆菌的不同菌株，如H37Rv，H37Ra，Beijing株或临床分离株等，或牛型结核杆菌和卡介苗的不同菌株。我们自己通过将基因库中这些序列进行比对我们自己通过将基因库中这些序列进行比对，证明了来源于这些菌株的HspX蛋白的编码基因是完全相同的。HspX蛋白的编码基因还可以参照GenBank公开数据库，通过人工基因合成的方式进行。在本发明的一个实施例中，是从结核杆菌H37Rv菌株的基因组扩增获得的。

本发明的重组质粒制备过程中，所采用的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒可以是pSMT3，pMV206，pMV261，pMV306和pMV361中的一种，但不限于此。大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的作用是携带外源的HspX蛋白的编码基因进入到卡介苗中，进一步利用大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒可在卡介苗复制的能力，最终有利于HspX在卡介苗中的过表达。在本项目的一个实施例中，采用的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒是pMV261。

本发明提供的抗结核杆菌的重组卡介苗rBCG::X，是将上述含有编码HspX蛋白的基因的重组质粒转化于卡介苗，得到重组卡介苗rBCG::X。

本发明提供的重组卡介苗rBCG::X的制备方法，包括以下步骤：

(1).扩增或人工合成编码HspX蛋白的基因；

(2).将编码HspX蛋白的基因序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的序列中，构建含编码HspX蛋白的基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒；

(3).将含有编码HspX蛋白基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒转化入卡介苗中，即得到重组卡介苗rBCG::X。

上述制备方法中所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒可采用但不局限于pSMT3，pMV206，pMV261，pMV306或pMV361。

本发明重组质粒转化的卡介苗的菌株，可以是现用于临床免疫接种的任何卡介苗菌株，如卡介苗巴斯德株，卡介苗丹麦株，卡介苗哥本哈根株，卡介苗日本株，卡介苗Tice株，卡介苗俄罗斯株，等等。

本发明首先将HspX蛋白的全长基因(Rv2031c)克隆，构建含编码HspX蛋白基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒，并将其转化入卡介苗中，形成重组卡介苗rBCG::X。实验结果表明，本发明提供的这种重组卡介苗rBCG::X实现了HspX蛋白的过表达，免疫动物后，重组卡介苗可显著地诱导机体产生针对HspX蛋白的细胞免疫反应，并产生稳定和持久的抗感染保护。

用本发明提供的过表达HspX蛋白的重组卡介苗rBCG::X，免疫C57BL/6小鼠。同时将卡介苗rBCG::261(BCG含空质粒pMV261)和PBS分别作为阳性对照和阴性对照。结果显示，新型重组卡介苗rBCG::X可提供免疫小鼠长期而且稳定的抗结核杆菌感染的保护，短期和长期的保护型均强于原始的卡介苗。这种增强的保护性经证实，是与卡介苗增强了表达HspX蛋白，以及免疫动物诱导了针对HspX蛋白的细胞免疫应答密切相关。

本发明重组卡介苗rBCG::X具有以下优势：

1.安全性不变。与原始卡介苗相比，HspX蛋白也是卡介苗自身表达的蛋白之一，因而过表达HspX蛋白的重组卡介苗的安全性未发生改变。

2.过表达的HspX蛋白的性质不变。HspX蛋白在重组卡介苗的表达策略是通过利用其自身的启动子和调节序列，从而不需要额外的温度或其他特殊条件的诱导表达，充分实现过表达的HspX蛋白与卡介苗自身的HspX蛋白在结构和功能上的完全一致。

3.有利于人体应用。HspX蛋白在重组卡介苗的表达策略是通过利用其自身的启动子和调节序列，从而不需要额外的温度或其他特殊条件的诱导表达，有利于重组卡介苗的人体应用。

4.表达稳定性。在有和无卡那霉素抗生素存在的情况下，rBCG::XB可稳定表达HspX蛋白，见附图2。

5.保护效果强。过表达HspX蛋白的新型的重组卡介苗rBCG::X的短期和长期的免疫保护型均显著强于原始卡介苗。

附图说明

图1为本发明的重组质粒pMHspX和原始质粒pMV261的结构模式图。

图2为Western blotting检测重组卡介苗rBCG::X细胞裂解物中高表达的HspX蛋白。1，rBCG::261(BCG含空载体pMV261)；2，rBCG::X(BCG含重组质粒pMHspX)。G1为第一代培养物；G4为第四代培养物。

图3为免疫C57BL/6小鼠6周(短期)和24周(长期)后，ELISPOT分析分泌抗原特异的IFN-γ的脾细胞数量变化。^*P＜0.05vs.rBCG::261。

图4为分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠6周后，尾静脉感染10⁶CFU结核杆菌4周后，不同种小鼠肺脏的细菌负荷数(bacterial loads)。^*P＜0.05vs.rBCG::261。

图5为分别免疫BALB/c和C57BL/6小鼠6周后，尾静脉感染10⁶CFU结核杆菌4周后，不同种小鼠脾脏的细菌负荷数(bacterial loads)。^*P＜0.05vs.rBCG::261。

图6为免疫C57BL/6小鼠6周后，尾静脉感染10⁶CFU结核杆菌4周，10周和18周后，不同时间点小鼠肺脏的细菌负荷数(bacterial loads)的变化。rBCG::X vs.rBCG::261(3个时间点肺脏细菌数P＜0.05)。

图7为免疫C57BL/6小鼠6周后，尾静脉感染10⁶CFU结核杆菌4周，10周和18周后，不同时间点小鼠脾脏的细菌负荷数(bacterial loads)的变化。rBCG::X vs.rBCG::261(仅4周时间点脾脏P＜0.05)。

具体实施方式

实施例1

重组质粒pMHspX的构建和鉴定

分子生物学技术按照常规进行：0.8kb的HspX(acr，Rv2031c)基因，利用PCR技术从结核杆菌H37Rv的基因组中被扩增。扩增条件分别为：95℃5min，然后94℃45s，60℃45s，72℃50s，30个循环，最后72℃5min。PCR产物用AxyPrep PCR产物回收试剂盒(Axygen)回收。用BamHI和XbaI酶切0.8kb的acr基因后，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)回收。然后acr基因与同样酶切回收的pcDNA3.1(-)连接，后亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261，形成重组质粒pMHspX。进一步酶切鉴定和序列分析，证明构建的重组表达质粒完全正确。测序结果表明，克隆的acr(Rv2031c)基因与美国NIH GenBanK中分别公布的结核杆菌和牛型结核杆菌全基因组序列中对应的基因的编码序列完全一致。空载体pMV261和表达HspX的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭重组质粒质粒(pMHspX)的结构模式图见图1。

实施例2

重组卡介苗rBCG::X的建立

重组卡介苗rBCG::X的制备如下。首先制备卡介苗的感受态。取对数生长期的卡介苗菌株1ml，无菌接种于7H9液体培养基50ml中，37℃静止培养2周。将培养基冰浴2小时后，4℃离心收集细菌。加1ml 10％冰冷的甘油重悬，用粘磨器将细菌粘磨分散后。后用原培养体积的1/2，1/10和1/50的体积冰冷的甘油洗涤3次，最后用1ml冰冷的甘油重悬，分装为100μl每管，-80℃保存备用。其次是卡介苗的电转化。先将100μl的感受态卡介苗菌株加入到预冷的2mm Bio-Rad电穿孔杯中，将纯化的重组质粒pMHspX(小于5μl)加入后混匀，冰浴10min，去掉杯中气泡和杯外的水珠，用Bio-Rad电穿孔仪电穿。电穿参数为：电压2kv，25μF，1000Ω转化。时间常数介于15-25ms为优。转化完成后，立即将细菌转移入10ml7H9液体培养基中，37℃振荡过夜培养；次日离心收集细菌，接种于含25μg/ml卡那霉素的7H11固体平板。37℃培养4周后，挑取抗性生长克隆，接种于7H9液体培养基(含25μg/ml卡那霉素)37℃扩大培养4周后，分别离心收集细菌和上清，进行Western Blotting鉴定。抗Rv2031c鼠单克隆抗体来源于Abcam公司(ab64786，Abcam)。化学发光法进行显色。结果证实细菌裂解液中有分子量约16kDa的蛋白特异性表达，并且重组疫苗rBCG::X过表达HspX蛋白的量显著超过原始卡介苗。见图2。含有空质粒pMV261的重组卡介苗(rBCG::261)同上制备，并作为实验对照。

实施例3

重组卡介苗rBCG::X的细胞免疫特性

分别将10⁶CFU重组疫苗rBCG::X和rBCG::261免疫C57BL/6小鼠，以PBS作对照。免疫小鼠后6周和24周，无菌分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，用ELISPOT技术检测脾脏淋巴细胞抗原特异的IFN-γ细胞的分泌数。抗原包括PPD，Ag85B和HspX蛋白，抗原浓度为2μg/ml，细胞数为10⁶。见图3，重组疫苗rBCG::X诱导了短期和长期免疫小鼠脾脏淋巴细胞针对HspX蛋白的特异IFN-γ细胞的分泌数增加。

实施例4

重组卡介苗rBCG::X的短期和长期保护性

为了评价鼠系对免疫效果的影响，分别将10⁶CFU重组疫苗rBCG::X和rBCG::261免疫BALB/c和C57BL/6小鼠，以PBS作对照。免疫6周后，用10⁶CFU结核杆菌尾静脉感染免疫小鼠，4周后，不同种小鼠肺脏和脾脏的细菌负荷数(bacterial loads)见图4。重组疫苗rBCG::X在两种小鼠均产生了对脾脏和肺脏的强保护，其增强的保护不受小鼠品系的影响。

为了进一步评价重组卡介苗rBCG::X的短期和长期保护性，分别将10⁶CFU重组疫苗rBCG::X和rBCG::261免疫C57BL/6小鼠，以PBS作对照。免疫6周后，用10⁶CFU结核杆菌尾静脉感染免疫小鼠，4周，10周和18周后，小鼠肺脏和脾脏的细菌负荷数(bacterial loads)见图5。重组卡介苗rBCG::X对免疫的小鼠肺脏和脾脏的短期保护性同上，并提供了对肺脏的长期保护性。

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于，它是将编码HspX蛋白的基因序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的序列中构成的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，编码HspX蛋白的基因(又叫Rv2031c，Acr，Hsp16.3，alpha-crystallin)可来源于结核杆菌的不同菌株或卡介苗菌株，或通过人工合成。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，编码HspX蛋白的基因包含HspX自身启动子序列、编码序列和调节序列，可指导HspX蛋白的过表达。

4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所采用的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒可以是pSMT3，pMV206，pMV261，pMV306和pMV361中的一种，但不限于此。

5.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，它是将编码HspX蛋白的基因序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261中，取代pMV261中的热休克蛋白启动子Hsp60构成的重组质粒。

6.一种抗结核杆菌的重组卡介苗rBCG::X，其特征在于，将权利要求1至5中任一响所述的重组质粒转化入卡介苗，得到重组卡介苗rBCG::X。

7.一种重组卡介苗rBCG::X的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1).扩增或人工合成编码HspX蛋白的基因；

(2).将编码HspX蛋白的基因序列插入到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒的序列中，构建含编码HspX蛋白的基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒；

(3).将含有编码HspX蛋白基因的重组大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒转化入卡介苗中，即得到重组卡介苗rBCG::X。

8.一种如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒可采用但不局限于pSMT3，pMV206，pMV261，pMV306或pMV361。

9.一种如权利要求6所述的重组卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法中使用的卡介苗可采用现用于临床免疫接种的任何卡介苗菌株。

10.一种如权利要求6所述的重组卡介苗的制备方法，其特征在于，该方法中使用的卡介苗可采用卡介苗巴斯德株、卡介苗丹麦株、卡介苗哥本哈根株、卡介苗日本株、卡介苗Tice株或卡介苗俄罗斯株。

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