KR101624208B1

KR101624208B1 - Ｒｖ０３５１ 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물

Info

Publication number: KR101624208B1
Application number: KR1020140023165A
Authority: KR
Inventors: 신성재; 김종석; 김우식; 조상래; 한승정
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2016-05-25
Also published as: KR20150101630A

Abstract

본 발명은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Rv0351 단백질을 항원으로 이용할 경우, 고병원성 결핵균인 K 균주에 의한 감염을 유발시킨 동물모델에서 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 고병원성 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Rv0351 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발률이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Ｒｖ０３５１ 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 {Vaccine composition for tuberculosis containing Rv0351 protein}

본 발명은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

결핵은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacerium tuberculosis)에 유발되며, WHO에서 정한 3대 감염질환 중 하나로, 높은 발병률과 사망률을 나타내고 있다. 전 세계적으로 약 6천만명의 활동성 결핵 환자가 있으며 매년 5천만 내지는 1억여명이 결핵에 감염되는 것으로 추정되고, 적어도 매년 900만명의 결핵 신환자가 발생하며, 150만 명 이상이 결핵으로 사망한다고 알려졌다. 결핵 발병률(incidence rate)은 인구 10만명 당 146명, 결핵 사망률은 인구 10만명 당 49명으로 단일 감염병 중에서 가장 많은 사망 원인을 차지하고 있어, 세계적으로 심각한 보건 문제로 남아 있다. 최근에는 약제내성을 나타내는 난치결핵환자의 증가와 HIV 감염증가로 인해 발병 양상은 더욱 심각해지는 추세이다. 현재 HIV 감염자의 약 50%인 1,500만 여명이 결핵균에 동시에 감염되어 있으며, 결핵균이 HIV 증식을 촉진하여 다른 기회 감염균보다 기대수명(life expectancy)을 2분의 1로 단축시켜, HIV 감염자에게는 더욱 위협이 되고 있다. 또한 HIV 양성 결핵환자의 경우 결핵에 의한 사망률이 3배 이상 높고 치료 효과는 2배 정도 낮다고 보고되었다. 우리나라의 결핵균 감염률은 약 40%로 약 2천만명이 결핵균에 감염되었을 것으로 추정되고 있다. 이 가운데 약 10%인 200만 명은 일생에 한번은 결핵 환자가 될 것으로 예상된다. 우리나라에서 전염병으로 사망하는 사람의 60%가량이 결핵으로 그 심각성을 유추할 수 있으며, 이는 21세기 국가보건 및 복지에 심각한 문제로 대두되고 있다. 특히 우리나라는 고병원성인 베이징과(Beijing family)의 결핵균이 많다. 베이징 균주는 다른 결핵균과 달리 병원성과 전염력이 높으며 다제내성 결핵의 발생이나 재활성화 결핵의 발생 빈도가 매우 높다. 한국 내 결핵균의 유전자 지문을 통해 베이징과의 하나가 우점적으로 존재한 것으로 나타났으며, 이 유전자형은 총 결핵균의 18.4%를 차지하는 것으로 나타났다 (Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). 김 등(2001)은 베이징과에 속하며 한국에서 발생한 전염성이 강한 결핵균을 확인하였으며, 이 균을 K 균주(K strain)라 명명하였다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주는 마우스 감염 시 초기 선천면역을 극복할 수 있는 특이적 병인기전을 나타내며 이는 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주 감염량의 10배에 해당되는 성장속도를 나타내었다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염에 의한 마우스의 폐사는 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주 감염에 의한 마우스의 폐사보다 2배이상 빠르며, 감염 후 폐사 시기의 균수는 거의 동일한 것으로 보아 감염 후기에는 숙주의 면역반응에 의한 면역병리가 병인기전으로서 매우 중요할 것으로 생각되기에 선천면역보다는 예방백신 등을 통한 후천면역을 특이적으로 올려주는 것이 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주를 방어하는 핵심 요소일 것으로 판단되었다.

현재, 결핵은 주로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin)의 생균을 이용하여 예방하고 있다. 그러나, BCG의 안전성 및 효능은 지역과 나라, 인종에 따라 논란이 있으며 (Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 7:17-43), 미국과 같은 몇몇 국가에서는 BCG의 사용이 제한되고 있다. 또한, BCG는 HIV에 감염되거나 면역이 저하된 어린이들에게 사용하기에는 적당하지 못하다고 알려져 있다 이에 BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 예방 백신의 개발이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명자는 안전하면서도 국내에서 유행하고 있는 고병원성 결핵균을 효과적으로 예방할 수 있는 백신을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 결핵균의 Rv0351 단백질을 항원으로 이용한 백신 조성물이 우수한 결핵 예방 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 Rv0351 단백질을 항원으로 이용할 경우, 고병원성 결핵균인 K 균주에 의한 감염을 유발시킨 동물모델에서 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜줌으로써 고병원성 결핵을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 Rv0351 단백질은 결핵의 치료 시에도 사용 가능하여 재발률이 높은 고병원성 결핵의 재발 또는 재감염을 예방하고 치료 효율을 높이는 데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 클로닝을 통해 분리한 재조합 Rv0351 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 도이다.
도 2는 수지상 세포에 Rv0351 단백질을 처리한 후, 이를 결핵균 K 균주가 감염된 마우스로부터 적출한 비장 T 세포와 함께 배양하였을 때, effector/memory T 세포의 유도를 나타낸 도이다.
도 3 및 도 4는 수지상 세포에 Rv0351 단백질을 처리한 후, 이를 결핵균 K 균주가 감염된 마우스로부터 적출한 비장 T 세포와 함께 배양하였을 때, 세포 내 사이토카인 및 단백질의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 5는 Rv0351 단백질의 결핵 예방 백신으로서의 효능을 검증하기 위한 실험 디자인을 나타낸 도이다.
도 6은 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스의 비장 세포와 폐 세포에 재조합 Rv0351 단백질을 농도별로 재처리 한 후, IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 7은 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스의 비장 세포와 폐 세포에 재조합 Rv0351 단백질을 농도별로 재처리 한 후, 기억 T 세포에서의 IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 8은 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스에 결핵균 감염 후, 폐에 모인 호중구, CD4 T 세포 및 CD8 T 세포의 수치를 나타낸 도이다.
도 9는 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스에 결핵균 감염 후, 폐에 모인 CD4 T 세포와 CD8 T 세포의 effector/memory T 세포의 비율을 나타낸 도이다.
도 10은 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스에 결핵균 감염 후, 기억 T 세포에서 IFN-γ의 생성능을 나타낸 도이다.
도 11은 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스의 비장 세포와 폐 세포에 재조합 Rv0351 단백질을 재처리한 후, 사이토카인의 발현을 나타낸 도이다.
도 12는 마우스에 결핵균을 호흡기로 감염 시키고 6주 후, 폐 조직에서 결핵균의 세균 수를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 마우스에 결핵균을 호흡기로 감염 시키고 6주 후, 폐 조직의 조직병리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 Rv0351(GRPE protein, HSP-70 cofactor, NP_214865.1)은 235개의 아미노산 서열로 이루어진 24-kDa 세포질 항원으로, ER 스트레스(Endoplasmic Reticulum Stress)에 의한 열 충격 단백질(heat shock protein)의 발현을 조절하는 보조인자(cofactor)의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 Rv0351 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시될 수 있으며, 상기 단백질의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 단백질의 변이체란 Rv0351 단백질의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 단편에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

상기 Rv0351 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화될 수 있으며, 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명의 Rv0351 단백질은 결핵균으로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

본 발명의 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 결핵은 바람직하게는 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주에 의해 발병되는 것이다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 병원성 유기체의 약독화된 균주를 개체에 접종하여 병원체에 대한 면역 반응을 유도한 것이 아니라, 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방한 것을 특징으로 하기 때문에, 기존에 알려진 BCG 면역법에 비하여 보다 안전한 면역법임을 특징으로 한다.

본 발명의 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 애쥬번트와 함께 투여할 수 있다. 애쥬번트는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 애쥬번트는 임의의 다양한 애쥬번트를 포함하며, 전형적인 애쥬번트로는 프로인트 애쥬번트(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 포폴리싸카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A등이 알려져 있다. 상기 애쥬번트는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 투여한다. 상기 면역학적 유효량이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여가능 하다.

본 발명의 약학적 조성물은 Rv0351 단백질과 함께 결핵의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 결핵의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 Rv0351 단백질의 준비

결핵균 게놈 DNA로부터 Rv0351를 분리하여 클로닝하였다. 먼저, 정방향 프라이머(5'-GTGACGGACGGAAATCAAAAGC-3') 및 역방향 프라이머(5'-ACTGCCCGACGGTTCTGATTC-3')를 이용하여 PCR을 통해 결핵균의 Rv0351 부위를 증폭시켰다. 상기 PCR 산물을 NdeI과 HindIII 제한 효소로 절단하고, 발현 벡터인 pET-22b(+)벡터(Novagen, Madison, WI)에 삽입하였다. 상기 Rv0351 유전자가 삽입된 pET-22b(+) 벡터를 이용하여 E. coli BL21을 형질전환 시킨 후, 이를 600 nm에서의 흡광도(OD)가 0.4 내지 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양한 후에, 1 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하고 8시간 동안 배양하였다. 발현된 단백질은 니켈-니트릴로트라이아세트산(Ni-NTA, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 아가로즈를 이용하여 제조사의 방법에 준하여 정제하였다. 최종적으로 정제한 재조합 Rv0351 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 2. Rv0351 단백질의 결핵균에 대한 방어 면역 증진 효과 검증

2-1. 수지상 세포의 분리

마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였다. 채취한 골수를 세척한 후 염화암모늄을 이용하여 적혈구를 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰 플레이트에 분주한 뒤, RPMI 1640 (10% FBS (Fetal bovine serum, 송아지 혈청), 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 50 μM 머캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 20 ng/ml GM-CSF, 20 ng/ml IL-4)배지 상에서 8 일 동안 배양하였다. 이때 GM-CSF 및 IL-4은 수지상 세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용하였다.

2-2. Rv0351 단백질의 결핵균에 대한 방어 면역 증진 효과 검증

상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 TLR2^-/-, TLR4^-/- 및 WT 마우스로부터 수지상 세포를 분리하였다. 분리한 각 수지상 세포(2 x 10⁵cell/well)에 5 μg/ml 농도의 Rv0351 단백질을 24시간 처리한 후 수지상 세포를 회수하였다. 대조군에는 100 ng/ml 농도의 LPS를 처리하였다. 회수된 수지상 세포를 결핵균 감염 마우스의 비장으로부터 분리된 T 세포(2 x 10⁶cell/well)와 함께 72시간 동안 배양하였다. 모든 세포를 회수한 후 PBS로 2회 세척하고, 원심 분리하였다. 그 다음, 상기 세포에 항-CD4, 항-CD8, 항-CD44 및 항-CD62L 등의 항체를 처리하고 30분간 상온에 방치 한 뒤, PBS로 수회 세척한 후 유세포 분석기(FACSverse)를 통해 effector/memory T 세포의 증감을 분석하였다. 또한, 항-IFN-γ, 항-IL-2 및 항-IL-4 등의 항체로 염색하여 세포 내 사이토카인(IFN-γ, IL-2, IL-4)의 분비량을 유세포 분석기로 분석하였으며, Th1과 Th2 세포의 전사조절인자인 T-bet와 GATA-3의 단백질 양을 웨스턴 블랏 방법을 통해 측정하였다. 그 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 처리한 경우 대조군(LPS)에 비해 effector/memory T 세포의 증식 정도가 높은 것을 확인하였으며, 이를 통해 Rv0351 단백질은 수지상 세포를 TLR4 의존적인 자극을 통하여 effector/memory T 세포 증식에 의한 면역 활성 능력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 처리한 경우 대조군(LPS)에 비해 IFN-γ, IL-2 및 T-bet이 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Rv0351 단백질은 Th1형 세포로 분화되도록 유도할 수 있으며, 결핵균에 대한 방어 면역을 증가 시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 3. Rv0351 단백질의 결핵 예방 백신으로서의 효능 검증 실험

3-1. 실험 디자인

상기 실시예 1에서 분리한 Rv0351 단백질이 결핵 예방 백신으로 이용될 수 있는지 그 효능을 검증하기 위하여, 동물 실험을 수행하였다. 그 구체적인 실험 디자인을 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(MPL-DDA, Ajuvant only)과 실험군(MPL-DDA+Rv0351)을 결핵균 감염 10주 전에 3회 피하주사로 각각 예방접종 한 뒤, 200개의 결핵균(k-strain)을 공기감염 장치를 통하여 감염시켰다. 감염 6주 후 각 마우스로부터 비장 세포와 폐 세포를 분리하였다.

3-2. IFN-γ 생성능 분석

상기 실시예 3-1에서 분리한 비장 세포와 폐 세포에 재조합 Rv0351 단백질을 농도별로 재처리한 후, IFN-γ 생성능을 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방 접종한 마우스의 비장 세포와 폐 세포에서 Rv0351 단백질의 농도에 의존적으로 IFN-γ의 생성양이 증가함을 확인하였다.

또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방 접종한 마우스의 폐와 비장 세포의 CD4 또는 CD8 기억 T 세포에서도 Rv0351 단백질의 농도에 의존적으로 IFN-γ의 생성양이 증가함을 확인하였다.

3-3. 결핵균 감염 후 Rv0351 단백질에 의해 폐에서 유도되는 면역세포 분석

결핵균 감염 6주 후, 폐에 모이는 면역세포를 분석하였다. 먼저, 모아진 세포를 PBS로 2회 세척한 후 원심 분리하였다. 그 다음, 항-Gr-1, 항-CD3, 항-CD4 및 항-CD8 등의 항체를 처리하고 30분간 상온에 방치하였다. 이를 PBS로 수회 세척한 후 유세포 분석기를 이용하여 면역세포를 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방 접종한 마우스의 폐에서는 Gr-1+ 호중구(neutrophil) 및 CD3+/CD4+ T 세포의 수가 대조군 보다 증가함을 확인하였다.

또한, 폐에서 모이는 T 세포가 항원 특이적 반응을 보이는지 확인하기 위하여 항-CD44, 항-CD62L, 항-CD4, 항-CD8 및 항-IFN-γ 등의 항체를 처리하고 동일한 방식으로 분석하였다. 그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다.

도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방 접종한 마우스에서 대조군보다 effector/memory CD4 T 세포가 특이적으로 증가하는 것을 확인하였으며, Rv0351 단백질 투여에 의해 모인 기억 T 세포에서 IFN-γ의 생성양이 증가하는 것을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 바탕으로, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방접종 한 마우스에서 항원 특이적인 면역반응이 활성화 됨을 확인하였다.

3-4. 결핵균 감염 후 Rv0351 단백질에 의해 폐 세포 및 비장 세포에서 유도되는 사이토카인 분석

결핵균 감염 6주 후, 마우스로부터 폐 세포 및 비장 세포를 분리한 후 생체 외(ex vivo)에서 재조합 Rv0351 단백질을 재처리하고, 항원 특이적 사이토카인(IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-5, IL-4, IL-17A, TGF-β)의 발현을 ELISA를 통해 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 예방 접종한 마우스의 폐 세포 및 비장 세포에서 Th1(IFN-γ, TNF-α, IL-2)과 Th17(IL-17A) 면역반응에서 분비되는 사이토카인이 증가하였으며, Th2 (IL-5, IL-4) 면역반응에서 분비되는 사이토카인은 유의미한 변화를 보이지 않음을 확인하였다.

실시예 4. Rv0351 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신의 효능 평가

4-1. 실험 동물

생후 5 내지 6주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6 마우스(Japan SLC, Inc. Shijuoka, Japan)를 연세대학교 의학 연구 센터 내의 BL-3 바이오해저드 애닐멀 룸의 제한 공간에서 사육하였다. 마우스에게는 멸균된 판매용 마우스 먹이와 물을 임의적으로 제공하였다.

4-2. 결핵균 및 BCG 배양

한국형 고병원성 결핵균인 K-strain(M. tuberculosis K-strain)과 M. bovis BCG(Pastuer strain)를 7H9-OADC broth에서 15일간 배양하였다. 배양된 균주들을 수집한 후, 6 mm 글래스 비드로 부드럽게 볼텍싱하면서 파쇄하였다. 세포 응집물이 가라앉은 다음, 상청액을 수거하고 각각 나누어 -70℃에 보관하였다. 이를 해동한 후, 살아있는 박테리아를 Middlebrook 7H11 아가(Difco, Detroit, MI, USA)에서 단계적 희석 평판 배양하고 카운팅하였다.

마우스에게 결핵균을 접종하기 위해, 상기 박테리아 현탁액을 음파조(sonic bath)에서 가볍게 음파처리하고, pH7.2의 PBS(phosphate buffered saline)로 희석시켜 원하는 수의 박테리아를 수득하였다.

4-3. 면역화

각 마우스를 3주 간격으로 애쥬번트와 함께 주사당 20g의 재조합 Rv0351 단백질을 포함하는 실험용 백신을 등에 피하주사하여 면역화시켰다. 마우스 당, 애쥬번트는 25 μg의 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A, MPL, Sigma Adjuvant System,Sigma,St.Louis,MO,USA)와 250 μg의 디메틸디옥타테킬암모늄(dimethyldioctadecylammonium, DDA;Sigma,St.Louis,MO,USA)을 사용하였다. MPL은 제조사의 지침서에 따라서 멸균 PBS에 녹인 후, 항원과 함께 희석하고, 최종 부피가 주사 당 200 μl가 되게 하였다. 처음 면역화 시킬 때, BCG Pasteur 1173P2 (2 10⁵CFU/mouse)균주를 피하로 투여하였고 결핵의 방어 능력을 평가하기 위한 양성대조군으로 사용하였다. 음성대조군은 200 μl의 멸균 PBS 또는 항원이 포함되어 있지 않는 200 μl의 애쥬번트를 피하 주사하였다.

4-4. 결핵균의 공기감염

상기 실시예 4-3에서 면역화시킨 마우스에 병원성이 높은 한국형 결핵균 K-strain을 Glas-Col inhalation device (Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200-250개의 결핵균이 들어가도록 흡입시켜 감염시켰다.

4-5. 폐 조직 내 박테리아 수 분석

결핵균으로 감염시키고 6주 후, 각 그룹의 마우스에서 폐 조직을 적출하고 박테리아의 수를 확인하였으며, 그 결과를 대조군과 비교 분석하였다. 보다 구체적으로, 폐 조직 내 살아있는 박테리아 수는 Middlebrook 7H11 아가상에서 전체 기관 균질현탁액을 순차적으로 희석하여 플레이팅하고, 이를 37에서 3-4주간 배양한 후, 콜로니를 카운팅하였다. 그 결과는 전체 폐 조직 당 평균 log10CFU±표준편차로 나타내었으며, 이를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 Rv0351 단백질을 항원으로 이용하여 면역화 시킨 군(Rv0351)은 양성대조군인 BCG 면역화 군(BCG)과 유사하게 박테리아의 수가 현저하게 감소됨을 확인하였다(p<0.0001). 따라서, 본 발명의 Rv0351 단백질을 포함하고 있는 서브유닛 백신은 고병원성 결핵균 K-strain에 의해서 유발되는 폐 결핵에 탁월한 예방효과를 나타냄을 확인하였다.

4-5. 조직병리학적 분석

결핵균으로 감염시키고 6주 후, 각 그룹의 마우스에서 폐 조직을 적출하여 이를 10% neutral-buffered formalin에 보존시킨 후, 파라핀에 고정시켰다. 고정된 조직을 4-5 μm의 두께로 절편을 만들고 H&E(hematoxylin and eosin)로 염색하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 결핵균만을 감염시킨 군(Infection control)과 애쥬번트 만을 투여한 군(Adjuvant only)은 많은 면역세포의 유입과 심각한 염증을 나타낸 반면, 본 발명의 Rv0351 단백질을 항원으로 이용하여 면역화 시킨 군(Rv0351 vaccination)은 면역세포의 유입이 감소하였고 염증 또한 심각하지 않게 나타남을 확인하였다.

이하 본 발명의 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

Rv0351 단백질 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

Rv0351 단백질 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

Rv0351 단백질 100mg

옥수수전분 100mg

유당 100mg

스테아린산 마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Vaccine composition for tuberculosis containing Rv0351 protein <130> 7 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 235 <212> PRT <213> Rv0351 <400> 1 Met Thr Asp Gly Asn Gln Lys Pro Asp Gly Asn Ser Gly Glu Gln Val 1 5 10 15 Thr Val Thr Asp Lys Arg Arg Ile Asp Pro Glu Thr Gly Glu Val Arg 20 25 30 His Val Pro Pro Gly Asp Met Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ala Asp Ala 35 40 45 Ala His Thr Glu Asp Lys Val Ala Glu Leu Thr Ala Asp Leu Gln Arg 50 55 60 Val Gln Ala Asp Phe Ala Asn Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Arg Asp Gln 65 70 75 80 Gln Ala Ala Ala Asp Arg Ala Lys Ala Ser Val Val Ser Gln Leu Leu 85 90 95 Gly Val Leu Asp Asp Leu Glu Arg Ala Arg Lys His Gly Asp Leu Glu 100 105 110 Ser Gly Pro Leu Lys Ser Val Ala Asp Lys Leu Asp Ser Ala Leu Thr 115 120 125 Gly Leu Gly Leu Val Ala Phe Gly Ala Glu Gly Glu Asp Phe Asp Pro 130 135 140 Val Leu His Glu Ala Val Gln His Glu Gly Asp Gly Gly Gln Gly Ser 145 150 155 160 Lys Pro Val Ile Gly Thr Val Met Arg Gln Gly Tyr Gln Leu Gly Glu 165 170 175 Gln Val Leu Arg His Ala Leu Val Gly Val Val Asp Thr Val Val Val 180 185 190 Asp Ala Ala Glu Leu Glu Ser Val Asp Asp Gly Thr Ala Val Ala Asp 195 200 205 Thr Ala Glu Asn Asp Gln Ala Asp Gln Gly Asn Ser Ala Asp Thr Ser 210 215 220 Gly Glu Gln Ala Glu Ser Glu Pro Ser Gly Ser 225 230 235 <210> 2 <211> 708 <212> DNA <213> Rv0351 <400> 2 gtgacggacg gaaatcaaaa gccggatggc aattcgggcg aacaggtaac cgtcactgac 60 aagcggcgga tcgatcccga gacgggtgaa gtgcggcacg tccctcccgg cgacatgccg 120 ggagggacgg ctgcggccga tgcggcgcac accgaagaca aggtcgccga gctgaccgcc 180 gatctgcaac gcgtgcaggc cgacttcgcc aactaccgta agcgggcgtt gcgcgatcag 240 caggcggccg ctgaccgagc caaggccagc gttgtcagcc aattgctggg tgtactggac 300 gatctcgagc gggcgcgcaa gcacggcgat ttggagtcgg gtccactgaa gtcggtcgcc 360 gacaagctag acagcgcgtt gaccgggctg ggtctggtgg cgttcggtgc cgagggcgag 420 gatttcgacc ccgtgctgca cgaagcggtg caacacgagg gcgacggcgg gcaggggtcc 480 aagccggtaa tcggcaccgt catgcggcag ggctaccaac tgggtgagca ggtgctgcgg 540 cacgccttgg tcggcgtcgt cgacacggtg gtcgtcgacg cggccgaact ggagtcagtc 600 gacgacggca ctgcggtcgc agataccgcc gaaaacgatc aagctgacca gggcaatagc 660 gccgacacct cgggcgaaca ggcagaatca gaaccgtcgg gcagttaa 708

Claims

Rv0351 단백질을 유효성분으로 포함하는, 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 감염에 의해 발병된 결핵 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Rv0351 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 Rv0351 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 암호화되는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 및 척추 결핵으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
Rv0351 단백질을 유효성분으로 포함하는, 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)의 감염에 의해 발병된 결핵의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.