KR101749993B1 - 재조합 백시니아 바이러스주 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 - Google Patents

재조합 백시니아 바이러스주 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본원은 마이코박테리움 투베쿨로시스 H37Rv의 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA의 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주, 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물, 및 상기 재조합 백시니아 바이러스주의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 백시니아 바이러스주 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물{RECOMVINANT VACCINIA VIRUS STRAIN AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING THE SAME}
본원은 마이코박테리움 투베쿨로시스 H37Rv의 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주, 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물, 및 상기 재조합 백시니아 바이러스주의 제조 방법에 관한 것이다.
결핵은 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의해 발병되는 질병으로서, 에이즈 및 말라리아와 함께 세계 3대 주요 감염성 질병으로 알려져 있다. 2016년 WHO의 결핵 분석보고서에 의하면, 2015년도에 전 세계에서 1040만명의 결핵환자가 발생하였고, 이 중 140만명이 사망한 것으로 추정되었다. 최근에는 에이즈환자의 50%가 결핵 중복감염으로 보고된 바 있으며, 다제내성균에 의한 난치결핵환자 증가로 인해 결핵에 의한 사망률이 감소하지 않고 있는 실정이다. 세계적으로 인구 10만명당 146명이 결핵에 감염되며 결핵에 의한 사망률은 인구 10만명당 49명으로 심각한 문제로 여겨진다. 우리 나라의 경우 결핵 발생률 및 사망률이 OECD 가입국 중 1위이며, 2000년 이후 매년 3만 5천여 명의 결핵환자가 지속적으로 발생하였다. 현재 우리나라의 2015년 결핵 신환자는 32,181명 (10만 명당 63.2명)이며 2015년 기준으로 결핵으로 인한 연간 사망자수는 2,305명으로 여전히 경제협력개발기구 (OECD) 국가 중 결핵 발생률과 사망률이 가장 높다. 이는 우리나라에서 전염병으로 사망하는 사람의 60%가 결핵에 의한 것을 의미하는 것이므로, 국가 보건 측면에서 그 심각성이 크게 대두되고 있다.
결핵 감염을 예방하기 위한 방법은 BCG 백신을 접종하는 것 이외의 효과적인 다른 백신은 아직까지 개발되지 않고 있다. 그러나, 유일한 결핵 백신인 BCG 백신은 생백신 (live vaccine)이어서 면역결핍환자 등에서 사망에까지 이르는 부작용을 나타낼 수 있으며, 임파선병변도 종종 일으킬 수 있다. 또한, BCG의 효과는 영유아 시기에는 효과적이라고 알려져 있으나 청소년기 이후에는 백신의 효과가 거의 없다는 것이 다양한 연구를 통해 밝혀진 바 있다. 더욱이, 영유아에 대한 백신 효과 역시 개인차가 많이 나는 것으로 알려져 있다.
이에 결핵 예방을 위한 효과적인 백신 후보주 개발의 필요성이 높고, 특히 영유아기 이후 감염에 대한 효과적인 백신 개발이 더욱 요구되는 실정이나, 우리나라에서 그러한 백신 후보주 개발은 아직 미흡한 상황이다.
대한민국 등록특허 제 10-1623498 호
본원은, 백시니아 바이러스주에 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA의 유전자를 도입함으로써 BCG에 비해 우수한 결핵균 예방 및 방어효과를 가지는 백신 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA (tissue plasminogen activator)의 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 제공할 수 있다.
본원의 제 2 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 제 3 측면은, Ag85B 유전자 및 tPA 유전자를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스주 제조 방법을 제공할 수 있다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본원발명에 따르면, 약독화된 백시니아 바이러스주에 항원 유전자로서 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드 유전자로서 tPA의 유전자를 도입함으로써, BCG에 비해 우수한 결핵균 예방 및 방어효과를 가지는 동시에 안전한, 결핵 예방용 백신으로 사용하기 위한 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 제공할 수 있다.
도 1은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스 제조 과정의 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 최적화된 Ag85B 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 체액성 면역 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 마우스 모델에서의 면역원성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스의 마우스 모델에서의 면역원성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스로 면역화된 마우스 모델의 폐 및 비장에서의 결핵균 감염에 대한 방어효능을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스로 면역화된 마우스 모델의 결핵균 감염에 의한 육안적 및 조직병리학적 소견을 보여주는 이미지이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 백시니아 바이러스로 면역화된 마우스 모델에 결핵균 감염시의 염증 정도를 나타낸 그래프이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.
이하, 본원의 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주, 이를 포함하는 백신 조성물 및 상기 백시니아 바이러스주의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본원의 제 1 측면은, 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 Ag85B 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA (tissue plasminogen activator)의 유전자를 포함하는, 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 제공할 수 있다.
백시니아 바이러스는 피막 DNA 바이러스로, 약 200 개의 독립 유전자를 암호화하는 약 120~180 kb의 이중 가닥 선형 DNA 유전체를 가진다. 각각의 유전자는 짧은 5'-프로모터, 인트론 없이 단백질을 암호화하는 단일 ORF 및 짧은 3'-폴리아데닐레이션 자리로 이루어진다. 이 단백질들은 IE(intermediate-early), E(early) 또는 L(late)의 바이러스 감염 단계에서 프로모터에 의존적으로 발현된다. 초기 프로모터 및 후기 프로모터의 서열은 기능 실험을 통해 잘 밝혀져 있다.
백시니아 바이러스는 18 세기 에드워드 제너가 최초로 두창(smallpox)에 대한 예방백신으로 사용한 이후, 백신이라는 말의 어원을 제공할 정도로 면역조절물질의 대명사가 되었다. 초기에 사용된 백시니아 바이러스는 면역효능이 우수한 백신으로 두창 박멸에 크게 기여하였지만, 백신을 맞은 사람이 전신감염이나 진행성 감염등의 심각한 부작용을 나타내는 경우가 가끔 있었다. 이에 부작용을 줄이기 위해 개발된 것이 병독성이 약화된 약독화 백시니아 바이러스이다. 약독화는 진핵 세포에서 수백 회 이상 계대함으로써 수행될 수 있다.
Ag85B (fbpB, Rv1886) 유전자는 M. tuberculosis 의 항원 유전자 중 하나이다. Ag85B 항원은 마이코박테리움의 특징인 외각의 미콜산(mycolic acid)을 포함하는, 세포벽을 구성하는데 필수적인 역할을 하는 Ag85 복합체 중 하나로서, CD4+/CD8+ T-세포 및 IFN-γ와 같은 세포 매개성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 Ag85B 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 서열번호 1의 변형된 유전자 서열은 NCBI genbank blast 조사 결과 현재 알려져 있는 마이코박테리움 투베쿨로시스 H37Rv 균주의 유전자 서열과 약 76%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 변형은 인간 코돈 최적화에 의한 것일 수 있으며, 진핵 숙주 세포에서 발현을 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 tPA 유전자는 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 서열번호 2는 NCBI genbank blast 조사 결과 알려져 있는 pENTR4-Pfs25-SpyTag의 tPA secretion leader 유전자 서열과 약 91% 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 tPA 유전자는 항원 유전자를 단백질로 발현시킨 후 세포 외 분비를 유도하기 위해서 유전자 상류에 삽입되는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이다. 상기 신호 서열을 삽입함으로써 항원 유전자의 발현 및 보호 효과를 유도할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 백시니아 바이러스주는 수탁번호 KCTC 18527P 로 기탁된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 2 측면에 따르면, 본원의 제 1 측면에 따른 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및/또는 액체 폴리에틸렌글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 면역보조제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것일 수 있으며, 알하이드로겔(alhydrogel)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 면역보조제는 사람 또는 동물에게 투여하는 경우 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 것을 의미하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물에 포함된 재조합 백시니아 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 백신 조성물에 포함된 재조합 백시니아 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하여 세포 밖으로 분비하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원 단백질은 세포 내에서 생산된 후 시그널 펩타이드에 의하여 세포 바깥으로 이송되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 결핵균 방어항원 단백질에 의하여 생체의 면역반응이 유도되는 것일 수 있으며, 상기 면역반응에 의하여 생체 내에 결핵균에 대한 항체가 생성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 인간을 포함하는 동물의 생체 내에 주입되어 결핵에 대해 면역을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명의 백신 조성물은 투여를 위하여 약학적으로 수용할 수 있는 담체 및/또는 면역 보조제를 포함하여 인간 또는 수의학적 용도로 제형화 할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 경구 투여 시, 예를 들어 캡슐제 또는 정제; 분말제 또는 과립제; 용제(solution), 시럽 또는 현탁제(suspension)(수성 또는 비수성 액상물 중; 식용 발포제(edible foam) 또는 휩 제형(whip formulation); 또는 유탁액제(emulsion)) 같은 별개의 단위로서 상기 백신 조성물을 제시할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어 비경구(parental) 투여 시, 상기 백신 조성물은 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 주사용 용제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액을 만들시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 투여는 근육주사, 피하주사, 또는 복강주사를 통한 투여인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원발명의 백신 조성물은 피투여자의 건강 상태, 체중, 성별 및 투여 목적 등에 따라 적절하게 용량을 설정하여 투여될 수 있다.
본원의 제 3 측면에 따르면, Ag85B 유전자 및 tPA 유전자를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는, 재조합 백시니아 바이러스주 제조 방법을 제공할 수 있다.
본원 명세서 전체에서, "벡터"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자를 말하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 핵산이 위치하는 것을 의미할 수 있다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체 (예: YAC)가 포함될 수 있다.
결핵균 방어항원 유전자인 Ag85B 유전자를 상기 전달 벡터에 삽입하는 것은, 당업계에 알려진 모든 유전자 재조합 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 상기 전달 벡터를 상기 백시니아 바이러스에 삽입하는 것은 당업계에 알려진 모든 형질감염 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 전달 벡터는 pVVT 벡터를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 전달 벡터는 pVVT-GFP, 예를 들어, pVVT1-GFP-C7L, pVVT1-GFP-K1L, 및/또는 pVVT1-GFP-C7L-K1L를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 전달 벡터를 백시니아 바이러스에 삽입한 후에, 제조된 재조합 백시니아 바이러스에 의한 Ag85B 항원의 생성을 확인하는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
예를 들어, 상기 재조합 백시니아 바이러스에 의한 결핵균 방어항원 (Ag85B 항원) 단백질의 생성을 확인하는 것은 당업계에 알려진 모든 단백질 검출 및/또는 검정 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 면역학적 방법에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치(sandwich)" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광성 면역검정, 또는 단백질 A 면역검정 등에 의하여 결핵균 방어항원 단백질의 생성을 확인할 수 있으며, 또는 상기 결핵균 방어항원에 연결된 형광 단백질을 이용하여 형광 검출을 이용하여 단백질의 생성을 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 Ag85B 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 tPA 유전자는 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 재조합바이러스 제작
1-1. 전달 벡터 pVVT1 - C7L -tPA- Ag85B의 제작
M. tuberculosis H37Rv 균주의 Ag85B 유전자 (Rv1886c, fbpB) 서열을 이용하여 세포 내에서 발현율을 높이기 위해 서열 변형(sequence modification)을 진행하였다. M. tuberculosis Rv1886c 유전자 서열을 이용하여 인간화 코돈 최적화(humanized codon optimization)를 진행 후, 유전자 상류에 세포 내 분비 신호 펩타이드인 tPA (tissue plasmodium activator) 서열과 함께 유전자 합성을 진행하였다. 최적화된 Ag85B 유전자 서열 및 pPA 유전자 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 나타나 있으며, Ag85B 유전자 서열의 최적화는 도 2에 나타나 있다. 합성된 유전자는 Sfi1 제한 효소를 이용하여 절단 후 백시니아 바이러스 전달벡터인 pVVT1-GFP-C7L 플라스미드에 결찰(ligation)하여 pVVT1-C7L-tPA-Ag85B를 제작하고, 이를 E. coli DH5α에 형질전환(transformation)하였다. 제작된 pVVT1-C7L-tPA-Ag85B 벡터의 구조는 도 1에 나타나 있다. 클로닝된 플라스미드는 VVTK-F와 VVTK-R 프라이머를 사용한 유전자 서열분석을 통해 삽입된 유전자의 염기서열을 확인하였으며, 엠피실린이 포함한 배지에 대량 배양하고 미디프렙 키트(midiprep kit)를 이용하여 대량 분리하였다. 시퀀싱 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타나 있다.
프라이머 서열
VVTK-F 5`-TTTGAAGCATTGGAAGCAACT-3` (서열번호 3)
VVTK-R 5`-ACGTTGAAATGTCCCATCGACT-3` (서열번호 4)
1-2. 재조합바이러스 제작을 위한 형질감염( transfection )
백시니아 바이러스 균주인 KVAC103과 클로닝 된 전달벡터를 베로 세포(vero cell)에 공-형질감염(co-transfection)하였다. 베로 세포는 형질감염 하루 전 12-웰 플레이트에 OPTI-MEM (2% FBS) 배지를 사용하여 1x105 세포/웰로 시딩(seeding) 하였다. 모 바이러스인 KVAC103 균주를 0.02 M.O.I 비율로 2시간 동안 감염시킨 후 리포펙틴(lipofectin) 2000과 클로닝 된 전달벡터 1.5 ㎍ 혼합액을 미리 감염시킨 베로 세포에 뿌려주고, 4시간동안 감염시킨 후, 5% CO2 배양기에서 3 내지 4 일 동안 배양하면서 CPE (cytopathic effect)를 확인하였다. 5% FBS DMEM 배지에서 배양한 베로 세포를 이용하여 재조합 바이러스를 2 내지 3회 계대배양한 후, 2회 플라크 분리(plaque isolation) 실험을 진행하여 CPE가 확인 된 플라크는 전달벡터의 프라이머를 이용해 PCR을 수행하여 재조합바이러스 제작 성공 여부를 확인하였다. 제작된 재조합바이러스는 웨스턴 블롯 실험 결과 항원 유전자의 단백질 발현이 확인되었다. 도 1은 재조합 백시니아 바이러스 제조 과정의 개략도이다.
1-3. 재조합바이러스 배양 및 농축
베로 세포(Vero cell, SFM, OptiMEM)에 제작된 재조합바이러스를 감염 시킨 후, 2 내지 3 일 동안 CPE를 확인하였다. CPE가 확인되면 동결 및 해동을 2 내지 3 회 반복하여 세포를 깨고 배지와 세포를 회수하였다. 4000 rpm으로 30분간 원심분리하여 세포잔존물이 제거된 상층액만을 회수한 후, 포어 사이즈 100,000NMWL의 아미콘 필터(amicon filter)을 이용하여 재조합 바이러스를 농축하였다.
2. 면역원성 평가
2-1. 마우스 면역화
생체 내(in vivo) 효능을 분석하기 위하여 백신후보물질을 이용하여 마우스를 면역화 하였다. 5~7 주령의 자성 C57BL/6N 마우스를 사용하여, 제조된 결핵후보물질들을 마우스에 투여하였다. BCG 접종은 BCG Pasteur 균주를 2x105 CFU로 일회 피하 접종하였으며 제조된 결핵 후보주 바이러스는 1x107 PFU로 3주 간격으로 2회 접종하였다. 최종 접종일로부터 4주 후에 마우스로부터 혈액, 비장 및 폐 조직을 채취하고자 하였다. 마우스를 케타민과 럼푼으로 마취한 후 심장채혈하고, 혈액을 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심 분리하여 혈청을 분리하여 -70℃에 보관하였다.
2-2. 체액성 면역 분석 (혈중 IgG 역가 분석)
제조된 결핵후보물질들의 체액성 면역반응을 분석하기 위하여 마우스의 항원 특이적 혈중 IgG 및 IgG 이소타입 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. 백신 후보 물질을 카보네이트 버퍼 (pH 9.6)에 현탁 한 후 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 가하여 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 다음날 1% 우태아혈청 알부민 (BSA)을 함유한 PBS 용액 300 ㎕을 가하여 블로킹(blocking) 한 다음, 0.5% 트윈(tween) 20을 함유한 PBS (PBST)로 세척하였다. 블로킹 용액으로 2배씩 계열 희석한 마우스 혈청 100 ㎕을 가하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시킨 다음 PBST로 웰을 세척하였다. 홀스래디쉬 페록시데이즈-컨쥬게이트 고트 항-마우스 (IgG), IgG1 및 IgG2a 이소타입 항체와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 TMB 용액을 가하여 발색한 후 0.1 N의 황산용액 50 ㎕을 가하여 반응을 중단시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 3). 그 결과, 대조군으로 사용한 BCG 백신에 비하여 항체 반응이 2 배 이상 높은 것이 관찰되었다.
2-3. 마우스모델의 비장세포 및 폐세포에서 면역원성의 평가
결핵백신 후보물질의 면역분석을 위하여 비장세포 및 폐세포를 분리하고 비장세포 및 폐세포들 각각에서 IFN-γ 분비 활성능과 IFN-γ 분비 활성을 가진 세포수를 각각 ELISA와 ELISpot으로 분석하였다 (도 4a 및 4b). 그 결과, 대조군인 BCG 백신을 사용한 경우에 비해 비장에서는 약 2.5 배, 그리고 폐에서는 약 2 배의 IFN-γ 분비능 증가가 관찰되었다. 또한, 분리된 면역세포 (CD4 및 CD8 T-세포)를 유세포 분석기를 이용하여 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α 등의 다기능 T-세포 분포를 조사하였다 (도 5a 및 5b). 그 결과, CD4 및 CD8 T-세포에서 3 종의 사이토카인을 모두 분비하는 다기능 T-세포 형성이 확인되었다.
2-4. 결핵균 감염방어능 평가
양성 대조군인 BCG 백신 접종군으로 2x105 CFU의 BCG Pasteur를 피하접종 하였다. 본원발명의 백신의 경우 접종 3 주 후 동일한 양의 바이러스를 피하접종 하여 부스팅 시켰다. 부스팅 후 5 주 뒤 M. tuberculosis H37Rv 균주를 공기 감염장치를 이용하여 공격접종 시켰다. 공격접종 후, 감염된 균수를 측정하기 위하여 최초 용량 시험(initial dose test)을 수행하였다. 공기감염이 끝나고 1 시간 후, 마우스를 부검하여 폐에 존재하는 결핵균 수를 측정한 결과, 약 150 CFU의 결핵균이 감염되었음을 확인하였다. 감염 후 10 주 째 되는 시점에 모든 마우스를 부검하여 각 마우스의 폐와 비장에서의 균수, 및 폐의 조직병리학적 검사를 통해 각각 백신 후보물질의 효능을 평가하였다 (도 6 내지 8). 도 6은 비장(A) 및 폐(B)에서의 결핵균 감염에 대한 본원발명의 백신의 방어효능을 보여주는 그래프로서, 음성대조군과 비교하여 폐에서 결핵균수가 유의적으로 감소하였다. 도 7은 결핵균 감염에 의한 육안적 및 조직병리학적 소견을 보여주는 이미지이고, 도 8은 결핵균 감염의 염증 정도를 나타낸 그래프이다. 이에 따르면, 음성대조군에 비해 본원발명의 백신 사용시 비교적 완화된 병변을 보였으며, 폐의 염증 정도 역시 음성대조군에 비해 완화된 것이 관찰되었다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 겹합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC18527P 20161202
<110> KOREA CENTERS FOR DISEASE CONTROL & PREVENTION <120> RECOMVINANT VACCINIA VIRUS STRAIN AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> PN1610-380 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 978 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ag85B optimized sequence <400> 1 atgacagatg tgtccaggaa aataagagcc tggggaagga ggctcatgat cggaacagcc 60 gccgcagtcg tgctgcccgg tttggtggga ttggcaggcg gggccgctac agcaggagca 120 ttctcaaggc ctggactgcc agtcgaatat ctccaggtgc ccagcccatc aatgggccgg 180 gacataaagg tccagttcca gagcgggggg aacaatagcc ctgccgtgta cctcctggat 240 ggtctgcggg cccaggacga ctataacggc tgggatatca atacgcccgc ctttgaatgg 300 tattatcagt ccggactgtc tatagtgatg cccgtgggcg gtcagtccag cttctactcc 360 gattggtatt ctccggcttg tggcaaggca ggttgccaaa cgtacaaatg ggaaacgttt 420 ctcacttctg agctccccca atggctcagt gctaatcggg ccgtgaaacc tacgggcagc 480 gcggctatcg gcctgtctat ggctggctca agcgccatga ttctcgcggc ttaccatcca 540 cagcaattca tctatgcggg gtctctctcc gcgctcttgg acccttctca gggcatgggg 600 ccatcactga tcgggctggc aatgggggac gctggaggct ataaagcagc tgatatgtgg 660 ggcccttcat ctgacccagc atgggagagg aatgacccca cacaacaaat tcctaagctg 720 gtggcaaata atactaggct gtgggtctat tgcggaaacg gcactcctaa tgagctggga 780 ggcgcaaaca tccctgctga atttcttgag aattttgtca gatctagtaa cctgaagttc 840 caggatgcat ataacgctgc tggaggtcat aatgccgttt tcaatttccc tccaaacggt 900 acacattcct gggagtactg gggtgcccag ctgaacgcta tgaagggaga tcttcagagt 960 agtctcggcg ccggttga 978 <210> 2 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence of t-PA <400> 2 atggacgcaa tgaagcgggg tctgtgctgc gtactcctgc tgtgtggcgc cgtgttcgtt 60 tctccttca 69 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VVTK-F primer <400> 3 tttgaagcat tggaagcaac t 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VVTK-R primer <400> 4 acgttgaaat gtcccatcga ct 22

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 Ag85B 및 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 가지는 tPA(tissue plasminogen activator)를 포함하는, 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 VV-tPA-85B(수탁번호 KCTC 18527P).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 VV-tPA-85B(수탁번호 KCTC 18527P)를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는, 백신 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    적어도 하나의 면역보조제를 더 포함하는, 백신 조성물.
  8. 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 Ag85B 및 서열번호 2로 표시되는 유전자 서열을 가지는 tPA를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 백시니아 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 VV-tPA-85B(수탁번호 KCTC 18527P)의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 전달 벡터를 백시니아 바이러스에 삽입한 후에, 제조된 재조합 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 VV-tPA-85B(수탁번호 KCTC 18527P)에 의한 Ag85B 항원의 생성을 확인하는 것을 추가 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스 VV-tPA-85B(수탁번호 KCTC 18527P)의 제조 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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