KR20200076335A - 결핵 다가 항원을 발현하는 재조합 아데노 바이러스 및 이를 포함하는 결핵 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Ag85B, ESAT6, MPT64, Rv2660를 포함하는 다가 항원 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA의 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주, 이를 포함하는 결핵 예방용 백신/부스터 조성물 및 상기 아데노 바이러스주의 제조 방법에 대한 것이다.

Description

결핵 다가 항원을 발현하는 재조합 아데노 바이러스 및 이를 포함하는 결핵 예방용 조성물 {Attenuated adeno virus expressing Mycobacterium tuberculosis multivalent antigen and vaccine for preventing Mycobacterium tuberculosis comprising the same}

본 발명은 마이코박테리움 투베쿨로시스의 항원인 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물, 및 상기 재조합 아데노 바이러스주의 제조 방법에 관한 것이다.

결핵은 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의해 발병되는 질병으로서, 에이즈 및 말라리아와 함께 세계 3대 주요 감염성 질병으로 알려져 있다. 2016년 WHO의 결핵 분석보고서에 의하면, 2015년도에 전 세계에서 1040만명의 결핵환자가 발생하였고, 이 중 140만명이 사망한 것으로 추정되었다. 최근에는 에이즈환자의 50%가 결핵 중복감염으로 보고된 바 있으며, 다제내성균에 의한 난치결핵환자 증가로 인해 결핵에 의한 사망률이 감소하지 않고 있는 실정이다. 세계적으로 인구 10만명당 146명이 결핵에 감염되며 결핵에 의한 사망률은 인구 10만명당 49명으로 심각한 문제로 여겨진다. 우리 나라의 경우 결핵 발생률 및 사망률이 OECD 가입국 중 1위이며, 2000년 이후 매년 3만 5천여 명의 결핵환자가 지속적으로 발생하였다. 현재 우리 나라의 2015년 결핵 신환자는 32,181명 (10만 명당 63.2명)이며 2015년 기준으로 결핵으로 인한 연간 사망자수는 2,305명으로 여전히 경제협력개발기구 (OECD) 국가 중 결핵 발생률과 사망률이 가장 높다. 이는 우리나라에서 전염병으로 사망하는 사람의 60%가 결핵에 의한 것을 의미하는 것이므로, 국가 보건 측면에서 그 심각성이 크게 대두되고 있다.

결핵 감염을 예방하기 위한 방법은 BCG 백신을 접종하는 것 이외의 효과적인 다른 백신은 아직까지 개발되지 않고 있다. 그러나, 유일한 결핵 백신인 BCG 백신은 생백신 (live vaccine)이어서 면역결핍환자 등에서 사망에까지 이르는 부작용을 나타낼 수 있으며, 임파선병변도 종종 일으킬 수 있다. 또한, BCG의 효과는 영유아 시기에는 효과적이라고 알려져 있으나 청소년기 이후에는 백신의 효과가 거의 없다는 것이 다양한 연구를 통해 밝혀진 바 있다. 더욱이, 영유아에 대한 백신 효과 역시 개인차가 많이 나는 것으로 알려져 있다. 이에 결핵 예방을 위한 효과적인 백신 후보주 개발의 필요성이 높고, 특히 영유아기 이후 감염에 대한 효과적인 백신 개발이 더욱 요구되는 실정이나, 우리나라에서 그러한 백신 후보주 개발은 아직 미흡한 상황이다.

특히, BCG 백신에 대하여 면역 스트레스를 이겨내고 진화된 고병원성 결핵균의 경우, 기존에 사용하고 있는 BCG 백신이 효과적인 예방을 할 수 없는 문제점이 발생되고 있으며, 우리나라의 경우, 환자에서 분리되는 임상결핵균의 80% 이상이 고병원성 균주형임을 감안하면, 고병원성 균주에 효과적인 백신 개발이 필요하다.

등록특허 제10-1749993호

이에 본 발명자들은, 기존의 BCG 백신이 가지고 있는 부작용과, 결핵 예방 효과가 떨어지는 문제점을 해결하고, 특히 고병원성 결핵 균주에 대한 예방 효과를 가지는 백신에 대한 연구를 수행하던 중, 결핵균의 주요 항원인 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비신호 펩타이드가 결합된 재조합된 아데노 바이러스가 결핵균에 대한 감염 방어 효능이 높게 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 아데노 바이러스주에 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA 유전자를 도입한 재조합 아데노 바이러스 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 아데노 바이러스를 포함하는 결핵 백신 부스터용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 주된 항원인 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA 유전자가 도입된, 재조합 아데노 바이러스주를 제공한다.

아데노 바이러스는 상부기도와 결막에 질병을 일으키고 정상인에게도 잠복감염상태로 존재하는 바이러스의 일종으로서, 대부분이 불현성바이러스이며, 발병하더라도 자연 치유가 가능하고 재감염에 대해서도 바이러스형 특이적 면역을 남긴다는 특징을 나타낸다. 바이러스입자는 주로 헥손, 펜톤단백질로 구성되고, 지름 70nm의 정 20면체 형상을 나타내는데, 각 정점에 돌기가 있으며 피막은 갖지 않는다. 그의 유전체는 약 36,000 염기쌍의 2중가닥 DNA로 구성되는데, DNA의 5′말단에는 말단 단백질(terminal protein; TP)이 공유결합을 하고 있고, 상기 TP는 DNA 복제의 시작점으로 작용한다고 알려져 있다. 최근에는, 유전자 재조합 방법에 의하여 진핵세포 유래의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 진핵세포에 도입하여 발현시키는 매개체인 유전자 벡터로서 사용되고 있다.

Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자는 M. tuberculosis 의 주요 항원 유전자들이다. Ag85B 항원은 마이코박테리움의 특징인 외각의 미콜산(mycolic acid)을 포함하는, 세포벽을 구성하는데 필수적인 역할을 하는 Ag85 복합체 중 하나로서, CD4+/CD8+ T-세포 및 IFN-γ와 같은 세포 매개성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다. ESAT6 (Early Secretory Antigenic Target 6 kDa)은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 생성된 6kDa의 조기 분비 항원 표적으로서 분비 단백질이며 강력한 T 세포 항원이다. ESAT6은 CFP10 및 TB7.7과 함께 전혈 인터페론 γ 검사 QuantiFERON-TB Gold에 의한 결핵 진단에 사용되며, 또한, TLR2 수용체에 직접 결합하여 하류 신호 전달을 억제하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는, 상기 Ag85B 및 ESAT6 외에도 결핵 바이러스의 항원인 MPT64, Rv2660 유전자가 추가로 도입된 퓨전 다가 항원을 포함하고 있다.

즉, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스가 포함하고 있는 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 항원은 모두 악성 결핵 바이러스 표면에 존재하는 면역 항원으로서, CD4+/CD8+ T-세포 및 IFN-γ와 같은 세포 매개성 면역반응을 강하게 유도할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 변형된 유전자 서열은 NCBI genbank blast 조사 결과 현재 알려져 있는 마이코박테리움 투베쿨로시스 H37Rv 균주의 유전자 서열과 약 76%의 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 변형은 인간 코돈 최적화에 의한 것일 수 있으며, 진핵 숙주 세포에서 발현을 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 tPA 유전자는 서열번호 5로 표시되는 유전자 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 서열번호 5는 NCBI genbank blast 조사 결과 알려져 있는 Homo sapiens의 tissue-type plasminogen activator (tPA)의 secretion leader 유전자 서열과 약 79.7% 상동성을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 tPA 유전자는 항원 유전자를 단백질로 발현시킨 후 세포 외 분비를 유도하기 위해서 유전자 상류에 삽입되는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이다. 상기 신호 서열을 삽입함으로써 항원 유전자의 발현 및 보호 효과를 유도할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 아데노 바이러스주는 수탁번호 KCTC13776BP(기탁일자 2018. 12. 14)로 기탁된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

다른 측면으로 본 발명은, 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있다.

상기 결핵 예방용 백신 조성물은, 단독으로 접종되는 백신 조성물 또는 BCG와의 병용 투여를 통하여 결핵 예방 효과를 가지는 부스터 백신 조성물일 수 있다.

본 발명에서 백신 부스터용 조성물이란, 보호 면역을 증진, 연장 또는 유지하여 일차 투여된 백신 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 조성물을 의미하며, 일차 백신 접종을 마친 후, 일정 간격으로 필요에 따라 투여될 수 있는 조성물이다.

본 발명의 일 측면으로서 백신 부스터(booster)용 조성물은 BCG 백신 접종과 함께 처리되는 경우, 기존에 BCG 에 의한 결핵 예방 효과가 미미한 고병원성 결핵 균주, 예컨대 HN878 균주에 대한 우수한 결핵 예방 효과를 달성할 수 있으며, 특히 면역 반응 유도를 통해 잠복 결핵의 재 활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 장점이 있다.

일차 예방 접종 및 부스터 접종을 포함한 백신 투여 스케줄은, 환자에게 필요한 한, 수일, 수주, 수년의 과정에 걸쳐 계속될 수 있다. 일부 양상으로, 백신 스케줄은 백신 요법의 시작 시에 가장 높은 빈도로 투여되며, 부스터 효과를 위한 부스터 백신의 투여는 점차 빈도를 줄여서 투여할 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및/또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 적어도 하나의 면역보조제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것일 수 있으며, 알하이드로겔(alhydrogel)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 면역보조제는 사람 또는 동물에게 투여하는 경우 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 것을 의미하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물에 포함된 재조합 아데노 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 백신 조성물에 포함된 재조합 아데노 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하여 세포 밖으로 분비하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원 단백질은 세포 내에서 생산된 후 시그널 펩타이드에 의하여 세포 바깥으로 이송되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 결핵균 방어항원 단백질에 의하여 생체의 면역반응이 유도되는 것일 수 있으며, 상기 면역반응에 의하여 생체 내에 결핵균에 대한 항체가 생성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물은 인간을 포함하는 동물의 생체 내에 주입되어 결핵에 대해 면역을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명의 백신 조성물은 투여를 위하여 약학적으로 수용할 수 있는 담체 및/또는 면역 보조제를 포함하여 인간 또는 수의학적 용도로 제형화 할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 경구 투여 시, 예를 들어 캡슐제 또는 정제; 분말제 또는 과립제; 용제(solution), 시럽 또는 현탁제(suspension)(수성 또는 비수성 액상물 중; 식용 발포제(edible foam) 또는 휩 제형(whip formulation); 또는 유탁액제(emulsion)) 같은 별개의 단위로서 상기 백신 조성물을 제시할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어 비경구(parental) 투여 시, 상기 백신 조성물은 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 주사용 용제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액을 만들시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 투여는 근육주사, 피하주사, 또는 복강주사를 통한 투여인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원발명의 백신 조성물은 피투여자의 건강 상태, 체중, 성별 및 투여 목적 등에 따라 적절하게 용량을 설정하여 투여될 수 있다.

또 다른 측면으로 본 발명은, Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비 신호 펩타이드인 tPA 유전자를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법을 제공할 수 있다.

본원 명세서 전체에서, "벡터"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자를 말하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 핵산이 위치하는 것을 의미할 수 있다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예: YAC)가 포함될 수 있다.

결핵균 방어항원 유전자인 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자를 상기 벡터에 삽입하는 것은, 당업계에 알려진 모든 유전자 재조합 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 상기 벡터를 상기 아데노 바이러스에 삽입하는 것은 당업계에 알려진 모든 형질감염 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 벡터는 pEntr 벡터를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 벡터는 클로닝 벡터로서 pEntr-BHRNX, 전달벡터로서 pAd/CMV/V5-DEST를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입한 후에, 제조된 재조합 아데노 바이러스에 의한 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 항원의 생성을 확인하는 것을 추가 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

예를 들어, 상기 재조합 아데노 바이러스에 의한 결핵균 방어항원 (Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 항원) 단백질의 생성을 확인하는 것은 당업계에 알려진 모든 단백질 검출 및/또는 검정 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 면역학적 방법에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치(sandwich)" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광성 면역검정, 또는 단백질 A 면역 검정 등에 의하여 결핵균 방어항원 단백질의 생성을 확인할 수 있으며, 또는 상기 결핵균 방어항원에 연결된 형광 단백질을 이용하여 형광 검출을 이용하여 단백질의 생성을 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 따르면, 상기 Ag85B유전자는 서열번호 1로, ESAT6 유전자는 서열번호 2로, MPT64 유전자는 서열번호 3으로, Rv2660 유전자는 서열번호 4로 표시되는 유전자 서열을 가지도록 변형된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 따르면, 상기 tPA 유전자는 서열번호 5로 표시되는 유전자 서열을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터 제조 시, 상기 항원 유전자 및 신호전달 펩타이드(tPA) 서열 이외에도, 링커를 포함할 수 있으며, 상기 링커는 서열번호 6 또는 7의 염기서열을 포함하는 것이나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.

본 발명의 재조합 아데노 바이러스주에 항원 유전자로서 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 및 분비 신호 펩타이드 유전자로서 tPA의 유전자를 도입함으로써, 우수한 결핵균 예방 및 방어효과를 가지는 동시에 BCG의 부작용을 완화하고 예방 효과를 높일 수 있는 부스터 백신으로 사용하기 위한 재조합 아데노 바이러스주를 제공할 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 아데노 바이러스 제조 과정의 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따라 최적화된 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자의 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 아데노 바이러스의 체액성 면역 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 본원의 일 실시예에 따른 재조합 아데노 바이러스의 마우스 모델에서의 면역원성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 도 7은 본원의 일 실시예에 따른 재조합 아데노 바이러스에 의해 면역화된 마우스 모델의 비장(도 5) 및 폐(도 6)에서의 결핵균 감염에 대한 방어효능을 보여주는 그래프이다.
도 8은 고병원성 결핵균(HN878)에 대한 본원의 재조합 아데노 바이러스의 부스팅 접종에 의한 감염 방어능을 평가한 결과로서, 폐 및 비장 조직 내 결핵균 수의 변화(감소)를 나타낸 것이다.
도 9는 고병원성 결핵균(HN878)에 대한 본원의 재조합 아데노 바이러스의 부스팅 접종 시, 폐조직의 염증병변/육아종 형성 여부를 확인한 결과이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.

이하, 본원의 재조합 아데노 바이러스주, 이를 포함하는 백신 조성물 및 상기 아데노 바이러스주의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

1. 재조합 바이러스 백신 후보주의 제작

M. tuberculosis H37Rv 균주의 Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660유전자 서열(서열번호 1 내지 서열번호 4)을 이용하여 세포 내에서 발현율을 높이기위해 서열 변형(sequence modification)을 진행하였다. M. tuberculosis Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 서열을 이용하여 인간화 코돈 최적화(humanized codon optimization)를 진행 후, 유전자 상류에 세포 내 분비 신호 펩타이드인 tPA (tissue plasmodium activator) 서열(서열번호 5)과 함께 유전자 합성을 진행하였다. 유전자 서열 및 pPA 유전자 서열은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 5에 나타나 있으며, Ag85B, ESAT6, MPT64 및 Rv2660 유전자 서열의 최적화는 도 2에 나타나 있다. 합성된 유전자는 BamH1 및 Xho1 제한 효소를 이용하여 절단 후 아데노 바이러스 전달벡터인 pEntr-BHRNX에 결찰(ligation)하였으며, 상기 재조합 아데노바이러스는 rAD-tPA-TB4으로 표시할 수 있다. (도 1)

상기 재조합 아데노 바이러스를 이용하여, E. coli DH5α에 형질전환(transformation)하여 entry clone을 확보하였다. 제작된 재조합 아데노바이러스의 entry clone의 플라스미드 DNA를 pAd/CMV/V5-DEST (150ng/ul) 벡터와 LR Clonase II 효소를 이용하여 LR recombination 진행 후 proteinase K로 처리하여 competent cell (DH5α)에 다시 형질전환 하였다.

상기 제작된 형질전환체로부터 분리한 DNA plasmid를 제한효소 Pac I 처리하여 miniprep 후 0.1~3.0ug/ul 농도로 준비하고, 293A 세포에 재조합 아데노바이러스 벡터와 Lipofectamine 2000을 혼합하여 형질감염한 후 하루 동안 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후 10cm 플레이트로 옮겨서 계속 배양하며 CPE 확인하며 10~13일간 배양하며 80% 이상 CPE 플라크 형성 여부를 확인하였다.

상기 플라크로부터 세포 lysate를 수거하여 freezing and thawing 2~3회 반복하여 실행한 후 원심분리를 하여 supernatant 따로 분리해서 항원 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 단백질 발현 여부를 검증하고, 완성된 재조합 바이러스를 T175 기준으로 20~25% 293A 세포를 seeding 하여 CPE가 확인되면 세포를 수확하여 동결 및 해동 후에 원심 분리하여 침전물을 제거하고 나누어 보관하였다. 항원 발현 여부를 확인(western blot)하여 선별된 재조합바이러스는 면역원성 분석을 위하여 대량배양 정제를 진행하였다.

2. 면역원성 평가

2-1. 마우스 면역화

in vivo 효능을 분석하기 위하여 백신후보물질을 이용하여 마우스를 면역화 하였다. 실험 동물로 생후 5 내지 6주된 특이적 병원체가 없는 암컷 C57BL/6N 마우스를 사용하였으며, 제조된 결핵후보물질(rAD-tPA-TB4)을 마우스에 투여하였다. 부스터 백신으로서의 효과를 평가하기 위하여, 피하주사로 BCG를 2×10⁵ 접종 한 후에 6주 이후에 평가할 후보물질 5 × 10⁷ PFU의 바이러스를 3주일 간격으로 2회 접종하고 최종 접종일로부터 2주후에 마우스로부터 혈액, 비장 및 폐 조직을 채취하고자 하였다. 마우스를 케타민과 럼푼으로 마취한 후 심장채혈하고, 혈액을 4℃에서 12시간 이상 방치한 후, 이를 원심 분리하여 혈청을 분리하고 분리된 혈청은 -70℃에 보관하였다.

2-2. 체액성 면역 분석 (혈중 IgG 역가 분석)

제조된 결핵후보물질(rAD-tPA-TB4)의 단독 또는 BCG와의 부스터 접종에 따른 체액성 면역반응을 분석하기 위하여 마우스의 항원 특이적 혈중 IgG 항체 역가를 ELISA법으로 측정하였다. 백신 후보 물질을 카보네이트 버퍼 (pH 9.6)에 현탁 한 후 96-웰 플레이트에 100 ㎕/웰로 가하여 4℃에서 12시간 동안 코팅하였다. 다음날 1% 우태아혈청 알부민 (BSA)을 함유한 PBS용액 300 ㎕을 가하여 블로킹(blocking) 한 다음, 0.5% 트윈(tween) 20을 함유한 PBS (PBST)로 세척하였다. 블로킹 용액으로 2배씩 계열 희석한 마우스 혈청 100 ㎕을 가하고 37℃에서 2 시간 동안 반응시킨 다음 PBST로 웰을 세척하였다. 홀스래디쉬 페록시데이즈-컨쥬게이트 고트 항-마우스 IgG 항체와 37℃에서 1시간 반응시킨 후 TMB 용액을 가하여 발색한 후 0.1 N의 황산용액 50 ㎕을 가하여 반응을 중단시킨 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 대조군으로서 BCG 백신만을 투여한 경우에 비하여 rAD-tPA-TB4 를 단독 접종 또는 BCG와 부스팅 접종한 군에서 항체 반응이 높게 나타나는 것이 관찰되었다. (도 3)

2-3. 세포성 면역 평가 (IFN-γ)

본 발명의 결핵백신 후보물질인 rAD-tPA-TB4의 면역분석을 위하여 BCG 단독 접종군 및 부스팅 접종군의 비장세포 및 폐세포를 분리하고 비장세포 및 폐세포들 각각에서 IFN-γ 분비 활성을 가진 세포수를 ELISpot으로 분석하였다 (도 4 및 도 5). 그 결과, 대조군인 BCG 백신만 접종한 그룹과 비교하여 rAD-tPA-TB4를 부스팅 접종한 그룹의 비장과 폐에서 모두 결핵 항원 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 세포수가 크게 증가되는 것을 확인하였다.

2-4. 다기능 T 세포 활성능 평가

결핵 백신 후보 물질을 통한 polyfunctional T 세포의 분석을 위해서 백신 후보 물질을 3주 간격으로 2회 피하 접종한 1주후에 마우스의 비장과 폐조직을 채취하여 면역세포를 분리하였다. 각각 의 조직에서 분리된 면역세포는 결핵 항원과 골지 수송 억제제(monensin/bradfeld A)를 첨가하여 10시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 세포를 harvest하여서 MHC II- FITC, CD4-V450, CD8-PerCP cy5.5 표면 마커를 염색한 다음 고정 및 침투(Fixation/Permeabilization) 용액으로 처리한 후, IL-2-PE, TNF-α-PE-cy7, IFN-γ-APC 항체로 세포내 (ICS; intracellular staining)를 염색하였다. 염색한 세포는 FACS 분석을 수행하였다. Flowjo와 SPICE 소프트웨어를 통해서 다양한 사이토카인을 분비하는 CD4와 CD8 T 세포를 분석하였다. 그 결과, 도 6 및 도 7에서 보듯이, 결핵백신 후보물질의 IL-2, TNF-α, IFN-γ를 분비하는 다기능 T 세포 유도능을 분석한 결과 특히 폐조직내 CD4+, CD8+ 다기능 T 세포의 유도가 크게 증가되는 것을 확인하였다.

3. 결핵균 감염 방어 효능 평가

결핵 백신 후보물질인 rAD-tPA-TB4의 결핵균 방어를 위한 BCG부스팅 능력을 확인하기 위해 상기 실시예 3과 같이 마우스에 BCG를 immunization 한 후 rAD-tPA-TB4으로 2회 부스팅 접종을 수행하였다. 이후, 결핵균 HN878를 감염하고 12 주 뒤 마우스 폐와 비장에서의 결핵 방어능을 확인한 결과, 도 8에서 보듯이, 폐에서 BCG 단독 처리군 보다 rAD-tPA-TB4로 부스팅한 경우 결핵균이 의미 있게 감소함을 확인하였고, 도 9와 같이, BCG 단독군보다 폐의 염증 병변 및 육아종 형성이 억제되었음을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC13776BP 20181214

<110> REPUBLIC OF KOREA(Korea Centers for disease control and prevention) <120> Attenuated adeno virus expressing Mycobacterium tuberculosis multivalent antigen and vaccine for preventing Mycobacterium tuberculosis comprising the same <130> pn1812-504 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 975 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 atgactgatg tgagccgcaa aatcagagcc tgggggcgaa ggctcatgat cggaaccgcc 60 gcagcagttg tgcttcccgg gctcgtgggc ctggcaggcg gcgcagccac agcaggagcc 120 ttctcccggc ctggactgcc cgttgaatat cttcaggtgc cttcccctag catgggaagg 180 gacatcaagg ttcagttcca atccggcgga aataacagtc ctgccgtata cttgctcgac 240 ggactgagag ctcaagatga ttacaacggg tgggacatta atacgccagc ctttgagtgg 300 tattatcaga gcggcttgag catagttatg cccgtcggcg gccaatccag tttctacagc 360 gactggtata gtcctgcatg cgggaaagct ggctgccaaa catacaaatg ggagacattc 420 ttgacttccg aacttcccca gtggctgtca gcaaatcggg ccgtgaagcc cactggatct 480 gctgctatcg gactttccat ggcaggtagc agtgccatga ttctggcagc ctatcaccca 540 cagcagttca tctacgctgg gtccctgtcc gcattgctcg atccctccca gggtatgggc 600 ccgagcctca taggtctggc aatgggagat gcaggaggct acaaagctgc tgatatgtgg 660 ggtccttctt ccgacccggc atgggaacgg aacgatccca cacagcaaat accgaagctg 720 gtggccaaca atactagatt gtgggtttat tgtggcaacg gaactcccaa cgagctcgga 780 ggcgcgaata taccagccga gttcctggag aacttcgtca ggagttctaa tctcaaattc 840 caggacgctt acaacgctgc gggagggcac aatgctgtct ttaactttcc gcccaacggc 900 acccatagct gggagtattg gggggcacaa ctgaatgcca tgaaaggtga cttgcaaagt 960 agcctgggag caggg 975 <210> 2 <211> 288 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 atgaccgagc agcagtggaa cttcgccggg attgaagctg ctgcatccgc cattcaaggg 60 aacgtgacgt caatacatag cttgctggat gaaggaaagc aaagtctcac caaactcgcg 120 gctgcttggg gtggctccgg atctgaggct tatcaaggag tacagcagaa gtgggatgcg 180 acggccactg agctgaacaa tgccctgcag aacctcgccc gcacaattag tgaggctgga 240 caagcaatgg cgtccaccga gggcaacgtt actggaatgt ttgctttt 288 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 3 tttgcggtca ctaatgacgg ggtaatt 27 <210> 4 <211> 225 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 4 atgattgctg gcgtcgacca agccctggca gccactggcc aggccagcca acgggctgcc 60 ggggcgtccg gaggagtaac agtcggggtg ggagtcggaa ccgagcagag gaatctctca 120 gtagtagcac cttctcaatt caccttcagc agcaggtctc ctgacttcgt ggacgagacg 180 gcagggcagt cctggtgtgc gatcctgggt ctgaaccagt tccac 225 <210> 5 <211> 69 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 5 atggatgcta tgaagcgggg gctctgttgt gtcctgctgc tgtgtggtgc cgtgttcgtg 60 tccccatca 69 <210> 6 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized antigen linker sequence <400> 6 gatgtcgca 9 <210> 7 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimized antigen linker sequence <400> 7 gggtccgga 9

Claims (12)

1. 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) H37Rv의 Ag85B, ESAT6, MPT64, Rv2660 항원 유전자; 및
   분비 신호 펩타이드인 tPA (tissue plasminogen activator)의 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주.
2. 제1항에 있어서,
   상기 Ag85B 항원 유전자는 서열번호 1, ESAT6 항원 유전자는 서열번호 2, MPT64 항원 유전자는 서열번호 3 및 Rv2660 항원 유전자는 서열번호 4로 각각 표시되는 염기 서열을 포함하는 것인, 재조합 아데노 바이러스주.
3. 제1항에 있어서,
   상기 tPA 유전자는 서열번호 5으로 표시되는 유전자 서열을 가지는 것인, 재조합 아데노 바이러스주.
4. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 아데노 바이러스주는 수탁번호 KCTC13776BP로 기탁된 것인, 재조합 아데노 바이러스주.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 재조합 아데노 바이러스주는 결핵 예방 효과 또는 결핵 백신 부스팅(boosting) 효과를 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노 바이러스주를 유효 성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
7. 제6항에 있어서,
   상기 백신 조성물은 결핵 백신의 부스터(booster) 백신인 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
8. Ag85B, ESAT6, MPT64, Rv2660 항원 유전자; 및 tPA 유전자를 전달 벡터에 삽입하는 단계;
   상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하는, 다가 항원유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입한 후, 제조된 재조합 아데노 바이러스에 의한 Ag85B, ESAT6, MPT64, Rv2660 항원 생성을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 Ag85B, ESAT6, MPT64, Rv2660 항원 유전자는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 가지도록 변형된 것인, 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법.
    
11. 제8항에 있어서,
    상기 tPA 유전자는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법.
    
12. 제8항에 있어서,
    상기 항원 유전자를 연결하는 링커 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법.

Images