KR102377090B1 - Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 - Google Patents

Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 Download PDF

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윤진승
신은경
이정아
이영란
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김수환
정경태
유정식
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Abstract

본 발명은 Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자;를 포함하고, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스, 상기 재조합 아데노 바이러스의 제조방법 및 상기 재조합 아데노 바이러스를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물{Recombinant adenovirus using an epitope of Ag85B, method for preparing the same and vaccine composition for preventing tuberculosis comprising the same}
본 발명은 Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
결핵은 전 세계적으로 10대 사망원인 중 하나로, 세계보건기구(WHO)에 의하면 `17년 한해에 1,000만 명의 결핵환자가 발생하였고 이는 인구 10만 명당 133명에 해당하는 수로 심각한 문제라고 할 수 있으며 매우 위협적인 질환이라고 할 수 있다.
결핵은 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의해 발병되는 질병으로서, 에이즈 및 말라리아와 함께 세계 3대 주요 감염성 질병으로 알려져 있다. 최근에는 에이즈환자의 50%가 결핵 중복감염으로 보고된 바 있으며, 다제내성균에 의한 난치결핵환자 증가로 인해 결핵에 의한 사망률이 감소하지 않고 있는 실정이다.
우리나라의 경우, 결핵 발생률 및 사망률이 OECD 가입국 중 1위이며, 2000년 이후 매년 3만 5천여 명의 결핵환자가 지속적으로 발생하였다. 현재 우리나라의 2015년 결핵 신환자는 32,181명(10만 명당 63.2명)이며 2015년 기준으로 결핵으로 인한 연간 사망자수는 2,305명으로 여전히 경제협력개발기구(OECD) 국가 중 결핵 발생률과 사망률이 가장 높다. 이는 우리나라에서 전염병으로 사망하는 사람의 60%가 결핵에 의한 것을 의미하는 것이므로, 국가 보건 측면에서 그 심각성이 크게 대두되고 있다.
한편, 결핵 감염을 예방하기 위한 방법은 BCG(Bacille Calmette-Guerin) 백신을 접종하는 것 이외의 효과적인 다른 백신은 아직까지 개발되지 않고 있다. 그러나, 유일한 결핵 백신인 BCG 백신은 생백신(live vaccine)이어서 면역결핍환자 등에서 사망에까지 이르는 부작용을 나타낼 수 있으며, 임파선병변도 종종 일으킬 수 있다. 또한 BCG 백신은 청소년 및 성인의 폐결핵에는 예방 효과가 제한적이라는 한계가 있다.
국내에는 1952년 BCG 백신이 처음 도입되어 현재 접종률은 약 85% 수준이다. 그러나 BCG 백신의 예방 효과가 0-80%로 매우 다양한 차이를 보이고 있고 방어면역이 접종 후 3~15개월 사이에서 감소하는 제한적인 효능을 보이는 단점이 있다.
따라서 전 세계적으로 결핵을 보다 효과적으로 예방 및 치료하기 위한 연구가 지속적으로 진행되고 있으며, WHO는 결핵 퇴치를 위한 새로운 전략으로 'END TB Strategy' 수립하였고, 결핵을 퇴치하기 위해서는 결핵 및 잠복결핵 감염을 진단, 치료 및 예방하는 획기적인 기술개발이 필수적임을 강조한 바 있다.
그러나 이러한 노력에도 불구하고 소아 및 성인의 결핵예방에 대하여 BCG 백신을 대체할 수 있는 안전하면서도 보다 효과적인 차세대 백신이 개발되지 못하고 있는 실정이다.
대한민국 등록특허 10-1749993
이에 본 발명자들은 결핵균에 대한 예방 및 방어효과가 우수한 새로운 차세대 백신의 개발을 연구하던 중, 결핵균 H37Rv의 Ag85B 단백질 부위에서 세포매개성 면역유도 활성이 우수한 Ag85B의 특정 에피토프를 규명하였고, 상기 에피토프 부위를 3번 반복 연결시키되, 이들 에피토프 사이를 4개의 글라이신 잔기 링커(linker)로 연결시키고, N-말단에는 개시코돈과 분비신호 서열인 인간조직 플라스미노겐 활성체(t-PA) 서열을 삽입한 재조합 아데노 바이러스를 제조하였으며, 재조합 아데노 바이러스를 결핵 백신으로 투여할 경우, 세포매개성 면역반응을 유도함으로써 결핵균에 대한 감염을 효과적으로 예방 및 방어할 수 있음을 확인하였으며, 그 효과가 종래 BCG 백신에 비해 더 우수하다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자;를 포함하고, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 본 발명의 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자;를 포함하고, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 tPA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, 상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 결핵 예방 또는 결핵 백신 부스팅(boosting) 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 세포매개성 면역유도 및 다기능 T 세포 유도 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 결핵 예방 또는 결핵 백신 부스팅(boosting) 효과를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 근육 주사 또는 피하 주사로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 세포매개성 면역유도 및 다기능 T 세포 유도 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포매개성 면역유도는 IFN-γ 생성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 다기능 T 세포 유도 활성은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포 증가를 유도하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 백신 조성물은 결핵균에 감염된 폐조직의 손상억제 및 폐에서 결핵균 수 감소를 유도하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, tPA(tissue plasminogen activator) 유전자, Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및 상기 전달벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 단계;를 포함하되, 상기 전달벡터에는 tPA 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 tPA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이며, 상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 항원성 재조합 융합 단백질을 생성하는 것일 수 있다.
또한 본 발명은, 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물로서, 상기 재조합 융합 단백질은 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열, Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열 및 4개의 글라이신으로 이루어진 링커 펩타이드 서열이 융합된 것으로, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열 다음에 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열이 3번 반복되어 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열들은 상기 링커 펩타이드에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열은 서열번호 5로 이루어진 것이고, 상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열은 서열번호 6으로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 제조한 Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스는 결핵균 감염 시 체내에서 세포매개성 면역반응 및 T 세포 활성을 효과적으로 유도함으로써 우수한 결핵균 예방 및 방어 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 재조합 아데노 바이러스는 결핵 예방을 위한 백신으로 유용하게 사용할 수 있으며, 종래 BCG 백신보다 효과가 더 우수하여 BCG 백신을 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신으로 사용할 수 있으며 동시에 BCG의 부스터 백신으로도 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 Ag85B에 대한 효과적인 T 세포 면역반응을 일으키는 에피토프를 선별하기 위해 Ag85B의 아미노산 정보를 이용하여 오버랩핑 펩타이드(OLPs: overlapping peptides)를 제작하는 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 오버랩핑 펩타이드에 대하여 결핵 주요 항원인 Ag85B에 대하여 세포매개성 면역 유도활성을 갖는 에피토프를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스 제조 과정에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 재조합 아데노 바이러스에 대한 접종 도즈 및 접종 방법에 따른 체액성 면역 분석결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 접종 도즈 및 접종 방법에 따라 면역화한 각 마우스의 비장세포 및 폐세포로부터 INF-r를 분비하는 세포수를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri), BCG 및 Ag85B의 전체 유전자를 도입한 재조합 아데노 바이러스(rAD-Ag85B)로 면역화한 각 마우스에 대하여 결핵 항원에 대한 항체인 PPD 및 항원 혼합물(Ag85B, EAST-6 및 CFP-10의 혼합물) 자극에 따른 폐세포와 비장세포에서의 INF-r 생성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스의 접종 도즈 및 접종 방법에 따른 면역화에 의한 비장세포에서의 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스 및 다른 결핵 백신주로 각각 면역화한 마우스의 폐세포 및 비장세포에서 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포 활성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 결핵균 H37Rv에 대한 본 발명의 재조합 아데노 바이러스의 부스팅 접종에 의한 감염 방어능을 평가한 것으로, (A)는 폐조직 내 결핵균 수의 변화를 확인한 것이고, (B)는 폐조직의 염증병변 형성 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 결핵균에 대한 우수한 방어 및 감염 예방 활성을 갖는 새로운 결핵 백신으로서, 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 항원인 Ag85B 단백질에 대하여 세포매개성 면역반응 활성을 효과적으로 유도할 수 있는 특정 에피토프 영역을 규명하였고, 규명한 에티토프를 이용하여 백신 제조를 위한 새로운 재조합 아데노 바이러스를 제조하였다.
따라서 본 발명은 새로운 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스를 제공할 수 있는 특징이 있으며, 본 발명에서 제공하는 상기 재조합 아데노 바이러스는 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자;를 포함하고, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 특징을 갖는다.
본 발명자들은 결핵 백신의 제조를 위해 아데노 바이러스를 이용하였는데, 아데노 바이러스는 상부기도와 결막에 질병을 일으키고 정상인에게도 잠복감염상태로 존재하는 바이러스의 일종으로, 대부분이 불현성 바이러스이며, 발병하더라도 자연 치유가 가능하고 재감염에 대해서도 바이러스형 특이적 면역을 남긴다. 바이러스입자는 주로 헥손, 펜톤 단백질로 구성되고, 지름 70nm의 정 20면체 형상을 나타내는데, 각 정점에 돌기가 있으며 피막은 갖지 않는다. 그의 유전체는 약 36,000 염기쌍의 2중가닥 DNA로 구성되는데, DNA의 5′말단에는 말단 단백질(terminal protein; TP)이 공유결합을 하고 있고, 상기 TP는 DNA 복제의 시작점으로 작용한다고 알려져 있다. 최근에는, 유전자 재조합 방법에 의하여 진핵세포 유래의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 진핵세포에 도입하여 발현시키는 매개체인 유전자 벡터로서 사용되고 있다.
본 발명자들은 결핵 백신 제조용 아데노 바이러스를 제조하기 위해, tPA(tissue plasminogen activator) 유전자를 이용하였는데, tPA 유전자는 항원 유전자를 단백질로 발현시킨 후 세포 외 분비를 유도하기 위해서 유전자 상류에 삽입되는 신호 펩타이드를 암호화하는 서열이다. 상기 신호 서열을 삽입함으로써 본 발명의 제조합 항원 유전자의 발현 및 보호 효과를 유도할 수 있다.
상기 Ag85B 항원은 마이코박테리움의 특징인 외각의 미콜산(mycolic acid)을 포함하는, 세포벽을 구성하는데 필수적인 역할을 하는 Ag85 복합체 중 하나로 알려져 있다.
한편, 본 발명에서는 Ag85B 항원에 대하여 우수한 세포 매개성 면역반응을 유도할 수 있는 Ag85B의 에피토프 영역을 규명하고자 실험을 수행하였는데, Ag85B의 단백질 서열을 토대로 OLPs(overlapping peptides)를 제조하고, 제조된 총 64개의 OLPs에 대하여 Ag85B 항원 특이적 세포 매개성 면역유도 실험을 수행한 결과, #57번 펩타이드가 다른 펩타이드에 비해 월등히 높은 세포 매개성 면역유도 활성이 있는 것을 확인하였다.
이를 토대로 본 발명자들은 상기 #57번 펩타이드를 Ag85B 항원에 대한 세포 매개성 면역 유도 에피토프로 선정하였고, 이를 이용하여 결핵균 H37Rv의 Ag85B 단백질의 319번째부터 374번째의 아미노산 영역이 3번 반복된 폴리펩타이드 절편을 제조하였고, 이때 상기 Ag85B 단백질의 319번째부터 374번째의 아미노산 영역들 간의 사이는 4개의 글라이신으로 이루어진 링커 펩타이드로 연결되도록 하였다.
또한 상기 3번 반복되어 위치하고 있는 Ag85B 단백질의 아미노산 영역과 이들을 연결하는 링커 펩타이드는 아데노 바이러스에 유전자 형태로 도입하기 위해 인간 코돈 최적화된 염기서열로 변형하였다. 그리고 N 말단에는 개시코돈과 분비신호서열인 tPA에 대한 유전자 서열을 삽입하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 tPA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가지도록 변형된 것일 수 있다. 또한, 상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 가지도록 변형된 것일 수 있다. 상기 변형은 인간 코돈 최적화에 의한 것일 수 있고, 진핵 숙주세포에서 발현을 용이하게 하기 위해 수행될 수 있다.
이러한 과정을 통해 본 발명자들은 결핵균의 Ag85B 항원에 대해 항원 특이적 세포매개성 면역을 유도할 수 있을 것으로 예상되는 Ag85B의 에피토프를 이용한 새로운 항원성 재조합 융합 단백질을 생성할 수 있는 재조합 아데노 바이러스를 제조하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 아데노 바이러스에 대하여, 마우스 모델을 이용하여 재조합 아데노 바이러스를 피하 및 근육 내로 접종하여 마우스를 면역화시킨 후, 혈청 내 IgG 항체의 생성 역가를 측정하였는데, 종래 결핵 백신인 BCG에 비해 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 접종한 경우, Ag85B 항원 특이적 IgG 항체의 생성능이 더 높은 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 결핵 백신으로 이용할 경우, 항체 생성을 통한 체액성 면역반응을 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 다른 일 실시예에서는, 세포매개성 면역유도 활성이 있는지 확인하였는데, 그 결과, BCG 접종 군에 비해 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 접종한 군에서 비장세포와 폐세포 모두 INF-r 생성 세포수가 더 높은 것으로 나타났고, IFN-γ, TNF-α 또는 IL-2를 분비하는 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포의 활성도 증가한 것으로 나타났다.
한편, 생체 내에서 세포성 면역반응은 대단히 중요한 역할을 한다. 일반적으로 체액성 면역은 체내에 침투된 항원에 대하여 특이적인 항체 생성을 자극함으로써 일부 세균이나 바이러스성 병에 대해 적절한 방어효과를 나타내는 기작이고, 다른 많은 세균, 바이러스나 진균 및 종양에 대해서는 기주의 방어기작으로서 세포성 면역이 더 중요한 역할을 담당한다.
세포성 면역에 관련된 주요한 세포는 T 세포로서, 이는 두 가지로 구분되는데 첫째로, B세포의 항체 생성 능력을 증대시켜주거나 마크로파지(macrophage)에 의한 항원과 결합된 항체의 탐식작용을 활성화시키는 사이토카인(cytokine)을 분비하는 CD4+ 헬퍼(helper) T 세포가 있고, 둘째로, 항원에 의해 감염된 항원표현 목표 세포(antigen-expressing target cell)를 파괴하여 항원을 소멸시킴으로써 궁극적인 치료 효과를 나타낼 수 있는 CD8+ CTL(cytotoxic T lymphocyte)이 있다. 이러한 CTL은 항원에 의해 감염된 기주의 세포를 파괴하는 것 이외에도, 체액성 면역반응이나 다른 세포성 면역반응에 관련된 세포들을 감염 부위에 끌어들이거나 면역 관련 세포들의 활성을 더 증가시키거나 또는 직접적으로 항원에 작용하여 항원의 감염성을 저해 또는 소멸시키는 작용을 하는 여러가지 사이토카인을 직접 분비하기도 하여 생체의 면역반응에서 근본적인 방어 역할을 담당한다.
이러한 점에서 본 발명의 재조합 아데노 바이러스는 결핵균의 항원에 대하여 특이적으로 우수한 세포매개성 면역반응을 유도하는 활성이 있음을 확인하였고, 이러한 효과는 BCG 백신에 비해 더 우수하다는 것을 실험을 통해 확인함에 따라, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 결핵 백신용으로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명은 본 발명의 재조합 아데노 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 결핵 예방용 백신 조성물은, 단독으로 접종되는 백신 조성물일 수 있거나 또는 BCG와의 병용 투여를 통하여 결핵 예방 효과를 가지는 부스터용 백신 조성물일 수 있다.
본 발명에서 백신 부스터용 조성물이란, 보호 면역을 증진, 연장 또는 유지하여 일차 투여된 백신 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 조성물을 의미하며, 일차 백신 접종을 마친 후, 일정 간격으로 필요에 따라 투여될 수 있는 조성물이다.
또한 상기 부스터(booster)용 백신 조성물은 BCG 백신 접종과 함께 처리되는 경우, 기존에 BCG에 의한 결핵 예방 효과가 미미한 병원성 결핵 균주에 대한 우수한 결핵 예방 효과를 달성할 수 있으며, 특히 면역 반응 유도를 통해 잠복 결핵의 재활성화를 효과적으로 억제할 수 있는 장점도 있다.
일차 예방 접종 및 부스터 접종을 포함하는 백신 투여 스케줄은, 환자에게 요구되는 한, 수일, 수주, 수년의 과정에 걸쳐 계속될 수 있다. 일부 양상으로, 백신 스케줄은 백신 요법의 시작 시에 가장 높은 빈도로 투여되며, 부스터 효과를 위한 부스터 백신의 투여는 점차 빈도를 줄여서 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 백신 조성물에는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및/또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성을 유지시킬 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한 본 발명의 백신 조성물에는 적어도 하나의 면역보조제를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 면역보조제는 수산화알루미늄을 포함하는 것일 수 있으며, 알하이드로겔(alhydrogel)을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 면역보조제는 사람 또는 동물에게 투여하는 경우 알레르기 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 것을 의미하나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
또한 본 발명의 백신 조성물에 포함된 본 발명의 재조합 아데노 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 백신 조성물에 포함된 재조합 아데노 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 결핵균 방어항원 단백질을 생산하여 세포 밖으로 분비하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 방어항원 단백질은 세포 내에서 생산된 후 분비신호 펩타이드에 의하여 세포 바깥으로 이송될 수 있다. 또한, 상기 결핵균 방어항원 단백질에 의하여 생체의 면역반응이 유도되며, 상기 면역반응에 의하여 생체 내에 결핵균에 대한 항체가 생성될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 결핵균에 대한 방어항원 단백질은 상기 기술한 본 발명의 항원성 재조합 융합 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
특히 본 발명의 항원성 재조합 융합 단백질은 생체 내에 결핵균에 대한 우수한 세포매개성 면역반응을 유도하여 결핵균에 대한 방어활성을 갖도록 한다.
본 발명의 백신 조성물은 투여를 위하여 약학적으로 수용할 수 있는 담체 및/또는 면역 보조제를 포함하여 인간 또는 수의학적 용도로 제형화 할 수 있다.
경구 투여 시, 예를 들어 캡슐제 또는 정제; 분말제 또는 과립제; 용제(solution), 시럽 또는 현탁제(suspension)(수성 또는 비수성 액상물 중; 식용 발포제(edible foam) 또는 휩 제형(whip formulation); 또는 유탁액제(emulsion)) 같은 별개의 단위로서 상기 백신 조성물을 제시할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
비경구(parental) 투여 시, 상기 백신 조성물은 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
주사용 제제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액을 만들시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균 분말제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
상기 투여는 근육주사, 피하주사, 또는 복강주사를 통한 투여인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 피투여자의 건강 상태, 체중, 성별 및 투여 목적 등에 따라 적절하게 용량을 설정하여 투여될 수 있다.
또한 본 발명은, 본 발명의 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법을 제공할 수 있다.
바람직하게 상기 방법은, tPA(tissue plasminogen activator) 유전자, Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및 상기 전달벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하되, 상기 전달벡터에는 tPA 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있다.
여기서 상기 tPA 유전자, Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자 및 상기 링커를 암호화하는 유전자의 서열은 앞서 기술한 바와 같다.
상기 "벡터"라는 용어는 벡터가 복제될 수 있는 세포 속으로 도입시키기 위한 외인성 뉴클레오티드 서열을 삽입시킬 수 있는 운반체 핵산 분자로 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 "외인성"일 수 있고, 이는 벡터를 도입시키는 세포에 대해 외부의 것이라는 의미이거나, 서열이 세포 내의 서열에 대해 상동이지만 서열이 통상적으로 발견되지 않는 숙주 세포 내의 위치에 핵산이 위치하는 것을 의미할 수 있다. 벡터에는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스 및 식물 바이러스) 및 인공 염색체(예: YAC)가 포함될 수 있다.
목적하는 유전자를 상기 벡터에 삽입하는 것은, 당 업계에 알려진 모든 유전자 재조합 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있으며, 상기 벡터를 상기 아데노 바이러스에 삽입하는 것은 당 업계에 알려진 모든 형질감염 방법 중에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것일 수 있다.
상기 벡터는 pEntr 벡터를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 벡터는 클로닝 벡터로서 pEntr-BHRNX를 사용하였고, 전달벡터로서 pAd/CMV/V5-DEST를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 제조합 아데노 바이러스 제조방법은, 상기 전달벡터를 아데노 바이러스에 삽입하여 제조된 재조합 아데노 바이러스에 의한 항원성 재조합 융합 단백질의 생성을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 재조합 아데노 바이러스에 의한 결핵균 방어항원, 즉 항원성 재조합 융합 단백질의 생성을 확인하는 것은 당 업계에 알려진 모든 단백질 검출 및/또는 검정 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 면역학적 방법에 의한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치(sandwich)" 면역검정, 면역침전 검정, 침전반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광성 면역검정, 또는 단백질 A 면역 검정 등에 의하여 결핵균 방어항원 단백질의 생성을 확인할 수 있으며, 또는 상기 결핵균 방어항원에 추가로 형광 단백질을 결합시켜 이를 이용한 형광 검출로 단백질의 생성을 확인할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
나아가 본 발명은 상기 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 재조합 융합 단백질은 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열, Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열 및 4개의 글라이신으로 이루어진 링커 펩타이드 서열이 융합된 것으로, 이때 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열 다음에는 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열이 3번 반복되어 위치하고, 상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열들은 상기 링커 펩타이드에 의해 서로 연결되어 있는 특징을 갖는다.
바람직하게, 상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열은 서열번호 5로 이루어진 것이고, 상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열은 서열번호 6으로 이루어진 것일 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 재조합 융합 단백질은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 상기 재조합 융합 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 구성요소와 기술적 특징을 다음의 실시예들을 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
결핵 항원인 Ag85B의 세포매개성 면역유도부위 분석
<1-1> Ag85B 항원에 대하여 세포매개성 면역유도 활성을 갖는 OLPs(overlapping peptides)의 제조
결핵균의 주요항원인 Ag85B에 대한 효과적인 T 세포 면역반응을 일으키는 에피토프를 선별하기 위하여, Ag85B 항원에 대한 아미노산 정보를 이용하여 15 mer의 펩타이드를 10개의 아미노산이 겹치는 오버랩핑 펩타이드(OLPs: overlapping peptides)를 각각 제조하였다. OLPs의 제조과정의 예시는 도 1에 나타내었다. 여기서 상기 Ag85B 단백질의 전체 아미노산 서열은 서열번호 8에 나타내었다.
<1-2> Ag85B의 OLPs(overlapping peptides)에 대한 세포매개성 면역유도반응 확인
상기 <1-1>에서 제조한 Ag85B 항원의 아미노산 서열로부터 제조된 총 64개의 OLPs(overlapping peptides)에 대하여, Ag85B에 대한 T 세포 면역반응이 가장 우수한 에피토프 부위를 확인하기 위해, Ag85B 항원을 3주 간격으로 2회 면역시킨 마우스의 비장세포를 분리한 후, 상기 <1-1>에서 제조한 OLPs 항원으로 자극한 후 IFN-γ 분비하는 세포를 ELISPOT 분석을 통해 측정하였다. 이때 ELISPOT 분석을 위해 분리된 비장세포는 웰당 2×105 세포로 분주하였고, OLPs 항원을 첨가한 후, 36시간 배양하고 당 업계에 공지된 ELISPOT 방법으로 분석하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Ag85B 항원의 #57번 펩타이드로 자극한 군에서 IFN-γ의 분비 세포가 가장 높은 특이적 반응을 보이는 것으로 나타났다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 결핵균의 주요 항원인 Ag85B에서 세포매개성 면역반응을 가장 효과적으로 유도할 수 있는 에피토프가 #57번 펩타이드라는 것을 알 수 있었으며, #57번 펩타이드의 서열은 서열번호 9에 나타내었다.
<실시예 2>
Ag85B의 에피토프 기반 재조합 아데노 바이러스의 제조
본 발명자들은 상기 실시예 1의 결과를 토대로 세포매개성 면역반응을 통한 결핵균의 감염을 효과적으로 예방 및 방어할 수 있는 새로운 결핵 백신을 개발하기 위해, 다음과 같이 결핵 H37Rv의 주요항원인 Ag85B의 에피토프 기반 재조합 아데노 바이러스 벡터 및 재조합 아데노 바이러스를 제조하였다.
먼저, Ag85B 단백질의 319번째부터 374번째 아미노산 서열을 3번 반복시키되 중간에 4개의 글라이신 잔기 링커(linker)를 포함하도록 한 후, 인간화 코돈 최적화를 진행하였고, 유전자 상류(N-말단)에 개시코돈 및 세포 내 분비 신호 펩타이드인 인간조직 플라스미노겐 활성화(tPA) 염기서열을 포함하여 유전자 합성을 진행하였고, 합성된 재조합 유전자(즉, 개시코돈+ tPA+Ag85B(319~374) 코딩 유전자+GGGG 코딩 유전자+Ag85B(319~374) 코딩 유전자+GGGG 코딩 유전자+Ag85B(319~374) 코딩 유전자가 순차적으로 연결된 유전자)의 염기서열은 서열번호 4에 나타내었다.
이후 합성된 재조합 유전자는 클로닝 벡터인 pEntr-BHRNX 벡터에 BamHI 및 XhoI 제한효소 사이트로 라이게이션하여 클로닝하였고, 대장균 DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환시키고 형성된 콜로니로부터 플라스미드를 분리하여 시퀀싱 분석을 통해 상기 재조합 유전자 합성이 제대로 되었는지를 확인하였다. 이후 클로닝된 플라스미드를 전달벡터인 pAd/CMV/V5-DEST 벡터에 LR Clonase II 효소를 이용하여 LR 재조합을 진행하였고, proteinase K를 처리하여 DH5α 컴피턴트 세포에 형질전환하였다. 이후 생성된 콜로니로부터 LR 재조합 반응을 통해 생성된 재조합 아데노 바이러스 벡터를 Pac I으로 처리한 다음, DNA를 분리하였다. 2% FBS OptiMEM 배지로 배양한 293A 세포에 리포펙타민을 이용하여 상기 재조합 아데노 바이러스 벡터로 형질감염시키고 37℃에서 하루 동안 배양시켰다. 다음 날, 10% FBS, 2mM L-glutamine, 1% penicillin/streptomycin을 포함한 DMEM 배지로 교체한 후, 48시간 배양한 다음, 직경 10cm의 플레이트로 옮겨서 계속 배양하였으며, CPE를 확인하며 10~13일간 배양하면서 80% 이상 CPE 플라크 형성을 확인하였다. 그런 뒤, 세포 용해물(lysate)를 수거하여 동결 및 해동 과정을 반복 실행한 후 원심분리를 하여 상층액을 따로 분리한 다음, 항원 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 방법으로 항원 단백질의 발현을 검증함으로써 본 발명에 따른 Ag85B의 에피토프 기반 재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri)가 제조되었음을 확인하였다.
본 발명의 Ag85B의 에피토프 기반 재조합 아데노 바이러스는 T175 기준으로 20~25% 293A 세포를 분주하여 배양하면서 본 발명의 재조합 바이러스에 의한 CPE가 확인되면 세포를 수확 후, 동결 및 해동 과정을 반복한 다음 원심분리하여 침전물은 제거하고 재조합 아데노 바이러스가 함유된 상층액을 바이알에 나누어 담아 보관하였다. 본 발명에 따른 Ag85B의 에피토프 기반 재조합 아데노 바이러스의 제작도는 도 3에 나타내었다.
<실시예 3>
면역원성 평가
상기 실시예 2에서 제조한 Ag85B을 이용한 재조합 결핵 항원의 에피토프를 탑재한 본 발명의 재조합 아데노 바이러스에 대하여 면역원성 여부를 하기 같은 실험들을 통하여 분석하였다.
<3-1> 마우스 면역화
생체 내(in vivo) 효능을 분석하기 위하여 백신후보물질을 이용하여 마우스를 면역화 하였다. 5~6 주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하였고, 제조된 결핵후보물질(본 발명의 재조합 아데노 바이러스)을 마우스에 투여하였는데, 이때 접종 도즈(1X103 ~ 1X106 IFU/ml) 및 접종 방법(피하주사(S.C.) 및 근육 내 주사(I.M.))을 각각 달리하여 3주 간격으로 2회 접종 후 최종 접종일로부터 1주 후에 마우스로부터 혈액, 비장 및 폐조직을 채취하였다. 또한, 혈액은 4℃에서 12시간 이상 방치한 후 원심분리하여 혈청을 분리하고 -70℃에 보관하였다. 또한 양성대조군으로는 본 발명의 재조합 아데노 바이러스 대신 BCG 백신을 투여한 군을 사용하였다.
<3-2> 체액성 면역분석(혈청 내 항원 특이적 IgG 역가 분석)
상기 <3-1>의 각 마우스 실험군으로부터 수득한 혈청에 대하여 혈청 내 항원 특이적 IgG 항체 역가를 ELISA 법으로 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, BCG 백신을 투여한 군에 비해 본 발명의 백신 후보 물질을 투여한 군이 결핵 항원 특이적 항체 반응이 더 높은 것으로 나타났다.
<3-3> IFN-γ 분비 세포수 분석을 통한 세포매개성 면역분석
본 발명의 결핵 백신 후보물질의 세포매개성 면역반응을 분석하기 위하여 상기 <3-1>의 각 마우스 실험군으로부터 수득한 비장 및 폐 조직으로부터 비장세포 및 폐세포를 각각 수득한 다음, 비장세포와 폐세포 각각에서 IFN-γ 분비 활성을 가진 세포수를 ELISpot으로 분석하였다. 비장세포는 비장을 갈아서 세포를 모은 후 적혈구 제거 용액을 사용하여 적혈구를 완전히 제거하고 RPMI 1640 배지를 사용하여 3회 세척 후 비장세포를 수득하였고, 폐세포는 폐조직을 잘게 갈아서 collagenase D를 첨가한 배지를 첨가하고 37℃ 항온 교반 반응기에서 1시간 동안 반응시킨 후, 40%/75%의 percoll gradient를 사용하여 2000 rpm으로 20분간 상온에서 원심분리한 다음, percoll gradient 사이에 걸리는 세포를 수득하여 사용하였다. 또한 상기 ELISpot 분석은 고착화효소항체법에 의한 항체생산 또는 각종 사이토카인생산 세포수를 측정하는 방법으로 알려져 있다.
분석 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 BCG 백신만 접종한 군에서는 IFN-γ를 분비하는 세포수가 거의 없는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 결핵 백신 후보물질을 접종한 군의 비장과 폐에서 모두 결핵 항원 특이적으로 IFN-γ를 분비하는 세포수가 BCG 백신 접종군에 비해 월등히 많이 존재하는 것으로 나타났다.
나아가 본 발명자들은 상기 각 마우스 실험군으로부터 분리된 폐세포와 비장세포에 대하여 결핵 항체인 PPD로 세포를 자극시킨 후, 각 세포에서 생성되는 IFN-γ의 생성능을 분석하였다. 또한 폐세포와 비장세포에 대하여 결핵 주요항원의 혼합물(Ag85B, ESAT-6 및 CFP-10의 항원 혼합물)로 세포를 자극시킨 후, 각 세포에서 생성되는 IFN-γ의 생성능을 분석하였다.
그 결과, PPD 항체로 자극시킨 군 및 결핵의 주요항원 혼합물로 자극시킨 군 모두에서 BCG 백신 접종군에 비해 본 발명의 결핵 백신 후보물질(재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri))를 접종한 군이 IFN-γ의 생성능이 월등히 우수한 것으로 나타났으며, 나아가 Ag85B 항원 전체 유전자를 탑재한 재조합 아데노 바이러스(rAD-Ag85B) 백신을 접종한 군에 비해서도 본 발명의 결핵 백신 후보물질을 접종한 군이 더 우수한 IFN-γ 생성능을 보이는 것으로 나타났다(도 6 참조).
<3-4> 다기능 T 세포 활성능 분석
본 발명의 결핵 백신 후보물질(재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri))이 IFN-γ, IL-2 또는 TNF-α를 분비하는 다기능 T-세포를 유도 및 활성화시킬 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명의 결핵 백신 후모물질을 접종 도즈 및 접종 방법을 각각 달리하여 접종한 후, 분리된 면역세포(CD4 및 CD8 T세포)를 유세포 분석기를 이용하여 다기능 T-세포 분포를 조사하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, BCG 백신 접종군에 비해 본 발명의 결핵 백신 후보물질을 접종한 군이 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포의 유도가 월등하게 증가된 것으로 나타났다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 결핵 백신 후보물질로 접종된 마우스의 폐세포 및 비장세포에서 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포의 활성을 다른 결핵 백신 접종군들과 비교하였는데, 이때 비교군으로 rAD-TB4 및 rAD-p85B 아데노 바이러스 결핵 백신을 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, BCG 백신 접종 군 및 다른 결핵 백신 접종 군에 비해 본 발명의 결핵 백신 후보물질을 접종한 군이 CD4+ 및 CD8+ 다기능 T 세포의 유도가 증가된 것으로 나타났다.
<3-5> 결핵균 감염 방어능 평가
본 발명의 결핵 백신 후보물질에 대한 결핵균 방어능을 확인하기 위해, BCG 접종 후, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스 결핵 백신 후보물질로 접종하여 2회 부스팅을 수행하였다. 부스팅 접종이 완료된 후, 결핵 균주 H37Rv를 이용하여 공격 감염을 수행하였고, 12주 뒤 마우스 폐를 대상으로 백신 접종에 따른 결핵 방어능을 분석하였다. 결핵 방어능의 분석은 각 마우스의 폐 조직에 대한 조직병리학적 분석을 통해 결핵 균수를 측정하였고, 결핵균 감염에 따른 염증 병변의 형성정도를 분석하였다. 상기 부스팅 접종에는 본 발명의 결핵 백신 후보물질(rAD-p85B-tri) 및 Ag85B 항원 전체를 탑재한 재조합 아데노 바이러스(rAD-Ag85B) 백신을 각각 사용하였다.
분석 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 폐조직 내 결핵균수를 확인한 결과, BCG 단독 처리군보다 본 발명의 결핵 백신 후보물질인 재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri) 백신으로 부스팅한 경우, 결핵균이 효과적으로 감소한 것으로 나타났고, 폐의 염증 병변도 BCG 단독 처리군에 비해 본 발명의 결핵 백신 후보물질을 처리한 군에서 더 억제되는 것으로 나타났으며, 나아가 rAD-Ag85B 부스팅 처리 군에 비해서도 더 우수한 것으로 나타났다.
따라서 본 발명의 결핵 백신은 단독으로 결핵 백신용으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 BCG 백신에 대한 부스터용 백신으로도 사용 가능함을 알 수 있었다.
이상의 결과를 통해 본 발명자들은 결핵 항원인 Ag85B로부터 세포매개성 면역유도가 우수한 특정 에피토프 영역을 확인하였고, 이를 이용하여 재조합된 결핵 항원의 에피토프를 탑재한 본 발명의 재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri) 백신을 제조하였으며, 상기 백신이 채액성 면역 및 세포매개성 면역반응을 동시에 유도할 수 있고, 또한 다기능 T 세포를 활성화시켜 결핵균을 효과적으로 예방 및 방어할 수 있음을 알 수 있었다. 나아가 본 발명의 결핵 백신은 종래 BCG 백신에 비해 더 우수한 백신 효과가 있음을 확인함으로써 BCG 백신을 대체할 수 있는 새로운 결핵 백신으로서 사용 가능함을 알 수 있었다. 상기 본 발명의 재조합 아데노 바이러스(rAD-p85B-tri) 백신을 한국생명공학연구원 한국미생물자원센터(KCTC)에 2021년 01월 12일에 기탁을 완료하였고, 수탁번호는 KCTC14447BP이다.
[본 발명에 사용된 서열번호]
서열명 해당서열 서열번호
tPA 염기서열 ATG GAT GCT ATG AAA CGA GGG CTC TGC TGT GTG CTG CTT TTG TGT GGT GCC GTT TTC GTC TCC CCA TCA 1
Ag85B의 319~374번째의
아미노산 서열에 대한 염기서열		 GAG AAT TTT GTT CGC TCT AGT AAC CTC AAA TTC CAA GAT GCC TAC AAC GCC GCT GGC GGA CAT AAT GCG GTC TTC AAT TTT CCT CCT AAT GGC ACG CAT AGC TGG GAG TAT TGG GGA GCA CAG CTC AAT GCA ATG AAG GGA GAT TTG CAA AGT TCA CTT GGT 2
GGGG 링커 펩타이드에 대한
염기서열		 GCA GGA GGT GGC 3
[tPA+Ag85B(319~374)+링커+Ag85B(319~374)+링커+Ag85B(319~374)]에 해당하는 염기서열 ATG GAC GCG ATG AAG CGC GGC CTC TGC TGC GTA CTC CTC CTT TGT GGC GCG GTG TTT GTG AGC CCT AGC GAG AAT TTT GTT CGC TCT AGT AAC CTC AAA TTC CAA GAT GCC TAC AAC GCC GCT GGC GGA CAT AAT GCG GTC TTC AAT TTT CCT CCT AAT GGC ACG CAT AGC TGG GAG TAT TGG GGA GCA CAG CTC AAT GCA ATG AAG GGA GAT TTG CAA AGT TCA CTT GGT GCA GGA GGT GGC GGA GGC GAA AAC TTT GTC CGG TCT TCA AAC TTG AAA TTC CAG GAC GCT TAC AAC GCC GCT GGA GGA CAC AAT GCG GTT TTC AAT TTT CCC CCA AAC GGG ACT CAT TCT TGG GAA TAT TGG GGC GCT CAG CTG AAC GCA ATG AAA GGG GAC CTC CAG AGC TCT TTG GGC GCG GGC GGG GGT GGC GGT GAA AAT TTT GTG AGA AGT TCC AAT TTG AAA TTC CAA GAC GCC TAT AAC GCT GCC GGC GGA CAT AAC GCA GTC TTC AAC TTT CCA CCA AAT GGC ACG CAC AGC TGG GAA TAC TGG GGG GCA CAG CTG AAT GCG ATG AAG GGC GAT CTG CAA TCT TCT CTT GGT GCC GGA tga tttttat ggcc ctgca ggcc ctcgag 4
tPA 아미노산 서열 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS 5
Ag85B의 319~374번째에 대한
아미노산 서열		 ENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG 6
[tPA+Ag85B(319~374)+링커+Ag85B(319~374)+링커+Ag85B(319~374)]에 해당하는 아미노산 서열 MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS
ENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG GGGG
ENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG
GGGG ENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG 		7
Ag85B 단백질 전체에 대한
아미노산 서열		 MTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGR
DIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYS
DWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHP
QQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKL
VANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNG
THSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG 		8
#57 OLP 서열 FQDAYNAAGGHNAVF 9
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC14446BP 20210112 한국생명공학연구원 KCTC14447BP 20210112
<110> Korea Disease Control and Prevention Agency <120> Recombinant adenovirus using an epitope of Ag85B, method for preparing the same and vaccine composition for preventing tuberculosis comprising the same <130> PN2010-504 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA <400> 1 atggatgcta tgaaacgagg gctctgctgt gtgctgcttt tgtgtggtgc cgttttcgtc 60 tccccatca 69 <210> 2 <211> 162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of Ag85B <400> 2 gagaattttg ttcgctctag taacctcaaa ttccaagatg cctacaacgc cgctggcgga 60 cataatgcgg tcttcaattt tcctcctaat ggcacgcata gctgggagta ttggggagca 120 cagctcaatg caatgaaggg agatttgcaa agttcacttg gt 162 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker peptides for GGGG <400> 3 gcaggaggtg gc 12 <210> 4 <211> 626 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA+Ag85B(position 319~374)+linker peptide+Ag85B(position 319~374)+linker peptide+Ag85B(position 319~374) <400> 4 atggacgcga tgaagcgcgg cctctgctgc gtactcctcc tttgtggcgc ggtgtttgtg 60 agccctagcg agaattttgt tcgctctagt aacctcaaat tccaagatgc ctacaacgcc 120 gctggcggac ataatgcggt cttcaatttt cctcctaatg gcacgcatag ctgggagtat 180 tggggagcac agctcaatgc aatgaaggga gatttgcaaa gttcacttgg tgcaggaggt 240 ggcggaggcg aaaactttgt ccggtcttca aacttgaaat tccaggacgc ttacaacgcc 300 gctggaggac acaatgcggt tttcaatttt cccccaaacg ggactcattc ttgggaatat 360 tggggcgctc agctgaacgc aatgaaaggg gacctccaga gctctttggg cgcgggcggg 420 ggtggcggtg aaaattttgt gagaagttcc aatttgaaat tccaagacgc ctataacgct 480 gccggcggac ataacgcagt cttcaacttt ccaccaaatg gcacgcacag ctgggaatac 540 tggggggcac agctgaatgc gatgaagggc gatctgcaat cttctcttgg tgccggatga 600 tttttatggc cctgcaggcc ctcgag 626 <210> 5 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA protein <400> 5 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 6 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope of Ag85B <400> 6 Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn 1 5 10 15 Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr 20 25 30 His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp 35 40 45 Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly 50 55 <210> 7 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tPA+Ag85B(position 319~374)+linker peptide+Ag85B(position 319~374)+linker peptide+Ag85B(position 319~374) protein <400> 7 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu 20 25 30 Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe 35 40 45 Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln 50 55 60 Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp 85 90 95 Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro 100 105 110 Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met 115 120 125 Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Glu 130 135 140 Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala 145 150 155 160 Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His 165 170 175 Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu 180 185 190 Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly 195 <210> 8 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ag85B protein <400> 8 Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met 1 5 10 15 Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala 20 25 30 Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val 35 40 45 Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val 50 55 60 Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp 65 70 75 80 Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro 85 90 95 Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val 100 105 110 Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly 115 120 125 Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu 130 135 140 Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser 145 150 155 160 Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala 165 170 175 Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu 180 185 190 Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met 195 200 205 Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser 210 215 220 Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu 225 230 235 240 Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro 245 250 255 Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe 260 265 270 Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly 275 280 285 Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp 290 295 300 Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser 305 310 315 320 Ser Leu Gly Ala Gly 325 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> #57 OLP <400> 9 Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe 1 5 10 15

Claims (16)

  1. tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자;를 포함하고,
    상기 tPA(tissue plasminogen activator) 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는,
    결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스(수탁번호 KCTC14447BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 tPA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고,
    상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스(수탁번호 KCTC14447BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 결핵 예방 또는 결핵 백신 부스팅(boosting) 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스(수탁번호 KCTC14447BP).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 세포매개성 면역유도 및 다기능 T 세포 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스(수탁번호 KCTC14447BP).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 아데노 바이러스를 유효성분으로 포함하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 결핵 예방 또는 결핵 백신 부스팅(boosting) 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 근육 주사 또는 피하 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 세포매개성 면역유도 및 다기능 T 세포 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포매개성 면역유도는 IFN-γ 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 다기능 T 세포 유도 활성은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인을 분비하는 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 결핵균에 감염된 폐조직의 손상억제 및 폐에서 결핵균 수 감소를 유도하는 것을 특징으로 하는, 결핵 예방용 백신 조성물.
  12. tPA(tissue plasminogen activator) 유전자; 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자; 및 4개의 글라이신 펩타이드로 이루어진 링커를 암호화하는 유전자를 전달벡터에 삽입하는 단계; 및 상기 전달벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 단계를 포함하되, 상기 전달벡터에는 tPA 유전자 다음에 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자가 3번 반복하여 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프를 암호화하는 유전자들은 상기 링커를 암호화하는 유전자에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는,
    결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 tPA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것이고,
    상기 링커를 암호화하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 항원성 재조합 융합 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는,
    결핵 백신 제조용 재조합 아데노 바이러스의 제조방법.
  15. 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물로서,
    상기 재조합 융합 단백질은 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열, Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열 및 4개의 글라이신으로 이루어진 링커 펩타이드 서열이 융합된 것으로,
    상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열 다음에 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열이 3번 반복되어 위치하며, 상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열들은 상기 링커 펩타이드에 의해 서로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는,
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 tPA(tissue plasminogen activator) 펩타이드 서열은 서열번호 5로 이루어진 것이고,
    상기 Ag85B의 에피토프에 대한 펩타이드 서열은 서열번호 6으로 이루어진 것을 특징으로 하는,
    서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물.

KR1020210013302A 2021-01-29 2021-01-29 Ag85B의 에피토프를 이용한 재조합 아데노 바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 결핵 예방용 백신 조성물 KR102377090B1 (ko)

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