CN108239660B

CN108239660B - 一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用

Info

Publication number: CN108239660B
Application number: CN201611217582.4A
Authority: CN
Inventors: 朱琳; 杨炯明; 张群; 托马斯·G·伊凡斯; 拉维·P·阿娜扎; 肯尼斯·巴里·沃克; 楼觉人
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2021-08-10
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN108239660A

Abstract

本发明涉及一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用。本发明的疫苗能有效增强接种人群机体的特异I型细胞免疫，强化接种人群对结核杆菌的免疫防护力；本发明的疫苗配合卡介苗联合应用，能够改变单独使用BCG对部分个体以及感染过结核分枝杆菌人群无效的状况，达到降低结核病发病率的目的。

Description

一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物工程和免疫领域，更具体地，本发明涉及一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用。

背景技术

结核病(tuberculosis，TB)已成为当今世界威胁人类健康的第一大传染病。据WHO统计，全球现有结核病患者约2000万，2013年新发病例约900万，每年有近200万人死于结核病。在中国，有5.5亿人感染结核，年发病人数约130万，位居全球第2位。

结核病的致病菌是结核杆菌，属于放线菌目分枝杆菌科分枝杆菌属。结核杆菌主要通过呼吸道传播，还可通过消化道进入人体。结核杆菌被吞噬细胞吞噬后可经淋巴-血循环散播到全身，在人体免疫力低下时而造成多种系统或脏器的结核病变，如骨结核、肾结核、生殖器结核、结核性脑膜炎等。

传统疫苗卡介苗(BCG)作为当今世界上唯一预防结核病的疫苗，长期使用结果表明，其免疫效果存在不足，BCG对儿童结核病能起到一定的预防作用，但对于成年人结核病的保护能力变化很大(0～80％)，并且无法应用于免疫缺陷患者；同时随着人口流动的增加、多重耐药结核菌株的出现、结核分枝杆菌与HIV伴发感染的发生以及BCG接种防护的自身局限性等因素，结核病的发生率在全球呈明显上升趋势，但目前尚没有新的疫苗可以完全取代BCG。

因此，研发更有效、更安全、适用于各类人群使用的防治结核病的疫苗，以及研究更为有效的临床治疗手段，势在必行。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用。

在本发明的第一方面，提供一种重组病毒载体，所述的重组病毒载体包括一表达盒，所述表达盒包括操作性连接的以下抗原的编码序列：ESAT6、Rv1733c、Rv2626c、RpfD。

在一个优选例中，所述的表达盒中还包括以下抗原的编码序列：Ag85B。

在另一优选例中，所述的表达盒中，按照5’→3’的次序，抗原依次为ESAT6，Rv1733c，Rv2626c，RpfD；或抗原依次为Ag85B，ESAT6，Rv1733c，Rv2626c，RpfD。

在另一优选例中，所述的表达盒中，在所述抗原的上游，还包括Kozak序列和TPA序列；较佳地，按照5’→3’的次序，Kozak序列和TPA序列以Kozak-ATG-TPA的方式连接。

在另一优选例中，所述的表达盒中，还包括：位于所述的抗原的编码序列的上游的启动子，和/或位于所述的抗原的编码序列下游的终止子；从而构成表达所述抗原的表达盒。

在另一优选例中，各个抗原之间，以限制性内切酶序列相间隔。

在另一优选例中，所述的ESAT6的编码序列如SEQ ID NO：2所示；所述的Rv1733c的编码序列如SEQ ID NO：3所示；所述的Rv2626c的编码序列如SEQ ID NO：4所示；所述的RpfD的编码序列如SEQ ID NO：5所示；或所述的Ag85BSEQ ID NO：1所示。

在本发明的另一方面，提供所述的重组病毒载体的用途，用于制备重组病毒，所述的重组病毒能够诱导机体产生对抗结核杆菌的免疫保护力。

在本发明的另一方面，提供一种制备重组病毒的方法，所述方法包括：通过同源重组将所述的重组病毒载体导入病毒中，获得重组病毒。

在一个优选例中，所述的病毒选自：痘(痘苗)病毒，腺病毒、单纯疱疹病毒、微小RNA病毒、黄病毒；较佳地是痘病毒和腺病毒；更佳地是牛痘病毒MVA株或复制缺陷型腺病毒Ad5。

在本发明的另一方面，提供一种重组病毒，所述的重组病毒由所述的方法制备获得。

在本发明的另一方面，提供所述的重组病毒的用途，用于制备防治结核病的疫苗组合物。

在一个优选例中，用于制备与卡介苗联合给药的组合物或药盒，所述的组合物或药盒在应用于给药后、比单以卡介苗给药具有更强的对抗结核杆菌的免疫保护力。

在另一优选例中，在应用重组病毒和卡介苗免疫时，首先以BCG进行初免再以本发明所述的重组病毒疫苗进行加强免疫。

在本发明的另一方面，提供一种重组病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括：所述的重组病毒；以及药学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的疫苗组合物还包括：卡介苗。

在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的重组病毒，或所述的重组病毒疫苗组合物。

在一个优选例中，所述的药盒中还包括：卡介苗。

在另一优选例中，在应用所述的药盒进行临床免疫时，首先以BCG进行初免再以本发明所述的重组病毒疫苗进行加强免疫。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、pA-5Ag重组克隆鉴定结果。1，表达质粒pA(EcoRI/HindIII)；2，1kDa DNALadder；3～8，pA-5Ag阳性重组克隆1#～6#。

图2、pA-4Ag重组克隆鉴定结果。1和10，100bp DNA Ladder；9和20，1kb DNALadder；2～8，11～19，鉴定克隆1#～16#。

图3、重组病毒MVA-4Ag和MVA-5Ag的Western Blot鉴定结果。1～3，重组病毒MVA-4Ag表达样品；4～6，重组病毒MVA-5Ag表达样品；7，MVA原始株(MVA empty)表达样品；8，细胞对照(cells only)；9，Protein Ladder。

图4、小鼠组织荷菌载量。A：结核分枝杆菌感染4周后的小鼠肺部与脾脏荷菌载量结果；B：结核分枝杆菌感染12周后的小鼠肺部与脾脏荷菌载量结果。

图5、各组实验猴在不同组织的病理大体总评分。其中，组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+4Ag组)。

图6、各组实验猴在不同组织的细菌载量。其中，组1，未免疫组；组2，BCG免疫组；组3，实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图7、结核感染后实验猴体重变化。其中，组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图8、结核感染后实验猴食欲变化。其中，组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图9、结核感染后实验猴咳嗽情况的记录。其中，组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图10、实验猴的胸部CT扫描结果评分。其中组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图11、实验猴的ESR水平变化。其中，组1；未免疫组；组2：BCG免疫组；组3：实验组(BCG+MVA-4Ag组)。

图12、重组MVA-5Ag0-4的Western Blot鉴定结果。M：Protein ladder，1-2：阴性对照，3-7：MVA-5Ag0/1/2/3/4。

图13、MVA-5Ag0/1/2/3/4组及对照的小鼠淋巴细胞增殖实验。

图14、MVA-5Ag0/1/2/3/4组及对照中，CD4⁺/CD8⁺淋巴细胞所占比例。

图15、小鼠淋巴细胞分泌细胞因子检测结果；A：经刺激后不同免疫组小鼠淋巴细胞分泌IL-2的细胞数量；B：经刺激后不同免疫组小鼠淋巴细胞分泌IL-4的细胞数量；C：经刺激后不同免疫组小鼠淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞数量；D：经刺激后不同免疫组小鼠淋巴细胞分泌TNF-α的水平(pg/ml)。

具体实施方式

本发明人致力于以病毒为载体的新型重组结核杆菌疫苗的研究，以及提高结核病的防治效果，经过长期的研究和筛选，开发了的一种新型重组结核杆菌疫苗。本发明的疫苗能有效增强接种人群机体的特异I型细胞免疫，强化接种人群对结核杆菌的免疫防护力；本发明的疫苗配合卡介苗(BCG)联合应用，能够改变单独使用BCG对部分个体以及感染过结核分枝杆菌人群无效的状况，达到降低结核病发病率的目的。

如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原”指可引发哺乳动物免疫应答的肽，无论是单独或融合，或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。

如本文所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。

如本文所用，“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受或已受结核杆菌感染的对象。

如本文所用，所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

本发明将ESAT6、Rv1733c、Rv2626c和RpfD，较佳地将Ag85B、ESAT6、Rv1733c、Rv2626c和RpfD联合应用，获得了新型的重组结核杆菌疫苗。

如本文所用，术语“Ag85B”是指结核杆菌分泌性蛋白Ag85中的b组分，其可引起结核杆菌感染者T细胞增殖和INF-γ释放。本发明所用Ag85B编码序列可以是结核杆菌中天然存在的Ag85B序列或其保留抗原的免疫原性的变体，只要其具有与天然Ag85B相同或类似的功能，其可以是人工合成的序列或重组表达的序列；优选地，其包含如SEQ ID NO：1所示的经密码子优化的序列，从而有利于融合抗原的表达。

如本文所用，术语“ESAT6”即“结核早期分泌抗原性靶-6”(Early secretoryantigenic target-6)，其能广泛地被感染结核菌的不同种属动物及不同遗传背景的个体细胞所识别，并在保护性免疫中发挥作用。本发明所用ESAT6基因可以是结核杆菌中天然存在的ESAT6序列或其保留抗原的免疫原性的变体，只要其具有与天然ESAT6相同或类似的功能，其可以是人工合成的序列或重组表达的序列；优选地，其包含如SEQ ID NO：2所示的经密码子优化的序列。

如本文所用，术语“Rv1733”是指结核杆菌潜伏期蛋白Rv1733，其可诱导长效的Th1型免疫反应，对于加强BCG的免疫效力，防止潜伏性结核病的复发具有重要作用。本发明所用Rv1733编码序列可以是结核杆菌中天然存在的Rv1733序列或其保留抗原的免疫原性的变体，只要其具有与天然Rv1733相同或类似的功能，其可以是人工合成的序列或重组表达的序列；优选地，其包含如SEQ ID NO：3所示的经密码子优化的序列。

如本文所用，术语“Rv2626”是指结核杆菌潜伏期表达的分泌蛋白Rv2626，能与巨噬细胞表面蛋白结合，对于加强BCG的免疫效力，防止潜伏性结核病的复发具有重要作用。本发明所用Rv2626编码序列可以是结核杆菌中天然存在的Rv2626序列或其保留抗原的免疫原性的变体，只要其具有与天然Rv1733相同或类似的功能，其可以是人工合成的序列或重组表达的序列；优选地，其包含如SEQ ID NO：4所示的经密码子优化的序列。

如本文所用，术语“RpfD”是指结核杆菌潜伏期表达的分泌蛋白RpfD，能与巨噬细胞表面蛋白结合，对于加强BCG的免疫效力，防止潜伏性结核病的复发具有重要作用。本发明所用RpfD编码序列可以是结核杆菌中天然存在的RpfD序列或其保留抗原的免疫原性的变体，其可以是人工合成的序列或重组表达的序列，只要其具有与天然Rv1733相同或类似的功能；优选地，其包含如SEQ ID NO：5所示的经密码子优化的序列。

作为本发明的优选方式，本发明的重组病毒载体的表达盒中，还包括Kozak序列和TPA序列；较佳地，还包括与起始密码子ATG的连接；更佳地，按照5’→3’的次序，它们以Kozak-ATG-TPA的方式连接。在所述抗原的编码序列的下游，还包括终止密码子序列；较佳地，所述终止密码子序列为TAATGATAG。

作为本发明的优选方式，所述的表达盒中，按照5’→3’的次序，抗原依次为ESAT6，Rv1733c，Rv2626c，RpfD；或抗原依次为Ag85B，ESAT6，Rv1733c，Rv2626c，RpfD。蛋白的不同排列方式经常会导致表达及蛋白性能的变化，因此，本发明人对于不同排列方式的抗原在表达后的免疫效果进行了研究。本发明人的实验结果显示，抗原的这种串联方式能够良好地实现表达，并保留抗原的免疫原性，在动物实验中呈现了比其它串联排列方式更为优异的效果。

作为本发明的更优选方式，各抗原序列之间以限制性内切酶序列相间隔，优选地为5Ag：Kozak-ATG-TPA-Ag85b-XmaI-ESAT6-BstBI-Rv1733-mod-PvuI-Rv2626-AscI-RpfD-Stop；4Ag：Kozak-ATG-TPA-ESAT6-BstBI-Rv1733-mod-PvuI-Rv2626-AscI-RpfD-Stop)。

本发明通过同源重组的方法，将所述的重组病毒载体导入病毒中，获得重组病毒。所述的病毒可以选自：痘(痘苗)病毒，腺病毒、单纯疱疹病毒、微小RNA病毒、黄病毒；较佳地是痘病毒和腺病毒，例如牛痘病毒MVA株或复制缺陷型腺病毒Ad5；最佳地是牛痘病毒MVA株(Modified Vaccinia VirusAnkara，MVA)。在前期研究过程中，曾尝试将所选的该4个抗原或5个抗原通过其它方式与卡介苗联合应用，也曾尝试将所述的该4个抗原或5个抗原放在牛痘病毒株以外的其它载体中制备疫苗，结果效果显著不如应用牛痘病毒MVA株的情形。特别是在结核感染动物模型免疫保护实验中，本发明人发现，将所选的该4个抗原或5个抗原藉由牛痘病毒MVA株制备疫苗，免疫效果极为理想；不存在本领域常见的当将疫苗应用于结核感染动物(如猴)模型免疫保护实验或临床针对病人免疫时效果不够理想的情况。应用MVA表达，抗原能在细胞内进行正确的翻译后加工、修饰，保留了相应的抗原性以及免疫原性；MVA本身也是很好的天然佐剂，可诱导机体产生持续的体液免疫及细胞免疫；且MVA由于基因的大量缺失，虽能感染绝大部分人体细胞并表达蛋白，但不增殖，因此应用于免疫低下患者可避免产生播散性感染，从而更具安全性，是非常理想的疫苗用病毒载体。

本发明所述的重组病毒，可用于制备防治结核病的疫苗组合物。所述的组合物包含：有效量的本发明所述的重组病毒(如病毒颗粒)，和药学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的重组病毒(如病毒颗粒)施用于对象，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明还提供了一种药盒，所述的药盒中含有本发明所述的疫苗组合物；更佳地，所述的药盒中还含有BCG。较佳地，所述的药盒中还可包含说明所述的疫苗组合物和/或BCG的使用方法的使用说明书，以指导本领域人员的应用。

在本发明的优选方式中，将本发明的新型结核疫苗配合卡介苗(BCG)联合应用。利用BCG初次免疫，在BCG初次免疫基础上、应用本发明的疫苗进行再次免疫。实验结果显示，这种应用可强化接种个体对结核杆菌的免疫防护力，改变单独使用BCG对成人以及感染过结核分枝杆菌人群无效的状况，从而达到降低结核发病率的目的。

在本发明的具体实施例中，本发明人将上述目的抗原基因导入转染质粒。将重组质粒通过基因同源重组技术导入病毒载体中，经过多轮加压筛选，获得携带结核抗原的重组病毒MVA-5Ag和MVA-4Ag。继而，进行了结核感染小鼠模型免疫保护实验，用这2种重组痘苗病毒对小鼠以BCG初免-重组MVA疫苗再免(Prime-boost)的方式进行免疫，来进行结核感染小鼠模型免疫保护实验。结果表明，重组痘苗病毒MVA-5Ag和MVA-4Ag在BCG初免的基础上对小鼠加强免疫后，可以增强BCG的免疫保护作用，并且诱导小鼠产生温和而持久的免疫反应。

更进一步地，本发明人利用结核杆菌感染非人灵长动物——恒河猴模型，验证和评估重组痘苗病毒MVA-4Ag对机体感染结核杆菌的预防保护性。在长达46周的实验过程中完成中国恒河猴进行BCG初免-重组亚牛痘病毒二次加强免疫(Prime-boost)、结核分枝杆菌H37Rv株攻击实验组(BCG+MVA-4Ag组)和对照组(未免疫组和BCG组)，在14周的时间内定期观察每只实验动物的临床表现、检测各项免疫及病理指标，进行对重组痘苗病毒预防结核病的效果评定。结果显示，与未免疫组和BCG组相比，实验组(BCG+MVA-4Ag组)的病理大体总评分显著性低于2个对照组的病理大体总评分，差异具有统计学意义(P<0.05)。病理大体总评分值越高，表明实验动物感染结核的程度越严重，反之，评分越低，表明实验动物感染结核的程度越轻。该项结果可以充分表明实验组(BCG+MVA-4Ag组)作为BCG初免后的加强疫苗，能产生较BCG单次免疫更好抗结核的免疫保护效果。图6的实验动物的病变组织细菌载量的结果中，实验组(BCG+MVA-4Ag组)在肺脏各叶及脾脏中所检测到的组织荷菌数均低于未免疫组和BCG组，但由于样本量较小的缘故，并不是所有的差异都具有统计学意义的。组织荷菌数越高，表明结核感染的程度越严重；反之则表明结核感染的程度越轻，所用疫苗的抗结核效果越好。

结核病是慢性消耗性疾病，活动性结核的标志性症状为咳嗽，有时伴有痰和血，还有胸痛、乏力、体重下降、食欲减退、发热和盗汗等。在整个实验期间，本发明人对食欲、咳嗽、体重等临床指证变化，以及ESR这项炎症指标的变化进行了监测。在感染后，实验组(BCG+MVA-4Ag组)的所有实验猴均未出现食欲下降；而BCG组除3只实验猴未出现明显的食欲下降外，其余猴子均被观察到有食欲下降的表现；未免疫组仅2只实验猴未出现食欲下降，有4只实验猴在感染后出现了持续性的食欲减退症状。在实验终点时，实验组(BCG+MVA-4Ag组)的所有实验猴均未出现体重减轻，相反体重均有不同程度增加；BCG组中编号为AMP10的实验猴在感染后体重出现持续性下降，至实验终点时下降的了较感染前15.7％；未免疫组中有3只实验猴在实验终点时体重较感染前下降，编号为AMP03的实验猴，虽未出现明显的体重下降，但是在实验终点3周前死亡。未免疫组在感染后有3只实验猴出现严重持续的咳嗽；BCG组中有1只实验猴感染后出现严重持续的咳嗽，有5只实验猴有过中度咳嗽症状；实验组(BCG+MVA-4Ag组)5只猴子在感染后有出现过咳嗽的症状，并没有猴子出现严重持续的咳嗽。血沉ESR加速，表明结核感染的严重。感染后，未免疫组中和BCG组中具有实验猴被检测到ESR值快速升高；而实验组(BCG+MVA-4Ag组)的所有实验猴均未检测到ESR水平快速升高，ESR值始终保持在较低的水平。

本发明人还对经BCG初免-重组亚牛痘病毒再免(Prime-boost)的恒河猴进行结核杆菌攻毒实验。结果显示，用BCG初免/MVA-4Ag加强免疫的策略无论是在临床症状、血清学检测、病理组织大体总评或是病变组织细菌载量的结果，均表现出较BCG单次免疫组更好的抗结核的免疫保护力，表明本发明的疫苗确实能增强BCG抗结核的效果，可以成为一种安全有效、适用于各种人群的新型结核病疫苗。

在BCG初免的基础上，作为加强疫苗，以进一步增强接种人群机体的特异Ⅰ型细胞免疫，强化接种人群对结核杆菌的免疫防护力，改变单独使用BCG对成人以及感染过结核分枝杆菌人群无效的状况，达到降低结核发病率的目的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

重组病毒构建实验材料如下：

菌株：结核杆菌H37Rv(ATCC)，大肠杆菌Top10。

毒株：牛痘病毒MVA株，购自ATCC。

细胞株：病毒扩增细胞株BHK21，病毒表达细胞株BSC40，均购自ATCC。

质粒：pA，获自上海生物制品研究所。

pVAX-5Ag(pVAX-Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)构建：串联各抗原基因获得Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD及Kozak-TPA-Ag85B基因序列，通过基因合成获得。将抗原基因Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD导入质粒pVAX-1中，通过PCR技术将(Kozak)-TPA-Ag85B序列，取代抗原基因Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD中的Ag85B，获得重组质粒pVAX-(Kozak-TPA)Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD(下文抗原名称中均省略“Kozak-TPA”)，即下文所述的pVAX-5Ag。并且，在设计、合成序列时，各抗原之间以限制性内切酶编码序列相互连接，具体为Kozak-ATG-TPA-Ag85b-XmaI-ESAT6-BstBI-Rv1733-mod-PvuI-Rv2626-AscI-RpfD-Stop。

为了改进表达效果，本发明人对各抗原的编码序列，进行了密码子优化，Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD及Kozak-TPA-Ag85B中，Ag85B优化后序列如SEQ ID NO：1所示；ESAT6优化后序列如SEQ ID NO：2所示；Rv1733c优化后序列如SEQ ID NO：3所示；Rv2626c优化后序列如SEQ ID NO：4所示；RpfD优化后序列如SEQ ID NO：5所示；TPA序列为GACGCCATGAAGAGGGGCCTGTGTTGCGTGCTGCTCCTGTGTGGCGCCGTGTTCGTGAGCCCCAGC(SEQ ID NO：6)；Kozak的氨基酸序列为GCCACC。

试剂：TIANprep Mini Plasmid Kit、TIANgel Midi Purification Kit，获自TIANGEN公司；限制性内切酶、pfu酶、DNA连接酶，获自Fermatas公司或MBI公司。

细胞培养基：MEM(10％FBS)、DMEM(10％FBS)、细胞培养试剂，获自GIBCO公司；细胞培养胎牛血清：获自AusGeneX公司。

转染试剂盒：X-tremeGene 9DNA Transfection Reagent(罗氏)、麦考酚酸(MPA)、黄嘌呤、次黄嘌呤(SIGMA公司)。

抗体：购自Abcam公司。

小鼠：CB6F1小鼠，雌性，6-8周龄。

恒河猴：中国恒河猴，3岁，共24只，12只雌性，12只雄性。所有实验动物身体状况良好，且排除特定细菌和病毒感染，X光胸检正常，tuberculin皮试阴性，符合实验标准。

所有实验动物由武汉大学ABSL-Ⅲ实验室饲养。攻击感染前，所有实验猴饲养在清洁级实验室内；攻击感染后，全部移至ABSL-Ⅲ实验室饲养。动物实验所有方案的伦理合法性经过武汉大学实验动物管理委员会批准。

统计学分析：采用SPSS16.0软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差

表示，组间比较采用方差分析，当P<0.05时为差异具有统计学意义。

实施例1、p5Ag(Kozak-TPA-pAg85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)重组质粒构建

本实施例中，将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒p5Ag(pKozak-TPA-Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)。

1.1获得酶切后的载体

如表1配制酶切体系。

表1(μl)

样品名	表达质粒pA	10×O缓冲液	EcoRI	SalI	ddH<sub>2</sub>O
						载体	20	4.5	1	1	46

混匀后，37℃反应2小时。酶切产物用核酸胶回收试剂盒TIANgel MidiPurification Kit纯化，得到40μl产物。

1.2获得酶切后的插入片段

如表2配制酶切体系。

表2(μl)

混匀后，37℃反应1小时。酶切产物用核酸胶回收试剂盒TIANgel MidiPurification Kit纯化，得到40μl产物。酶切获得的片段简称为5Ag，用于后续连接。

1.3片段和载体的连接

如表3配制酶切体系。

表3(μl)

混匀后，16℃反应6小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒p5Ag。

1.4重组质粒的转化

取20μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coli Top10＇)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→加入250μl LB培养液，置37℃水浴培养30分钟→将菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取6个克隆，接种于2.5ml LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。

2、阳性重组克隆的鉴定

将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒TIANprep Mini Plasmid kit(TIANGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。

如表4配制酶切体系。

表4(μl)

混匀后，37℃反应1.5小时。电泳鉴定，有目的条带5Ag(Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD 2652bp)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确。扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了p5Ag(p Kozak-TPA-Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)重组克隆，简写为“pA-5Ag”。鉴定结果见图1。

由图1可见，所有挑的6个克隆经限制性内切酶EcoRI/HindIII酶切后，均获得与设计的插入片段5Ag分子量大小一致的片段，证明所挑取的克隆均是阳性克隆，经测序确定插入基因的序列正确。

实施例2、p4Ag(pKozak-TPA-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)重组质粒的构建

本实施例中，将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒p4Ag(pESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)。

1、PCR获得并扩增Kozak-TPA-ESAT6(370bp)片段

4Ag正向引物(SEQ ID NO：7)：cgaattcgccaccatggacgccatgaagaggggcctgtgttgcgtgctgctcctgtgtggcgccgtgttcgtgagccccagcaccgagcagcagtgga

4Ag反向引物(SEQ ID NO：8)：gcttcgaaggcgaacatgccggtcaca

模板：p5Ag(pAg85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)或结核杆菌H37Rv基因组。

反应体系如表5。

表5、PCR反应体系(μl)

PCR反应条件：95℃3分钟→(95℃30秒→70℃30秒→72℃60秒)30个循环→72℃10分钟。

PCR产物的回收：用PCR产物用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi PurificationKit纯化，得到ESAT6(370bp)片段30μl。

此外，ESAT6的380bp也可用人工合成方法制备。

2、将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒

2.1酶切片段和载体(μl)

如表6配制酶切体系。

表6

混匀后，37℃反应2小时。电泳鉴定载体酶切完全，酶切产物用核酸胶回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化，载体样品回收大片段，得到30μl产物(载体：7kb，插入片段370bp)。

2.2片段和载体的连接(μl)

如表7配制酶切体系。

表7

混匀后，16℃反应1小时，移至冰浴，终止反应，从而获得连接产物，即质粒pA-4Ag。

2.3重组质粒的转化

取20μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coli Top10＇)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→加入250μl LB培养液，置37℃水浴培养30分钟→将菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取16个克隆，接种于2.5ml LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。

3、阳性重组克隆的鉴定

酶切反应体系(μl)如表8。

表8

样品	10×tango缓冲液	BstBI	EcoRI	ddH<sub>2</sub>O
					8	6	1	1	14

混匀后，37℃反应1.5小时。

电泳鉴定，有目的条带(ESAT6 370bp)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确。扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了p4Ag重组克隆，结果见图2。

由图2可见，所有挑的16个克隆经限制性内切酶BstBI/EcoRI酶切后，其中克隆1#～6#、11#、13#、14#和16#均获得与设计的插入片段ESAT6分子量大小一致的片段，证明这些克隆为阳性克隆，经测序确定插入基因的序列正确。

实施例3、重组病毒颗粒的获得、扩增与鉴定

本实施例中，通过同源重组将实施例1-2中制得的2种重组表达质粒分别导入牛痘病毒MVA中。

1、重组表达质粒转染牛痘病毒

1.1准备对数生长期的BHK21细胞感染0.1PFU的牛痘病毒MVA株。

1.2 MVA感染后1小时后，移去病毒液，换新无双抗培养基37℃孵育2小时，分别转染上述2种重组表达质粒。

1.3 37℃培养3天后收获病毒，并反复冻融3次。

1.4将冻融后的细胞裂解液再次感染BHK21细胞，用MPA选择培养基37℃培养2-5天。

1.5挑取单个病毒空斑，扩增，并对所挑取的克隆进行鉴定。如此反复克隆、纯化所得空斑。

1.6最后得到2个种类的重组病毒单克隆。经过鉴定确认后，以常规方法大量扩增重组病毒。

2、重组病毒克隆鉴定

2.1重组病毒感染BSC40细胞表达外源抗原。用特异抗体做蛋白质印迹实验鉴定确认重组病毒克隆，结果如图3所示。

由图3可见，经Western Blot检测后，重组病毒均表达了目的蛋白，分子量大小与预期的蛋白分子量近似。5Ag(Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)的分子量为93kDa，4Ag(ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)的分子量约为62kDa。结果表明，各类重组病毒按照设计要求表达出了结核杆菌抗原。

实施例1、2中制备的重组质粒及由其分别得到的重组MVA列于表9中。

表9

实施例4、重组病毒样品的制备

1、扩增重组病毒

将获得的重组病毒，感染BHK21细胞4天后，将感染细胞反复冻融3次，收获病毒液，于-70℃保存。

2、牛痘病毒的纯化

2.1将收集到的重组病毒液于300g，4℃离心5分钟，保留上清(上清1)，将沉淀用少量的10mM Tris.Cl pH9.0洗一遍，离心后获得上清2，合并上清1和上清2，超声1分钟。

2.2超声后的样品置于36％的蔗糖(10mM Tris.Cl，pH9.0)上层，进行超速离心(32900g，4℃，80分钟)，移去上清，沉淀用10mM Tris.Cl，pH9.0重悬后超声15秒。

2.3将获得的样品覆盖于蔗糖密度梯度(24％、28％、32％、36％、40％之上，超速离心(26000g，4℃，50分钟)，小心收集梯度间混合模糊的区带为病毒富集区。

2.4在收集液中加入2～3倍体积的10mM Tris.Cl pH9.0混匀，离心(32900g，4℃，60分钟)，收集沉淀既为病毒浓缩纯化产物。

2.5获得的纯化浓缩病毒样品用少量10mM Tris.Cl pH9.0重悬，超声匀浆15秒，分装后，保存于-70℃。

3、病毒滴度的测定

3.1将要测定的病毒液按1:10梯度稀释，稀释10个滴度。

3.2将稀释好的病毒液加到对数生长期BHK21细胞(24孔板)上，200μl/孔(24孔板)；每个稀释度必须做复孔。

3.3 37℃感染一小时(期间间隔15分钟晃动一次)后，移去病毒液。

3.4加入事先准备好的37℃预热的固定培养基(含2％FBS，0.65％低熔点琼脂的MEM培养基)，室温放置，待固定培养基凝固后，移至37℃培养。

3.5 3～4天后，观察细胞病变及空斑计数。

3.6空斑计算，换算出病毒滴度(PFU)。

实施例5、结核感染小鼠模型免疫保护实验

1.实验动物

CB6F1小鼠，雌性，6-8周龄；冻干皮内注射用卡介苗(BCG SSI)，结核分枝杆菌(H37Rv)。

2.结核感染小鼠模型免疫保护实验

2.1动物分组

将CB6F1小鼠随机分为5组，每组17只动物，分别为未免疫组(Naive组)、BCG组，BCG+MVA-5Ag组，BCG+MVA-4Ag组，BCG+MVA(空)组。

2.2免疫

在第0周，4组免疫组经皮内初免BCG，Navie组不作免疫；每只小鼠免疫剂量为1×10⁶CFU。

在第6周和第8周，分别对实验组(BCG+MVA-5Ag组，BCG+MVA-4Ag组，BCG+MVA(空)组)用重组病毒或空病毒2次经皮内进行加强免疫，免疫剂量为1×10⁶PFU/只，

组和BCG组不作免疫。

第10周，各组分别处死小鼠5只，取小鼠脾脏获取脾淋巴细胞，经不同的蛋白刺激后，通过ELISPOT方法检测各组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平。

2.3攻毒

第12周用结核分枝杆菌H37Rv株，通过气溶胶雾化感染全部小鼠，感染计量约为55CFU/只，建立结核杆菌感染小鼠模型。

2.4组织荷菌载量

第16周和24周每组分别处死小鼠6只，并对小鼠的肺部和脾脏做荷菌载量计数。

上述操作流程如表10。

表10

结果见图4。

经BCG免疫的小鼠(包括实验组)与未免疫组相比，小鼠脾脏与肺部组织荷菌载量显著性降低(P值均为0)，BCG提供了较强的抗结核的免疫保护效果。

实验组MVA-5Ag与BCG免疫组相比，在小鼠感染结核分枝杆菌4周，小鼠的肺部和脾脏的组织荷菌数并没有下降，但在12周后，小鼠肺部和脾脏的组织荷菌数较BCG组分别降低了0.16和0.02lgCFU，P值分别为0.262和0.899。

实验组MVA-4Ag与BCG免疫组相比，在小鼠感染结核分枝杆菌4周和12周后，小鼠肺部和脾脏的组织荷菌数分别降低了-0.05、0.03、0.015和-0.036lgCFU，P值分别为0.798、0.893、0.917和0.841。

BCG经MVA-empty加强免疫后，相比BCG组，小鼠感染结核分枝杆菌4周和12周后，小鼠肺部和脾脏的组织荷菌数分别升高了0.12、0.36、0.23和0.30lgCFU，P值分别为0.548、0.062、0.118和0.112。

实验组BCG+MVA-5Ag组相比BCG+MVA-empty组，在小鼠感染结核分枝杆菌4周和12周后，小鼠肺部和脾脏的组织荷菌数分别降低了0.02、0.29、0.39和0.32lgCFU，P值分别为0.928、0.131、0.011和0.088。

实验组BCG+MVA-4Ag组相比BCG+MVA-empty组，在小鼠感染结核分枝杆菌4周和12周后，小鼠肺部和脾脏的组织荷菌数分别降低了0.07、0.39、0.25和0.26lgCFU，P值分别为0.729、0.047、0.097和0.161。

因此，小鼠感染结核分枝杆菌4周，MVA-4Ag和MVA-5Ag与BCG组相比，2个实验组的组织荷菌数未降低；感染12周后，MVA-5Ag实验组的组织荷菌数较BCG组有降低，MVA-4Ag实验组的组织荷菌数尚没有表现明显降低，表明BCG初免-重组MVA加强免疫的策略，可以诱导温和而持久的免疫反应。

2个实验组与BCG+MVA-empty组相比，组织荷菌数均明显降低，表明所插入抗结核抗原能够增强小鼠的抗结核保护作用。

实施例6、结核感染猴模型免疫保护实验

中国恒河猴，3～4岁，共24只，雌雄对半。所有实验动物身体状况良好，且排除特定细菌和病毒感染，X光胸检正常，tuberculin皮试阴性，符合实验标准；由武汉大学ABSL鄄芋实验室饲养，动物合格证号：SCXK(鄂)2010鄄0010。攻击感染前，所有实验猴饲养在清洁级实验室内；攻击感后，全部移至ABSL鄄芋实验室饲养。动物实验所有方案的伦理合法性经过武汉大学实验动物管理委员会批准。

1、动物分组

将24只中国恒河猴随机分为3组，每组8只，雌雄各半。第一组为未免疫组(Unvaccinated Control)，4只雄性，编号为AMP01～AMP04，4只雌性，编号为AMP05～AMP08；第二组为BCG免疫组(BCG vaccinated Only)，4只雄性，编号为AMP09～AMP12，4只雌性，编号为AMP13～AMP16；第三组为实验组(BCG+MVA-4Ag)，4只雄性，编号为AMP17～AMP20，4只雌性，编号为AMP21～AMP24。

结果见表11。

表11

2、免疫

在第0周对第2组BCG免疫组和第3组实验组经皮内进行BCG初免，第1组未免疫组不作免疫；每只实验猴的免疫剂量为1×10⁵CFU。

在第18周和第22周分别对第3组实验组(BCG+4Ag组)用重组病毒MVA-4Ag经皮内2次加强免疫，免疫剂量为5×10⁸PFU/只，未免疫组和BCG组不作免疫。

结果见表12。

表12

3、攻毒

第32周用结核分枝杆菌H37Rv株，通过纤维支气管镜感染恒河猴右肺下叶，攻毒剂量为15CFU/只猴，建立结核杆菌感染模型。

4、临床观察和检测

定期按时监测实验猴的食欲变化、有无咳嗽症状及体重变化，X线胸片检查，并定期采血进行血清学和免疫学检测，实验猴死亡或第24周处死后，全部尸检并进行病理学组织评分、组织细菌载量计数等检测。

4.1尸检及病理学组织评分

在实验节点(第46周)，分批对所有存活的实验猴按武汉大学标准操作程序实施安乐死并进行尸检；如有实验猴提前死亡或处于濒死状态，则提前对其安乐死并进行尸检。应用病理评分系统对实验猴进行总体病理学评价。肺脏、肝脏、脾脏、心脏、肾脏和淋巴结(如隆突淋巴结、肺门淋巴结及外周淋巴结)的组织样本经甲醛固定后进行HE染色，由病理学专家诊断，提供组织病理报告。

在尸检时，病理评分以肉芽肿的数目和大小为标准：

0分(未见肉芽肿)；

1分(1～3个可见肉芽肿)；

2分(4～10个可见肉芽肿)；

3分(>10个可见肉芽肿)；

4分(出现菌团或结核菌性急性肺炎体征)。

以最大肉芽肿的大小为标准评分如下：

0分(不可见)；

1分(<1～2mm)；

2分(3～4mm)；3分(>4mm)。

总体病理评分为由上述各组织出现的结核肉芽肿病变评分之和，评分越高，表明动物感染情况越严重；反之，感染越轻微。

在实验终点对所有存活的实验猴处死尸体解剖后，进行组织评分；未免疫组编号为AMP03的实验猴死于感染后第11周，同样对其尸体解剖，进行组织评分，评分越高，说明动物感染情况越严重；反之，感染越轻微。各组实验猴的病理大体总评分平均值见表13和图5。与未免疫组和BCG组相比，实验组(BCG+MVA-4Ag组)的病理总评分显著性降低，差异具有统计学意义(P值为分别为0.002和0.046)。

表13

表13中，组1，未免疫组；组2，BCG免疫组；组3，实验组(BCG+4Ag组)。

4.2病变组织细菌载量的检测

收集实验猴肺脏、脾脏，经研磨及匀浆后，将悬液10倍系列稀释，连续稀释5～6个稀释度，各稀释度稀释液重悬混匀后取100μl，接种至7H11-ADC平皿，置37℃培养5周，进行菌落计数(Colony Forming Unit，CFU)，结果见图6。

在左肺上中下叶、右肺上中下叶、副叶、肺脏以及脾脏中，实验组(BCG+MVA-4Ag组)与非免疫组比较，细菌载量分别降低了2.08lgCFU/g、1.72lgCFU/g、1.46lgCFU/g、1.41lgCFU/g、2.94lgCFU/g、1.12lgCFU/g、2.89lgCFU/g、0.80lgCFU/g和1.40lgCFU/g，P值分别为0.032、0.062、0.120、0.125、0.001、0.183、0.001、0.201和0.102。实验组(BCG+MVA-4Ag组)与BCG组比较，细菌载量分别降低了1.18lgCFU/g、0.59lgCFU/g、0.53lgCFU/g、0.710lgCFU/g、1.86lgCFU/g、0.098lgCFU/g、2.441lgCFU/g、-0.039lgCFU/g和1.663lgCFU/g，P值分别为0.208、0.507、0.569、0.433、0.024、0.906、0.005、0.950、0.054。

4.3临床观察

每日实验猴进食3次，按照三餐的进食情况进行评分，监测实验猴的食欲变化。每天观察和记录动物每餐摄取的食物量，根据动物每餐进食情况评定进食得分：全部吃完得2分，如果吃一部分得1分，如果没有吃，则得0分；每日进食得分为当天每餐进食得分的总和，统计每天备餐总分，每餐备餐总分为2分，因此每日备餐总分为3x2＝6分；每周结束时，计算该周动物的进食总得分与该周备餐总分的比率，即为最终的食欲评分。同时每天两次观察实验猴的咳嗽情况，有咳嗽表现＝0，没有咳嗽＝1，每天结束时，记录一天每只实验猴的得分；每周结束时，将每天的咳嗽表现得分加和得到该周的咳嗽表现得分(如7分则代表这周没有观察到咳嗽；5分意味着动物在7天中有2天咳嗽)；最终的咳嗽评分为每周总体咳嗽表现得分除以7后得到的比值。在每个采血时间点监测实验猴的体重。结果见图7-9。

根据图7，以第32周，也就是攻毒后第0周的体重作为比较基准。未免疫组中编号为AMP02、AMP05和AMP07的实验猴在感染结核杆菌后体重减轻，在实验终点时分别减轻了22.1％、5.5％和18.2％；编号为AMP03的实验猴在感染结核杆菌第11周时死亡。BCG组中编号为AMP10的实验猴在感染后体重一直在减轻，至实验终点时体重下降了15.7％，而编号为AMP13、AMP15和AMP16的实验猴在感染初期体重略有下降，但感染后期未见体重下降。实验组(BCG+MVA-4Ag组)在感染后编号为AMP18、AMP19、AMP21、AMP22、AMP24的实验猴体重略有减轻，但至实验终点时，该组所有的实验猴均未见体重减轻，相比感染后第0周，体重均增加了15.7％、8.0％、4.6％、3.6％、6.1％、4.8％和12.3％。

根据图8，未免疫组在整个感染期除了编号为AMP01、AMP04的实验猴没有出现食欲下降外，该组其余实验猴均有出现明显的食欲下降。其中编号为AMP05的实验猴在感染后第2周食欲就开始出现持续性下降，编号为AMP02、AMP03和AMP07的实验猴在感染后第10周出现持续性的食欲下降。BCG免疫组中编号为AMP09、AMP12和AMP13的实验猴在感染后未出现明显地食欲下降；编号为AMP15的实验猴在感染一周后就开始出现了食欲下降，AMP10在感染后第12周后出现食欲下降。实验组(BCG+MVA-4Ag组)的所有猴子在感染后并未出现明显的食欲下降情况，编号为AMP22、AMP23和AMP24的实验猴仅在实验终点时有观察到食欲下降的情况。

根据图9，未免疫组中编号为AMP03的实验猴在感染后第6周，实验猴AMP07在感染后第11周，AMP05在感染后第16周开始出现了严重且持续的咳嗽症状。BCG组的实验猴AMP09在感染后第11周出现了严重持续的咳嗽症状，AMP13在感染后第10周及第16周出现了咳嗽症状；AMP14仅在感染后第10周，出现了咳嗽；AMP15和AMP16在感染后第18周出现了咳嗽症状。实验组(BCG+MVA-4Ag组)中仅AMP19在感染后第14周，AMP21在感染后12周，AMP22、AMP23和AMP24在感染后第18周有出现咳嗽的症状。

4.4胸部CT扫描及结果

在感染前(第28周)及感染后的各个采血点对所有存活的实验猴按武汉大学标准操作程序采用Fidex锥形束断层扫描成像系统对实验动物进行胸部CT数据采集。根据结核分枝杆菌感染非人灵长类动物模型的生理病变等特征，以肺脏、胸腔淋巴结以及胸腔积液等作为主要的观察对象，扫描结果由匹兹堡大学CT专家分析及评分，根据CT片表现出的结核感染病理特征给出相应评分，分值越高表明动物CT扫描结果显示的结核感染病理特征越明显，评分越低说明动物结核感染病理特征越轻微；结果见图10。

根据图10，未免疫组中编号为AMP02，AMP06，AMP07的CT扫描结果评分为3分，说明这三只实验猴结核感染情况严重，编号AMP03的实验猴在结核杆菌感染后11周死亡，故没有该实验猴CT扫描评分结果，该组其余实验猴的CT扫描结果评分小于1，说明CT片未见明显的结核感染特征，该组CT评分平均值为1.79；BCG组中编号为AMP13实验猴的CT扫描结果评分3分，有严重的结核感染特征，AMP09和AMP12的CT评分为2分，说明这2只实验猴的结核感染症状不太严重，该组的其余5只实验猴CT扫描结果评分均没有大于1，CT扫描片没有显示明显的结核感染特征，BCG组的CT评分均值为1.44；实验组(BCG+MVA-4Ag组)仅编号为AMP20实验猴CT评分为3分，AMP17实验猴CT评分为2分，该组其余的6只实验猴的CT评分均为1分，显示胸部CT扫描未见明显结核感染特征，实验组的CT评分均值为1.38。

4.4血清学检测

在采血点采集实验猴外周血，用全自动血沉仪检测枸缘酸钠抗凝血血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)水平变化，结果见图11。

根据图11，未免疫组编号为AMP02和AMP07的实验猴分别在感染后第10周和第14周检测到ESR水平急速升高；BCG组中编号为AMP11和AMP13的实验猴分别在感染后第6周和第14周检测到ESR水平快速升高，AMP13的ESR值虽在感染后第10周ESR值回落，但在第14周依然检测到ESR值升高；实验组(BCG+MVA-4Ag组)的所有实验猴在感染后均未检测到ESR水平快速升高，ESR值始终保持在较低的水平。

实施例7、不同的基因排列方式制成的重组病毒对免疫原性的影响

如前方法，构建具有不同的基因排列方式的表达质粒，并制成的重组病毒(Western Blot结果见图12)，检测所获得的重组病毒对小鼠免疫原性的影响。

5Ag0：Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD，构建的重组病毒为MVA-5Ag1，即MVA-5Ag(MVA-Ag85B-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c-RpfD)；

5Ag1：Ag85B-RpfD-ESAT6-Rv1733c-Rv2626c，构建的重组病毒为MVA-5Ag2；

5Ag2：Ag85B-ESAT6-RpfD-Rv1733c-Rv2626c，构建的重组病毒为MVA-5Ag3；

5Ag3：ESAT6-Rv2626c-RpfD-Ag85B-Rv1733c，构建的重组病毒为MVA-5Ag4；

5Ag4：ESAT6-Rv1733c-Ag85B-Rv2626c-RpfD，构建的重组病毒为MVA-5Ag5；

免疫细胞的类型以及细胞因子的种类对抗结核免疫反应的效果起着重要的作用，重组痘苗病毒MVA-5Ag0、MVA-5Ag1、MVA-5Ag2、MVA-5Ag3、MVA-5Ag4分别免疫小鼠，通过淋巴细胞增殖、淋巴细胞分型以及IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子测定实验，来比较不同重组MVA的免疫原性。

1.实验动物及分组

BABL/c，SPF级，雌性，6-8周龄，42只,随机分为7组，每组6只动物，分别为PBS组、MVA(空)组、MVA-5Ag0组、MVA-5Ag1组、MVA-5Ag2组、MVA-5Ag3组及MVA-5Ag4组。

2.免疫及处死

在第0周和第2周分别对各组小鼠经尾静脉进行免疫，每只小鼠免疫剂量为1x10⁶PFU/100ul，PBS组用100ulPBS进行免疫。

于第6周颈椎脱臼处死所有实验小鼠，取脾进行后续检测。如表14。

表14

3.重组病毒免疫原性比较

3.1小鼠脾淋巴细胞悬液的制备

取出小鼠脾脏用冷却无菌PBS漂洗后，研磨于4ml Ez-SepTM Mouse 1×淋巴细胞分离液中，即成细胞悬液，2000rpm离心20分钟后，吸取中间淋巴细胞层，培养液洗2次以去除淋巴细胞分离液，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液(内含2mmol/L谷氨酰胺，2g/LNaHCO，，青霉素和链霉素各100U/m1)悬浮细胞，计数后，调整细胞浓度为10⁷个/ml备用。

3.2小鼠淋巴细胞体外增殖实验(MTT法)

取上述脾淋巴细胞悬液用MTT法进行淋巴细胞增值实验，以结核特异性抗原Ag85B作为刺激物，以PBS共培养作为阴性对照，ConA共培养作为阳性对照。通过淋巴细胞增殖实验，比较不同5基因重组MVA免疫的小鼠淋巴细胞对特异性抗原(Ag85B)的反应活性，使用刺激指数(SI，SI＝(实验组-阴性对照组)/(阴性对照组-空白对照组))来处理各组数据，结果如图13所示。

3.3小鼠CD4+、CD8+淋巴细胞分型实验

运用流式细胞技术，对免疫后小鼠的脾淋巴细胞亚群进行比例测定。首先用CD3+抗体标记细胞，确定所要测定目标细胞范围，再对被CD4+，CD8+抗体标记的细胞进行分析，结果如图14所示。

3.3免疫小鼠细胞因子检测

通过ELISPOT实验，对在体外经过抗原Ag85B刺激的淋巴细胞进行细胞因子IL-2/IL-4/IFN-γ测定，细胞所分泌的免疫因子可以被周围的特异性抗体捕获，通过显色，可在PVDF膜上显示出相应的斑点，显示出可以分泌相应免疫因子的细胞数量；通过ELISA实验直接测定经抗原刺激后，不同组的淋巴细胞分泌TNF-α的量，结果如图15所示。经WesternBlot检测后，重组病毒MVA-5Ag0/1/2/3/4均表达了目的蛋白，分子量大小与预期的蛋白分子量一致，为93kDa。

如图13所示，与PBS组比较，实验组(MVA-5Ag0/1/2/3/4组)细胞经特异性抗原Ag85B刺激后均能使小鼠淋巴细胞发生特异性增殖(P<0.05)。实验组(MVA-5Ag0～MVA-5Ag4组)的MTT值显著性高于MVA(空)组(P<0.05，P值分别为：0.007，0.009，0.043，0.035，0.016)，尤其以MVA-5Ag0、MVA-5Ag1最高；MVA-5Ag1/2/4与重组MVA-5Ag0间没有明显差别P>0.05(P值分别为0.790，0.800，0.800)，MVA-5Ag0明显优于MVA-5Ag3组(P＝0.026)。

如图14所示，在抗结核杆菌感染的免疫反应中，细胞免疫是不可或缺的重要组成部分，其中又以CD4+T细胞产生的TH 1型应答最为关键。实验组中的(MVA-5Ag0/1/2/3/4)的CD4+细胞数明显高于CD8+细胞数P<0.05(P＝0.002)，对照组(PBS，MVA(空))中两者没有区别P>0.05。与对照组相比，实验组中CD8+细胞比例虽均高于PBS组，但二者在统计学上无显著性差异。在CD4+细胞比例比较中，所有的实验组均明显高于对照组(PBS，MVA(空))(P<0.05)，并且新构建MVA-5Ag4与MVA-5Ag0之间存在明显差别P<0.05(P＝0.0051)，但MVA-5Ag0与其他新构建疫苗MVA-5Ag1/2/3中没有差异。结果表明，重组MVA可以有效刺激CD4+T细胞的增殖分化，但无法刺激CD8+型T细胞的分化，能够诱导较强的TH1型免疫反应，尤其以新构建的MVA-5Ag4疫苗和原始MVA-5Ag0疫苗作用最强。

细胞免疫应答，通过分泌关键性的细胞因子IFN-γ，IL-2以及TNF-α来抑制结核杆菌的生长，引发局部炎症反应，加快结核病菌的吞噬与清除。

如图15，对照组(PBS，MVA(空))阳性细胞数量极低，与实验组(MVA-5Ag0/1/2/3/4)成显著性差异(P<0.05)。实验组中，新构建重组疫苗MVA-5Ag1/4在分泌IL-2水平上均高于本发明的疫苗MVA-5Ag0(P值分别为：0.004和0.025)，MVA-5Ag2/3的IL2分泌水平比MVA-5Ag0组高，但无统计学差异。

IL-4的分泌主要与MVA病毒的感染有关，是细胞产生的抗病毒反应。MVA(空)组与PBS组在分泌IL-4水平上有显著性差异(P＝0.000)，但MVA-5Ag1/2/3组没有明显区别。经MVA-5Ag0/4免疫的小鼠的T细胞均能高效分泌IL-4，与MVA(空)有显著性差异(P<0.05)，其中MVA-5Ag0组尤为显著(P＝0.000)，提示可能MVA-5Ag0表达的融合蛋白有不同于其他四组的特殊空间抗原表位暴露，通过抗原提呈，激活了TH 2型免疫应答，产生相关抗体，参与体液免疫应答。

IFN-γ是抗结核的重要细胞因子，图15C中实验组(MVA-5Ag0/1/2/3/4)均与对照组在分泌IFN-γ水平上有显著性差别(P<0.05)。实验组MVA-5Ag1/2/4中经刺激后淋巴细胞分泌IFN-γ水平明显弱于MVA-5Ag0，有显著差异(P<0.05)，MVA-5Ag3与MVA-5Ag0组持平，没有显著差异。

图15D中MVA-5Ag 0和MVA-5Ag 1组小鼠淋巴细胞经刺激后分泌TNF-α的水平最高，不过各实验组之间，以及与对照组之间均没显著性差异(P>0.05)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海生物制品研究所有限责任公司

<120> 一种重组结核病疫苗，其制备方法及应用

<130> 166406

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 优化的Ag85B核苷酸序列

<400> 1

ttttccagac ccggcctccc tgtcgagtac ctccaggtgc ctagccccag catgggcagg 60

gacatcaagg tccagttcca gtccggcggc aacaatagcc ctgccgtgta tctgctcgac 120

ggcctcaggg cccaagacga ctacaacgga tgggacatca acacccccgc cttcgagtgg 180

tactaccaga gcggcctcag catcgtgatg cctgtgggcg gccagtccag cttctacagc 240

gactggtata gccccgcctg tggcaaggcc ggatgtcaga cctacaagtg ggagaccttc 300

ctgacaagcg agctgcccca gtggctgagc gctaacagag ccgtgaaacc cacaggcagc 360

gccgctattg gcctgagcat ggccggctcc tccgctatga tcctcgctgc ctatcacccc 420

cagcagttta tttacgccgg aagcctgtcc gctctgctgg atcccagcca aggcatggga 480

cccagcctga tcggactggc tatgggagac gctggcggct acaaggccgc tgacatgtgg 540

ggacccagct ccgatcctgc ctgggagagg aatgacccca cccagcagat ccccaagctc 600

gtcgccaaca acaccaggct ctgggtctac tgcggcaatg gcacccccaa cgagctggga 660

ggcgccaata tccccgctga gttcctggag aacttcgtga ggagcagcaa cctcaagttc 720

caggacgcct ataatgccgc cggcggccac aatgccgtct ttaacttccc ccccaacgga 780

acacactcct gggagtactg gggcgcccag ctcaacgcca tgaaaggaga cctgcagtcc 840

tccctgggag ccgga 855

<210> 2

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 优化的ESAT6核苷酸序列

<400> 2

accgagcagc agtggaactt cgccggcatc gaagctgccg ctagcgccat ccaaggcaac 60

gtgaccagca tccacagcct gctggacgag ggcaagcaga gcctgaccaa gctggctgct 120

gcttggggcg gatccggaag cgaagcctac cagggcgtgc agcagaagtg ggacgccaca 180

gccaccgagc tgaacaacgc cctgcagaac ctcgccagaa ccatcagcga ggccggacag 240

gctatggcca gcacagaggg caatgtgacc ggcatgttcg cc 282

<210> 3

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 优化的Rv1733核苷酸序列

<400> 3

atcgccacca ccagggacag ggaaggcgct accatgatca ccttcaggct gaggctcccc 60

tgcaggacca tcctgagggt gttcagcagg aaccccctgg tgaggggcac cgacagactg 120

gaagccgtgc aggacagcag gagccacgtg tatgcccacc aggctcagac caggcaccct 180

gctaccgcca ccgtgatcga ccacgagggc gtgatcgact ccaacaccac cgccaccagc 240

gctcctccca gaaccaagat cacagtgccc gccaggtggg tggtgaacgg catcgagagg 300

agcggcgagg tgaacgccaa gcctggaacc aagagcggcg acagggtggg catttgggtc 360

gatagcgccg gccagctggt ggatgaacct gctccccctg ccagagccat cgccgatagg 420

gccatcctga tcagggtgag gaacgccagc tggcagcacg acatcgacag cctgttctgc 480

acccaaagg 489

<210> 4

<211> 426

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 优化的Rv2626核苷酸序列

<400> 4

acaacagcca gggacatcat gaacgccggc gtgacctgcg tgggagagca tgaaaccctc 60

accgccgccg cccaatacat gagggagcac gacatcggcg ccctgcccat ctgtggagac 120

gacgacaggc tgcacggcat gctgaccgac agggacatcg tgatcaaggg cctggctgcc 180

ggcctcgatc ctaacaccgc tacagccggc gagctggcca gagacagcat ctactacgtg 240

gacgccaacg ccagcatcca ggagatgctc aacgtgatgg aggagcacca ggtgagaagg 300

gtgcctgtga tcagcgagca caggctggtg ggcatcgtga ccgaggccga tatcgctagg 360

cacctgcccg agcacgccat cgtgcagttc gtgaaggcca tctgcagccc catggctctg 420

gccagc 426

<210> 5

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 优化的RpfD核苷酸序列

<400> 5

acccccggac tcctcaccac agctggagct ggcaggccca gagacagatg cgccaggatc 60

gtgtgcaccg tgttcatcga gaccgccgtg gtggctacca tgttcgtggc cctgctgggc 120

ctgagcacca tcagcagcaa ggccgacgac atcgactggg acgccatcgc ccagtgtgaa 180

tccggcggaa actgggccgc caataccggc aatggcctgt acggcggcct gcagatcagc 240

caggctacct gggactccaa cggaggagtg ggaagccctg ccgctgcttc ccctcagcag 300

cagatcgagg tggccgacaa catcatgaag acccaaggcc ctggcgcctg gcctaagtgt 360

tccagctgta gccagggcga tgctcctctg ggcagcctga cccacatcct gacctttctc 420

gccgccgaga caggcggatg tagcggaagc agggacgac 459

<210> 6

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> TPA序列

<400> 6

gacgccatga agaggggcct gtgttgcgtg ctgctcctgt gtggcgccgt gttcgtgagc 60

cccagc 66

<210> 7

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

cgaattcgcc accatggacg ccatgaagag gggcctgtgt tgcgtgctgc tcctgtgtgg 60

cgccgtgttc gtgagcccca gcaccgagca gcagtgga 98

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

gcttcgaagg cgaacatgcc ggtcaca 27

Claims

1.一种制备重组牛痘病毒的方法，包括：在重组病毒载体中引入一表达盒，通过同源重组将重组病毒载体导入牛痘病毒中，获得重组牛痘病毒；所述表达盒中，按照5’→3’的次序，抗原依次为：ESAT6、Rv1733c、Rv2626c、RpfD，或依次为：Ag85B、ESAT6、Rv1733c、Rv2626c、RpfD；在所述抗原的上游还包括Kozak-ATG-TPA；其中，所述的ESAT6的编码序列如SEQ ID NO：2所示；所述的Rv1733c的编码序列如SEQ ID NO：3所示；所述的Rv2626c的编码序列如SEQ ID NO：4所示；所述的RpfD的编码序列如SEQ ID NO：5所示；所述TPA序列如SEQID NO：6所示；所述的Ag85B的编码序列如SEQ ID NO：1所示；所述牛痘病毒是牛痘病毒MVA株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表达盒中，还包括：位于所述的抗原的编码序列的上游的启动子，和/或位于所述的抗原的编码序列下游的终止子；从而构成表达所述抗原的表达盒。

3.权利要求1～2任一所述的方法的用途，其特征在于，用于制备重组牛痘病毒，所述的重组病毒诱导机体产生对抗结核杆菌的免疫保护力。

4.一种重组牛痘病毒，其特征在于，所述的重组牛痘病毒由权利要求1～2任一所述的方法制备获得。

5.权利要求4所述的重组牛痘病毒的用途，其特征在于，用于制备防治结核病的疫苗组合物。

6.权利要求4所述的重组牛痘病毒的用途，其特征在于，用于制备防治结核病的组合物或药盒。

7.一种重组牛痘病毒疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括：

权利要求4所述的重组牛痘病毒；以及

药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的重组牛痘病毒疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还包括：卡介苗。

9.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中含有权利要求4所述的重组牛痘病毒，或权利要求7所述的重组牛痘病毒疫苗组合物。

10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述的药盒中还包括：卡介苗。