KR102059855B1 - 재조합 아데노 바이러스주 및 이를 이용한 삼일열 말라리아 백신 조성물 - Google Patents

재조합 아데노 바이러스주 및 이를 이용한 삼일열 말라리아 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼일열원충(Plasmodium vivax)의 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1) 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주, 이를 이용한 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 아데노 바이러스주 기반의 백신 조성물 및 재조합 백시니아 바이러스주 기반의 백신 조성물을 포함하는 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물을 제공한다.

Description

재조합 아데노 바이러스주 및 이를 이용한 삼일열 말라리아 백신 조성물{RECOMBINANT ADENOVIRUS STRAIN AND VACCINE COMPOSITION AGAINST VIVAX MALARIA USING THE SAME}
본 발명은 삼일열원충(Plasmodium vivax)의 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1)의 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주, 이를 이용한 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 조성물, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 재조합 아데노 바이러스주 기반의 백신 조성물 및 재조합 백시니아 바이러스주 기반의 백신 조성물을 포함하는 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물을 제공한다.
말라리아는 매년 1백만 내지 3백만명 이상의 사망자를 내는 플라스모디움 종(Plasmodium spp.)에 의한 감염병으로, 세계 약 30억 이상의 인구가 말라리아 감염의 위험에 노출되어 있는 등 세계 보건에 높은 영향을 끼치는 질병으로 여겨지고 있다. 그러나 이의 복잡한 생활사와 탁월한 숙주적응력으로 현재까지 퇴치되지 않고 있다.
말라리아 원충은 동물의 적혈구 안에서 기생, 증식, 복제하며, 여러 종류의 숙주를 가지는데, 이 중에서 즉, 열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(P. vivax), 사일열원충(P. malariae), 난혈열원충(P. ovale)이 사람을 숙주로 한다. 최근에는 원숭이열원충(P.knowlesi)도 인수 공통으로 인체 감염된다고 보고되고 있다.
열대열 말라리아에 대한 적극적인 연구 전략과 재정 지원으로 열대열 말라리아에 대한 백신 개발 및 사망률 감소 등의 성과가 있었다. 그러나 상대적으로 삼일열 말라리아의 발병 확대로 인해 최근 세간의 관심이 증폭되고 있다. 국내에서는 삼일열 말라리아만 발생하고 있으며, 1979년 퇴치 후 1993년 재발생하여 현재까지 증가와 감소를 거듭하며 토착화되어오다가 최근 연이은 감소로 인하여 2012년에는 WHO 공인 퇴치 단계(elimination phase)로 들어선 바 있다. 그러나 최근 감소하던 삼일열 말라리아의 발생이 2014년 다시 급격히 증가하며 매우 중요한 감염병으로 부각되고 있으며 재퇴치를 위한 새로운 연구 전략과 이에 대한 과학적 근거가 필요한 상황이다.
특히, 국내에 토착화되어 있는 삼일열 말라리아는 간세포기의 잠복소체(Hypnozoite)로 유발되는 장기잠복기 환자가 절반을 차지하고, 무증상 잠복기를 갖고 있어 감염 후 오랜 시간이 경과한 후에 지연발병(late primary attack)하거나 발병 후 다시 재발(relapse)하는 특징이 있다. 더욱이 잠복기 기생충은 약물로 치료하기 힘들어 질병 관리에 어려움이 있는 실정이다.
종래 삼일열 말라리아의 백신 후보 물질은 열대열 말라리아에 비해 상대적으로 부족하며 면역 연구 및 백신 개발 연구는 소규모로만 수행되었다. 삼일열 말라리아의 항원으로서는, 전적혈구기(간세포기) 항원인 포자소체 단백질(CSP; circumsporozoite protein), 적혈구기 항원인 첨단막 항원-1(AMA-1; apical membrane antigen-1), 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1; merozoite surface protein-1), 분열소체 표면 단백질-3(MSP-3), Duffy 결합 단백질(DBP; duffy binding protein) 등이 알려져 있다.
한국등록특허 제10-0380306호는 말라리아의 MSP 항원을 포함하는 항체 조성물 및 이를 이용한 말라리아 항체의 검출방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허에서는 MSP 항원 단백질을 대상으로 하는 백신 조성물에 대해서는 연구된 바 없다.
한국공개특허 제10-2000-0065265호는 말라리아원충 MSP-1의 p42 단편 유래의 재조합 단백질 및 이를 포함하는 백신 조성물을 개시하고 있다. 그러나 상기 특허는 재조합 바이러스를 유전자 전달 벡터로 사용하는 것에 대해서는 언급하고 있지 않다.
1. 한국등록특허 제10-0380306호 2. 한국공개특허 제10-2000-0065265호
본 발명에서는, 삼일열원충의 항원 단백질 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스를 이용하여 삼일열 말라리아 감염 예방에 효과적인 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 재조합 아데노 바이러스주 기반의 백신 조성물 및 재조합 백시니아 바이러스주 기반의 백신 조성물을 포함하는 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 삼일열원충의 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1)의 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노 바이러스주를 제공한다. 바람직하게는, 상기 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 재조합 아데노 바이러스주는 서열번호 1의 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 3회 반복하여 포함한다.
일 실시태양에서 상기 재조합 아데노 바이러스주는 HuAd5-PvMSP-133이다.
본 발명은 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 면역증강제를 추가로 포함할 수 있으며, 면역 반응을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명은 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는, 상기 재조합 아데노 바이러스주 제조 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 전달 벡터는 플라스미드이며, 더욱 바람직하게는, pGEM-T 또는 pShuttle-CMV이다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물; 및 (b) 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물 또는 백신 키트를 제공한다. 상기 (b)의 백신 조성물에 포함되는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주는 KVAC C7L-PvMSP-133일 수 있다.
본 발명은 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로, 높은 항체 생성능을 가지며, 삼일열 말라리아 감염 예방에 우수한 효과를 갖는다.
특히, 상기 재조합 아데노 바이러스와 재조합 백시니아 바이러스의 병용 요법을 이용하는 프라임-부스트 복합 백신 조성물은, 우수한 체액성 및 세포성 면역반응을 나타내며, 삼일열원충의 적혈구 침입을 효과적으로 억제한다. 나아가, 상기 복합 백신 조성물은 숙주 말초혈액 내의 삼일열원충의 수를 감소시킨다.
따라서 본 발명에 따른 백신 조성물은 삼일열 말라리아 감염의 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 재조합 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133의 제조에 사용되는 pShuttle-CMV/3xPvMSP 플라스미드 구축물의 제조 과정을 도시한다.
도 2는 실시예 1의 재조합 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133가 제조되었음을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에서 제조된 재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133 Belem 및 KVAC C7L-PvCSP Sal1로부터 각각 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 단백질 및 CSP 단백질이 발현되었음을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 3에 기재된 바와 같이, 재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133을 이용한 마우스 면역화 및 면역 분석 스케줄을 나타낸다.
도 5 및 도 6은 재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133에 의해 유도되는 항체 생성능의 실험 결과를 나타낸다. 도 5는 Balb/c 마우스를 대상으로 한 실험 결과이며, 도 6은 C57BL/6 마우스를 대상으로 한 실험 결과이다.
도 7는 실시예 4에 기재된 바와 같이, 재조합 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133을 이용한 마우스 면역화 및 면역 분석 스케줄을 나타낸다.
도 8은 재조합 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133에 의해 유도되는 항체 생성능의 실험 결과를 나타낸다.
도 9 및 도 10은 실시예 5에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133 및 KVAC C7L-PvMSP-133의 복합 백신 조성물을 이용한 마우스 면역화 및 면역 분석 스케줄을 나타낸다. 도 9는 체액성 면역 분석 스케줄을, 도 10은 세포매개성 면역 분석 스케줄을 나타낸다.
도 11 및 도 12는 실시예 5의 복합 백신 조성물에 의해 유도되는 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 단백질에 대한 Ig 아형(Ig subtype)을 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸다. 도 11은 C57BL/6 마우스를 대상으로 한 실험 결과이며, 도 12는 BALB/c 마우스를 대상으로 한 실험 결과이다.
도 13 내지 도 16은 실시예 5의 복합 백신 조성물에 의해 유도되는 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 단백질에 대한 IgG 항체가를 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸다. IgG 항체가는 복합 백신 접종이 완료된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스로부터 혈청을 채취한 후 2달 간격으로 측정되었는데, 도 13 및 도 14는 1차 검정 결과를, 도 15 및 도 16은 2차 검정 결과를 나타낸다.
도 17 내지 도 20은 실시예 5의 복합 백신접종 후 BALB/c 및 C57BL/6 마우스 비장에서 CD4+, CD8+ T 세포수를 분석한 결과를 나타낸다.
도 21은 실시예 6에 기재된 바와 같이 백신 후보주로 접종된 마우스 혈청에서 분열소체 적혈구 침입 억제능을 확인하기 위한 분석 스케줄을 나타낸다.
도 22는 실시예 7에 기재된 바와 같이 백신 후보주로 접종된 마우스에서 쥐열원충 감염 후 마우스의 생존율을 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
1. 재조합 아데노 바이러스주
본 발명은 삼일열원충의 항원 단백질 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스주를 제공한다. 일 실시태양에서 상기 항원 단백질 유전자는 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1) 33 kDa 단편의 유전자 또는 포자소체 단백질(CSP)의 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “삼일열원충”은 삼일열 말라리아를 일으키는 플라스모디움(Plasmodium) 속 말라리아 원충들 중 하나로서, “Plasmodium vivax” 또는 “ P. vivax ”, 또는 간단히 “Pv”로 지칭되기도 한다.
본원에서 사용되는 용어 “분열소체 표면 단백질” 또는 이의 영문 약어 “MSP”는 삼일열원충의 분열소체에 존재하는 주요한 표면 단백질로써, 삼일열 말라리아의 특이 항원으로 적혈구기 항원이며, 말라리아의 무성 혈액 단계(asexual blood stage)에 대한 백신 후보 물질로 연구되어 왔다. 이 중 MSP-1은 크기가 큰 단백질로서(~200 kDa) 카르복실 말단 영역의 글리코포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커에 의해 세포 막에 연결된다. MSP-1의 C 말단 부위를 인식하는 항체는 in vitro에서 숙주 적혈구에 대한 분열소체의 침입을 억제한다. 또한 MSP-1은 동물 모델의 무성 혈액 단계에 대해 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는 것으로 보고된 바 있다.
본원에서 사용되는 용어 “포자소체 단백질” 또는 이의 영문 약어 “CSP”는 삼일열원충의 포자소체의 표면에 풍부하게 발현되는 단백질로서, 삼일열 말라리아의 특이 항원으로 전적혈구기(간세포기) 항원이다. CSP는 항체와 임파구를 효과적으로 인식하며, 항체와 T-세포의 수동 전달자(passive transfer)로 알려져 있다. PBMC(Peripheral blood mononuclear cells) 조사 결과, IFN-γ, IL-4의 높은 발현을 보여주었고, 자연감염 환자에서 항원성 및 면역원성을 보여주는 결과가 확인되었다.
본원에서 사용되는 용어 “PvMSP”는 삼일열원충의 분열소체 단백질을 나타내며, “PvCSP”는 삼일열원충의 포자소체 단백질을 나타낸다.
일 실시태양에서, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스주는 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자 또는 CSP의 유전자를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 재조합 아데노 바이러스주는 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편 유전자 또는 CSP 유전자와 상동성을 갖는 유전자를 포함한다. 본 발명에 따르면, 상동 유전자 또는 서열은 50% 이상의 상동관계 즉, 50%-100%의 상동관계, 즉 50% 이상의 일치하는 뉴클레오티드 염기를 갖는 반면, 50% 미만의 상동성을 갖는 유전자 또는 서열은 이종인 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 “유전자”는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 항원 등을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 상동 유전자로부터 번역된 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 동일한 역할을 수행하며 동일한 기능적 특성을 나타낸다. 상동 유전자는 주로 다르지만 관련된 공급원 또는 생물체로부터 유래된다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편 유전자는 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 가진다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 재조합 아데노 바이러스주는 서열번호 1의 PvMSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 3회 반복하여 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 아데노 바이러스주는 인간 아데노 바이러스(Human Adenovirus), 바람직하게는, 인간 아데노 바이러스 혈청타입 5(Human Adenovirus Serotype 5, HuAd5)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있으며, 당업계에 알려진 모든 아데노 바이러스 종 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 재조합 아데노 바이러스주는 HuAd5-PvMSP-133일 수 있다.
2. 백신 조성물
본 발명은 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.
일 실시태양에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제를 포함할 수 있다. 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기술되어 있다.
또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여 방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 등장화제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 백신 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 보조제(adjuvant) 또는 면역증강제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 “보조제(adjuvant)” 또는 “면역증강제”는 백신의 면역 반응을 향상시킬 목적으로 투여되는 약학적 또는 면역학적 제제를 의미한다. 상기 보조제는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알룸(포타슘 알루미늄 설페이트), MF59, virosome, AS04[알루미늄 하이드록사이드 및 모노포스포릴 리피드 A(MPL)의 혼합물], AS03(DL-α-tocopherol, squalene 및 유화제인 polysorbate 80의 혼합물), CpG, Flagellin, Poly I:C, AS01,AS02, ISCOMs 또는 ISCOMMATRIX일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여시, 산화방지제, 완충제, 정균제, 및 의도한 수용자의 혈액과 등장액 상태가 되도록 한 용질 등을 포함하는 수성 및 비수성 멸균 주사 용제를 포함할 수 있으며, 수성 및 비수성 멸균 현탁제는 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 주사용 용제로 이용하기에 유용한 첨가제는 예를 들어 물, 알코올, 폴리올(polyol), 글리세린 및 식물성 오일 등을 포함한다. 상기 조성물은 단위 용량(1 회분) 또는 다중 용량(수 회분) 용기로 나타낼 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 앰풀(ampoule) 및 바이알(vial)에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면 주사액 제조시 필요한 물의 첨가만을 필요로 하는 동결건조 조건 하에 저장할 수 있다. 예를 들어, 상기 투여는 근육주사, 피하주사, 또는 복강주사를 통한 투여일 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 피투여자의 건강 상태, 체중, 성별 및 투여 목적 등에 따라 적절하게 용량을 설정하여 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 본 발명의 백신 조성물에 포함된 재조합 아데노 바이러스는 생체 내에 주입된 후 생체 내에서 삼일열 말라리아 항원 단백질을 생산하여 세포 밖으로 분비한다. 예를 들어, 상기 항원 단백질은 세포 내에서 생산된 후 시그널 펩티드에 의하여 세포 바깥으로 이송될 수 있다. 예를 들어, 상기 삼일열 말라리아 항원 단백질에 의하여 생체의 면역 반응이 유도될 수 있으며, 상기 면역 반응에 의하여 생체 내에 삼일열 말라리아에 대한 항체가 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “면역 반응”은 항원 도입에 대한 반응에서 숙주, 예를 들어 포유류의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응, 또는 둘 다의 형태일 수 있다.
3. 백신 조성물의 제조 방법
본 발명은 삼일열원충의 항원 단백질의 유전자를 전달 벡터에 삽입하고, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는, 재조합 아데노 바이러스주의 제조 방법을 제공한다. 일 실시태양에서 상기 항원 단백질의 유전자는 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1)의 유전자 또는 포자소체 단백질(CSP)의 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "벡터"는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 지칭한다. 벡터에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 면역원성 단백질을 암호화하는 핵산 작제물을 포함하거나 이들로 구성된다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 및 인공 염색체(예: YAC)를 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 일 실시태양에서, 상기 전달 벡터는 플라스미드 벡터, 예를 들어 pGEM-T 또는 pShuttle-CMV일 수 있다.
상기 삼일열원충 항원 단백질의 유전자를 상기 전달 벡터에 삽입하는 것은, 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 것은 당업계에 공지된 형질감염 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 상기 방법은 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입한 후에, 제조된 재조합 아데노 바이러스주로부터 삼일열원충 항원 단백질, 예를 들어, MSP-1 단백질의 생성을 확인하는 단계를 추가 포함할 수 있다. 상기 재조합 아데노 바이러스로부터 삼일열원충 항원 단백질의 생성을 확인하는 것은 당업계에 공지된 단백질 검출 및/또는 검정 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 면역학적 방법일 수 있으며, 구체적으로, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), 샌드위치(sandwich) 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광성 면역검정, 또는 단백질 A 면역검정 등을 포함할 수 있다.
4. 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물 또는 백신 키트
본 발명은 (a) 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물; 및 (b) 삼일열원충의 항원 단백질 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 프라임-부스트 복합 백신 조성물을 제공한다.
많은 경우에, 백신의 단일 투여는 해당 병원의 감염을 예방하는데 효과적인 면역 세포를 장기간 지속하여 발생시키는데 충분하지 않다. 이에 따라 상기 병원체에 대해 지속적이고 충분한 면역을 확립하기 위해서는, 특이적 병원체에 특이적인 생물학적 조성물로의 반복된 자극이 요구된다. 동일한 병원체에 대해 처방된 백신의 반복 투여를 포함하는 투여 요법을 본원에서는 "프라임-부스트 백신 접종 요법"으로 지칭한다. 바람직하게는, 프라임-부스트 백신 접종 요법은 특이적 병원체에 대해 처방된 백신 또는 백신 조성물을 2회 이상 투여하는 것을 의미한다. 백신 조성물의 제1 투여는 "프라이밍(priming)"으로서 지칭되며, 제1 백신과 동일한 병원체에 대해 처방된 다른 백신 조성물 또는 동일한 백신의 임의의 후속 투여는 "부스팅(boosting)"으로서 지칭될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 프라임-부스트 백신접종 요법은 면역 반응을 프라이밍하기 위한 백신의 1회 투여 및 면역 반응을 부스팅하기 위한 적어도 1회의 후속투여를 포함한다.
본 발명의 프라임-부스트 복합 백신 조성물에서, 제1 백신 조성물은 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물일 수 있다.
본 발명의 프라임-부스트 복합 백신 조성물에서, 제2 백신 조성물은 삼일열원충의 항원 단백질 유전자를 포함하는 재조합 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물일 수 있다. 일 실시태양에서 제2 백신 조성물에 포함되는 삼일열원충의 항원 단백질 유전자는 MSP-1 33 kDa 단편 또는 CSP일 수 있다. 또다른 일 실시태양에서 제2 백신 조성물의 재조합 바이러스주는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주 또는 재조합 아데노 바이러스주일 수 있다.
일 실시태양에서, 제1 백신 조성물은 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스를 포함하고, 제2 백신 조성물은 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 또는 아데노 바이러스주를 포함할 수 있다. 일 실시태양에서, 상기 제2 백신 조성물에 포함되는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주는 KVAC C7L-PvMSP-133일 수 있다.
또다른 일 실시태양에서, 제1 백신 조성물은 삼일열원충의 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 포함하는 재조합 아데노 바이러스를 포함하고, 제2 백신 조성물은 삼일열원충의 CSP의 유전자를 포함하는 재조합 백시니아 또는 아데노 바이러스주를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 상기 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 유효량의 적어도 1회 투여량; 및 (b) 삼일열원충의 항원 단백질 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 유효량의 적어도 1회 투여량을 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 키트를 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[실시예 1]
재조합 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-1 33 의 제조 및 발현 확인
간세포기 또는 적혈구기에서 발현하는 분열소체 표면 단백질(MSP)-1 33 kDa 단편의 재조합 PvMSP-133의 아데노 바이러스 백신 후보주 제조를 위하여, 백신 후보주 셔틀벡터 8.4kb에 PvMSP-133 Belem의 유전자를 연속적으로 연속 3중 삽입하여, 항원 단백질 MSP-1 33 kDa 단편을 발현하는 백신 후보주를 제조하였다.
구체적으로, NheI와 XbaI 부분이 포함되어 증폭된 MSP-1 유전자를 pGEM-T 벡터에 제한효소 NheI와 XbaI를 이용하여 절단한 후 삽입하였다. 염기서열 분석을 통해 삽입된 MSP-1 33 kDa 단편 유전자가 기존 MSP-1 33 kDa 단편 유전자와 상동성을 가짐을 확인하였다. 확인된 MSP-1 33 kDa 단편 유전자 부분을 pShuttle-CMV에 삽입하고 제한효소를 이용하여 mapping으로 확인하였다. 이를 2회 반복하여 총 3개의 연속된 MSP-1 33 kDa 단편 유전자가 삽입되도록 하였다. 이로써 pShuttle-CMV/3xPvMSP를 제조하였다(도 1).
상기 전달 벡터를 아데노 바이러스 HuAd5에 삽입함으로써, 재조합 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133를 제조하여 대량생산하였다.
웨스턴 블롯(western blot)을 통해 MSP-1 33 kDa 단편 단백질을 발현하는 HuAd5-PvMSP-133 백신 후보주가 제조되었음을 확인하였다(도 2).
이를 통해 확보된 HuAd5-MSP-133 백신 후보주는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112019035967420-pat00001
[실시예 2]
재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-1 33 및 KVAC C7L-PvCSP의 제조 및 발현 확인
약독화한 백시니아 바이러스 전달 벡터(pVVT1-PA-C7L)에 삼일열말라리아 PvMSP-133 Belem과 PvCSP-Sal1 유전자를 재조합시켰다. 상기 재조합된 전달 벡터를 백시니아 바이러스 KVAC에 공지된 방법으로 삽입하여, 재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133 Belem 및 KVAC C7L-PvCSP Sal1을 제조하였다. 그 후 재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주를 대량생산하였다.
웨스턴 블롯을 통해 재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133 Belem 및 KVAC C7L-PvCSP Sal1로부터 MSP와 CSP 단백질의 안정적인 발현을 확인하였다. 웨스턴 블롯 결과, MSP-1 33 kDa 단편 및 CSP 단백질에 해당하는 밴드를 확인하였다(도 3).
이를 통해 확보된 KVAC C7L-PvMSP-133 및 KVAC C7L-PvCSP 백신 후보주는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112019035967420-pat00002
[실시예 3]
재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-1 33 의 채액성 면역 분석
실시예 1에서 제조된 재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133의 PvMSP-133에 대한 항원성 확인을 위해 체액성 면역 반응을 분석하였다. 본 실험에서는 투여(접종) 경로, 접종 PFU(투여량), 마우스 종(Balb/c, C57BL/6)을 변경함으로써 실험을 진행하였다.
재조합 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133에 대한 체액성 면역 반응을 분석하였다. 구체적으로 백신 후보주를 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 PFU의 투여량으로 Balb/c와 C57BL/6 마우스 각각에 피내(Intradermal/ID) 및 근육내(Intramuscle/IM)로 1차 접종 후 2주 후에 채혈하여 항체 생성능을 분석하였고, 2차 접종 후 2주 후에 다시 채혈하여 항체 생성능 분석하였다(도 4).
분리된 혈청을 사용하여 IgG에 대한 항체가를 통상의 ELISA로 측정하였다. 구체적으로, 재조합 삼일열말라리아 MSP-133 단백질을 100 ng/well씩 사용하였고, 백신 후보주로 면역화된 마우스에서 볼 채혈을 통한 혈액을 100-400ul를 획득하였고, 혈청분리 후 1:25, 1:50, 1:100 배수로 희석하여 하여 위 단백질과 반응시켰다. 검출용 항체로는 마우스 IgG (Fc)-HRP을 1:3000으로 희석하여 사용하였다.
Balb/c 마우스 및 C57BL/6 마우스에 대한 항체 생성능의 실험 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다. 이로부터 제조된 HuAd5-PvMSP-133 백신 후보주 접종에 의한 높은 항체 생성능을 확인하였다.
또한, 백신 접종시 감염 수(투여량)은 1차 접종 후 항체 생성능 확인 결과로부터 5 X 107 PFU가 가장 적정한 것으로 확인되었다. 마우스 종간의 차이는, Balb/c 마우스 종에서 보다 C57BL/6 마우스 종의 항체생성능이 더 우수한 것을 확인하였다. 접종 방법은 피내 투여가 근육내 투여보다 더 높은 항체 생성능을 나타내었다.
[실시예 4]
재조합 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-1 33 의 채액성 면역 분석
실시예 2에서 제조된 재조합 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133의 MSP-133 항원성 확인을 위해 체액성 면역 반응을 분석하였다. 본 실험에서는 투여(접종) 경로, 접종 PFU(투여량), 마우스 종(BalB/c, C57BL/6)을 변경함으로써 실험을 진행하였다.
실시예 2의 대량생산을 통해 생산된 KVAC C7L-PvMSP-133에 대한 체액성 항체를 분석하였다.
재조합 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133를 Balb/c와 C57BL/6 마우스 각각에 피내(Intradermal/ID)로 접종한 후 2주 후 혈청을 분리하여 IgG에 대한 항체가를 통상의 ELISA로 측정하였다(도 7). 구체적으로, 재조합 삼일열 말라리아 MSP-1 33 kDa 단편 단백질을 100 ng/well씩 사용하였고, 백신 후보주를 감염시킨 마우스에서 볼 채혈을 통한 혈액을 100-400ul를 획득하였고, 혈청 분리 후 1:25, 1:50, 1:100 배수로 희석하여 하여 위 단백질과 반응시켰다. 검출용 항체로는 마우스 IgG (Fc)-HRP을 1:3000으로 희석하여 사용하였다.
그 결과, Balb/c와 C57BL/6 마우스에서, PBS와 공벡터를 접종한 마우스(대조군)보다 KVAC C7L-PvMSP-1-33를 접종한 마우스에서 MSP-1 33 kDa 단편 특이적인 항체가 많이 생성된 것을 확인하였다(도 8).
또한 Balb/c 마우스 종에서 보다 C57BL/6 마우스 종의 항체생성능이 더 우수한 것을 확인하였다.
상기 실시예 3 및 4의 실험결과로부터, MSP-1 33 kDa 단편 항원에 대한 두 가지 HuAd5-PvMSP-133 및 KVAC C7L-PvMSP-133 백신 후보주를 이용한 복합 백신접종(dual vaccination) 요법 확립 실험 시, 감염수는 5 X 107 PFU, 접종 방법은 피내(ID), 마우스 종은 C57BL/6 마우스가 가장 적정함을 확인하였다.
[실시예 5]
재조합 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-1 33 및 KVAC C7L-PvMSP-1 33 을 이용한 복합 백신접종시의 항원성 및 면역원성 평가
가. 마우스 면역화
C57BL/6 및 BALB/c 마우스에 아데노 바이러스 백신 후보주 HuAd5-PvMSP-133를 1차 피하 접종하고, 2주 후 백시니아 바이러스 백신 후보주 KVAC C7L-PvMSP-133를 2차 피하 접종하였다. 각각의 실험군을 하기 표 3에 나타내었다.
Figure 112019035967420-pat00003
또한, 마우스 면역화를 위한 백신 후보주 접종 및 면역원성 분석 스케줄은 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같다.
나. 체액성(항체) 면역 분석 : 항체생성 및 항체 아형(subtype) 분석
도 9에 나타낸 바와 같은 분석 스케줄에 따라 마우스에 백신 후보주를 2차에 걸쳐 접종 한 후 그로부터 6주 후 각각의 마우스에서 혈청을 채취하여 ELISA로 Ig 아형에 대한 혈청의 반응성을 측정하였다.
면역화된 마우스로부터 혈청 분리 방법은 다음과 같다. 백신 후보주 최종 접종 후 6주일 째 마우스의 안구에서 마리당 500㎕의 혈액을 채취하였다. 채혈은 혈액응고 방지를 위해 heparin이 처리되어 있는 capillary를 이용하여 실시하며 채혈 후 1.5㎖ tube에 혈액을 담아 8,000 rpm에 10분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후 혈청 상청액을 채취한 후 새로운 1.5㎖ tube로 옮기고 -70℃에 냉동 보관하였다.
사용한 ELISA의 구체적인 방법은 다음과 같다. 정제한 재조합 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 단백질을 코팅 버퍼에 2 ug/ml의 농도로 희석한 후 96 well ELISA plate(Immulone)에 각 웰 당 50 ul씩 첨가하고 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅하였다. 반응 후 반응액을 제거하고 각 웰에 250 ul의 워싱 버퍼(washing buffer, 0.01 M PBS, 0.02% Tween 20, pH 7.4)를 첨가하여 3회 반복 세척한 후 블로킹 버퍼(blocking buffer, 0.01 M PBS, 3% skim milk)를 각 웰 당 100 ul씩 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 위와 동일한 방법으로 세척한 다음, 희석 버퍼(dilution buffer, 3% skim milk, 0.05% Tween-20, 0.01mM PBS)에 1:100배수로 희석된 대조군과 면역된 마우스 혈청을 50 ul씩 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 위와 동일한 방법으로 세척한 후, 홀스래디쉬 과산화효소(HRP)-컨쥬게이트 항인간 IgG(Sigma)를 희석 버퍼에 1:1,000으로 희석하여 각 웰에 50 ul씩 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후 위와 동일한 방법으로 세척하고 발색용액(0.5 mg/ml o- phenylenediamine, 0.3% H2O2, 0.1 M phosphate-citric acid buffer, pH 5.0)을 각 웰 당 100 ul씩 첨가하여 30분간 반응시키고 ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
C57BL/6 마우스에서 2차에 걸쳐 피하 복합 백신접종 결과, 실험군 1과 2에서 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편에 대한 전체 IgG가 증가하였다(도 11). 접종한 백신 후보주의 역가별 차이는 미미하여 1X107 PFU의 저역가에서도 면역반응이 잘 유도되는 것을 확인하였다. IgG 아형 분석 결과, IgG2a보다 IgG1의 증가가 두드러진 것으로 보아 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편은 C57BL/6 마우스에서 주로 Th2 면역반응을 유도하는 것으로 예상된다.
한편, BALB/c 마우스에서 2차에 걸친 백신 후보주 피하 접종 결과, 실험군 1과 2 모두에서 PvMSP-133에 대한 전체 IgG의 증가를 나타내었으나 C57BL/6 마우스에 비해 증가폭은 작았다(도 12). 접종한 백신 후보주의 역가별 차이는 C57BL/6 마우스에서와 마찬가지로 미미하여 1X107 PFU의 저역가에서도 면역반응을 유도하는 것으로 나타났다. IgG 아형 분석 결과 IgG1과 IgG2a의 증가가 비슷하게 나온 것으로 보아 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편은 BALB/c 마우스에서 고른 Th1/Th2 면역반응을 유도하는 것으로 예상된다.
IgM은 대조군과 실험군의 차이가 거의 없었다. 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편에 대한 기본적인 IgM 반응성은 C57BL/6 마우스보다 BALB/c 마우스에서 상대적으로 높게 나타났으며 이는 마우스 실험종 별 차이로 예상된다.
혈청 채취 후 2달 간격으로 혈청 내 IgG 품질을 ELISA로 확인한 결과 항체가가 잘 유지되는 것을 확인하였다(도 13 내지 도 16).
다. 세포매개성(T 세포) 면역 반응 분석
도 10에 나타낸 바와 같은 분석 스케줄에 따라 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편에 대한 세포매개성 면역을 분석하기 위해 최종 접종이 끝나고 마우스에서 비장을 적출하여 비장세포를 배양하였다. 배양 중인 비장세포에 재조합 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 단백질을 투여하고 생산된 항원특이적 CD4+, CD8+ T 세포를 통상의 ELISPOT으로 분석하였다.
마우스 비장세포의 준비 방법은 다음과 같다. 백신 후보주 최종 접종 후 6주일 째 마우스를 포란을 이용하여 마취시킨 후 비장을 적출하였다. 마취된 마우스를 알콜로 소독한 후 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 마우스의 갈비뼈 끝 쪽 외피를 조심스럽게 벗기고 비장을 적출하였다. 적출한 비장을 PBS 5 ml이 담긴 페트리접시(petri-dish)의 세포 스트레이너(cell strainer, 40 mm pore size) 위에 넣고, 3 ml 주사기 손잡이 끝으로 조심스럽게 갈아주었다. 새로운 PBS 5 ml로 세포 스트레이너를 다시 한 번 수세하고 15 ml 튜브로 옮겼다. 이를 1,200 rpm으로 5분간 원심한 펠렛에 RBC lysis buffer 1 ml을 넣었다. 완전 배지(complete media; RPMI1640, 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin) 8 ml을 채우고 1,200 rpm으로 5분간 2회 원심분리하였다. 완전 배지로 현탁시킨(suspension) 후 최종적으로 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
ELISPOT을 이용한 분석 방법은 다음과 같다. 항-IFN-γ 모노클로날 Ab가 코팅되어있는 96-웰 플레이트에 블로킹 용액 200 uL를 각 웰에 첨가하여 1회 세척하고 200 uL 블로킹 용액을 첨가한 후 37℃ 인큐베이터(5% CO2)에서 2시간 동안 배양하였다. 대조군과 면역된 비장세포는 세포수가 5 X 106/ml이 되도록 준비하고 블로킹된 96-웰 플레이트에 100 ul씩 넣고, 면역된 재조합 단백질 항원을 0.5 ug/ml, 1 ug/ml 농도로 처리하고 37℃ 5% CO2에 16 내지 20시간동안 배양하였다. 세척 버퍼(PBS with 0.05% tween) 200 uL을 넣고 3회 세척하고, 2차 항체를 PBS/10% FBS를 이용하여 1:250으로 희석한 다음 100 uL씩 각 웰에 첨가하고, 2시간 동안 상온에서 배양한 다음 세척 버퍼를 200 uL씩 넣고 3번 세척하였다. APC 용액(streptavidin-HRP를 1:100으로 희석- PBS with 10% PBS)을 100uL씩 첨가하고 1시간 동안 배양 상온에서 배양한 후 세척 버퍼로 4번 세척한 다음 세척 버퍼(PBS)로 2회 세척하였다. 이후 최종 기질 용액(20 uL chromogen/1mL solution)를 100 uL씩 첨가하고 5~60분 동안 배양하면서 발색반응을 관찰하고, 발색반응이 어느 정도 진행되면 DW로 웰을 세척하여 반응을 정지시키고 2 시간 동안 공기 중에서 플레이트를 말려서 판독하였다. 그 결과를 도 17 내지 도 20에 나타내었다.
BALB/c와 C57BL/6 마우스 모두에서 대조군에 비해 CD4+, CD8+ T 세포의 증가가 나타났다(도 17 내지 도 20). 그러나 체액성 면역과는 달리 마우스 종에 따른 CD4+, CD8+ T 세포의 차이는 나타나지 않았다.
라. 삼일열원충 항원의 T 세포 에피토프 면역분석
CD8+/IFN-γ ELISPOT을 위한 펩티드를 선정하기 위해 IEDB의 에피토프 예측 프로그램 중 MHC-NP 및 MHC-I 결합 예측 알고리즘으로 예측을 수행하였다. 각각의 알고리즘에서 예측된 항원성의 강도 순으로 에피토프를 선별하였다(표 4). 이로부터 얻어진 펩티드를 사용하여 IFN-γ ELISPOT을 수행하였다.
백신 후보주로 1차 및 2차 접종하여 면역화된 C57BL/6 및 BALB/c 마우스에서 비장세포를 분리하였다. CD8+/IFN-γ ELISPOT 96-웰 플레이트에 분리한 비장세포 1×105개씩을 투여하였다. 선별된 항원 1㎍/㎖ 에피토프(펩티드)를 투여하여 비장세포를 자극하였다. IFN-r 생성 CD8+ T 세포수를 spot을 통해 분석하여 가장 효과가 좋은 펩티드를 선별하여 위의 예측 결과와 비교하였다(표 4).
Figure 112019035967420-pat00004
[실시예 6]
백신 후보주에 의한 삼일열원충 분열소체의 적혈구 침입 억제 평가
태국 송클라 지역 삼일열말라리아 환자 혈액을 이용하여 백신 후보주 접종 마우스 혈청에서 삼일열원충 분열소체의 적혈구 침입 억제능을 조사하였다.
가. 삼일열원충 감염 신선 검체
삼일열말라리아 환자로부터의 신선 검체를 800g에 10분간 원심분리하여 혈청과 혈구 분리하고, 혈청은 -20°C에 보관하였다. 혈구를 RPMI1640 배지를 이용하여 세정하고 혈구 용적율이 20%가 되게 RPMI 배지를 첨가하였다. 말라리아원충 필터(Plasmodium filter)를 이용하여 희석된 혈구를 초당 1방울씩 떨어지게 필터에 투과시켜 백혈구를 제거하였다. 투과된 혈구는 800g에 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다.
나. 신선 검체를 이용한 삼일열원충 배양
상기 신선 검체 처리법을 통해 얻어진 혈구에 25% 인간 AB 혈청을 포함한 McCoy배지를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2환경에서 배양하거나 신선 혈액을 넣어 혼합 배양하였다. 배양 24시간 후 500 ul의 배양액을 채취하였다. 이를 800g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 박층 및 후층도말 검경하여 배양상태를 확인하였다. 45% percoll(1200g, 30min)를 이용하여 윤상체(Ring form)와 영양체(Trophozoite)를 분리하였다. 70 시간 더 배양하여 분열체(schizont)를 확인하였다.
다. 정상 혈액 내 미성숙 적혈구의 분리
정상인 농축 적혈구(250 ± 50 ml)를 19% Nycodenz/KCL 용액 원심분리하여 미성숙 적혈구를 분리하였다. 메틸렌블루(Methylen blue)로 염색하고 검경하여 미성숙 적혈구의 순도를 확인하였다.
라. 삼일열원충의 분열소체 적혈구 침입 억제( P. vivax in vitro invasion inhibition) 평가
감염 적혈구(Schizoint)와 미성숙 적혈구를 1:6 비율로 혼합 배양하였다. 여기에 HuAd5 C7L-PvMSP-133 및 KVAC C7L-PvMSP-133의 두 백신 후보주로 면역화된 마우스 혈청 또는 대조군 마우스 혈청을 적정 비율로 투여하였다. 18시간 배양 후 박층 도말 표본을 제조하고 검경하였다. 삼일열원충의 적혈구 내 단계별 개수를 측정하였다(도 23). 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure 112019035967420-pat00005
백신 후보주 접종 마우스 혈청 처리군의 분열소체 수는 RBC 1,000개 당 약 8개로 대조군에 비해 8배 높았다. 그러나 윤상체의 수는 대조군에 비해 절반 적은 것으로 확인되었다. 따라서, 백신 후보주 접종 마우스 혈청 내 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편에 대한 항체가 분열소체의 미성숙 적혈구 침입을 약 50% 억제하였음을 알 수 있다.
[실시예 7]
HuAd5 C7L-PvMSP-1 33 및 KVAC C7L-PvMSP-1 33 백신 후보주 프라임-부스트(prime-booster) 요법의 감염 방어능 평가
본 실시예에서는 HuAd5 C7L-PvMSP-133 및 KVAC C7L-PvMSP-133 백신 후보주로 병용 접종된 마우스의 감염 방어능을 평가하였다.
C57BL/6 마우스에 HuAd5 C7L-PvMSP-1 33 및 KVAC C7L-PvMSP-1 33 백신 후보주를 병용 접종시킨 후, 2주 후 쥐열원충(P. berghei)을 원충률 2%로 200 ul씩 복강을 통해 감염시켰다. 7일 후 마우스 말초혈액에서 쥐열원충 원충률을 확인하였다. PBS 투여군 및 대조군 백신주 투여군의 원충률은 각각 12.31% 및 11.21%였으나 백신 후보주를 병용 접종시킨 마우스의 원충률은 8.76%로 감소하였다. 이는 대조군과 대비하여 백신 후보주 병용 접종된 마우스에서 약 29%의 원충률 감소를 나타내어, 결국 쥐열원충 감염에 저항성을 나타냄을 의미한다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
Figure 112019035967420-pat00006
HuAd5 C7L-PvMSP-1 33 및 KVAC C7L-PvMSP-1 33 백신 후보주로 병용 접종된 BALB/c 마우스에 쥐열원충을 감염시키고 생존율을 추적하였다. 대조군 마우스는 쥐열원충 감염 후 15일을 전후하여 마우스가 모두 사망하였다. 반면 백신 후보주로 병용 접종된 마우스는 쥐열원충 감염 후 최대 28일까지 생존하였다(도 24). 이러한 결과는 백신 후보주 병용 접종이 쥐열원충 감염에 의한 병인을 억제할 수 있음을 의미한다. 또한 위 결과는 백신 접종이 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편에 대한 항체를 생성하고, 그 항체가 쥐열원충의 적혈구 침입을 방해하는 방식으로 작용함을 나타낸다.
이로부터 삼일열 말라리아에 대한 백신으로서 재조합 아데노 바이러스 및 백시니아 바이러스 백신주의 프라임-부스트 병용 요법이 효과적임을 확인하였다.
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> RECOMBINANT ADENOVIRUS STRAIN AND VACCINE COMPOSITION AGAINST VIVAX MALARIA USING THE SAME <130> KCD19P-0001-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 854 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment of MSP-1 of Plasmodium vivax <400> 1 gcacaagatt atgctgaaga ctacgataaa gttatcgcac tgccgctgtt tggcaacaat 60 gatgacgatg gtgaagaaga tcaggtcacc acgggtgaag cggaatctga agccccggaa 120 atcctggttc cggcaggcat cagtgactat gatgtcgtgt acctgaaacc gctggctggc 180 atgtacaaaa cgatcaaaaa acaactggaa aaccatgtca atgcgttcaa tacgaacatt 240 acggacatgc tggattctcg tctgaaaaaa cgcaattatt ttctggaagt tctgaacagt 300 gacctgaacc cgttcaaata ctcgccgagc ggcgaatata ttatcaaaga cccgtacaaa 360 ctgctggact tagagaaaaa gaaaaaatta ctgggctcct ataaatacat tggtgcgtca 420 atcgacaaag atctggcgac cgccaacgat ggcgtcacct attataataa aatgggcgaa 480 ctgtataaaa cccacctgac ggccgtgaac gaagaagtga aaaaagttga agcagacatc 540 aaagctgaag acgataaaat taagaaaatt ggttctgata gtaccaaaac cacggaaaaa 600 acgcagtcca tggcgaaaaa agccgagtta gaaaaatatc tgccgtttct gaatagcctg 660 caaaaagaat atgaatccct ggtctcaaaa gtgaacacct acacggataa cctgaaaaaa 720 gttatcaaca actgccagct ggagaaaaaa gaagcggaaa tcaccgtcaa aaaactgcaa 780 gactacaaca aaatggatga aaaactggaa gaatacaaaa aatctgaaaa gaaaaacgaa 840 gtgaaatcct cagg 854

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 삼일열원충(Plasmodium vivax)의 분열소체 표면 단백질-1(MSP-1) 33 kDa 단편의 유전자를 3회 반복하여 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 면역증강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 서열번호 1로 표시되는 유전자 서열을 갖는 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편의 유전자를 전달 벡터에 3회 반복하여 삽입한 후, 상기 전달 벡터를 아데노 바이러스에 삽입하는 것을 포함하는, 제1항의 재조합 아데노 바이러스주의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 전달 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전달 벡터는 pGEM-T 또는 pShuttle-CMV인 것을 특징으로 하는, 재조합 아데노 바이러스주의 제조 방법.
  10. (a) 제1항의 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물; 및
    (b) 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 또는 포자소체 단백질(CSP) 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물
    을 포함하는 것을 특징으로 하는, 삼일열 말라리아 감염 예방용 프라임-부스트(prime-boost) 복합 백신 조성물.
  11. 제10항에 있어서, (b)의 백신 조성물은 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 프라임-부스트 복합 백신 조성물.
  12. (a) 제1항의 재조합 아데노 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 유효량의 적어도 1회 투여량; 및
    (b) 삼일열원충 MSP-1 33 kDa 단편 유전자를 포함하는 약독화된 재조합 백시니아 바이러스주를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물의 유효량의 적어도 1회 투여량
    을 포함하는 삼일열 말라리아 감염 예방용 백신 키트.
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