KR102004902B1 - 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 ESAT-6(6 kDa early secretory antigenic target)를 포함하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 결핵 예방용 조성물로, 예를 들면 결핵 백신용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 항원으로 사용하는 경우 결핵균에 의한 감염을 유발시킨 동물모델의 비장과 폐에서 높은 IFN-γ 생성능을 나타내고, 다기능성(multifunctional) CD4+ T 세포의 발현 수준을 높이며, 빠른 후천적 방어면역의 형성과 T 세포의 기억화를 유지시켜 줌으로써 활성기의 결핵 감염뿐만 아니라, 잠복기의 결핵 감염의 재활성화 또한 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 조성물{Composition for tuberculosis comprising fusion protein}

본 발명은 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 조성물로, 예를 들면 결핵 백신용 조성물에 관한 것이다.

결핵은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacerium tuberculosis)에 유발되며, WHO에서 정한 3대 감염 질환 중 하나로, 높은 발병률과 사망률을 나타내고 있다. 전 세계적으로 약 6천만명의 활동성 결핵 환자가 있으며 매년 5천만 내지는 1억여명이 결핵에 감염되는 것으로 추정되고, 적어도 매년 900만명의 결핵 신환자가 발생하며, 150만 명 이상이 결핵으로 사망한다고 알려졌다. 결핵 발병률(incidence rate)은 인구 10만명 당 146명, 결핵 사망률은 인구 10만명 당 49명으로 단일 감염병 중에서 가장 많은 사망 원인을 차지하고 있어, 세계적으로 심각한 보건 문제로 남아 있다. 최근에는 약제 내성을 나타내는 난치 결핵 환자의 증가와 HIV 감염 증가로 인해 발병 양상은 더욱 심각해지는 추세이다. 현재 HIV 감염자의 약 50%인 1,500만 여명이 결핵균에 동시에 감염되어 있으며, 결핵균이 HIV 증식을 촉진하여 다른 기회 감염균보다 기대수명(life expectancy)을 2분의 1로 단축시켜, HIV 감염자에게는 더욱 위협이 되고 있다. 또한 HIV 양성 결핵 환자의 경우 결핵에 의한 사망률이 3배 이상 높고 치료 효과는 2배 정도 낮다고 보고되었다. 우리나라의 결핵균 감염률은 약 40%로 대략 2천만명이 결핵균에 감염되었을 것으로 추정되고 있다. 이 가운데 약 10%인 200만 명은 일생에 한번은 결핵 환자가 될 것으로 예상된다. 우리나라에서 전염병으로 사망하는 사람의 60% 가량이 결핵으로 그 심각성을 유추할 수 있으며, 이는 21세기 국가보건 및 복지에 심각한 문제로 대두되고 있다. 특히 우리나라는 고병원성인 베이징과(Beijing family)의 결핵균이 많다. 베이징 균주는 다른 결핵균과 달리 병원성과 전염력이 높으며 다제내성 결핵의 발생이나 재활성화 결핵의 발생 빈도가 매우 높다. 한국 내 결핵균의 유전자 지문을 통해 베이징과의 하나가 우점적으로 존재한 것으로 나타났으며, 이 유전자형은 총 결핵균의 18.4%를 차지하는 것으로 나타났다 (Choi et al., 2010; Kim et al., 2001; Park et al., 2000). 김 등(2001)은 베이징과에 속하며 한국에서 발생한 전염성이 강한 결핵균을 확인하였으며, 이 균을 K 균주(K strain)라 명명하였다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주는 마우스 감염 시 초기 선천면역을 극복할 수 있는 특이적 병인기전을 나타내며 이는 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주 감염량의 10배에 해당되는 성장속도를 나타내었다. 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 감염에 의한 마우스의 폐사는 결핵균 표준 균주인 H37Rv 균주 감염에 의한 마우스의 폐사보다 2배 이상 빠르며, 감염 후 폐사 시기의 균수는 거의 동일한 것으로 보아 감염 후기에는 숙주의 면역 반응에 의한 면역 병리가 병인 기전으로서 매우 중요할 것으로 생각되기에 선천면역보다는 예방백신 등을 통한 후천면역을 특이적으로 올려주는 것이 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주를 방어하는 핵심 요소일 것으로 판단되었다.

현재, 결핵은 주로 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)의 비독성 균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG: Bacillus Calmette-Guerin)의 생균을 이용하여 예방하고 있다. 그러나, BCG의 안전성 및 효능은 지역과 나라, 인종에 따라 논란이 있으며 (Styblo K et al., Tuberc Lung Dis 1976; 7:17-43), 미국과 같은 몇몇 국가에서는 BCG의 사용이 제한되고 있다. 또한, BCG는 HIV에 감염되거나 면역이 저하된 어린이들에게 사용하기에는 적당하지 못하다고 알려져 있다. 이에 BCG를 대체할 보다 안전하고 효과가 우수한 새로운 예방 백신의 개발이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명자는 안전하면서도 국내에서 유행하고 있는 고병원성 결핵균을 효과적으로 예방할 수 있는 백신을 개발하기 위한 연구를 계속한 결과, 본 발명에 따른 융합 단백질을 항원으로 이용하는 경우 결핵을 효과적으로 예방하여 결핵 백신용 조성물로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 목적은 결핵을 효과적으로 예방할 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방할 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 ESAT-6(6 kDa early secretory antigenic target)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 융합 단백질에서 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드는 상기 ESAT-6의 N-터미널의 전단 부위에 융합될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드는 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유래 PE18의 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 융합 단백질에서 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드는 상기 ESAT-6의 N-터미널의 전단 부위에 융합될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드는 마이코박테리움 튜버큘로시스 유래 PPE30의 에피토프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 융합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 PE18의 에피토프 폴리펩티드와, 서열번호 2로 표시되는 PPE30의 에피토프 폴리펩티드를 모두 포함할 수 있고, 보다 상세하게는 상기 ESAT-6의 N-터미널의 전단 부위에, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드가 융합된 폴리펩티드가 융합될 수 있고, 이때 두 폴리펩티드의 융합 순서는 특별히 제한하지 않는다. 다만, 바람직하게는 본 발명의 상기 융합 단백질은 ESAT-6의 N-터미널의 전단 부위에, 상기 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드가 융합된 단백질일 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드는 상기 PE18의 에피토프와 PPE30의 에피토프가 순서대로 융합된 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단, 본 발명에서 상기 "N-터미널의 전단 부위에 융합"의 의미는 상기 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드의 어느 일 말단이 ESAT-6의 N-터미널 말단의 전방 부위에 융합되는 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 ESAT-6는 서열번호 4로 표시되는 폴리펩티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "PE PPE 패밀리 단백질"은 결핵균인 마이코박테리움 튜버큘로시스 유전자의 전체 코딩 용량의 약 10%의 큰 비중을 차지하고 있으며, 이들 단백질의 N-터미널(N-terminal) 부분에 일정하게 보존되어 있는 모티프로 Pro-Glu (PE)와 Pro-Pro-Glu (PPE)의 반복되는 서열이 나타나고 있어 이를 PE PPE라 부른다. 이 단백질들의 기능과 특성은 아직도 밝혀지지 않은 부분이 많으나, 세포벽을 구성하거나 분비형 단백질로, 이들 또한 결핵균의 독성(virulence)에 중요한 요소인 것으로 알려져 있다. 결핵균에서 PE 패밀리는 약 100개, 그리고 PPE 패밀리는 약 70개의 단백질들로 구성되어 있으며, 이들의 N-터미널 부분에 각각 110개와 180개의 일정한 아미노산으로 보존되어 있는 도메인이 있고, C-터미널(C-terminal) 부분에는 매우 다양한 크기와 반복 구조를 보이는 서열로 이루어져 있다는 특징이 있다. 또한, 상기 C-터미널의 서열에 따라 두 아군으로 나눌 수 있고, 보다 상세하게 PE 패밀리는 PE-PGRS로, 그리고 PPE는 PPE-MPTR의 아군으로 각각 나뉜다. 이들은 모두 G+C 비율이 높은 단백질을 코딩하고 있으며 C-터미널의 다양한 서열의 변화로 인해 다양한 항원을 제공하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 상기 "ESAT-6 (early secreted antigenic target 6 kDa)"는 결핵균에서 생산되는 6 kDa의 초기 분비 단백질로 대표적인 T 세포 항원이며, 가장 강력한 백신 후보 물질로 주목 받고 있는 항원이다. 또한, 상기 ESAT-6는 독성과 연관이 있는 유전적 장소인 RD1 (region of difference 1)에 속해 있는 항원으로, 결핵균에는 존재하지만 BCG와 그 외 다른 모든 BCG 균주에는 결여되어 있는 부분이기도 하다. 결핵균은 두꺼운 외피 구조와 그 특성상 단백질을 수송하기 위해 사용되는 독특한 분비 체계로 ESX Type VII 분비 시스템이 있는데, 결핵균은 이 체계를 부호화하고 있는 것으로 esx-1에서 esx-5의 클러스터(cluster)를 포함하고 있으며, 이 중 esx-1은 RD1이라는 유전적 장소에 의해 부호화 된다. ESAT-6는 상기 ESX-1 단백질에 속하며, 여기서 나오는 단백질들은 숙주의 면역 체계와의 상호 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다.

그런데 상기한 ESAT-6는 중요하게 가능성이 있는 T 세포 에피토프를 많이 가지고 있음에도 불구하고, 면역 반응은 면역 우성(immunodominant) 에피토프가 아닌 준우성 에피토프(subdominant epitope)에 연관되어 있는 경우가 있고, 기존의 단독 ESAT-6 항원은 그 효과가 한계적이다.

따라서, 본 발명의 발명자들은 예의 노력한 결과, 결핵균 유래 PE18 에피토프, PPE30 에피토프 또는 이들의 융합 폴리펩티드를 ESAT-6 항원의 면역 우성 에피토프 전단에 융합시킨 단백질을 항원으로 사용하는 경우 IFN-γ 및 다기능성(multifunctional) CD4+ T 세포의 발현 수준을 높이며, 결핵균에 대하여 방어 면역을 빠르게 형성하여 결핵을 효과적으로 예방할 수 있음을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

일반적으로 결핵 질환에서 '활성기(active phase)'는 결핵균이 활발하게 증식하는 단계를 말한다. 통상적으로 결핵에 걸린 동물의 혈청으로부터 다량의 결핵균이 검출되는 시기이다. '잠복기(latent phase)' 또는 비활성기는 결핵균으로 감염되어 있으나, 이의 증식이 억제되어 결핵균이 검출되지 않는 단계를 말한다. 일반적으로 결핵균은 정상 동물에 감염될 경우에 활성기 없이 잠복기에 들어간다. 숙주의 면역반응 또는 항생제 등의 치료에 의하여 결핵균의 증식이 억제되고, 숙주의 면역 상태 또는 치료 정도에 따라 잠복기는 매우 다양한 기간 동안 지속될 수 있다. 이 때, 결핵균이 검출되지 않거나, 미비한 양이 검출된다.

본 발명의 융합 단백질은 활성기에 있는 결핵의 감염 외에도, 결핵 복합체 미생물들(결핵균(Mycobacterium tuberculosis), M.보비스(M.bovis), M.아프리카눔(M.africanum))의 종에 의하여 야기되는 잠복 결핵 감염의 재활성화를 예방할 수 있다.

본 발명에서 상기 융합 단백질은, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 ESAT-6를 포함하는 융합 단백질; 또는 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드 및 ESAT-6를 포함하는 융합 단백질;일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, '폴리뉴클레오티드'는 뉴클레오티드(nucleotide) 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬모양으로 이루어진 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하는 것으로, 일정 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 지칭한다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방식은 당업계에서 사용되는 방법을 사용할 수 있으며 바람직하게는 PCR, 화학적 방법을 통하여 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 오버랩 PCR(overlap PCR)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, '발현 벡터'는 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현 벡터는 개시 코돈, 종결 코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 발현 벡터는 프로모터와 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 발명에서 상기 '작동가능하게 연결(operably linked)'이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 발현 벡터의 백본(backbone)으로 사용할 수 있는 벡터는 융합 단백질을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않으나, 예를 들면, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA, 상업적으로 개발된 플라스미드(pGEM® T 벡터, pET22b, pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pGEX-4T-1, pET, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)일 수 있으나, 이는 실험에 따라 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 발현 벡터가 도입되어 형질 전환된 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 '형질전환'은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체의 통합 완성에 의하여 복제 가능하게 되는 것을 지칭하는 개념이다.

본 발명에서 상기 형질전환제의 제작에 사용되는 숙주 세포는 본 발명의 융합 단백질을 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, BL21 또는 DH5α 등의 대장균(E. coli), 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포, 사카로마이세스 세레비지애, 스키조사카로마이세스 폼베 등의 효모 세포, 피치아 파스토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포, CHO, COS, NSO, 293, 보우 멜라노마 세포 등의 동물 세포, 또는 식물 세포를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 결핵 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 결핵은 안 결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장 결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 결핵은 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 또는 베이징(Beijing) 결핵 균주에 의해 발병되는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 병원성 유기체의 약독화된 균주를 개체에 접종하여 병원체에 대한 면역 반응을 유도한 것이 아니라, 백신 효과를 가지는 단백질 항원을 투여함으로써 이후의 병원균 감염을 예방한 것을 특징으로 하기 때문에, 기존에 알려진 BCG 면역법에 비하여 보다 안전한 면역법임을 특징으로 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 본 발명에 따른 융합 단백질과 함께 결핵의 예방 및 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 결핵의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 백신 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 예방용 백신 조성물은 단독으로 투여 가능하지만 바람직하게는, 면역 증강제(adjuvant)와 함께 투여할 수 있다.

본 발명에서 상기 면역 증강제는 면역세포의 초기 활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대한 면역 반응을 촉진하는 물질로, 숙주에게 면역원은 아니지만 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 제제, 분자등을 의미한다(Warren et al., 1986, Annu.Rev.Immunol,. 4:369). 본 발명의 백신 조성물과 함께 투여되어 면역 반응을 증강시킬 수 있는 면역 증강제는 임의의 다양한 면역 증강제를 포함하며, 전형적인 면역 증강제는 GLA-SE, 프로인트 애쥬번트(Freund adjuvant), 알룸 화합물(aluminum compound), 무라밀 디펩타이드(muramyl dipeptide), 리포폴리사카라이드(LPS), 모노포스포릴 리피드 A, 또는 쿠일 A 등이 알려져 있다. 상기 면역 증강제는 백신 조성물과 동시에 투여되거나 시간 간격을 두고 순차적으로 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 BCG 백신 투여 후, 부스터(booster) 백신으로도 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 부형제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 용매에는 생리식염수, 증류수 등이 포함되며, 상기 부형제에는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포타슘 설페이트 등이 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 백신 제조에 사용하는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있고, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 피하 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여할 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 결핵 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 항원으로 사용하는 경우 IFN-γ 및 다기능성(multifunctional) CD4+ T 세포의 발현 수준을 현저히 높여 결핵균에 대한 높은 방어 면역을 형성하고, T 세포의 기억화를 유지시켜 줌으로써 활성기의 결핵 감염이나, 잠복기의 결핵 감염의 재활성화를 모두 효과적으로 예방할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 결핵균 H37Rv 균주 유래 PE 패밀리 단백질에 대하여 다중 서열 정렬을 실시하여 일정하게 보존된 아미노산 서열을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 결핵균 H37Rv 균주 유래 PPE 패밀리 단백질에 대하여 다중 서열 정렬을 실시하여 일정하게 보존된 아미노산 서열을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 결핵균 H37Rv 균주 유래 PPE 패밀리 단백질에 대하여 다중 서열 정렬을 실시하여 일정하게 보존된 아미노산 서열을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 결핵균 H37Rv 균주 유래 PE-PGRS 패밀리 단백질에 대하여 다중 서열 정렬을 실시하여 일정하게 보존된 아미노산 서열을 조사한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2에서 C57BL/6 마우스를 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)로 감염시킨 뒤 실시예 1에서 최종 선별된 21개의 폴리펩티드 단편으로 자극 후 마우스의 폐와 비장에서 IFN-γ의 발현 수준을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에서 상기 실시예 2의 IFN-γ 검사에서 선별된 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프와, 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프, 및 이들의 융합 폴리펩티드를 ESAT-6 항원과 융합하여 단백질을 제조하는 설계안을 나타낸 것이다.
도 7의 (a)은 본 발명의 실시예 5에서 ESAT-6 항원(1)과, 최종 제조된 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 융합 단백질(2)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, (b)는 ESAT-6 항원(1)과, 최종 제조된 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 융합 단백질(2)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이며, (c)는 ESAT-6 항원(1)과, 최종 제조된 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 융합 단백질(2)의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예 6에서 C57BL/6 마우스를 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide); 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide); 또는 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide);를 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 단백질로 면역화시킨 후 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)으로 감염시킨 뒤 상기 마우스의 폐와 비장 조직에서 IFN-γ의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7에서 C57BL/6 마우스를 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide); 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide); 또는 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide);를 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 단백질로 면역화시킨 후 ESAT-6 또는 상기 PE18 에피토프와 상기 PPE30 에피토프로 자극시킨 뒤 상기 마우스의 폐 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예 7에서 C57BL/6 마우스를 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide); 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide); 또는 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide);를 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 단백질로 면역화시킨 후 ESAT-6 또는 상기 PE18 에피토프와 상기 PPE30 에피토프로 자극시킨 뒤 상기 마우스의 비장 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 7에서 C57BL/6 마우스를 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide); 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide); 또는 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide);를 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 단백질로 면역화시킨 후 베이징 결핵균 HN878 균주(Beijing Mycobacterium tuberculosis HN878 strain)로 공기 감염시킨 뒤 상기 마우스의 폐 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현 수준을 분석한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 8에서 C57BL/6 마우스를 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide); 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide); 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide);를 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 단백질로 면역화시킨 후 베이징 결핵균 HN878 균주(Beijing Mycobacterium tuberculosis HN878 Strain)로 공기 감염시킨 뒤 상기 마우스의 비장 조직에서 감염된 결핵균의 수를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[실시예 1] PE PPE 패밀리 단백질의 에피토프 선별

결핵균 H37Rv 균주의 전체 게놈(genome)에서 PE 패밀리 36개, PE-PGRS 패밀리 62개, PPE 패밀리 69개를 찾아 각 패밀리에서 다중 서열 정렬(multiple sequence alignment)를 실시하여 일정하게 보존된 아미노산 서열을 조사하였다(도 1 내지 4). 각 패밀리 안에 있는 단백질들끼리 나타날 수 있는 상세한 아미노산의 염기 차이는 가장 많은 빈도수를 보이는 아미노산에 따라 결정하였다. 그 결과 하기 표 1에서 보는 바와 같이, PE 패밀리에서 2개, PPE 패밀리에서 10개, PE-PGRS 패밀리에서 9개의 보존된 펩티드 서열을 얻을 수 있었다.

번호	펩티드 유래	아미노산 수	아미노산 서열
1	PE18	21	MSFVTTQPEALAAAAGSLQGI(서열번호 1)
2	PE19	21	AATPTTGVVPAAADEVSALTA
3	PPE30	21	MDFGVLPPEINSGRMYAGPGS(서열번호 2)
4	PPE30	27	PMLAAAAAWDGLATELQSTAADYGSV
5	PPE25, PPE27	26	LAATGYASVIAELTGAPWVGAASLSM
6	PPE30	21	WSGQSSGTMAAAAAPYVAWMS
7	PPE45	22	AGMQARAAAAAYELAFAMTVPP
8	PPE45	23	AMTVPPPVVVANRALLVALVATN
9	PPE45	24	VVANRALLVALVATNFFGQNTPAI
10	PPE45	21	LVATNFFGQNTPAIAATEAQY
11	PPE45	21	IAATEAQYAEMWAQDAAAMYA
12	PPE25	23	SASLARANKIGALSVPPSWVKTT
13	PE-PGRS33	22	MSFVVTIPEALAAVATDLAGIG
14	PE-PGRS33	21	STIGTANAAAAVPTTTVLAAA
15	PE-PGRS33	22	VLAAAADEVSAAMAALFSGHAQ
16	PE-PGRS33	25	AYQALSAQAALFMEQFVRALTAGAG
17	PE-PGRS33	23	QFVRALTAGAGSYAAAEAASAAP
18	PE-PGRS17	20	INAPVQSLTGRPLIGDGANG
19	PE-PGRS17	23	SLTGRPLIGDGANGIDGTGQAGG
20	PE-PGRS17	21	GGNGGWLWGNGGNGGSGAPGQ
21	PE-PGRS17	17	GGAGGAAGLIGNGGAGG

[실시예 2] 펩티드의 합성 및 IFN-γ 검사법을 통한 펩티드 선별

상기 실시예 1에서 선별된 총 21개의 폴리펩티드 단편을 합성하고, 결핵균으로 감염시킨 마우스를 이용한 IFN-γ 검사법을 통하여 각 폴리펩티드 단편들에 대한 반응을 조사하였다. IFN-γ는 CD4+ T 세포에서 나오는 사이토카인 중 중요한 요소이며, 항원이 숙주의 면역 체계에 인식되는 정도의 지표가 되는 것이므로, 면역학적으로 인지 능력이 있는 폴리펩티드를 선별하기 위한 스크리닝에 상기 IFN-γ 검사법을 이용하였다.

보다 상세하게는 C57BL/6 마우스를 숙주로 하여 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)를 감염시켰다. 상기 감염 후 4주가 경과하였을 때 상기 실시예 1에서 선별된 총 21개의 폴리펩티드 5 ug/ml으로 자극한 뒤 마우스의 폐(lung)와 비장(spleen)으로부터 조직을 채취하여 ELISA 법으로 IFN-γ의 발현 수준을 측정해, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 선별된 21개의 폴리펩티드는 PE 패밀리 단백질과 PPE 패밀리 단백질의 각 N-터미널 부분의 펩티드로, ESAT-6 항원에 융합하기 위한 PCR 프라이머로 제작되는데 이용되었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드(1번 폴리펩티드)와, 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드(3번 폴리펩티드)로 자극한 경우, 그 외의 다른 폴리펩티드로 자극한 경우에 비하여, 마우스의 폐와 비장에서 IFN-γ의 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 3] 재조합 융합 단백질의 프라이머 제작 및 PCR 반응

상기 실시예 2의 IFN-γ 반응 검사를 토대로, 이하에서는 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드와, 이들 두 폴리펩티드를 융합한 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드를 ESAT-6 항원(서열번호 4)의 N-터미널에 융합하여 재조합 융합 단백질을 제조하고자 하였다(도 6). 즉, 각 선별된 폴리펩티드 자체를 융합 단백질의 제조를 위한 정방향 프라이머(sense primer)로 제작하였고, 역방향 프라이머(anti-sense primer)는 ESAT-6 항원의 C-터미널 부분을 이용하였다 (표 2).

PCR 반응을 위하여, 주형 DNA 0.5 ㎕, 각 프라이머 0.5 ㎕ (10 pmole)씩, 그리고 HiPi 5X PCR Master Mix 4 ㎕ 와 DW를 14.5 ㎕를 채워 최종 20 ㎕이 되게 하였다. PCR 시 증폭은 S1000 Thermal Cycler (BIORAD) 기계로 95℃ 3분, (95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 40초) 30번, 72℃ 10분의 조건으로 실시하였다. PCR 산물은 1.5% 아가로스 겔에 전기 영동한 후, 목적 부분만을 정교하게 잘라내어 클로닝에 이용하였다.

재조합 단백질 구성	방향	염기서열
PE18 에피토프+ESAT-6	F	5'- CATATGTCNTTTGTGACTACTCAGCCGGAGGCGCTTGCGGCGGCGGCGGGATCACTTCAAGGTATTGAGATACTCGAGTGGCGAACATGACAGAG - 3'(서열번호 5)
PPE30 에피토프+ESAT-6	F	5'- CATATGGATTTCGGAGTTCTTCCACCAGAGATCAATTCGGGGCGTATGTACGCCGGACCTGGTTTCATGCCCAAGAGAAGCGAATACAATGACAGAG - 3'(서열번호 6)
PE18 에피토프+PPE30 에피토프+ESAT-6	F	5' - CATATGTCNTTTGTGACTACTCAGCCGGAGGCGCTTGCGGCGGCGGCGGGATCACTTCAAGGTATTCATATGGATTTCGGAGTTGTGTAGGTCAGCCCCATCC - 3'(서열번호 7)
공통의 역방향 프라이머	R	5' - AAGCTTTGCGAACATCCCAGTGACGTTGCCTTCGGT - 3' (서열번호 8)
* CAT ATG : NdeI 제한 효소 AAG CTT : HindIII 제한 효소

[실시예 4] 클로닝 및 발현

상기 실시예 3에서 재조합 융합 단백질의 제조를 위한 클로닝을 위하여 목적하는 부분의 DNA를 PCR 산물로 얻어낸 후, 이를 pGEMT easy vector system (Promega)을 이용하여 T 벡터에 삽입하였다. 삽입한 목적 DNA를 DH5α 수용성 세포(competent cell)에 형질전환 시킨 뒤, LB 아가 플레이트에 X-gal IPTG (40 mg/ml, 4 ug/ml)를 넣고 블루/화이트 선별법으로 목적 DNA가 성공적으로 삽입된 T 벡터를 선별하였다. 그 후 다시 단백질 발현 벡터인 pET22b 벡터에 옮긴 뒤 BL21 수용성 세포에 형질전환하고, LB 아가 플레이트에 도말한 뒤 37℃에서 밤새 배양하였다. 그 결과로 형성된 콜로니(colony)를 LB 액체 배지에 대용량 배양하여 목적 단백질을 발현 시켰다. 배양 조건은 30℃ 2시간 배양 후 1mM IPTG를 넣어 이후로 6시간을 같은 온도에서 더 배양하였다. 세포 배양액은 원심 분리로 수확(harvest)하여 다음 단계를 위해 냉동 보관해 두었다.

[실시예 5] 재조합 융합 단백질의 정제

상기 실시예 4에서 목적하는 재조합 융합 단백질의 대용량 배양 후 냉동 보관되었던 세포를 얼음에 15분간 녹이고, 불용성(insoluble) 추출법으로 정제하였다. 완충 용액으로 6M 우레아(urea), 50mM 인산 완충액(phosphate buffer) (pH 7.0)와 300mM NaCl 용액을 사용하여, 이를 LB 배지 500 ml에 배양 세포를 기준으로 10 ml의 양으로 넣고 세포를 부유시켰다. 그 후 음파 처리(sonication)를 통해 세포를 파쇄시켜 세포 내부에 있는 단백질을 용출시킨 뒤 원심분리(15000rpm, 30분, 4℃)하여 상층액을 분리하였다. 이후 정제를 위해 His-tag 친화적 크로마토그래피법 (His-tag affinity chromatography)으로 Ni-NTA (Invitrogen)를 사용하여 완충 용액에 미리 평형 시켜 놓은 뒤 세포 부유액의 상층액을 넣어 통과시켰다. 수지에 흡착된 목적 단백질을 10mM 이미다졸(imidazole)이 녹아 있는 완충용액으로 세척한 후, 125mM 이미다졸로 최종 용출시켰다. 용출된 목적 재조합 융합 단백질을 분획 별로 모아 재접힘(refolding)을 위해 투석을 실시하였다. 여기에서 사용된 막으로는 Slide-A-Lyzer® Dialysis cassette (2000 MWCO, Thermo)를 사용하였고, 0.5X PBS 버퍼를 사용하여 처음 6M 우레아에서 0M 우레아까지 서서히 농도를 줄여가며 4℃에서 2박 3일 동안 투석하였다. 그 후 Triton X-114 (Sigma)를 이용하여 내독소인 LPS(Lipopolysaccharides)를 제거하였고, 이후 Amicon® Ultra-15 (3000NMWL, Merck Millipore Ltd.)을 이용하여 세척 및 농축을 통해 남아 있는 Triton X-114를 제거한 뒤 최종 정제된 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 재조합 융합 단백질(1, PE+E6), 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 재조합 융합 단백질(2, PPE+E6), 및 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드와 ESAT-6 항원의 재조합 융합 단백질을 얻을 수 있었다 (도 7의 (a) 내지 (c)).

[실시예 6] 재조합 융합 단백질의 백신 효과 평가(1)

상기 실시예 5에서 얻어진 3종류의 재조합 융합 단백질의 백신 효능을 조사하기 위하여, C57BL/6 마우스에 상기 3종의 재조합 융합 단백질 2 μg을 3회 주사하였다. 음성 대조군으로는 정상 마우스, 양성 대조군으로 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide), 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide), 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드(PE/PPE peptide)를 비교하였다. 마지막 면역화(immunization) 후 4주가 경과한 뒤에 상기 재조합 융합 단백질의 결핵균에 대한 방어 효능을 조사하기 위하여 상기 마우스에 한국형 결핵균 K 균주(Mycobacterium tuberculosis K strain)를 공기감염 시켰다. 그리고 15주가 경과하였을 때 마우스를 ESAT-6 1 μg으로 자극한 뒤 상기 마우스로부터 폐와 비장 조직을 채취하여 IFN-γ의 발현 수준을 측정하였고, 그 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다.

도 8에서 보는 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide), 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide), 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프가 융합된 폴리펩티드(PE/PPE peptide) 각각을 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 재조합 융합 단백질을 항원으로 사용하여 마우스를 면역화시킨 경우가, 상기 PE18 에피토프, PPE30 에피토프 또는 이들의 융합 폴리펩티드를 단독으로 사용한 경우에 비하여 마우스의 폐 및 비장 조직에서 IFN-γ의 발현 수준이 현저히 증가하였고, ESAT-6 항원을 단독으로 사용한 경우에 비하여도 IFN-γ가 높은 수준으로 발현된 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 7] 재조합 융합 단백질의 백신 효과 평가(2)

상기 실시예 5에서 얻어진 3종류의 재조합 융합 단백질의 백신 효능을 조사하기 위하여, C57BL/6 마우스에 상기 3종의 재조합 융합 단백질 2 μg을 면역 증강제인 GLA-SE 5 μg와 섞어 3회 주사하였다. 음성 대조군으로는 정상 마우스, 양성 대조군으로 BCG 백신 그룹, 그리고 ESAT-6 항원 단독 그룹을 비교하였다. 마지막 면역화 후 4주가 경과한 뒤에 상기 재조합 융합 단백질의 결핵균에 대한 방어 효능을 조사하기 위해 베이징 결핵균 HN878 균주(Beijing Mycobacterium tuberculosis HN878 strain)을 마우스에 공기감염 시켰다. 이후 15주가 경과하였을 때 마우스에 ESAT-6 단독 항원과 서열번호 1 및 2로 표시되는 폴리펩티드 각각을 1 μg의 농도로 주입하여 자극시킨 후 상기 마우스의 폐와 비장 조직을 채취하여 결핵균 방어 능력에 중요한 지표가 되는 CD4+ T 세포와 Ⅰ형 사이토카인을 측정하였다. 이와 같은 면역 반응 조사는 베이징 결핵 균주 감염 전과 후로 나누어 조사함으로써 감염 전 면역화시킨 각 재조합 융합 단백질의 면역능력 정도와 감염 후 본격적인 결핵균의 방어능력에 대한 평가로 각각 실시되었다. 베이징 결핵 균주 감염 전 마우스의 폐와 비장 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현 수준을 분석한 결과는 각각 도 9 및 10에 나타내었고, 감염 후 마우스의 폐 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현 수준을 분석한 결과는 도 11에 나타내었다.

도 9 내지 11에서 보는 바와 같이, 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프(PE peptide), 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프(PPE peptide), 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프가 융합된 폴리펩티드(PE/PPE peptide) 각각을 ESAT-6 항원의 N-터미널 전단 부위에 융합시킨 재조합 융합 단백질을 항원으로 사용하여 마우스를 면역화시킨 경우가, ESAT-6 항원을 단독으로 사용하여 면역화시킨 경우에 비교하여, 폐 및 비장 조직에서 다기능성 CD4+ T 세포의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 IFN-γ+IL-2+ T 세포의 발현 수준이 두드러지게 증가한 것으로부터 잠복 결핵 감염의 재활성화 또한 예방할 수 있음을 용이하게 예측할 수 있었다.

[실시예 8] 재조합 융합 단백질의 백신 효과 평가(3)

상기 실시예 5에서 얻어진 3종류의 재조합 융합 단백질의 결핵균 감염 억제 효과가 있는지 확인하기 위하여, C57BL/6 마우스에 상기 3종의 재조합 융합 단백질 2 μg을 면역 증강제인 GLA-SE 5 μg와 섞어 3회 주사하였다. 음성 대조군으로는 정상 마우스, 양성 대조군으로 BCG 백신 그룹, 그리고 ESAT-6 단독 항원 그룹을 비교하였다. 마지막 면역화 후 4주가 경과한 뒤에 공기감염 장치인 Glas-Col inhalation device(Terre Haute, IN)를 이용하여 마우스당 200 내지 250개의 베이징 결핵균 HN878 균주(Beijing Mycobacterium tuberculosis HN878 strain)가 감염될 수 있도록 흡입시켜 공기 감염시켰다. 감염 후 15주가 경과하였을 때 마우스를 안락사시킨 후 비장에 붙어있는 결핵균을 PBS로 추출하여 균질 현탁액을 획득하고, 각각의 균질 현탁액을 단계적으로 희석한 후 Middlebrook 7H11 아가(Difco, Detroit, MI, USA)에서 배양하여 감염된 결핵균의 수를 확인하고, 감염된 결핵균 수는 전체 비장 조직 당 평균 log₁₀CFU로 나타내었다.

그 결과로 도 12에서 보는 바와 같이, 상기 ESAT-6 항원의 N-터미널의 전단 부위에, 서열번호 1로 표시되는 PE18 에피토프, 서열번호 2로 표시되는 PPE30 에피토프, 및 서열번호 3으로 표시되는 PE18 에피토프와 PPE30 에피토프의 융합 폴리펩티드를 융합한 재조합 융합 단백질로 면역화시킨 경우, ESAT-6 항원을 단독으로 사용하여 면역화 시킨 경우와 비교하여 비장 내 감염 결핵균의 수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 융합 단백질을 항원으로 사용하는 경우 고병원성 결핵균의 감염, 혹은 잠복 결핵의 재감염을 효과적으로 예방할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Composition for tuberculosis comprising fusion protein <130> DPB173639 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Ser Phe Val Thr Thr Gln Pro Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Gln Gly Ile 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Gly Arg Met Tyr 1 5 10 15 Cys Gly Pro Gly Ser 20 <210> 3 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide <400> 3 Met Ser Phe Val Thr Thr Gln Pro Glu Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Gln Gly Ile Met Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn 20 25 30 Ser Gly Arg Met Tyr Cys Gly Pro Gly Ser 35 40 <210> 4 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 4 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser 1 5 10 15 Ala Ile Gln Gly Asn Val Thr Ser Ile His Ser Leu Leu Asp Glu Gly 20 25 30 Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser Gly Ser 35 40 45 Glu Ala Tyr Gln Gly Val Gln Gln Lys Trp Asp Ala Thr Ala Thr Glu 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly 65 70 75 80 Gln Ala Met Ala Ser Thr Glu Gly Asn Val Thr Gly Met Phe Ala 85 90 95 <210> 5 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 catatgtcnt ttgtgactac tcagccggag gcgcttgcgg cggcggcggg atcacttcaa 60 ggtattgaga tactcgagtg gcgaacatga cagag 95 <210> 6 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 catatggatt tcggagttct tccaccagag atcaattcgg ggcgtatgta cgccggacct 60 ggtttcatgc ccaagagaag cgaatacaat gacagag 97 <210> 7 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 catatgtcnt ttgtgactac tcagccggag gcgcttgcgg cggcggcggg atcacttcaa 60 ggtattcata tggatttcgg agttgtgtag gtcagcccca tcc 103 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 aagctttgcg aacatcccag tgacgttgcc ttcggt 36

Claims (14)

1. 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 서열번호 4로 표시되는 ESAT-6(6 kDa early secretory antigenic target)를 포함하는 융합 단백질.
2. 제1항에 있어서,
   상기 융합 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드; 및 서열번호 4로 표시되는 ESAT-6를 포함하는, 융합 단백질.
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 융합 단백질에서 상기 폴리펩티드는 ESAT-6의 N-터미널에 융합되는, 융합 단백질.
5. 제1항, 제2항 및 제4항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
7. 제6항의 발현 벡터가 도입되어 형질 전환된 형질전환체.
8. 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 서열번호 4로 표시되는 ESAT-6(6 kDa early secretory antigenic target)를 포함하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 결핵 예방용 약학적 조성물.
9. 제8항에 있어서,
   상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵을 포함하는, 결핵 예방용 약학적 조성물.
10. 제8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 면역 증강제(adjuvant)를 더 포함하는, 결핵 예방용 약학적 조성물.
11. 제8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 결핵 예방용 백신의 형태인, 결핵 예방용 약학적 조성물.
12. 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드 및 서열번호 2로 표시되는 폴리펩티드 중 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 서열번호 4로 표시되는 ESAT-6(6 kDa early secretory antigenic target)를 포함하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 잠복 결핵의 재감염 예방용 약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 폴리펩티드; 및 서열번호 4로 표시되는 ESAT-6를 포함하는, 잠복 결핵의 재감염 예방용 약학적 조성물.
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