KR20120083899A - 마이코박테리아 백신들 - Google Patents

Abstract

융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고, 또한 융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 제공된다. 또한 마이코박테리아 감염들에 대항하여 영장류를 보호하기 위한 해당하는 치료적 용도들이 제공된다.

Description

마이코박테리아 백신들 {Mycobacterial vaccines}

본 발명은 상세하게는 사람과 같은 영장류에서, 마이코박테리아 감염들의 치료 또는 예방을 위한 폴리뉴클레오타이드들 및 융합 단백질들, 벡터들, 면역원성 조성물들 또한 방법들 및 그들의 용도들에 관한 것이다.

마이코박테리움 투버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis, MTB) 및 이와 밀접한 유연관계를 가지는 종들은 마이코박테리움 투버쿨로시스 복합체 (MTC)라고 알려져 있는 작은 마이코박테리아 그룹을 형성한다. 본 그룹은 5가지의 구별되는 종들을 포함한다: M. 투버쿨로시스 (M. tuberculosis), M. 마이크로티 (M. microti), M. 보비스 (M. bovis), M. 카네티 (M. caneti), 및 M. 아프리카눔 (M. africanum).

결핵 감염 (TB)의 병인학적 물질인 마이코박테리움 투버쿨로시스 (M. tuberculosis)는 세계적으로 박테리아 감염성 질환에 의한 사망의 주된 원인이 되고 세계 인구의 1/3이 잠복성 감염에 걸려 있다. 세계 보건 기구 (World Health Organisation, WHO)는 매년 거의 9백만 건의 새로운 TB 감염 사례들, 또한 거의 2백만 건의 사망 사례들이 전세계적으로 발생하는 것으로 추산하고 있다. 가장 많은 새로운 TB 사례들이 2005년 동남 아시아에서 발생하였으며 (전세계적 발병 사례들의 34%), 아프리카의 사하라 남부지역에서 추정되는 발병율은 인구 100,000명 당 거의 350 사례들이 되고 있다. 그러나, TB 감염은 개발도상국들에 제한되지 않는다: 영국 (UK)은 1980년대 후반 이래로 결핵의 재유행 (resurgence)을 관찰하여 왔으며 현재까지 매년 8,000건을 넘는 새로운 사례들이 인구 100,000명 당 14.0명의 비율로 보고되었다.

다른 마이코박테리아들, 예를 들어 반추동물들에서 존씨 질환 (Johne's disease)을 유발하는 M. 아붐 아종 파라투머쿨로시스 (M. avium subsp . paratuberculosis), 소에서 결핵을 유발하는 M. 보비스 (M. bovis), 면역저하된 환자들 (예로, AIDS 환자들 및 골수이식 환자들)에서 결핵을 유발하는 M. 아붐 및 M. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare), 또한 인간에서 나병을 유발하는 M. 레프리 (M. leprae)도 역시 사람 및 동물들에서 병원성을 가진다.

M. 투버쿨로시스에 대항한 백신 보호작용의 효율성은 다양하게 변하여 왔다. 현재의 M. 투버쿨로시스 백신, BCG는 M. 보비스의 약독화 (attenuated) 균주이다. 이것은 아동들에서 TB의 심각한 합병증들에 대항하여 효과적이지만, 성인들에서는 그의 효율성이, 상세하게 인종 그룹들 간에 매우 다양하다. BCG의 효능은 연령에 따라 감소하는 것으로 여겨지고, 이와 같이 성인들은 질환을 예방하는 것이 상세하게는 TB 유행 지역에서 효과적이지 않다. BCG 백신접종은 결핵성 수막염 (tuberculous meningitis)을 예방하는 데 사용되어 왔고 또한 폐-외부 부위에서 M. 투버쿨로시스의 전파를 막도록 돕지만, 감염을 예방하지는 못한다. BCG의 제한된 효능 및 TB의 전세계적인 유행은 새롭고도 더욱 효과적인 백신들을 생산하려는 국제적인 노력을 가져왔다.

많은 결핵 소단위 백신들이 일정한 정도의 보호작용과 함께 강력한 면역 반응들을 유도하는 것으로 관찰되어 왔지만, 단독으로 사용될 때 효능의 수준은 단지 BCG에 의해 부여되는 정도여서 이들은 BCG의 대용물들으로서는 배제되어 왔다.

대부분의 백신들은 적절한 병원체에 의한 감염에 대항하여 보호작용하는 항체들을 유도하여 작용한다. 아쥬반트들이 때로 특이적 백신 항원들과 조합으로 사용될 때 항원-특이 면역 반응을 가속시키거나, 연장시키거나, 증진시키는 데 사용되고 있다. 보편적으로 사용되는 면역학적 아쥬반트들로는 오일 및 알루미늄 염들을 포함한다.

이러한 아쥬반트의 하나는 보체 4 결합 단백질 (complement 4 binding protein, C4bp)이고, 이것은 보체 경로의 조절인자이다. C4bp는 대형 당단백질이고 많은 포유동물 종들로부터 분리되어 왔다. 인간들에서, C4bp은 여러 가지의 이소형들로서 혈장에 존재하고, 주요한 이소형은 C-말단에 다함께 연결된 일곱 개의 α-사슬들 및 하나의 β-사슬로 구성되는 칠중체 (heptamer)이다. 그의 "거미 또는 문어-유사" 구조 및 예측된 긴 혈청 반감기 때문에, C4bp와 단백질들의 융합은 전달 형식 (delivery platform)으로서 생물활성 및 면역원성을 증진할 것으로 제안되었다 (국제특허출원 제 WO91/11461호). 국제특허출원 제 WO91/11461호는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다. C4bp-기초 백신 접근법들의 추가적인 예들은 유럽 특허 제 EP 1795540호, 국제특허출원 제 WO 08/122817호 및 제 WO 05/014654호에서 기술되어 있으며, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

면역 반응을 생성하도록 탐구하는 다른 접근법은 관심 있는 항원 또는 에피토프를 벡터 내로 클론하는 것이다. 플라스미드들 뿐만 아니라 바이러스성 벡터들이 보편적으로 사용된다. 예를 들어, M. 투버쿨로시스 항원 85A를 발현하는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스 (modified vaccinia Ankara virus, MVA)가 많은 동물 모델들에서 BCG 반응을 추가자극 (boost)하고 보호작용하는 일정의 능력을 보여주었다. 임상 시험들은 BCG 면역 반응을 추가자극하는 MVA 85A의 실질적인 능력을 보여주었다 (McShane et al. Nat Med 10, 1240; 2004).

마이코박테리아 감염의 위협 및 전세계적인 유행이 증가하고 있는 점을 고려하여, 마이코박테리아 감염의 예방 및 치료를 위한 대안의/개선된 방법들 및 조성물들이 요구된다.

상세하게, 설치류에서는 초기 임상 데이타가 일정의 난관론을 제공하였더라도, 영장류에서는 (명확하게 인간들에서는) 해당 효능이 지금까지 실망스러운 것이었다.

유사하게는, BCG 백신이 전세계적인 "골드 표준 (gold standard)"으로 여전히 남아있는 한편, 추가자극 백신들에 의한 개선된 보호작용을 제공하려는 노력들은 지금까지 특히 동물들에서 (명확하게 인간들과 같은 영장류에서) 실망스러운 것으로 입증되었다.

본 발명은 하나 이상의 상기 문제점들을 해결하고 있다.

본 발명은 융합 단백질 (fusion protein)의 첫 번째 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도 (sequence identity) 를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 (consecutive) 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한 융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원 (mycobacterial antigen) 또는 그의 항원성 단편을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 (polynucleotide sequence)을 제공한다.

융합 단백질의 첫 번째 도메인은 하이브리드 비-보체 조절 단백질 (non-complement control protein, CCP)/C4bp 단백질의 올리고중합 (oligomerization) 도메인을 포함한다. 상기 하이브리드 C4bp-항원 융합이 설치류와 같은 동물들에서 뿐만 아니라 영장류에서 마이코박테리아 감염에 대항하여 개선된 보호작용을 제공하는 것이 가장 놀랍다. 설치류에서 고무적인 점은 영장류에서 의미 있는 효능을 전달하기에 실패하였더라도 이것이 많은 초기의 연구들로서 중요한 과학적 진보를 제시하고 있다.

인간에서의 주요한 C4bp 이소형은 C-말단에서 다함께 연결된 일곱 개의 α-사슬들 및 하나의 β-사슬로 구성된다. α-사슬의 마지막 엑손은 알파 사슬에서 비-CCP (보체 조절 단백질)만을 인코드한다. 본 도메인은 일곱 개의 C4bp 알파 사슬들의 올리고중합을 위해 충분하다. 본 도메인의 올리고중합 효과는 다른 융합된 폴리펩타이드들/단백질들에 이르기까지 확장되어 왔다. 최근에 마우스 C4bp의 올리고중합과 말라리아 항원의 융합이 융합 단백질 형태로 투여될 때 특이적 항체들의 유도를 증진하는 것이 확인되었다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편으로 구성된다.

한 가지 구현예에서, 아미노산 서열 일치도는 적어도 20개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 25, 28, 30 35, 40, 45, 50, 또는 55개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이)가 되는 아미노산 서열들의 영역 (region)에 걸쳐서 존재한다.

아미노산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

첫 번째 도메인의 문맥에서, 단편은 상기 아미노산 서열의 적어도 20개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 그의 적어도 25, 28, 30, 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 또는 54개의 연속된 아미노산 잔기들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인의 문맥에서, 아미노산 서열의 단편은 전장 (full-length)의 아미노산 서열의 서열 길이의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

서열번호 1 (IMX313이라고도 약칭함)은 55개의 아미노산 잔기들로 구성된다. 서열번호 1의 변이체들 (variants)이 본 발명에 의해 포괄되고, 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들 또는 삽입들을 가진 아미노산 서열들을 포함할 수 있다. 상세하게, 치환들은 N- 및 C-말단 결실들로서 착상된다. 치환들은 보존적인 치환들을 포함한다. 보존적인 치환들을 선택하고 결실들 및 삽입들을 만드는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

따라서 한 가지 구현예에서, 서열번호 1의 변이체는 적어도 1개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 연속된 아미노산 잔기들)의 길이로 N-말단 결실을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 서열번호 1의 변이체는 적어도 1개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개의 연속된 아미노산 잔기들)의 길이로 C-말단 결실을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 서열번호 1의 변이체는 서열번호 1의 다음의 잔기들의 적어도 1개 (예로, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26개)를 보유한다: 6번 Ala; 11번 Glu; 13번 Ala; 21번 Asp; 22번 Cys; 25번 Pro; 27번 Ala; 28번 Glu; 29번 Leu; 30번 Arg; 31번 Thr; 32번 Leu; 33번 Leu; 34번 Glu; 35번 Ile; 37번 Lys; 38번 Leu; 40번 Leu; 41번 Glu; 42번 Ile; 43번 Gln; 44번 Lys; 45번 Leu; 48번 Glu; 49번 Leu; 또는 50번 Gln.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인은 아미노산 모티브 "AERL" (예로, 서열번호 1의 27 내지 30번 위치들)을 보유한다. 상기 모티브는 하나 이상의 보존적인 치환들, 예를 들어 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적인 아미노산 치환들을 포함할 수 있다.

융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원, 또는 상기 마이코박테리아 항원의 항원성 단편을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "마이코박테리아성 (mycobacterial)" 또는 "마이코박테리움 (Mycobacterium)"은 M 플레이 (M. phlei), M. 스메그마티스 (M. smegmatis), M. 아프리카눔 (M. africanum), M. 카네티 (M. caneti), M, 포투이툼 (M. fortuitum), M. 마리눔 (M. marinum), M. 얼세란스 (M. ulcerans), M. 투버쿨 로시스 (M. tuberculosis), M. 보비스 (M. bovis), M. 마이크로티 (M. microti), M. 아붐 (M. avium), M. 파라투버쿨로시스 (M. paratuberculosis), M. 레프리 (M. leprae), M. 레프리뮤리움 (M. lepraemurium), M. 인트라셀루라레 (M. intracellulare), M. 스크로풀라세움 (M. scrofulaceum), M. 제노피 (M. xenopi), M. 제나벤스 (M. genavense), M. 칸사시 (M. kansasii), M. 시미애 (M. simiae), M. 스줄가이 (M. szulgai), M. 헤모필럼 (M. haemophilum), M. 아시아티쿰 (M. asiaticum), M. 말모엔스 (M. malmoense), M. 바캐 (M. vaccae), M. 카네티 (M. caneti), 및 M. 쉬모이데이 (M. shimoidei) 종들을 포괄한다. 상세하게, M. 투버 쿨로시스와 같은 MTC의 구성원들이 흥미롭다.

용어 항원 또는 항원성 단편은 면역계에 의해 인식될 수 있고 및/또는 세포 매개성 면역 반응을 자극하고 및/또는 항체들의 생성을 자극하는 펩타이드-기초 서열이라면 모두를 의미한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드들을 사용하여 달성된 양성의 면역원성 결과들은 (하기 실시예 3 및 도 1 내지 도 6을 참조하라) 가장 놀랍고도 기대하지 못한 것이다. 예를 들어 본 발명과는 대조적으로, 말라리아 항원들과 서열번호 1의 융합은 증진된 면역 반응을 유발시키지 못하였다 (하기 실시예 3 및 도 7을 참조하라). 보다 더 놀라운 것은 마우스에서 관찰된 마이코박테리아성 항원에 대한 양성의 면역원성이 영장류에서도 역시 관찰되었던 점이다.

한 가지 구현예에서, 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편은 T 세포들 (CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포들)이 관여하는 감염에 대한 세포 매개성 반응 및/또는 INF-γ와 같은 Th1-유형 사이토카인들과 반응하는 능력을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 마이코박테리아 항원은 INF-γ-분비하는 세포들 (예로, 우세적으로 CD4+ T 세포들)을 유도한다. 본 관점으로, 최근의 연구들은 T 세포 면역 반응들은 (폐 점막에서와 같음) 폐의 마이코박테리아성 질환에 대항한 보호를 위해 결정적일 수 있다.

한 가지 구현예에서, 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편은 M. 투버 쿨로시스와 같은 마이코박테리아에 의한 감염 (challenge)에 대항한 보호작용을 (장기 보호작용 (long term protection)과 같음) 제공한다.

예로서, 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편은 "기억 T 세포들 (memory T cells)"를 유도할 수 있고, 이는 장기간 동안 (예로, 수십 년 동안) 보호적 면역 (protective immunity)을 계속하여 자극할 수 있다. 기억 면역 반응들은 분화된 효과기 T-세포들로부터 직접적으로 생기고 정지 (quiescent) 상태에서 유지되는 장수 항원-특이 T 림프구들의 재활성화로 인한 것으로 알려져 왔다. 기억 T 세포들은 불균질하고; 적어도 두 가지의 소집단들 (subsets)이 서로 다른 이동 능력 및 효과기 기능을 가지는 것으로 확인되었다. 첫 번째 소집단의 기억 T 세포들은 일차 반응에서 생성되는 효과기 T 세포들을 모방하기 때문에 '효과기 기억 T 세포들 (effector memory T cells)' (TEM)이라고 알려져 있고, 그들은 감작된 (inflamed) 조직들 내로 이동하는 림프절-귀소 수용체들이 결여되어 있다. 항원과 재회 시, TEM은 IFN-γ 또는 IL-4을 신속하게 생산하거나, 미리-저장된 퍼포린 (perforin)을 방출한다. 두 번째 소집단의 기억 T 세포들 ('중앙 기억 세포들 (central memory cells)'(TCM)이라고 알려져 있음)은 L-셀렉틴 (L-selectin) 및 CCR7을 발현하고 즉각적인 효과기 기능이 결여되어 있다. TCM은 낮은 활성화 역치 (activation threshold)를 가지고 이차적인 림프계 기관들에서 재자극될 때 증식하고 효과기들로 분화한다.

한 가지 구현예에서, 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편은 마이코박테리아 (예로, M. 투버쿨로시스) 감염에 대한 항체 반응 (예로, 중화 항체 반응)을 제공한다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 85A/Rv3804c, 85B/Rv1886c, 85C/Rv0129c, ESAT6/Rv3875, TB10.4/Rv0288, Rv0125, PPE18/Rv1196, P27/Rv1411c, HSP65/Rv0440, HBHA/Rv0475, Rv2659c, Rv2660c, HspX/Rv2031c, RPFA/Rv0867c, RPFB/Rv1009, RPFC/Rv1884c, RPFD/Rv2389c, RPFE/Rv2450c, Rv1733c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626c, Rv2627c, Rv2628, Rv0111, Rv1806/1807, Rv0198, 또는 Rv3812로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 26 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 26 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편으로 구성된다.

한 가지 구현예에서, 아미노산 서열 일치도는 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 413개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이)가 되는 아미노산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

아미노산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

두 번째 도메인의 문맥에서, 단편은 상기 아미노산 서열의 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 412개의 연속된 그의 아미노산 잔기들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인의 문맥에서, 아미노산 서열의 단편은 전장의 아미노산 서열의 서열 길이의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 되는 서열 길이를 가진다.

폴리펩타이드의 단편은 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 항원 85A, 항원 85B 및 항원 85C를 포함하는 마이코박테리아 항원들의 패밀리로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 (또는 그의 항원성 단편)을 포함한다. 본 높은 동종유래 패밀리의 단백질들은 M. 투버쿨로시스, BCG, 및 많은 다른 마이코박테리아의 종들에 의해 분비된다.

항원 85A (Rv3804c)는 서열번호 3으로 표현되고, 항원 85B (Rv1886c)는 서열번호 4호 표현되며, 또한 항원 85C (Rv0129c)는 서열번호 5로 표현된다.

따라서 한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 서열번호 3, 4, 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도 (예로, 적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%의 서열 일치도)를 가지는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인이 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한 상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인이 서열번호 2 또는 서열번호 53의 핵산 서열과 적어도 70%의 일치도를 가지는 핵산 서열, 또는 그의 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편에 의해 인코드되는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 '첫 번째 도메인' 핵산 서열이 서열번호 2 또는 서열번호 53의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 융합 단백질의 첫 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 '첫 번째 도메인' 핵산 서열이 서열번호 2 또는 서열번호 53의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편으로 구성되는, 융합 단백질의 첫 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 핵산 서열 일치도는 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이 (예로, 적어도 65, 70, 75, 80, 84, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 155, 160, 165개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이)가 되는 핵산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

핵산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

첫 번째 도메인의 문맥에서, 핵산 서열 단편은 상기 핵산 서열의 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들 (예로, 그의 적어도 65, 70, 75, 80, 84, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 145, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 또는 164개의 연속된 뉴클레오타이드들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인의 문맥에서, 핵산 서열의 단편은 전장의 핵산 서열의 서열 길이의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인의 문맥에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 특정한 숙주/숙주세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다 (codon-optimized). 따라서 한 가지 구현예에서, 상기 첫 번째 도메인은 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된다. 한 가지 구현예에서, 상기 첫 번째 도메인을 인코딩하는 상기 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 53을 포함하거나 이로 구성된다.

핵산 서열들을 코돈-최적화하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 두 번째 도메인이 서열번호 27 내지 51 또는 56으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 70% 일치도를 가지는 핵산 서열, 또는 그의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편에 의해 인코드되는, 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 '두 번째 도메인' 핵산 서열이 서열번호 27 내지 51 또는 56의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 융합 단백질의 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 '두 번째 도메인' 핵산 서열이 서열번호 27 내지 51 또는 56의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 핵산 서열, 또는 그의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편으로 구성되는, 융합 단백질의 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 핵산 서열 일치도는 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이 (예로, 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 또는 1200개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이)가 되는 핵산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

핵산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

두 번째 도메인의 문맥에서, 핵산 서열 단편은 상기 핵산 서열의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들 (예로, 그의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 또는 1199개의 연속된 뉴클레오타이드들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인의 문맥에서, 핵산 서열의 단편은 전장의 핵산 서열의 서열 길이의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인의 문맥에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 특정한 숙주/숙주세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다. 따라서 한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 본 명세서에서 기술된 마이코박테리아 항원들 (또는 그들의 항원성 단편들)의 코돈-최적화된 버전들을 포함하거나 이들로 구성된다. 한 가지 구현예에서, 상기 두 번째 도메인은 서열번호 27의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 구성되는 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드된다. 한 가지 구현예에서, 상기 두 번째 도메인을 인코딩하는 상기 코돈-최적화된 핵산은 서열번호 51 또는 56을 포함하거나 이로 구성된다.

핵산 서열들을 코돈-최적화하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 54의 핵산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 핵산 서열 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 구성된다.

한 가지 구현예에서, 핵산 서열 일치도는 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이 (예로, 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 또는 1200개의 연속된 뉴클레오타이드들의 길이)가 되는 핵산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

핵산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 문맥에서, 핵산 서열 단편은 상기 핵산 서열의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들 (예로, 그의 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 또는 1118개의 연속된 뉴클레오타이드들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 문맥에서, 핵산 서열의 단편은 전장의 핵산 서열의 서열 길이의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인이 융합 단백질의 두 번째 도메인의 C-말단에 배열되는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다. 대안의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인이 두 번째 도메인의 N-말단에 배열되는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 3'에 배열되는, 융합 단백질의 첫 번째 도메인 및 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 대안의 구현예에서, 융합 단백질의 첫 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열이 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열의 5'에 배열된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 좀 더 나아가 융합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 도메인들 사이에 위치하는 중간의 (intervening) '링커 (linker)' 서열을 인코드하는 핵산 서열을 포함한다. 본 구현예에 따르면, '링커' 핵산 서열은 융합 단백질의 첫 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 및 두 번째 도메인을 인코딩하는 핵산 서열 사이에 위치한다. 한 가지 구현예에서, 상기 링커는 '글리신-세린' (예로, Gly-Ser) 링커, 예를 들어 뉴클레오타이드 서열 "ggcagc"에 의해 인코드되는 글리신-세린 링커이다.

일반적으로, 이들 링커 서열들에 의해 인코드되는 아미노산들은 그 결과 얻은 융합 단백질의 면역원성에 해롭지 않으며, 심지어 면역원성에 유익이 될 수 있다.

대안으로, 본 발명의 융합 단백질은 중간의 뉴클레오타이드들이 없이 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열들의 발현에 의해 에피토프 가닥 (string)로서 생산될 수 있다. 중간의 링커 서열의 부재는 불필요한 핵산 및/또는 아미노산 물질의 존재를 피하게 한다. 따라서 본 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 인코딩하는 핵산 서열들 사이에 중간의 '링커' 뉴클레오타이드들이라면 모두를 포함하지 않는다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 인코드된 융합 단백질이 적어도 하나의 추가적인 (예로, 상기에서 정의된 첫 번째 및 두 번째 도메인들에 추가함) 도메인을 포함하는 융합 단백질을 인코드한다. 예를 들어, 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 항원 또는 항원성 단편 (2, 3, 4, 6, 8, 10개의 추가적인 항원들 또는 항원성 단편들과 같음)을 포함할 수 있다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 추가적인 항원 또는 항원성 단편과 같은 (추가적인 항원들 또는 항원성 단편들을 인코딩하는 2, 3, 4, 6, 8, 10개의 추가적인 핵산 서열들과 같음) 적어도 하나의 추가적인 도메인을 인코드하는 추가적인 핵산 서열들을 (예로, 상기에서 정의된 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 인코딩하는 핵산 서열들에 추가함)을 포함한다.

상기에서 논의된 바와 같이, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 융합 단백질의 두 번째 도메인에 포함되는 마이코박테리아 항원/항원성 단편과 동일할 수 있다. 대안으로, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 융합 단백질의 두 번째 도메인에 포함되는 마이코박테리아 항원/항원성 단편과 서로 다를 수 있다. 예로서, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 마이코박테리아 항원 (또는 항원성 단편)일 수 있거나, 비-마이코박테리아성, 예로 다른 병원성 박테리아와 같은 다른 병원체로부터 나온 것일 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코드하는 (상기에서 정의된 바와 같음) 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터를 사용하여 달성된 양성의 면역원성 결과들은 (하기 실시예 3 및 도 1 내지 도 6을 참조하라) 가장 놀랍고도 기대하지 못한 것이다. 예를 들어 본 발명과는 대조적으로, 말라리아 항원들과 서열번호 1의 융합을 포함하는 벡터들은 증진된 면역 반응을 유발시키지 못하였다 (하기 실시예 3 및 도 7을 참조하라). 보다 더 놀라운 것은 마우스에서 관찰된 마이코박테리아 항원에 대한 양성의 면역원성이 역시 영장류에서도 관찰되었던 점이다.

한 가지 구현예에서, 벡터는 DNA 벡터, RNA 벡터, 바이러스성 벡터 (viral vector), 박테리아성 벡터 (bacterial vector), 플라스미드 벡터 (plasmid vector), 코스미드 벡터 (cosmid vector), 효모 인공 염색체 벡터 (yeast artificial chromosome vector)와 같은 인공 염색체 벡터로부터 선택된다.

본 발명의 한 가지 구현에서, 벡터는 플라스미드 DNA 벡터와 같은 DNA 벡터이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스성 벡터이다. 한 가지 구현예에서, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스 또는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA) 바이러스 벡터이다.

바이러스성 벡터들은 보통 비-복제성 (non-replicating) 또는 복제-결함성 (replication-impaired) 벡터들이고, 이는 바이러스성 벡터가 통상적인 수단에 의해 측정되는 바 - 예로, DNA 합성 및/또는 바이러스 역가를 측정하여 정상 세포들 (예로, 정상 인간 세포들)에서 유의한 정도라면 모든 정도로 복제할 수 없는 것을 의미한다. 비-복제성 또는 복제-결함성 벡터들은 자연적으로 (예로, 그들이 자연으로부터 이와 같이 분리되었음) 또는 인위적으로 (예로, 시험관내 배양에 의해 또는 유전적 조작에 의함) 만들어졌을 수 있다. 일반적으로 복제-결함성 바이러스성 벡터를 성장시킬 수 있는 적어도 하나의 세포-유형이 존재할 것이고 - 예를 들어, 변형된 백시니아 앙카라 (MVA)는 CEF 세포들에서 성장시킬 수 있다.

전형적으로, 바이러스성 벡터는 동물 개체에서, 전형적으로 인간, 소, 돼지, 말, 오소리 또는 여우와 같은 포유동물 개체에서 유의한 감염을 유발시킬 수 없다.

한 가지 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 또는 폭스바이러스 벡터로부터 선택된다. 본 문맥에서 유용한 바이러스성 벡터들의 예들로는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA) 및 NYVAC와 같은 약독화 백시니아 바이러스 벡터들, 또는 이들로부터 유래된 균주들을 포함한다. 다른 벡터들의 예들로는 파울폭스 (fowlpox) 벡터들 (예로, FP9) 또는 카나리폭스 벡터들 (예로, ALVAC 및 이들로부터 유래된 균주들)과 같은 조류폭스 (avipox) 벡터를 포함한다. 본 발명에서 유용한 대안의 바이러스성 벡터들로는 아데노바이러스성 벡터들 (예로, 비-인간 아데노바이러스 벡터들), 알파바이러스 (alphavirus) 벡터들, 플래비바이러스 (flavivirus) 벡터들, 헤르페스 바이러스성 벡터들 (예로, 헤르페스 심플렉스 (herpes simplex), CMV 및 EBV), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) 벡터들 및 레트로바이러스성 벡터들을 포함한다.

아데노바이러스들은 보편적으로 벡터화된 (vectored) 백신들로서 사용되고 여러 가지의 서로 다른 부류들 (classes)로 구분될 수 있다. 예를 들어, 가금류 (fowl) 아데노바이러스-유래 벡터들은 조류 종들의 백신 접종을 위해 바람직하고, 마이코박테리아에 대항하여 포유동물들을 백신접종하는 데는 유용성을 덜 가질 수 있다. 아데노바이러스들은 그들이 처음 분리되었던 숙주(들)에 의해 분류된다. 따라서, 과학적 문헌은 보편적으로 "인간 아데노바이러스들", "침팬지 아데노바이러스들" 및 "원숭이 아데노바이러스들"을 언급하고 있다. 침팬지 아데노바이러스들로부터 유래한 아데노바이러스성 벡터들의 매력은 인간들이 이러한 바이러스들에 의해 자연적으로는 거의 감염되어 있지 않아서 이러한 벡터들에 대한 기존의 면역이 무시할만한 것이라는 점이다. 동일한 근거로, 인간 아데노바이러스들로부터 유래한 아데노바이러스성 벡터들 중에서 좀 더 심화된 구분들이 이루어질 수 있다: 아데노바이러스 5 (Ad5)에 의한 감염은 인간 집단들에서 매우 보편적이고, 따라서 인간 아데노바이러스성 벡터들을 더 희귀한 인간 분리물들로부터 유래한 것들을 사용하도록 하는 자연적인 Ad5 감염을 이어서 교차-면역 (cross-immunity)이 제한되는 시기 또는 장소에 대한 선호도가 존재할 수 있다. 이러한 더 희귀한 분리물들로부터 유래한 벡터들의 예들로는 Ad35 및 Ad11 벡터들 뿐만 아니라 Ad26, Ad48, 및 Ad50 벡터들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 벡터는 인간 아데노바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 원숭이 아데노바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 침팬지 아데노바이러스이다. 본 명세서에서 언급되는 바, 침팬지는 팬 트로글로다이츠 (Pan troglodytes) (보편적인 침팬지) 및 팬 패니스쿠스 (Pan paniscus) (보노보)를 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 5 (Ad5), 아데노바이러스 35 (Ad35), 아데노바이러스 (Ad11), 아데노바이러스 26 (Ad26), 아데노바이러스 48 (Ad48) 또는 아데노바이러스 50 (Ad50)로부터 선택된다. 본 발명자들은 인간 아데노바이러스들로부터 발현될 때 좋은 면역원성을 유도하는 항원들이 침팬지 아데노바이러스들로부터 발현될 때도 역시 면역원성을 가지는 것을 주목하였다. 이것은 인간 및 침팬지 아데노바이러스성 발현 시스템들에서 다양한 항원들의 비교 평가들을 다룬 과학적 문헌에서 입증되어 왔다 - 예를 들어, Reyes-Sandoval et al. 2010 (Infection and Immunity, January 2010, p. 145-153, Vol. 78, No. 1)를 참조하라.

본 발명의 벡터들은 임의적으로 프로모터 (promoter) 및/또는 종결인자 (terminator)와 같은 적절한 조절 서열들을 포함한다. 이러한 벡터들과 같은 발현 조절 서열들은 당업자라면 숙지하고 있고 숙주세포들에 의존하여 선택될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다.

발현 벡터들은 발현을 위해 요구되는 추가적인 조절 요소들에 작동적으로 연결되어 있는 관심 있는 폴리펩타이드(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 핵산 분자들 (직선형 또는 원형)이다.

본 관점으로, 발현 벡터들은 일반적으로 프로모터 및 종결인자 서열들, 또한 임의적으로 하나 이상의 인핸서 (enhancer) 서열들 및 폴리아데닐화 신호들 (polyadenylation signals) 등을 포함한다. 발현 벡터들은 리보좀 결합 부위들 (ribosomal binding sites), 또한 해독 개시 및 종결 서열들을 포함하는 적합한 해독 조절 요소들도 역시 포함할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터들에서 사용되는 전사 및 해독 조절 요소들은 발현에 사용되는 숙주세포에서 기능적이고, 자연적으로 마이코박테리아 유전자들과 연관된 것들을 포함할 수 있다.

적합한 프로모터들, 종결인자들, 선택가능한 마커들 및 기타 다른 요소들의 선택은 당해 기술분야에서 보통의 기술 수준 내의 일상적인 설계의 문제이다.

trp, lac 및 파지 프로모터들과 같은 프로모터들, tRNA 프로모터들 및 당분해효소 (glycolytic enzyme) 프로모터들은 원핵성 숙주들에서 사용될 수 있다. 유용한 효모 프로모터들로는 금속티오네인 (metallothionein), 3-포스포글리세레이트 키나제 (3-phosphoglycerate kinase) 또는 에놀라제 (enolase) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 같은 다른 당분해효소들, 말토스 및 갈락토스 유용성을 부여하는 효소들, 또한 기타 다른 것들의 프로모터 부위들을 포함한다. 적절한 비-고유의 (non-native) 포유동물 프로모터들로는 SV40로부터 나온 초기 및 후기 프로모터들 또는 마우스 몰로니 백혈병 바이러스 (murine moloney leukaemia virus), 마우스 유방종양 바이러스 (mouse mammary tumour virus), 조류 육종 바이러스들 (avian sarcoma viruses), 제 Ⅱ형 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스 (bovine papilloma virus) 또는 폴리오마 바이러스를 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 발현 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.

일반적으로, "작동적으로 연결된 (operably linked)"은 연결된 핵산 서열들이 연속적이고 (contiguous) 그들이 의도된 목적들을 위해 화합하여 기능하도록 배열되는 것을 의미하고 - 예를 들어, 전사가 프로모터에서 개시하고 코딩 폴리뉴클레오타이드 분절을 통하여 종결인자까지 진행한다. 두 개의 단백질 코딩 영역들을 결합하는 것이 필요한 곳에서, 폴리뉴클레오타이드 코딩 서열들은 연속적이고 해독 구조틀 (reading frame)이 맞아야 한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 첫 번째 도메인이 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한 융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 융합들을 사용하여 달성된 양성의 면역원성 결과들은 (하기 실시예 3 및 도 1 내지 도 6을 참조하라) 가장 놀랍고도 기대하지 못한 것이다. 예를 들어 본 발명과는 대조적으로, 말라리아 항원들과 서열번호 1의 융합들은 증진된 면역 반응을 유발시키지 못하였다 (하기 실시예 3 및 도 7을 참조하라). 보다 더 놀라운 것은 마우스에서 관찰된 마이코박테리아 항원에 대한 양성의 면역원성이 영장류에서도 역시 관찰되었던 점이다.

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다 (또는 이로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 아미노산 서열 일치도는 적어도 20개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 25, 28, 30 35, 40, 45, 50, 또는 55개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이)가 되는 아미노산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

아미노산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

첫 번째 도메인의 문맥에서, 단편은 상기 아미노산 서열의 적어도 20개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 그의 적어도 25, 28, 30, 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 또는 54개의 연속된 아미노산 잔기들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 첫 번째 도메인의 문맥에서, 아미노산 서열의 단편은 전장의 아미노산 서열의 서열 길이의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원, 또는 상기 마이코박테리아 항원의 항원성 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 85A/Rv3804c, 85B/Rv1886c, 85C/Rv0129c, ESAT6/Rv3875, TB10.4/Rv0288, Rv0125, PPE18/Rv1196, P27/Rv1411c, HSP65/Rv0440, HBHA/Rv0475, Rv2659c, Rv2660c, HspX/Rv2031c, RPFA/Rv0867c, RPFB/Rv1009, RPFC/Rv1884c, RPFD/Rv2389c, RPFE/Rv2450c, Rv1733c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626c, Rv2627c, Rv2628, Rv0111, Rv1806/1807, Rv0198, 또는 Rv3812로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 26 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다 (또는 이로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 아미노산 서열 일치도는 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 413개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이)가 되는 아미노산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

아미노산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

두 번째 도메인의 문맥에서, 단편은 상기 아미노산 서열의 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 그의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 412개의 연속된 아미노산 잔기들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다). 한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인의 문맥에서, 아미노산 서열의 단편은 전장의 아미노산 서열의 서열 길이의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%가 되는 서열 길이를 가진다.

폴리펩타이드의 단편은 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 항원 85A (서열번호 3 또는 서열번호 52), 항원 85B (서열번호 4) 및 항원 85C (서열번호 5)를 포함하는 마이코박테리아 항원들의 패밀리로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 (또는 그의 항원성 단편)을 포함한다. 본 높은 동종유래 패밀리의 단백질들은 M. 투버쿨로시스, BCG, 및 많은 다른 마이코박테리아의 종들에 의해 분비된다.

따라서 한 가지 구현예에서, 두 번째 도메인은 서열번호 3, 4, 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질의 첫 번째 도메인이 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한 상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3, 4, 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인의 C-말단에 (예로, "두 번째 도메인 - 첫 번째 도메인"의 순서로) 배열된다. 대안으로, 첫 번째 도메인은 두 번째 도메인의 N-말단에 (예로, "첫 번째 도메인 - 두 번째 도메인"의 순서로) 배열된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열번호 55의 아미노산 서열과 적어도 70% (적어도 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%와 같음)의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 단편을 포함하거나 이로 구성된다.

한 가지 구현예에서, 핵산 서열 일치도는 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 또는 338 또는 372개의 연속된 아미노산 잔기들의 길이)가 되는 아미노산 서열들의 영역에 걸쳐서 존재한다.

아미노산 서열 일치도를 결정하는 통상적인 방법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

본 발명의 융합 단백질의 문맥에서, 단편은 상기 아미노산 서열의 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 그의 적어도 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 337 또는 371개의 연속된 아미노산 잔기들)을 포함한다 (또는 이들로 구성된다).

한 가지 구현예에서, 융합 단백질의 문맥에서, 아미노산 서열의 단편은 전장의 아미노산 서열의 서열 길이의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 되는 서열 길이를 가진다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 도메인들 사이에 위치하는 중간의 '링커' 서열들을 포함한다. 일반적으로, 이들 링커 서열들에 의해 인코드되는 아미노산들은 그 결과 얻은 융합 단백질의 면역원성에 해롭지 않으며, 심지어 면역원성에 유익이 될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 링커 서열은 글리세린 및 세린 아미노산들을 포함하거나 이들로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 링커 서열은 (5' -> 3' 방향으로) 글리신 및 세린, 예로 Gly-Ser을 포함하거나 이들로 구성된다. 대안으로, 본 발명의 융합 단백질은 중간의 뉴클레오타이드들이 없이 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열들의 발현에 의해 에피토프 가닥으로서 생산될 수 있다. 본 구현예에서, 융합 단백질은 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 사이에 중간의 '링커' 아미노산들을 포함하지 않는다. 중간의 링커 서열의 부재는 불필요한 핵산 및/또는 아미노산 물질의 존재를 피하게 한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 좀 더 나아가 적어도 하나의 추가적인 도메인 (예로, 상기에서 정의된 첫 번째 및 두 번째 도메인들에 추가함)을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 항원 또는 항원성 단편 (2, 3, 4, 6, 8, 10개의 추가적인 항원들 또는 항원성 단편들과 같음)을 포함할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 융합 단백질의 두 번째 도메인에 포함되는 마이코박테리아 항원/항원성 단편과 동일할 수 있다 (또는 동일한 것으로부터 유래할 수 있다). 한 가지 구현예에서, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 융합 단백질의 두 번째 도메인에 포함되는 마이코박테리아 항원/항원성 단편과 다를 수 있다. 예로서, 추가적인 항원(들) 또는 단편들은 마이코박테리아 항원 (또는 항원성 단편)일 수 있거나, 비-마이코박테리아성, 예로 다른 병원성 박테리아와 같은 다른 병원체로부터 나온 것일 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 숙주세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 (상기 기술된 바와 같음) 및 본 발명의 벡터 (상기 기술된 바와 같음)를 발현시키는 과정을 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

융합 단백질들의 생성과정은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다. 융합 단백질들은 융합 단백질을 인코드하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 생성될 수 있다. 예로서, 본 발명의 융합 단백질의 첫 번째 및 두 번째 도메인들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열들은 벡터 내에서 프로모터 하류의 동일한 해독 구조틀에 위치될 수 있고, 이에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열들을 통과하는 전사 및 하나의 단백질 산물로서 해독을 허용한다.

본 발명의 융합 단백질들은 표준 분자생물학 방법들을 사용하여 양립가능한 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포들에 넣은 벡터들 또는 기타 다른 발현 운반체들 (vehicles)에서의 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열들을 발현하여 제조될 수 있다 (예로, Sambrook et al. 1989, 분자적 클로닝: 실험실 매뉴얼 (Molecular Cloning a Laboratory Manual), 제 2판, 콜드 스프링 하버 출판사, 콜드 스프링 하버, 뉴욕; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다).

가장 보편적으로 사용되는 원핵성 숙주들은 B. 섭틸리스 (B. subtilis) 또는 슈도모나스 (Pseudomonas)와 같은 다른 원핵생물이 사용될 수 있기는 하지만, 대장균 (E. coli)의 균주들이다. 본 발명에서는 효모, 필라멘트성 (filamentous) 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류 또는 조류 종들의 숙주들과 같은 포유동물 또는 기타 다른 진핵성 숙주 세포들도 역시 유용할 수 있다. 배양에서 포유동물 세포들의 증식은 그 자체로 잘 알려져 있다. 보편적으로 사용되는 포유동물 숙주 세포주들의 예들로는 다른 세포주들이 예로 더 높은 발현을 제공하는 데 적절할 수 있기는 하지만, VERO, HeLa 세포들, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포들, WI38, BHK, 및 COS 세포주들이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 미생물들 또는 단일세포 실체들로서 배양되는 고등 진핵성 세포주들을 가르키는 "숙주 세포들 (host cells)", 및 이러한 다른 용어들은 재조합 벡터 또는 다른 전달 DNA를 위한 수여자들로서 사용될 수 있거나 사용되었던 세포들을 말하고, 형질전환된 고유의 (original) 세포의 자손을 포함한다. 단일한 부모 세포의 자손은 모양에서 또는 게놈 또는 전체 DNA 상보성 (complement)에서 자연적, 우연적 또는 인공적 (deliberate) 돌연변이로 인해 고유의 부모와 반드시 완전하게 일치하는 필요는 없는 것으로 이해된다.

관심 있는 폴리뉴클레오타이드 서열들은 시험관내에서 전사될 수 있고 그 결과 얻은 RNA가 숙주세포 내로 (예로, 주입에 의해) 도입되거나, 폴리뉴클레오타이드 서열들이 직접적으로 전기천공 (electroporation); 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 기타 다른 물질들을 사용하는 형질전환 (transfection); 리포펙션 (lipofection); 감염 (벡터가 레트로바이러스성 게놈과 같은 감염성 제제임)을 포함하는, 세포성 숙주의 유형에 의존하여 변화하는 방법들에 의해 숙주 세포들 내에 도입될 수 있다. "형질전환 (transformation)"은 삽입에 사용되는 방법, 예를 들어 직접적 섭취 (direct utake), 형질감염 (transduction), f-메이팅 또는 전기천공을 상관하지 않고 숙주세포 내로 외인성 폴리뉴클레오타이드들을 삽입하는 것을 말한다.

벡터들은 자발적으로 복제할 수 있거나, 숙주세포의 게놈 내로 삽입되어 복제할 수 있으며, 이 경우에 그들은 삽입 서열을 포함한다.

발현 및 클로닝 벡터들은 선별가능한 마커, 유전자로 형질전환된 숙주세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 본 유전자는 이들 삽입자들을 발현하는 숙주세포들의 성장만을 보장한다. 통상적인 선별 유전자들은 (a) 항생제들 또는 다른 독성물질들, 예로 앰피실린 (ampicillin), 네오마이신 (neomycin), 메토트렉세이트 (methotrexate) 등에 대한 저항성을 부여하거나; (b) 자가영양 결핍들 (auxotrophic deficiencies)을 보상하거나; (c) 복합 배지로부터 입수가능하지 않은 결정적인 영양분들을 공급하는 단백질들을 인코드하고, 예로 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제 (D-alanine racemase)를 인코딩하는 유전자를 들 수 있다.

형질전환된 숙주세포는 기지의 방법들에 따라 배양될 수 있고, 발현된 폴리펩타이드는 수확되고, 예로 통상적인 프로토콜들을 사용하여 (예로, 배양 배지로부터) 회수되고 분리될 수 있다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 융합 단백질 (상기 기술된 바와 같음)을 포함하는 숙주세포를 제공한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 융합 단백질 (상기 기술된 바와 같음) 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명의 문맥에서, "면역원성 (immunogenic)" 조성물은 면역 반응을 나타내는 조성물에서 항원의 능력을 말한다. 면역 반응은 CD4+, CD8+, 및/또는 INF-γ 반응들과 같은 체액성 및/또는 세포-매개성 면역 반응들을 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물을 사용하여 달성된 양성의 면역원성 결과들은 (하기 실시예 3 및 도 1 내지 도 6을 참조하라) 가장 놀랍고도 기대하지 못한 것이다. 예를 들어 본 발명과는 대조적으로, 말라리아 항원들과 서열번호 1의 융합은 증진된 면역 반응을 유발시키지 못하였다 (하기 실시예 3 및 도 7을 참조하라). 보다 더 놀라운 것은 마우스에서 관찰된 마이코박테리아 항원에 대한 양성의 면역원성이 영장류에서도 역시 관찰되었던 점이다.

면역 반응을 감시하는 것은 당해 기술분야에서 일상적이다. 예를 들어, T 세포 반응들을 측정하고 정량하는 새로운 면역학적 검정법들이 지난 10년에 걸쳐서 확립되어 왔다. 예를 들어, 인터페론-감마 (IFN-γ) 엘리스폿 (ELISPOT) 검정법은 항원-특이 T 세포들로부터 나온 INF-γ의 분비가 M. 투버쿨로시스에 대항한 보호작용과 상호관련되기 때문에 면역학적 결과 (readout)로서 유용하다. 또한, 엘리스폿 검정법은 매우 재현가능하고 민감한 IFN-γ 분비하는 항원-특이 T 세포들의 수를 정량하는 방법이다. 면역 반응은 항원에 특이적인 항체 역가를 측정하는 방식에 의해서도 역시 측정될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 데 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물 (상기 기술된 바와 같음)을 제공한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 약제의 제조에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물 (상기 기술된 바와 같음)의 용도를 제공한다.

치료적 용도들 및 방법들의 문맥에서, '개체 (subject)'는 M. 투버쿨로시스와 같은 마이코박테리아에 대항한 면역 반응의 자극 또는 유도로부터 유익을 얻을 동물 개체라면 모두이다. 전형적인 동물 개체들로는 영장류, 예를 들어 인간, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 까마귀, 개 또는 고양이 개체들과 같은 포유동물들이다. 한 가지 구현예에서, 개체는 인간, 소, 돼지, 말, 오소리 또는 여우이다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아성 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물 (상기 기술된 바와 같음)을 제공한다.

본 발명의 융합들을 사용하여 달성된 양성의 면역원성 결과들은 (하기 실시예 3 및 도 1 내지 도 6을 참조하라) 가장 놀랍고도 기대하지 못한 것이다. 예를 들어 본 발명과는 대조적으로, 말라리아 항원들과 서열번호 1의 융합들은 증진된 면역 반응을 유발시키지 못하였다 (하기 실시예 3 및 도 7을 참조하라). 보다 더 놀라운 것은 마우스에서 관찰된 마이코박테리아 항원에 대한 양성의 면역원성이 영장류에서도 역시 관찰되었던 점이다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아성 감염의 치료 또는 예방하는 약제의 제조를 위한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물 (상기 기술된 바와 같음)의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 (상기에서 기술된 바와 같음) 개체에게 투여하는 과정을 포함하는 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 방법을 제공한다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 (상기에서 기술된 바와 같음) 개체에게 투여하는 과정을 포함하는 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 방법이 제공된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아성 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.

한 가지 구현예에서, M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아성 감염을 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 (상기에서 기술된 바와 같음) 개체에게 투여하는 과정을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 (상기에서 기술된 바와 같음) 개체에게 투여하는 과정을 포함하고, 여기에서 상기 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 또 다른 면역원성 조성물의 투여 이전에 실질적으로, 이와 함께 동시적으로 또는 이와 연속하여 투여된다.

한 가지 구현예에서, M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아성 감염을 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 (상기에서 기술된 바와 같음) 개체에게 투여하는 과정을 포함하고, 여기에서 상기 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 또 다른 면역원성 조성물의 투여 이전에 실질적으로, 이와 함께 동시적으로 또는 연속적으로 투여된다.

한 가지 구현예에서, M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 본 발명의 벡터, 또는 본 발명의 융합 단백질, 또는 본 발명의 면역원성 조성물을 감작 (priming) 백신 조성물의 투여 이후 1, 2, 3, 4 또는 5년까지 추가자극 (booster) 백신 조성물로서 투여하는 과정을 포함한다.

한 가지 구현예에서, 감작 백신 조성물은 두 번째의 마이코박테리아 항원 (예로, BCG)을 포함하거나 인코드한다.

"감작-추가자극 (prime-boost)" 백신접종 요법들 (regimens)을 포함하는 사전적 (prior), 동시적 (simultaneous), 및 연속적 (sequential) 투여 요법들은 본 명세서에서 이후에 보다 자세하게 논의된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 넓은 범위의 면역 반응들을 유도하는 데 유용할 수 있고, 따라서 넓은 범위의 질환들을 치료하는 방법들에 유용할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 마이코박테리아가 연루되는 넓은 범위의 비-마이코박테리아성 질환들을 치료하거나 예방하는 데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 약제로부터 유익을 얻을 수 있는 질환들은 자가면역 질환, 암 (예로, 방광암), 염증성 장 질환, 크론씨 질환 (Crohn's Disease), 존씨 질환 (Johne's Disease), 한센병 (Hansen's Disease), 골수염 (osteomyelitis), 림프절염 (lymphadenitis), 천연두 또는 원숭이 수두 (monkeypox)와 같은 염증성 질환들을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료 (treatment)" 또는 "치료하는 (treating)"은 치료적 또는 예방적 (preventative)/예방적 (prophylactic) 척도들을 포함하고, 마이코박테리아 감염의 감염-이후 치료법 및 이의 개선을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "예방하는 (preventing)"은 마이코박테리아 감염의 개시를 예방하는 것 및/또는 마이코박테리아 감염의 중증도 (severity) 또는 강도를 감소시키는 것을 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 (상기 기술된 바와 같음) 마이코박테리아성 감염, 마이코박테리아성 감염과 연관된 병폐 또는 증상들을 이미 가지는 개체 (전형적으로는 인간, 소, 돼지, 말, 오소리 또는 여우와 같은 포유동물 개체)에게 상기 마이코박테리아성 감염을 치료하거나 예방하도록 투여될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 개체는 마이코박테리아와 접촉되었던 것으로 의심되거나 마이코박테리아와 기지의 접촉을 가졌던 적이 있었지만, 노출의 증상들은 아직 나타내지는 않는다.

마이코박테리아성 감염 또는 질환을 이미 가지거나 마이코박테리아 감염과 연관된 증상들을 나타내지는 않는 개체 (전형적으로는 인간, 소, 돼지, 말, 오소리 또는 여우와 같은 포유동물)에게 투여될 때, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 (상기 기술된 바와 같음) 이러한 치료의 부재 시 예상되는 것을 넘어서 하나 이상의 증상들을 치료하거나, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 개선하고 및/또는 개체의 생존을 연장시킬 수 있다.

대안으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 (상기 기술된 바와 같음) 궁극적으로 마이코박테리아 감염을 획득할 수 있는 개체 (전형적으로는 인간, 소, 돼지, 말, 오소리 또는 여우와 같은 포유동물)에게 이러한 치료의 부재 시 예상되는 것을 넘어서 상기 마이코박테리아 감염의 하나 이상의 증상들을 치료하거나, 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 개선하도록, 또는 개체의 생존을 연장시키도록 투여될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 개체는 이전에 마이코박테리아에 노출된 적이 있다. 예를 들어, 개체는 과거에 마이코박테리아 감염을 가졌을 수 있다 (그러나 임의적으로 현재는 마이코박테리아로 감염되어 있지 않다). 개체는 잠복성으로 마이코박테리아에 감염될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 개체는 과거에 마이코박테리아성 감염에 대항한 백신접종을 받았을 수 있다 (예로, 개체는 이전에 BCG 백신접종을 받았다).

본 발명의 치료 방법들 및 예방적 치료법들은 서로 다른 연령의 다양한 서로 다른 개체들에게 적용가능하다. 인간들의 문맥에서, 치료법들은 아동들 (예로, 유아들, 5세 미만의 아이들, 큰 아이들 또는 십대들) 및 성인들에게 적용가능하다. 다른 동물 개체들 (예로, 소들, 돼지들, 말들, 오소리들 또는 여우들과 같은 포유동물들)의 문맥에서, 치료법들은 미성숙한 개체들 (예로, 송아지들, 어린 돼지들, 망아지들) 및 성숙한/어른 개체들에게 적용가능하다. 본 발명의 치료 방법들 및 예방적 치료법들은 면역저하되거나 면역억제된 개체들 (예로, HIV 또는 AIDS를 가진 인간 환자들, 또는 비교가능한 면역결핍 질환들을 가진 기타 동물 환자들), 기관 이식, 골수 이식을 겪었거나, 유전적 면역-결핍들을 가지는 개체들에게 적용가능하다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열들, 또는 벡터들, 또는 융합 단백질들, 또는 면역원성 조성물들은 (상기 기술된 바와 같음) 백신들로서 모두 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "백신 (vaccine)"은 포유동물 (예로, 인간, 소, 돼지, 말, 오소리, 여우, 양, 염소, 까마귀, 개 또는 고양이)와 같은 동물 개체에게 투여될 때 마이코박테리아 감염에 대항한 보호적 면역 반응을 자극하는 제형물이다. 면역 반응은 체액성 및/또는 세포-매개성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 백신은 예를 들어 마이코박테리아성 감염 (예로, M. 투버쿨로시스 감염)의 효과들로부터 동물을 보호작용하도록 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "백신 (vaccine)"은 용어들 "치료적/예방적 조성물", "제형물 (formulation)" 또는 "약제 (medicament)"과 상호교환적으로 사용된다.

본 발명의 백신 (상기 정의된 바와 같음)은 약제학적으로 허용가능한 담체에 추가하여 좀 더 나아가 하나 이상의 염, 부형제, 희석제, 아쥬반트, 면역원성 제제 및/또는 항미생물 화합물과 조합될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 벡터, 또는 융합 단백질, 또는 면역원성 조성물은 중성 또는 염의 형태들로서 백신 내에 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 염들로는, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산들, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 말레산 등과 같은 유기산들로 형성된 산 추가 염들을 포함한다. 또한 자유 카복실 그룹들로 형성된 염들도, 예를 들어 소듐, 포타슘, 암모니움, 칼슘, 또는 철 산화물들과 같은 무기염들, 또한 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로케인 등과 같은 유기염들로부터 유래될 수 있다.

일반적으로 면역원성 조성물들, 치료적 제형물들, 약제들 및 예방적 제형물들 (예로, 백신들)의 투여는 통상적인 경로들, 예로 정맥내, 피하, 복강내, 또는 점막 경로들에 의한다. 투여는 비경구 주사, 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의할 수 있다. 상세하게, 중화 항체들을 포함하는 제형물들은 정맥내, 근육내, 피부내, 또는 피하적 투여에 적합할 수 있다.

따라서, 본 발명의 면역원성 조성물들, 치료적 제형물들, 약제들 및 예방적 제형물들 (예로, 백신들)은 전형적으로 액체 용액들 또는 현탁액들과 같은 주사가능한 것들로서 제조될 수 있다. 대안으로, 주사 이전에 액체화되는 용액 또는 현탁액으로 적합한 고체 형태들이 제조될 수 있다. 또한 제조물은 에멀전화되거나, 리포좀들 또는 미세캡슐들 내에 피막화된 펩타이드일 수 있다.

활성을 가진 면역원성 성분들은 종종 약제학적으로 허용가능하고 활성 성분과 양립가능한 부형제들과 혼합된다. 적합한 부형제들로는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합들이다. 또한 원하는 경우라면, 백신은 습윤화 또는 에멀전화 제제들, pH 완충제들, 및/또는 백신의 효율성을 증진시키는 아쥬반트들과 같은 소량의 보조적 물질들을 포함할 수 있다.

일반적으로, 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체이다. 약제학적으로 허용가능한 담체들의 비-제한적인 예들로는 물, 식염수, 및 인산-완충 식염수를 포함한다. 그러나 일정 구현예들에서, 조성물은 냉동-건조된 형태로 있을 수 있고 이 경우에 이것은 BSA와 같은 안정화제를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 장기간 저장을 용이하게 하도록 조성물을 티오머잘 (thiomersal)또는 소듐 아자이드와 같은 보존제를 사용하여 제형화하는 것이 바람직할 수 있다.

효과적일 수 있는 추가적인 아쥬반트들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 완전 프런트 아쥬반트 (CFA), 불완전 프런트 아쥬반트 (IVA), 사포닌 (Saponin), Quil A와 같은 사포닌의 정제된 추출물 분획, QS-21와 같은 사포닌의 유도체, ISCOM/ISCOMATIX와 같은 사포닌에 기초한 지질 입자들, LTK63 및/또는 LTK72와 같은 대장균 열 불안정 독소 (E. coli heat labile toxin, LT) 돌연변이체들, 알루미늄 하이드록사이드, N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (CGP 11637, 노르-MDP라고 약칭됨), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴 옥시)-에틸아민 (CGP 19835A, MTP-PE라고 약칭됨), 또한 2% 스쿠알렌/트윈 80 에멀전에 넣은 박테리아로부터 추출된 세 가지 성분들, 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A), 트레할로스 디마이콜레이트 (trehalose dimycolate) 및 세포벽 골격 (MPL + TDM + CWS)을 포함하는 RIBI를 포함한다.

완충제들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 소듐 숙시네이트 (pH 6.5), 및 인산 완충 식염수 (PBS; pH 6.5 및 7.5)를 포함한다.

기타 다른 투여 방식들에 적합한 추가적인 제형물들로는 좌약들, 또한 일정 경우에 경구적 제형물들 또는 에어로졸들로서 시판에 적합한 제형물들을 포함한다. 좌약들의 경우, 통상적인 결합제들 및 담체들로는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜들 또는 트리글리세라이드들을 포함할 수 있고; 이러한 좌약들은 0.5% 내지 10%, 바람직하게는 1% 내지 2%의 범위로 활성 성분을 포함하는 혼합물들로부터 형성될 수 있다.

경구적 제형물들은 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카라인, 셀룰로우스, 마그네슘 카보네이트 등과 같은 정상적으로 사용되는 부형제들을 포함한다. 이들 조성물들은 용액들, 현탁액들, 정제들, 환제들, 캡슐들, 서방성 제형물들 또는 파우더들의 형태를 취한다.

오소리들 또는 여우들과 같은 동물 개체들의 경우에는, 제형물이 "미끼 (bait)"를 형성하도록 담체 물질을 포함할 수 있다. 다양한 물질들이 액체 및 고체 물질들 둘 다를 포함하는 담체 물질을 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 담체는 섭취를 촉진하고 및/또는 특이적 동물들을 유인하는 데 효과적인 식품 원료가 될 수 있다. 미끼 제형물들에 사용하기 위한 적합한 식품 원료들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 밀가루, 밀 시리얼, 밀겨, 몰라스, 식초, 아가, 젤라틴, 애완동물 먹이, 밀, 콩 제품들, 귀리, 옥수수, 채소 오일들, 쌀, 과일들, 육류, 육류 부산물들, 생선, 생선 부산물들, 슈가, 껍질에 싸인 채소 종자들, 껍질에 싸인 곡물 종자들, 낙농 제품, 유장 파우더, 카제인, 알부민, 혈액 가루, 뼈 가루, 효모, 지방, 맥주 제품들, 종이 섬유, 셀룰로우스 및 그들의 혼합물을 포함한다.

기타 다른 적합한 첨가물로는 유인제들 (attractants) 및 비-식품 담체들을 포함한다. 비-식품 담체들은 단독으로 또는 식품 물질들 및/또는 유인제들과 조합으로 사용될 수 있다. 첨가물들로서 적합한 비-식품 담체들의 예들로는 셀룰로우스, 모래, 진흙, 실리카, 폴리아크릴산 중합체들, 폴리아크릴아마이드 중합체들, 알기네이트 및 왁스를 포함한다.

마이코박테리아 호흡기 감염 (예로, M. 투버쿨로시스 감염)의 경우에, 폐에서의 감염 부위에 치료적/예방적 조성물 또는 약제의 효율적인 전달은 경구적 또는 비강내 투여 (i.n.)에 의해 달성될 수 있다. 이들 전달 방식들은 M. 투버쿨로시스 감염의 전달 경로에 해당한다.

비강내 투여를 위한 제형물들은 코 비말 (nasal droplets) 또는 코 스프레이의 형태일 수 있다. 비강내 제형물은 500 내지 4,000 μm, 1,000 내지 3,000 μm 또는 100 내지 1,000 μm와 같은 대략 100 내지 5,000 μm 범위의 직경을 가지는 비말을 포함할 수 있다. 대안으로, 부피의 견지에서, 비말들은 0.1 내지 50 μL 또는 1.0 내지 25μL와 같은, 또는 0.001 내지 1 μL와 같은 약 0.001 내지 100 μL의 범위가 될 수 있다.

대안으로, 치료적/예방적 조성물 또는 약제는 에어로졸 제형물일 수 있다. 에어로졸 제형물은 파우더, 현탁액 또는 용액의 형태를 취할 수 있다. 에어로졸 입자들의 크기는 에어로졸의 전달 능력에 적절하다. 더 작은 입자들은 호흡 기도를 따라서 폐포를 향하여 더 큰 입자들보다 좀 더 이동할 수 있다. 한 가지 구현예에서, 에어로졸 입자들은 기관지 (bronchi), 세기관지 (bronchioles), 및 폐포 (alveoli)의 전 길이를 따라 전달을 용이하게 하도록 직경 분포를 가진다. 대안으로, 입자 크기 분포는 호흡 기도의 특정한 구획, 예를 들어 폐포를 표적하도록 선택될 수 있다. 약제의 에어로졸 전달의 경우에, 입자들은 대략 0.1 내지 50 μm, 바람직하게는 1 내지 25 μm, 더욱 바람직하게는 1 내지 5 μm 범위의 직경들을 가질 수 있다.

에어로졸 입자들은 분무기 (예로, 입을 통함) 또는 코 스프레이를 사용하여 전달될 수 있다. 에어로졸 제형물은 임의적으로 추진제 (propellant) 및/또는 표면활성제 (surfactant)를 포함할 수 있다.

비말들/입자들의 크기를 본 발명의 정의된 범위 이내로 조절하여, 폐포로의 부적절한 약제의 전달을 피하고 (또는 최소화하여) 폐들의 염증 및 섬유적 흉터 (fibrotic scarring)와 같은 폐포-연관된 병리학적 문제들을 회피하는 것이 가능하다.

비강내 (i. n.) 백신접종은 다른 점막-연관된 림프계 조직들과는 다른, 코 및 기관 연관된 점막 조직들에서 T 및 B 세 매개성 효과기 기작들을 작동시킨다. 비강내 투여 경로에 의해 유도된 보호 기작들은 선호적 폐 귀소를 가진 T 림프구들의 활성화; 공동-자극 분자 (예로, B7.2)의 상승조절; 및/또는 대식세포들 또는 분비되는 IgA 항체들의 활성화:를 포함할 수 있다.

항원들의 비강내 전달은 점막의 항체 반응의 유도를 용이하게 할 수 있고, 이는 항체 생산을 돕는 Th2 표현형을 향한 T 세포 반응에서의 이동으로 나타난다. 점막 반응은 증진된 IgA 생산을 특징으로 하고, Th2 반응은 증진된 IL-4 생산을 특징으로 한다.

본 발명의 마이코박테리아성 항원들의 비강내 전달은 호흡계의 점막하 B 세포들에 항원들의 표적화를 허용한다. 이들 B 세포들은 포유동물들에서 대다수의 국소적 IgA-생산 세포들이고 비강내 전달은 마이코박테리아성 항원들에 대항하는 이들 세포들에 의한 IgA 생산에서의 신속한 증가를 용이하게 한다.

본 발명의 치료적 제형물들, 약제들 및 예방적 제형물들 (예로, 백신들)은 약제학적으로 허용가능한 담체, 임의적으로 하나 이상의 염, 부형제, 희석제 및/또는 아쥬반트를 포함한다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신들)은, 예를 들어 면역글로불린들, 항생제들, 인터루킨들 (예로, IL-2, IL-12), 및/또는 사이토카인들 (예로, INFγ)로부터 선택된, 하나 이상의 면역조절성 제제들을 포함할 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신들)은 통상적인 항-결핵 약물들 (예로, 리팜피신 (rifampicin), 이소니아지드 (isoniazid), 에탐부톨 (ethambutol) 또는 피리진아마이드 (pyrizinamide))과 같은 하나 이상의 항미생물 화합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 치료적 제형물, 약제 및 예방적 제형물 (예로, 백신)은 단일 용량 스케쥴 (single dose schedule)로 주어질 수 있다 (예로, 전 용량이 실질적으로 한 번에 주어진다). 대안으로, 본 발명의 치료적 제형물, 약제 및 예방적 제형물 (예로, 백신)은 복수 용량 스케쥴 (multiple dose schedule)로 주어질 수 있다.

복수 용량 스케쥴은 치료의 일차적인 과정 (예로, 백신접종)이 1 내지 6번의 분리된 용량들로 시행될 수 있고, 이후에 면역 반응을 유지하고 강화하기 위하여 요구되는 연속되는 시간 간격들, 예를 들어 (인간 개체들의 경우) 두 번째 용량의 경우 1 내지 4개월에 또한 필요한 경우 다시 1 내지 4개월 이후에 연속된 용량(들)로 주어지는 다른 용량들로 이어진다.

용량 요법 (dosage regimen)은 적어도 부분적으로는 개인의 필요에 의해 결정되고 시행자 (예로, 의사 또는 전문가)의 판단에 의존할 것이다.

동시적 투여 (simutaneous administration)는 (실질적으로) 동일한 시점에서의 투여를 의미한다.

둘 이상의 조성물들/치료적 제제들/백신들의 연속적 투여 (sequential administration)는 조성물들/치료적 제제들/백신들이 (실질적으로) 서로 다른 시점에서 하나씩 투여되는 것을 의미한다.

예를 들어, 한 가지 구현예에서, 본 발명의 백신은 "감작-추가자극 (prime-boost)" 백신접종 요법의 일부로서 투여될 수 있다.

감작-추가자극 백신접종 요법들은 감작 과정 (Priming) - 예로, 하나 이상의 항원들 또는 백신을 개체에게 노출하는 것; 또한 추가자극 과정 (Boosting) - 예로, 연속하여 하나 이상의 항원들 또는 백신을 상기 개체에게 노출하는 것:을 포함한다. 전형적으로 "추가자극" 항원들/백신은 "감작" 항원들/백신과는 서로 다르다 ("이종유래의" 감작-추가자극이라고 알려져 있음). 본 관점으로, 이종유래의 감작-추가자극 면역접종 전략들은 동일한 백신을 사용한 동종유래의 추가자극과 비교하여 더 높은 수준들의 효과기 T 세포 반응들을 개체들에서 유도하는 것으로 확인되어 왔다. 예를 들어, BCG와 같은 통상적인 백신들을 사용한 반복된 백신접종이 TB에 대항한 보호작용을 좀 더 증진하는 것으로 여겨지지 않는다. 그러나, BCG를 이종유래의 감작-추가자극 요법에 도입하는 것은 BCG의 보호작용 효과들을 유지시킬 수 있다.

따라서 한 가지 구현예에서, 본 발명은 이종유래의 통상적인 백신 (예로, BCG 백신)의 투여에 의해 개체의 면역계를 '감작'시킨 다음 본 발명의 백신의 투여에 의해 상기 개체의 면역계를 '추가자극'하는 과정을 포함하는, 마이코박테리아성 감염에 대항한 백신접종 방법을 제공한다. 한 가지 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 백신을 BCG와 같은 이종유래의 통상적인 백신에 미리 노출되었던 개체에게 투여하는 과정을 포함하는, 마이코박테리아성 감염에 대항한 백신접종 방법을 제공한다.

대안으로, 개체의 면역계는 본 발명의 백신의 투여에 의해 '감작'된 다음, 이종유래의 통상적인 백신 (예로, BCG 백신)의 투여에 의해 '추가자극'될 수 있다. 따라서 한 가지 구현예에서, 백신은 BCG와 같은 이종유래의 통상적인 백신에 연속적으로 노출될 개체에게 투여된다.

'감작' 단계는 모든 연령의 개체에서 수행될 수 있고 - 포유동물 개체들의 경우에 (예로, 인간들, 소들, 돼지들, 말들, 오소리들, 여우들, 양들, 염소들, 까마귀들, 개들 또는 고양이들), BCG를 사용한 감작은 통상적으로 신생아 시기, 또는 유아기, 청소년기 또는 성인기 동안 통상적으로 수행된다. '추가자극' 단계는 '감작' 단계 이후에 언제라도 수행될 수 있다. 포유동물 개체들의 경우에 (예로, 인간들, 소들, 돼지들, 말들, 오소리들, 여우들, 양들, 염소들, 까마귀들, 개들 또는 고양이들), 추가자극 단계는 감작 단계 이후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10주 시점에, 또는 감작 단계 이후에 적어도 약 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 30, 33, 36, 39, 40, 44, 48, 50, 54 또는 60개월 시점에, 또는 추가자극 단계 이후에 적어도 약 1, 2, 3, 4, 또는 5년, 또는 심지어 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40년 이상 된 시점에 수행될 수 있다. 한 가지 구현예에서, 인간 개체의 경우에, 감작 단계는 유아기 동안 수행되고 추가자극 단계는 청소년기 동안 수행된다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신)은, 포유동물과 같은 개체 (예로, 인간, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 까마귀, 개 또는 고양이 개체)에게, 예를 들어 면역글로불린들, 항생제들, 인터루킨들 (예로, IL-2, IL-12), 및/또는 사이토카인들 (예로, INFγ)로부터 선택된, 하나 이상의 면역조절성 제제들과 조합으로 (동시적으로 또는 연속적으로) 투여될 수 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신)은, 포유동물과 같은 개체 (예로, 인간, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 까마귀, 개 또는 고양이 개체)에게, 통상적인 항-결핵 약물들 (예로, 리팜피신, 이소니아지드, 에탐부톨 또는 피라진아마이드)과 같은 하나 이상의 항미생물 화합물들과 조합으로 (동시적으로 또는 연속적으로) 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신)은 활성 성분의 적어도 10% 또는 25%, 또는 활성 성분의 적어도 40%, 또는 활성 성분의 적어도 50, 55, 60, 70 또는 75%와 같은 활성 성분의 5% 내지 95%를 포함할 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물, 치료적 제형물, 약제 또는 예방적 제형물 (예로, 백신)은 용량 제형물과 양립가능한 방식으로, 또한 예방적으로 및/또는 치료적으로 유효할 양으로 투여된다.

본 관점으로 본 명세서에서 사용되는 바, "유효량 (effective amount)"는 원하는 생물학적 성과를 달성하는 데 충분한 용량 또는 양이다. 본 명세서에서 사용되는 바, "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 개체 (포유동물과 같음 - 예로, 인간, 소, 돼지, 말, 오소리, 여우, 양, 염소,까마귀, 개 또는 고양이)에게 단일 또는 복수의 용량 투여 시 이러한 치료의 부재 시 예상되는 것을 넘어서 장애 또는 재발한 장애의 적어도 하나의 증상을 치료하거나, 예방하거나, 치료하거나 (curing), 지연시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 개선하거나, 개체의 생존을 연장시키는 데 효과적인 양이다.

따라서, 일반적으로 용량 당 항원 5 마이크로그램 내지 250 마이크로그램의 범위가 되는 (경구적으로 또는 바이러스성 벡터들의 형태로 전달되는 경우라면 더 높은) 투여될 활성 성분의 양은 치료될 개체, 보호적 면역 반응을 생성하는 개체의 면역계의 능력 및 원하는 보호작용의 정도에 의존한다. 투여되도록 요구되는 활성 성분의 정확한 양들은 의사의 판단에 의존할 수 있고 각 개체에 특정될 수 있다.

본 발명은 본 출원에서 확인된 기준 (reference) 서열번호들이라면 모두를 기초로 하는 폴리펩타이드들 (그들의 단편들을 포함함)과 실질적으로 동종유래인 폴리펩타이드들을 포괄한다. 용어들 "서열 일치도 (sequence identity)" 및 "서열 상동성 (sequence homology)"은 본 명세서에서 동의어로서 고려된다.

예로서, 관심 있는 폴리펩타이드는 기준 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

두 가지의 아미노산 서열들을 정렬하는 데 사용가능한 많은 확립된 알고리즘들이 존재한다.

전형적으로 하나의 서열이 기준 서열로서 작용하고, 여기에 테스트 서열이 비교될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 표시된 프로그램 매개변수들을 기초로 하여, 기준 서열과 대비한 테스트 서열(들)을 위한 서열 일치도 백분율을 계산한다. 비교를 위한 아미노산 서열들의 정렬이, 예를 들어 컴퓨터가 실행하는 알고리즘들 (예로, GAP, BESTFIT, FASTA 또는 TFASTA), 또는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘들에 의해 수행될 수 있다.

하기에 나타난 BLOSUM62 표는 단백질 서열 분절들의 약 2,000개의 국소적인 복수의 정렬들로부터 유래한 아미노산 치환 매트릭스이고, 500개 이상의 관련된 단백질들 그룹들의 매우 보존된 영역들을 나타내고 있다 (Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다). 아미노산들은 표준 단일-문자 코드들에 의해 표시된다. 일치도 백분율은 다음과 같이 계산된다:

{(일치하는 매치들의 전체 수) / (더 긴 서열의 길이 + 두 개의 서열들을 정렬하도록 더 긴 서열 내에 도입된 간격들의 수)} x 100

BLOSUM62 표

상동성 비교에서, 일치도는 적어도 10개의 아미노산 잔기들의 길이 (예로, 적어도 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 또는 685개의 아미노산 잔기들의 길이 - 예로, 기준 서열의 길이 전부까지)가 되는 서열들의 영역에 걸쳐서 존재할 수 있다.

실질적으로 동종유래의 폴리펩타이드들은 하나 이상의 아미노산 치환들, 결실들, 또는 부가들을 가진다. 많은 구현예들에서, 이들 변화들은 예를 들어 보존적인 아미노산 치환들이 관여하는 소수의 특성이다. 보존적인 치환들은 다음의 그룹들 내에서 하나의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하여 만들어지는 것들이다: 염기성: 아르기닌, 라이신, 히스티딘; 산성: 글루탐산, 아스파트산; 극성: 글루타민, 아스파라진; 소수성: 루이신, 이소루이신, 발린; 방향족: 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신; 소형: 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌. 또한, 실질적으로 동종유래의 폴리펩타이드들은 폴리펩타이드의 접힘 (folding) 또는 활성에 유의하게 영향을 주지 않는 다른 치환들; 전형적으로 1 내지 약 30개 아미노산들 (1 내지 10개, 또는 1 내지 5개 아미노산들)의 작은 결실들; 또한 아미노-말단 메티오닌 잔기 약 20 내지 25개 잔기들까지의 작은 링커 펩타이드, 또는 친화성 태그와 같은 작은 아미노- 또는 카복시-말단 연장들을 포함하는 것들을 포괄한다.

또한, 본 발명의 폴리펩타이드들은 비-자연적으로 생기는 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 본 관점으로, 20개의 표준 아미노산들에 추가하여 비-표준 아미노산들 (예로, 4-하이드록시프롤린 (4-hydroxyproline), 6-N-메틸 라이신 (6-N-methyl lysine), 2-아미노이소부티르산 (2-aminoisobutyric acid), 이소발린 (isovaline) 및 α-메틸 세린 (α-methyl serine)과 같음)이 본 발명의 마이코박테리아성 폴리펩타이드들의 아미노산 잔기들로 치환될 수 있다. 비-보존적인 아미노산들, 유전 암호에 의해 인코드되지 않는 아미노산들 및 비-자연적인 아미노산들의 제한된 수가 마이코박테리아성 폴리펩타이드 아미노산 잔기들로 치환될 수 있다. 비-자연적으로 생기는 아미노산들로는, 이제 제한되는 것은 아니지만 트랜스-3-메틸프롤린 (trans-3-methylproline), 2,4-메타노-프롤린 (2,4-methano-proline), 시스-4-하이드록시프롤린 (cis-4-hydroxyproline), 트랜스-4-하이드록시-프롤린 (trans-4-hydroxy-proline), N-메틸글리신 (N-methylglycine), 알로-트레오닌 (allo-threonine), 메틸-트레오닌 (methyl-threonine), 하이드록시-에틸시스테인 (hydroxy-ethylcysteine), 하이드록시에틸호모-시스테인 (hydroxyethylhomo-cysteine), 니트로-글루타민 (nitro-glutamine), 호모글루타민 (homoglutamine), 피페콜산 (pipecolic acid), 터르-루이신 (tert-leucine), 노르발린 (norvaline), 2-아자페닐알라닌 (2-azaphenylalanine), 3-아자페닐-알라닌 (3-azaphenyl-alanine), 4-아자페닐-알라닌 (4-azaphenyl-alanine), 및 4-플루오로페닐알라닌 (4-fluorophenylalanine)을 포함한다.

비-자연적으로 생기는 아미노산 잔기들을 폴리펩타이드들 내로 도입하는 여러 가지 방법들이 당해 기술분야에 알려져 있다. 예를 들어, 화학적으로 아미노아실화된 억제인자 tRNAs (supperssor tRNAs)를 사용하여 넌센스 돌연변이들이 억제되는 시험관내 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산들을 합성하여 tRNA를 아미노아실화하는 방법들이 당해 기술분야에 알려져 있다. 넌센스 돌연변이들을 포함하는 플라스미드들의 전사 및 해독은 대장균 S30 추출물, 시판되는 효소들 및 기타 다른 반응액들을 포함하는 무세포 (cell free) 시스템에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드들은 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 두 번째 방법에서, 해독은 돌연변이된 mRNA 및 화학적으로 아미노아실화된 억제인자 tRNAs의 미세주입에 의해 제노푸스 난자들에서 수행된다. 세 번째 방법 내에서는, 대장균 세포들이 대체될 자연적인 아미노산 (예로, 페닐알라닌)의 부재 시 또한 원하는 비-자연적으로 생기는 아미노산(들) (예로, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플루오로페닐알라닌)의 존재 시 배양된다. 비-자연적으로 생기는 아미노산은 그의 자연적인 상대방을 대신하여 폴리펩타이드 내에 도입된다. 자연적으로 생기는 아미노산 잔기들은 시험관내 화학적 변형에 의해 비-자연적으로 생기는 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 치환들의 범위를 좀 더 확장하도록 부위-유도된 돌연변이화와 조합된다.

본 발명의 폴리펩타이드들에 있는 것들과 같은 필수 아미노산들은 부위-유도된 돌연변이화 (site-directed mutagenesis) 또는 알라닌-스캔 돌연변이화 (alanine-scanning mutagenesis)와 같은 당해 기술분야에서 알려져 있는 절차들에 따라 확인될 수 있다. 또한 생물학적 상호작용의 부위들은 아미노산들의 잠재적인 접촉 부위의 돌연변이와 조합하여 핵자기 공명, 결정구조학 (crystallography), 전자 회절 (electron diffraction) 또는 광친화 표지 (photoaffinity labelling)와 같은 기법들에 의해 결정되는 바와 같이 물리적 구조 분석에 의해 결정될 수 있다. 필수 아미노산들의 실체들도 역시 관심 있는 폴리펩타이드의 관련된 패밀리 구성원들과의 상동성들의 분석으로부터 추론될 수 있다.

복수의 아미노산 치환들이 기지의 돌연변이화 및 검색 방법들을 사용하여 만들어지고 테스트될 수 있다. 폴리펩타이드에서 둘 이상의 위치들을 동시적으로 무작위 추출하고, 기능을 가진 폴리펩타이드를 선별하고, 다음으로 돌연변이된 폴리펩타이드들을 서열결정하여 각 위치에서 허용가능한 치환들의 범주 (spectrum)를 결정하는 방법들이 알려져 있다. 사용될 수 있는 다른 방법들로는 파지 디스플레이 (phage display)를 포함한다.

핵산 분자들의 일상적인 결실 분석들이 본 발명의 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산 분자의 기능적 단편들을 획득하도록 수행될 수 있다. 설명하자면, DNA 분자들이 일련의 포개진 (nested) 결실들을 획득하도록 Bal31 핵산분해효소로 소화될 수 있다. 다음으로 이들 DNA 단편들은 적절한 해독 구조틀에 맞추어 발현 벡터들 내에 삽입되고, 또한 발현된 폴리펩타이드들은 분리되고 원하는 활성에 대해 테스트된다. 엑소뉴클레아제 소화에 대한 대안은 결실들을 도입하는 올리고뉴클레오타이드-유도된 돌연변이화 또는 원하는 단편의 생산을 특정하는 종결 코돈들을 사용하는 것이다. 대안으로, 특정한 폴리뉴클레오타이드 단편들은 중합효소 연쇄반응을 사용하여 합성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 돌연변이체는 기준 폴리펩타이드의 서열과 비교된 바와 같이, 하나 이상의 아미노산 유사체들 (예로, 비자연적인 아미노산), 또는 치환된 연결 (linkage)을 포함할 수 있다. 좀 더 심화된 구현예에서, 관심 있는 폴리펩타이드는 기준 폴리펩타이드의 모방체 (mimic)일 수 있고, 이는 기준 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프를 모방하여 재생산한다.

본 발명의 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열들의 돌연변이체들은 DNA 셔플링 (DNA shuffling)을 통하여 생성될 수 있다. 간략하게, 돌연변이 DNAs는 부모 DNA의 무작위 단편화에 의한 시험관내 동종유래의 재조합에 의해 생성되고, PCR을 사용하여 재조립이 이어지고, 그 결과 무작위적으로 도입된 점 돌연변이들이 유발된다. 본 기법은 공정 내에 추가적인 다양성을 도입하기 위하여 부모 DNAs 패밀리를 사용하여 변형될 수 있다. 원하는 활성의 선별 또는 검색이 돌연변이화의 추가적인 반복들로 이어지고 또한 검정 (assay)이 해로운 변화들을 골라내면서 동시에 바람직한 돌연변이들을 선별하여 신속한 서열들의 "진화 (evolution)"를 제공한다.

상기에 기재된 돌연변이화 방법들은 클론된 돌연변이 폴리펩타이드들의 활성을 검출하도록 고속-통과 검색 (high-throughput screening) 방법들과 조합될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드들, 또는 그들의 단편들을 인코드하는 돌연변이화된 핵산 분자들은 숙주 세포들로부터 회수되고 현대적 장치를 사용하여 신속하게 서열결정될 수 있다. 이들 방법들은 관심 있는 폴리펩타이드에서 개별 아미노산 잔기들의 중요성을 신속하게 결정하도록 허용하고, 미지의 구조의 폴리펩타이드들에 적용될 수 있다.

관심 있는 폴리펩타이드의 "단편 (fragment)"은 상기 폴리펩타이드의 서열로부터 나온 일련의 연속된 아미노산 잔기들을 포함한다. 예로서, 관심 있는 폴리펩타이드의 "단편"은 상기 폴리펩타이드의 서열로부터 나온 적어도 10개의 연속된 아미노산 잔기들 (예로, 상기 폴리펩타이드의 15, 20, 25,, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 또는 412개 연속된 아미노산 잔기들)을 포함할 수 있다 (또는 이들로 구성된다). 단편은 관심 있는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다.

관심 있는 폴리펩타이드, 또는 단편은 기준 폴리펩타이드의 활성 부위를 소유할 수 있다.

관심 있는 폴리펩타이드, 또는 그의 단편은 공통적인 항원 교차-반응성 및/또는 기준 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 생체내 생물학적 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드들, 또는 폴리펩타이드 단편들, 및 기준 폴리펩타이드들은 이전에 마이코박테리아 감염의 항원성 성분에 노출되었던 T-림프구 (예로, CD4+, CD8+, 효과기 T 세포 또는 TEM 또는 TCM과 같은 기억 T 세포)의 "회상 반응 (recall response)"를 유도하는 공통적인 능력을 공유하고 있다.

T 세포 반응들을 측정하고 정량하는 새로운 면역학적 검정법들이 지난 10년에 걸쳐서 확립되어 왔다. 예를 들어, 인터페론-감마 (IFN-γ) 엘리스폿 검정법은 항원-특이 T 세포들로부터 나온 INF-γ의 분비가 M. 투버쿨로시스에 대항한 보호작용과 상호관련되기 때문에 면역학적 결과로서 유용하다. 또한, 엘리스폿 검정법은 매우 재현가능하고 민감한, IFN-γ 분비하는 항원-특이 T 세포들의 수를 정량하는 방법이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "핵산 서열 (nucleic acid sequence)" 및 "폴리뉴클레오타이드 (polynucleotide)"는 상호교환적으로 사용되고 길이 제한이라면 모두를 의미하지는 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "핵산 (nucleic acid)" 및 "뉴클레오타이드 (nucleotide)"는 상호교환적으로 사용된다. 용어들 "핵산 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA (cDNA를 포함함) 및 RNA 서열들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "아미노산 서열 (amino acid sequence)" 및 "폴리펩타이드 (polypeptide)"는 상호교환적으로 사용되고 길이 제한이라면 모두를 의미하지는 않는다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열들로는 자연적으로 생긴 그들의 환경으로부터 분리되었던 핵산 서열들, 재조합 또는 클론된 DNA 분리물들, 또한 화학적으로 합성된 유사체들 또는 이종유래의 시스템들에 의해 생물학적으로 합성된 유사체들을 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드들은 당해 기술분야에서 알려져 있는 수단이라면 모두에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드들의 많은 양들이 적합한 숙주세포에서 복제에 의해 생산될 수 있다. 원하는 단편을 코딩하는 자연적 또는 합성 DNA 단편들은 원핵 또는 진핵세포 내로 도입되어 이들에서 복제할 수 있는 재조합 핵산 제작물들, 전형적으로 DNA 제작물들 내로 통합될 것이다. 보통 DNA 제작물들은 효모 또는 박테리아와 같은 단일세포 숙주에서 자발적인 복제에 적합할 것이지만, 배양된 곤충, 포유동물, 식물 또는 기타 다른 진핵성 세포주들의 게놈에 도입 또는 이들 내에 통합이 의도될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드들은 화학적 합성에 의해, 예로 포스포아미다이트 방법 (phosphoamidite method) 또는 트리에스테르 방법 (triester method)에 의해서도 역시 생산될 수 있고, 시판되는 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기들 상에서 수행될 수 있다. 이중-가닥 단편이 상보적 가닥을 합성하고 적절한 조건들 하에서 가닥을 다함께 아닐링하는 과정에 의해 또는 상보적 가닥을 적절한 프라이머 서열과 함께 DNA 중합효소를 사용하여 첨가하는 과정에 의해 화합적 합성의 단일가닥 산물로부터 획득될 수 있다.

핵산 서열에 적용될 때, 용어 "분리된 (isolated)"는 본 발명의 문맥에서 폴리뉴클레오타이드 서열이 자연적인 그의 유전적 환경으로부터 제거되었고 따라서 다른 외래의 또는 원치않는 코딩 서열들이 없으며 (그러나 프로모터들 및 종결인자들과 같은 자연적으로 생긴 5' 및 3' 미해독 영역들을 포함할 수 있고), 또한 유전적으로 조작된 단백질 생산 시스템들 내의 사용에 적합한 형태로 존재하는 것을 의미한다. 이러한 분리된 분자들은 자연적인 그들의 환경으로부터 분리된 것들이다.

핵산 서열들을 분리하는 방법들은 당해 기술분야에서 알려져 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열은 PCR과 같은 통상적인 클로닝 절차들에 의해 획득될 수 있거나, 핵산 합성 기계들을 사용하여 합성될 수 있다. 전장의 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 대안의 방식은, 예를 들어 글릭 및 파스테르낙 (Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applications of Recombinant DNA, (1994))에서 기술된 바와 같이, 특정된 한 벌의 중복된 (overlapping) 올리고뉴클레오타이드들 (예로, 40 내지 100개의 뉴클레오타이드들)을 합성하는 것이다. 전사 및 해독을 위한 적절한 개시 및 종결의 신호들을 포함하는 다른 서열들은 첨가될 수 있다.

유전 암호의 중복성 (degeneracy)의 견지에서, 상당한 서열 다양성이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들 중에서 가능하다. 주어진 아미노산에 대한 가능한 코돈들 모두를 포괄하는 중복 코돈들 (degenerate codons)은 하기에 설명되어 있다:

당업자라면 어떠한 모호성 (ambiguity)이 각 아미노산을 인코딩하는 가능한 코돈들 모두를 나타내는 중복 코돈을 결정하는 데 도입되는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 중복 서열에 의해 포괄되는 일정 폴리뉴클레오타이드들이 변이체 아미노산 서열들을 인코드할 수 있지만, 당업자라면 이러한 변이체 서열들을 본 발명의 아미노산 서열들을 참조하여 쉽게 확인할 수 있다.

"변이체 (variant)" 핵산 서열은 기준 핵산 서열 (또는 그의 단편)과 실질적인 상동성 또는 실질적인 유사성을 가진다. 핵산 서열 또는 그의 단편은 (적절한 뉴클레오타이드 삽입들 또는 결실들을 가짐) 다른 핵산 서열 (또는 그의 상보적인 가닥)과 최적으로 정렬할 때 뉴클레오타이드 서열 일치도가 적어도 70%, 75%, 80%, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 또는 99%의 뉴클레오타이드 염기들에서 존재하는 경우라면, 기준 서열과 "실질적으로 동종유래 (substantially homologous)" 이다 (또는 "실질적으로 일치한다 (substantially identical)). 상동성 결정은 폴리펩타이들의 경우에 상기에서 기술된 바와 같이 수행된다.

대안으로, "변이체" 핵산 서열은 "변이체" 및 기준 서열이 엄격한 (예로, 매우 엄격한) 혼성화 (hybridization) 조건들 하에서 혼성화할 수 있는 경우라면 기준 서열 (또는 그의 단편)과 실질적으로 동종유래이다 (또는 실질적으로 일치한다). 핵산 서열 혼성화는 당업자라면 바로 이해될 바와 같이, 염기 조성, 상보적 가닥들의 길이, 혼성화하는 핵산들 간의 뉴클레오타이드 염기 비매치들 (mismatches)의 수에 추가하여 염 농도 (예로, NaCl), 온도, 또는 유기용매들과 같은 조건들에 의해 영향을 받을 것이다. 바람직하게는 엄격한 온도 조건들이 사용되고, 일반적으로 30℃ 초과, 전형적으로 37℃ 초과, 또한 바람직하게는 45℃ 초과하는 온도를 포함한다. 엄격한 염 조건들은 보통 1000 mM 이하, 전형적으로 500 mM 이하, 또한 바람직하게는 200 mM 이하가 될 것이다. 매개변수들의 조합이 어떠한 단일 매개변수보다 훨씬 더 중요하다.

당업자라면 서로 다른 종이 "선호적 코돈 사용도 (preferentail codon usage)"를 나타내는 것을 이해하고 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "선호적 코돈 사용도"는 소정의 종의 세포들에서 각 아미노산을 인코딩하는 하나 또는 소수의 대표적인 가능한 코돈들을 선호하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈들을 말한다. 예를 들어, 아미노산 트레오닌 (Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT에 의해 인코드될 수 있지만, 포유동물 숙주 세포들에서는 ACC가 가장 보편적으로 사용되는 코돈이고; 다른 종들에서는 다른 Thr 코돈들이 선호될 수 있다. 특정한 숙주세포 종을 위한 선호적 코돈들은 당해 기술분야에서 알려져 있는 다양한 방법들에 의해 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들 내로 도입될 수 있다. 코돈-최적화를 위한 통상적인 방법들은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있으며 일반 당업자의 수준에 속하는 일상적인 기법들이다. 예로서, 특정한 숙주에서 발현을 위해 관심 있는 서열을 코돈-최적화하는 무료로 입수가능한 소프트웨어 도구들이 많이 존재한다. 옵티마이저 (OPTIMIZER)는 바로 이러한 도구이고 http://genomes.urv.es/OPTIMIZER (Puigbo et al. Nucl. Acids Res. (2007) 35 (suppl 2): W126-W131)에서 입수가능하다. 예를 들어, 재조합 DNA 내로 선호적 코돈 서열들의 도입은 특정한 세포 유형 또는 종 내에서 단백질 해독을 더욱 효율적으로 만들어 단백질의 생산을 증진시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 구현예에서, 핵산 서열은 숙주세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다.

관심 있는 폴리뉴클레오타이드의 "단편"은 상기 전장의 폴리뉴클레오타이드의 서열로부터 나온 일련의 연속된 아미노산 잔기들을 포함한다. 예로서, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드의 "단편"은 상기 폴리펩타이드의 서열로부터 나온 적어도 30개의 연속된 핵산 잔기들 (예로, 상기 폴리뉴클레오타이드의 적어도 35, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 또는 1200개의 연속된 핵산 잔기들)을 포함할 수 있다 (또는 이들로 구성될 수 있다). 단편은 적어도 하나의 항원 결정기를 포함할 수 있고 및/또는 해당하는 관심 있는 폴리펩타이드의 적어도 하나의 항원성 에피토프를 인코드할 수 있다.

관심 있는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그의 변이체 또는 단편은 공통적인 항원 교차-반응성 및/또는 기준 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 생체내 생물학적 활성을 가지는 폴리펩타이드를 인코드할 수 있다.

예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 (또는 단편 또는 변이체)에 의해 인코드되는 폴리폴리펩타이드들 및 기준 폴리펩타이드는 이전에 마이코박테리아성 감염의 항원성 성분에 노출되었던 T-림프구 (예로, CD4+, CD8+, 효과기 T 세포 또는 TEM 또는 TCM과 같은 기억 T 세포)의 "회상 반응"를 유도하는 공통적인 능력을 공유하고 있다.

T 세포 반응들을 측정하고 정량하는 새로운 면역학적 검정법들이 지난 10년에 걸쳐서 확립되어 왔다. 예를 들어, 인터페론-감마 (IFN-γ) 엘리스폿 검정법은 항원-특이 T 세포들로부터 나온 INF-γ의 분비가 M. 투버쿨로시스에 대항한 보호와 상호관련되기 때문에 면역학적 결과로서 유용하다. 또한, 엘리스폿 (ELISPOT) 검정법은 매우 재현가능하고 민감한, IFN-γ 분비하는 항원-특이 T 세포들의 수를 정량하는 방법이다.

대안으로 또는 추가적으로, 관심 있는 폴리뉴클레오타이드, 또는 단편 또는 변이체에 의해 인코드되는 폴리펩타이드와 결합가능한 항체도 역시 기준 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드와 결합가능할 수 있다.

서열번호들에 관한 사항

서열번호 1 하이브리드 C4bp 올리고중합 도메인 아미노산 서열 (IMX313);

서열번호 2 펩타이드 IMX313를 인코딩하는 하이브리드 C4bp 올리고중합 도메인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 3 마이코박테리아 펩타이드 85A/Rv3804c;

서열번호 4 마이코박테리아 펩타이드 85B/Rv1886c;

서열번호 5 마이코박테리아 펩타이드 85C/Rv0129c;

서열번호 6 마이코박테리아 펩타이드 ESAT6/Rv3875;

서열번호 7 마이코박테리아 펩타이드 TB10.4/Rv0288;

서열번호 8 마이코박테리아 펩타이드 Rv0125;

서열번호 9 마이코박테리아 펩타이드 PPE18/Rv1196;

서열번호 10 마이코박테리아 펩타이드 P27/Rv1411c;

서열번호 11 마이코박테리아 펩타이드 HSP65/Rv0440;

서열번호 12 마이코박테리아 펩타이드 HBHA/Rv0475;

서열번호 13 마이코박테리아 펩타이드 Rv2659c;

서열번호 14 마이코박테리아 펩타이드 Rv2660c;

서열번호 15 마이코박테리아 펩타이드 HpX/Rv2031c;

서열번호 16 마이코박테리아 펩타이드 RPFA/Rv0867c;

서열번호 17 마이코박테리아 펩타이드 RPFB/Rv1009;

서열번호 18 마이코박테리아 펩타이드 RPFC/Rv1884c;

서열번호 19 마이코박테리아 펩타이드 RPFD/Rv2389c;

서열번호 20 마이코박테리아 펩타이드 RPFE/Rv2450c;

서열번호 21 마이코박테리아 펩타이드 Rv1733c;

서열번호 22 마이코박테리아 펩타이드 Rv2029c;

서열번호 23 마이코박테리아 펩타이드 Rv2032;

서열번호 24 마이코박테리아 펩타이드 Rv2626c;

서열번호 25 마이코박테리아 펩타이드 Rv2627c;

서열번호 26 마이코박테리아 펩타이드 Rv2628;

서열번호 27 펩타이드 85A를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 28 펩타이드 85B를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 29 펩타이드 85C를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 30 펩타이드 ESAT6을 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 31 펩타이드 TB10.4를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 32 펩타이드 Rv0125를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 33 펩타이드 Rv1196을 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 34 펩타이드 Rv1411을 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 35 펩타이드 HSP65를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 36 펩타이드 HBHA를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 37 펩타이드 Rv2659c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 38 펩타이드 Rv2660c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 39 펩타이드 HspX/Rv2031c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 40 펩타이드 RPFA/Rv0867c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 41 펩타이드 RPFB/Rv1009를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 42 펩타이드 RPFC/Rv1884c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 43 펩타이드 RPFD/Rv2389c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 44 펩타이드 RPFE/Rv2450c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 45 펩타이드 Rv1733c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 46 펩타이드 Rv2029c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 47 펩타이드 Rv2032를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 48 펩타이드 Rv2626c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 49 펩타이드 Rv2627c를 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 50 펩타이드 Rv2628을 인코딩하는 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 51 펩타이드 85A를 인코딩하는 코돈-최적화된 마이코박테리아 폴리뉴클레오타이드;

서열번호 52 서열번호 51에 의해 인코드되는 마이코박테리아 펩타이드 85A;

서열번호 53 펩타이드 IMX313을 인코딩하는 코돈-최적화된 하이브리드 C4bp 올리고중합 도메인 폴리뉴클레오타이드 서열;

서열번호 54 gly-ser 링커를 가진 마이코박테리아 펩타이드 85A 및 IMX313 펩타이드의 융합 단백질을 인코딩하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열;

서열번호 55 서열번호 55에 의해 인코드되는 gly-ser 링커를 가진 마이코박테리아 펩타이드 85A 및 IMX313 펩타이드의 융합 단백질;

서열번호 56 서열번호 27의 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열.

(이하 서열목록 참조)

도 1은 Balb/c 마우스에서 DNA 검색을 나타낸 것이다.
Balb/c 마우스는 50 μg의 DNA-85A 또는 DNA-85AIMX313로 0 및 2주째에 근육내로 (i.m.)로 면역화되었다. 엘리스폿 (ELISpot)이 각 개별적 펩타이드의 각각의 백신접종 12일 이후에 (패널 a) 혈액에서 또한 최종 백신접종 14일 이후에 비장에서 함께 p15 및 p11에 대한 반응을 측정하는 데 사용되었다.
도 2는 Balb/c 마우스에서 MVA 검색을 나타낸 것이다.
Balb/c 마우스는 106개 PFU의 MVA-85A 또는 MVA-85AIMX313로 근육내 (패널 a) 또는 피부내 (i.d.) (패널 b) 경로를 통하여 0일째에 면역화되었고 1주 이후에 모든 동물들의 비장에서 p15 및 p11에 대한 반응이 측정되었다.
Balb/c 마우스는 106개 PFU의 MVA-85A 또는 MVA-85AIMX313로 0 또는 2주째에 면역화되었다. 세포내 사이토카인 염색이 감작 또는 추가자극 백신접종 1주 이후에 혈액 시료들 상에서 수행되었다. 그래프들은 IFN-ν 생산하는 CD4+ (패널 c) 또는 CD8+ (패널 d) 세포들의 빈도를 나타낸다.
모든 그래프들의 경우에, 막대는 단일점으로서 표시된 각 개별 동물을 가진 그룹 당 평균을 나타낸다.
도 3은 항원 85A에 대한 IFN-ν 엘리스폿 반응들을 나타낸 것이다.
수컷 레서스 머카크 원숭이들이 106개 PFU의 MVA-85A 또는 MVA-85AIMX313로 0 또는 6주째에 면역화되었고 항원 85A에 대한 반응이 IFN-γ 엘리스폿에 의해 백신접종 이전에 (미리) 또한 백신접종 1주부터 2주에 한 번씩 측정되었다. 그래프들은 MVA-85A (패널 a 및 d) 또는 MVA-85AIMX313 (패널 b 및 e)로 면역화된 동물들의 경우에 모든 85A 펩타이드들을 포함하는 단일 풀 (패널 a 및 b) 또는 7가지의 분리된 펩타이드 풀들의 총합에 대한 각 개별 동물의 반응을 나타낸다.
패널 c 및 f: 그래프들은 백신접종 이후 1주 또는 7주에 85A (패널 c) 또는 모든 풀들의 총합 (패널 f)에 대한 그룹 반응을 나타낸다. 막대들은 단일점으로서 표시된 각 동물을 가진 그룹의 중앙값 반응을 나타낸다.
패널 g 및 h: 그래프는 1주 (패널 g) 또는 7주 (패널 h)에 각 펩타이드 풀에 대한 반응을 풀 반응 총합의 백분율로서 나타낸다. 막대들은 단일점으로서 표시된 각 동물을 가진 그룹 당 중앙값 반응을 나타낸다.
도 4는 백신의 추가자극 1주 이후에 사이토카인 분비를 나타낸 것이다.
7주 냉동된 PBMCs 시료들이 재자극 이전에 하룻밤 동안 해동되었고, 항-CD28, 항-CD49d 및 2 μg의 항원 85A 펩타이드들의 존재 시 자극의 최종 4시간 동안 골지-플러그 (golgi-plug) 및 골지-스탑 (golgi-stop)을 첨가하면서 6시간 동안 배양되었다. 시료들은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 고정 및 세포내 염색 이전에 CD4, CD8, CD3, CD45RA, CD95, CD14 및 CD20에 대해 표면 염색되었다. 시료들은 CD4+ 및 CD8+ 세포들로 분리, 빈도의 분석 및 각 사이토카인의 평균 형광 강도 이전에 크기 상으로 CD14- 및 CD20-, CD3+ 게이팅되었다. 항원 특이 사이토카인 생산의 빈도는 미자극된 대조군에서 사이토카인 양성 세포들의 빈도를 차감한 이후에 결정되었다. 통합된 평균 형광 강도는 MFI로 빈도를 곱하고 다음으로 해당하는 미자극된 대조군으로부터 iMFI를 차감하여 계산되었다.
도 5는 백신접종의 추가자극 1주 이후에 사이토카인 반응의 다중기능성을 나타낸 것이다.
도 4에서 기술된 바와 동일한 시료들에서, 3가지 사이토카인들 각각에 대한 반응이 1가지의 단일 사이토카인, 2가지 사이토카인들 또는 모두 3가지 사이토카인들의 조합을 만드는 세포들의 빈도 및 비율을 결정하도록 동시에 분석되었다.
패널 a 및 c: 파이 도표는 모두 3가지의 사이토카인들 (검은색), 2가지 사이토카인들 (어두운 회색)의 조합 또는 단 1가지 사이토카인 (밝은 회색)을 생산하는, 사이토카인 생산하는 세포들 CD4+ (패널 a) 또는 CD8+ (패널 c)의 비율을 나타낸다.
패널 b 및 d: CD4+ (패널 b) 또는 CD8+ (패널 d) 세포들의 전반적인 집단과 대비하여 사이토카인 생산하는 세포들의 각 집단의 빈도를 나타낸다. 막대들은 단일점으로서 표시된 각 동물을 가진 그룹 당 중앙값 반응을 나타낸다.
도 6은 사이토카인 생산하는 세포들의 효과기 및 기억 소집단들 내에서의 분포를 나타낸 것이다.
도 4에서 기술된 동일한 시료들에서, 사이토카인 생산하는 세포들 (IFN-γ+, 또는 TNF-α+ 또는 IL-2+ 세포들)은 좀 더 나아가 CD45RA+, CD95- T 효과기 세포들 (Teff), CD45RA+ CD95+ T 효과기 기억 세포들 (Tem) 또는 CD45RA-, CD95+ T 중앙 기억 세포들로 세분화되었다. 그래프들은 각 집단에서 CD4+ (패널 a) 또는 CD8+ (패널 c) Teff, Tem, Tcm의 절대적 빈도 또는 사이토카인 생산하는 CD4+ (패널 b) 또는 CD8+ (패널 d) 세포들의 비율을 나타낸다. 선들은 단일점으로서 표시된 각 동물을 가진 그룹 당 중앙값 반응을 나타낸다.
도 7은 두 가지 말라리아 항원들을 가진 IMX313를 나타낸 것이다.
패널 a: Balb/c 마우스가 IFN-γ 엘리스폿에 의해 항원 특이 (Pb6) 세포들의 빈도를 결정하도록 50 μg의 DNA-meTRAP 또는 DNA-meTRAPIMX313을 사용하여 0 또는 2주째에 근육내로 면역화되었고 2주 이후에 비장에 수확되었다.
패널 b: Balb/c 마우스가 두 번의 분리된 용량 (5 x 10⁵ 또는 5 x 10⁴ ihu)으로 AdCh63-meTRAP 또는 AdCh63-meTRAPIMX313 둘 중 하나를 사용하여 피부내 면역화되었다. 비장 엘리스폿이 항원 특이 INF-γ 생산하는 세포들의 빈도를 결정하도록 면역접종 2주 이후에 수행되었다.
패널 c: Balb/c 마우스가 IFN-γ 엘리스폿에 의해 항원 특이 (Pb6) 세포들의 빈도를 결정하도록 50 μg의 DNA-CSN 또는 DNA-CSNIMX313을 사용하여 0 또는 2주째에 근육내로 면역화되었고 2주 이후에 비장에 수확되었다.
패널 d: Balb/c 마우스가 두 번의 분리된 용량 (10⁸ 또는 5 x 10⁶ ihu)으로 AdCh63-CSN 또는 AdCh63-CSNIMX313 둘 중 하나를 사용하여 근육내로 면역화되었다. 비장 엘리스폿이 항원 특이 INF-γ 생산하는 세포들의 빈도를 결정하도록 면역접종 2주 이후에 수행되었다.

본 발명은 다음의 실시예들에 의해 좀 더 명확해질 것이고, 이는 본 발명을 순수하게 예시하는 것이고 결코 제한하려는 것이 아니다.

실시예들

실시예 1 - 85 AIMX313 융합 단백질들을 발현하는 플라스미드들의 제작

C4bp 올리고중합 도메인들은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 마우스, 닭 및 인간 C4bp 올리고중합 도메인들을 포함하는 다양한 C4bp 올리고중합 도메인들의 클로닝, 발현 및 정제는 당해 기술분야에서 보편적인 것이다 (예를 들어, 국제특허출원 제 WO 08/122817호, 유럽특허 제 EP 1795540호 및 국제특허출원 제 WO 91/11461호를 참조하라).

pSG2 -85A313의 제작

IMX313 도메인을 인코딩하는 DNA가 PCR 및 다음의 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 플라스미드 pIMX313로부터 증폭되었다:

oIMX1027

5' gaagcccgacctgcaacgt ggatcc aagaagcaaggtgatgctgatg 3'

oIMX1028

5' gggccctctagatgcatgctcgagcggccgcttattactccttgctcagtccttgc 3'

다음으로 229개 염기쌍의 PCR 산물이 DNA 백신접종 벡터 pSG2-85A (Taracha et al . Infect Immun 71, 6904; 2003에 기술됨) 내에 가이저 들에 의해 기술된 부위-유도된 돌연변이화를 사용하여 삽입되었다 (Geiser et al., Biotechniques 31, 88; 2001). 이것은 85A 해독 구조틀의 C-말단 (및 TGA 종결 코돈)에 있는 9개의 아미노산 에피토프를 IMX313 도메인 (및 두 개의 TAA 종결 코돈들)을 인코딩하는 DNA로 대체시켰다. 85AIMX313 융합 단백질을 인코딩하는 서열 전부는 DNA 서열결정 (DNA sequencing)에 의해 검증되었다.

pMVA - GFP - TD -85A313의 제작

플라스미드 pSG2-85A313가 AgeI으로 부분적으로 소화되었고 다음으로 NotI을 사용한 완전 소화로 이어졌다. 85AIMX313 해독 구조틀을 인코딩하는 DNA가 젤 정제 의해 획득되었고, 다음으로 젤 정제되기 이전에 AgeI 및 NotI으로 소화되고 (완전하게) 탈인산화되었던 백시니아 전달 벡터 pMVA-GFP-TD 내로 라이게이션되었다. 이것은 표준 방법들이 MVA 내의 TK 좌위 내로 플라스미드 삽입자를 전달하는 데 사용된 이후에 백시니아 P7.5 프로모터로부터 85AIMX313 융합 단백질의 발현을 가져온다. 벡터 골격과 85AIMX313 해독 구조틀 (open reading frame) 전부를 가지는 삽입자의 연결들은 DNA 서열결정에 의해 검증되었다.

실시예 2 - 마이코박테리아 항원 85A와 융합된 IMX313 도메인의 클로닝 및 발현

IMX313 올리고중합 도메인을 인코딩하는 DNA 단편은 상기 실시예 1에서와 같이 증폭되고, PCR 산물은 제한효소들 BamHI 및 NotI으로 소화되고 동일한 제한효소들로 소화된 인비트로겐사 (Invitrogen)로부터 나온 pRsetA 벡터 내로 클론되어 플라스미드 pRsetA313가 만들어진다. 두 번째 PCR에서, 85A 항원이 플라스미드 pSG2-85A (상기 실시예 1을 참조하라)로부터 다음의 올리고뉴클레오타이드들을 사용하여 증폭된다:

85AN: 5' GGGGCATATGTTTTCCCGGCCGGGCTTGCCGGTGG 3' 및

85AC: 5' GGGGGGATCCGGCGCCCTGGGGCGCGGGCCCGGTGTT 3'

또한 PCR 산물은 제한효소들 NdeI 및 BamHI으로 소화되고 플라스미드 pRsetA313 내로 클론되어 pRset85A313가 만들어진다.

발현

플라스미드 pRsetA85A313는 대장균 균주 C41(DE3) 내로 형질전환된다. 형질전환된 세포들은 대략 0.6의 OD600까지 37℃에서 LB 배지로 배양되고, 다음으로 발현이 0.5 mM의 최종 농도로 IPTG를 사용하여 유도되며, 배양액은 세포들이 원심분리에 의해 수확되었던 시점까지 37℃에서 4시간 동안 좀 더 배양된다.

85 AIMX313 단백질의 정제

단백질 85AIMX313은 1 리터의 C41(DE3) 세포들로부터 정제된다. 모든 단백질이 20 mM MES pH 6.5, 5 mM EDTA 및 단백분해효소 저해제들 (로슈사)의 혼합물 (cocktail)을 포함하는 완충용액에서 파쇄하여 용해된 이후에 수용성 분획에서 발견된다. 원심분리 이후에 상청액은 HitrapS 컬럼 상에 로딩된다.

양이온성 컬럼 ( HiTrap S)

컬럼은 20 mM MES pH 6.5, 5 mM EDTA 완충용액 (완충용액 A)에서 평형화된다. 단백질은 완충용액 A로부터 완충용액 B (1 M NaCl을 첨가한 완충용액 A)까지 10배 컬럼 부피의 구배를 사용하여 용출된다. 85AIMX313를 포함하는 HiTrapS 분획들은 밀리포아 농축기 (Millipore concentrator, 컷-오프 30 K)를 사용하여 농축되고 다음으로 50 mM 트리스 pH 8 및 8 M 우레아를 포함하는 완충용액에서 10 mLs의 최종 부피로 하룻밤 동안 변성 이후에 젤 여과 컬럼 상에 로딩된다.

우레아 존재 시의 첫 번째 젤 여과 컬럼 ( 슈퍼덱스 200 26/60 제조 등급)

슈퍼덱스 200 26/60 (Superdex 200 26/60) 컬럼은 20 mM 트리스 완충용액 pH 8, 150 mM NaCl 및 8M 우레아로 평형화되고, HiTrapS 분획들로부터 나온 농축된 85AIMX313 단백질이 로딩된다. 85AIMX313를 포함하는 분획들은 풀링되고 밀리포아 농축기 (컷-오프 30 K)를 사용하여 농축되고, PBS로 평형화된 두 번째 슈퍼덱스 200 26/60 컬럼 상에 로딩된다.

두 번째 젤 여과 컬럼 ( 슈퍼덱스 200 26/60 제조 등급)

첫 번째 슈퍼덱스 200 26/60 컬럼으로부터 나온 농축된 85AIMX313 단백질이 로딩된다. 더 이상 변성되지 않은 단백질이 칠중체로서 용출되고 이를 포함하는 분획들이 풀링된다.

생물리학적 특성분석

85AIMX313 단백질의 올리고체 상태는 환원제 베타-머캅토에탄올 (BME)의 존재 시 및 부재 시 SDS-PAGE 젤 상에서 그의 행동을 비교하여 검토된다. 85AIMX313 단백질은 대략 150 kDa의 외관상 크기를 BME 부재 시 (소단위 내의 디설파이드 결합들이 공기에 노출에 이어서 형성된다) 가지는 한편, BME 존재 시에는 이것이 환원되어 22kDa를 넘는 외관상 크기로 진행된다 (디설파이드 결합들이 박테리아 세포질의 환원 환경에서는 형성될 수 없는 바와 같음).

85AIMX313 단백질의 의도된 용도들에 의존하여, 단백질은 좀 더 심화된 정제 단계들, 예를 들어 투석, 또는 농축 단계들 예를 들어 냉동 건조로 진행될 수 있고 또한 PBS에 넣어 투여되거나 아쥬반트들을 사용하여 제형화될 수 있다. 바람직하게, 100 마이크로그램까지의 단백질을 포함하는 적어도 두 번의 주사들이 적어도 2주 간격으로 피하적으로 주어질 것이다.

실시예 3 - 마우스 및 영장류에서 항원- IMX313 백신들의 결과들

동물들 및 면역접종

6주 이상 된 암컷 Balb/c 마우스 (하란, 영국)가 홈 오피스 동물들 규정 프로젝트 라이센스 (Home Office Animals Act Project License)에 따라 사용되었다. 마우스는 정강근 (musculus tibialis) 내의 근육내로 (i.m.) 또는 귀 내의 피부내로 (id) PBS에 희석된 전체 부피 50 μg의 DNA 또는 MVA를 사용하여 면역화되었다. DNA 면역접종을 위하여 마우스는 면역접종 당 50 μg의 DNA를 수여받았고, 또한 MVA 백신접종들을 위해 마우스는 면역접종 당 10⁶개의 플라크 형성 단위 (PFU)를 수여받았다.

2.5 내지 6년 된 수컷 레서스 머카크 원숭이들은 삼각근 (deltoid muscle) 내로 (팔들은 번갈아 백신접종되었음) 0 및 6주째에 10⁸ PFU의 MVA로 (arms were switched between vaccinations) 2번 면역접종 받았다. PBMCs 분리를 위해 15 mLs의 혈액 또한 혈청을 위해 5 mLs의 혈액이 이후 1주부터 2주에 한 번 수집되었다. 혈액 시료들은 연속적인 공정 및 검정법들을 위해 상온에서 보관된다.

IMX313 도메인과 85A의 융합은 마우스에서 CD4 및 CD8 반응들을 증진한다.

항원 85A에 대한 면역 반응을 증진하는 IMX313 도메인의 능력을 평가하기 위하여, DNA 및 MVA 벡터들을 사용한 초기 검색 실험들이 마우스에서 수행되었다. 우세한 CD4 (p15) 및 CD8 (p11) 에피토프들에 대한 반응에서의 증가가 단일 면역접종 이후 혈액에서 관찰되었고 (도 1a), 이는 두 번째 면역접종 이후에 좀 더 증진되었다 (도 1a). 비장에서, CD4 (p15) 반응의 약간 증가가 관찰되었고 (도 1b) 본 증진은 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었던 (p = 0.0082) p11 특이 반응 (CD8)에서 더 두드러졌다 (도 1b).

MVA 벡터들을 사용한 면역접종은 IMX313과의 융합에 의해 85A에 대한 반응의 유사한 증진을 보여주었다. MVA-85AIMX313를 사용한 근육내 백신접종 1주 이후에, 비장에서 p15 및 p11 특이 반응들에서 통계적으로 유의한 증가들이 관찰되었고 (도 2a), 유사한 증진이 마우스가 피부내 경로에 의해 면역화될 때도 역시 관찰되었다 (도 2b). DNA 백신들의 감작-추가자극 데이타와 일치하도록, 단일 면역접종 이후에 관찰된 85A에 대한 반응의 증진이 두 번째 동종유래의 면역접종 이후에 좀 더 증진되었다 (도 2c, 2d).

MVA -85 AIMX313 은 레서스 머카크 원숭이들에서 면역 반응을 증진한다.

마우스에서 관찰된 IMX313과 융합의 유의한 아쥬반트 능력으로부터 이어서, MVA-85A 및 MVA-85AIMX313 백신들에 대한 면역 반응이 레서스 머카크 원숭이들에서 비교되었다. 동물들은 0주 및 6주째에 IFN-γ 엘리스폿에 의해 측정된 항원 85A에 대한 반응으로 근육내 면역화되었다. 전체 85A 풀 또는 펩타이드 풀들의 총합에 대한 반응에서 피크가 각 백신접종을 이어서 1주에 관찰되었다 (도 3). 각 백신접종 이후에 피크 반응들을 비교할 때, 둘 다의 백신접종 이후 MVA-85A 단독과 대비하여 더 높은 중앙값 85A 전체 풀 반응이 MVA-85AIMX313 융합으로 백신접종된 동물들에서 두 번째 면역접종 이후 관찰된 가장 큰 배수의 증가로 (1.86배 감작 대비 4.40배 추가자극) 관찰되었다 (도 3c). 85A 펩타이드 풀들의 총합에 대한 유사한 중앙값 반응이 1주째에 관찰되었고, 중앙값 반응에서 6.9배 증가가 MVA-85AIMX313로 면역화된 동물들 그룹에서 두 번째 백신접종 1주 이후에 관찰되었다 (도 3f). 항원 85A 펩타이드 풀들에 대한 반응의 깊이 (breadth)를 비교할 때, 85A 또는 85AIMX313로 면역화된 동물들 간의 차이가 1주 또는 7주째에 보이질 않았다 (도 3).

유동세포측정 분석법 (flow cytometry analysis)이 이들 동물들의 항원 특이 반응을 좀 더 조사하는 데 사용되었다. 이들 동물들을 추가자극하고 1주 이후에, IFN-γ, TNF-α 및 IL-2의 더 높은 빈도로의 경향성이 MVA-85AIMX313로 면역화된 머카크 원숭이들 그룹에서 관찰되었다 (도 4). 세포를 기초로 하여, 본 동일한 그룹에서의 동물들은 평균 형광 강도에 의해 측정된 바와 같이 더 높은 양들의 각 사이토카인을 생산하였다 (도 4).

MVA-85AIMX313로 면역화된 동물들에서 사이토카인 분비하는 세포들의 더 높은 빈도의 경향성은 1, 2 또는 3가지의 동시적 사이토카인들의 어느 하나를 생산하는 세포들의 다중기능적 집단들 각각의 경우에서도 역시 사이토카인 생산하는 세포들의 두 집단 간에 관찰되는 각 아형으로의 동등한 분포를 사용하여 관찰되었다 (도 5). 사이토카인 생산하는 세포들의 효과기 및 기억 표현형의 분석 시, MVA-85AIMX 313으로 면역화된 동물들은 CD4 또는 CD8 세포들의 전반적인 집단과 대비하여 (도 5) T 세포 아형들 각각의 빈도에서 전반적인 증가를 이들 아형들 각각의 비율을 변경하지 않고도 가졌다 (도 5). 요약하면, MVA-85AIMX313으로 면역접종은 특정한 사이토카인 생산하는 집단 또는 효과기/기억 소집단 둘 중 하나에 대한 반응의 질을 변화시키지 않고도 항원 특이 세포들의 전반적인 빈도를 증가시켰다. 또한, 머카크 원숭이들에서 관찰된 반응의 깊이 및 다중기능성은 MVA-85A로 면역화된 인간 지원자들에서 관찰되는 반응과 탁월한 유사성을 보여준다. 본 증거를 근거로 하여, 우리는 MVA-85AIMX313가 인간들에서 유사한 아쥬반트 능력을 가지고 질적인 변경 없이도 반응의 수준을 증진시킬 것이라고 예상할 수 있다.

IMX313 는 플라스모듐 팔시파룸 으로부터 나온 말라리아 항원 CS 및 meTRAP 에 대한 면역 반응을 증진하지 못한다.

IMX313 도메인이 서로 다른 항원들에 대한 면역 반응을 증진하는 능력을 평가하기 위하여, IMX313은 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 서컴포자소체 단백질 (circumsporozoite protein, CS) 및 meTRAP으로부터 나온 두 가지의 서로 다른 항원들, 트롬보스폰딘-관련 부착 단백질 (Thrombospodin-Related Adhesion Protein, TRAP)과 융합된 다중-에피토프 가닥과 융합되었다. Balb/c 마우스가 근육내로 면역화되었고 2주 이후에 시료가 분석되었다. DNA 백신들에서 IMX313 융합들은 meTRAP (도 7a) 또는 CS (도 7c)에 대한 반응에서 증진을 보여주지 못하였다. 아데노바이러스에서 검색은 IMX313 아쥬반트 효과의 유사한 결여를 보여주었고; meTRAP (도 7b) 또는 CS (도 7d)에 대한 반응에서 증가는 테스트된 모든 백신 용량들에서 IMX313과 항원의 융합에 의해 전혀 관찰되지 않았다. 항원 85A에 대한 반응에서 지속적인 증가가 IMX313과의 융합에 의해 관찰되었던 반면 (도 1 내지 도 6), 지금까지 테스트된 두 가지의 말라리라 항원들의 경우 IMX313의 아쥬반트 효과가 DNA 또는 아데노바이러스 백신 형식에서 전혀 관찰되지 않았다.

실시예 4

85 AIMX313 융합 단백질을 발현하는 인간, 원숭이 및 침팬지 아데노바이러스 벡터들의 제작

아데노바이러스성 전달 벡터 pENTR4-LP는 스린드하 등 (Sridhar et al. 2008)에 기술되어 있고, 이는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다 ( J Virol. 2008, volume 82, pages 3822-3833). 85AIMX313 융합 단백질을 인코딩하는 상기 실시예 1에 기술된 AgeI (부분적)-NotI 단편은 pENTR4-LP의 AgeI 및 NotI 부위들 내로 클론된다. pIMX462라고 명명된 새로이 획득된 본 전달 벡터를 사용하여, 발현 제작물이 pAd/PL-DEST와 재조합되고 85AIMX313 융합 단백질을 발현하는 재조합 AdH5 아데노바이러스들이 생성된다.

마우스는 인용된 출판물에서 기술된 바와 같이 면역화되고 이들 마우스에서 CD4 및 CD8 면역 반응들이 상기 실시예 3에서 기술된 바와 같이 측정된다. 인간 아데노바이러스들 11, 26, 35, 48 및 50로부터 유래한 유사한 아데노바이러스성 벡터들이 둘 다 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 Lemckert et al. 2005 (J Virol. 2005, volume 79, pages 9694-9701) 및 Abbink et al. 2007 ( J Virol . 2007, volume 81, pages 4654-4663)의 출판물에서 인용된 방법들을 사용하여 제작된다. 원숭이 또는 침팬지 아데노바이러스성 벡터들을 제작하기 위하여, 예를 들어 파리나 등 (Farina et al ., J Virol . 2001, volume 75, pages 11603-11613), 및 로이 등 (Roy et al ., Hum Gene Ther . 2004, volume 15, pages 519-530)에 의해 출판된 것들과 유사하거나 일치하는 방법들이 사용된다. Farina et al. 2001은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.

상기-기술된 인간, 원숭이 및 침팬지 벡터들에서 85AIMX313 융합 단백질의 발현은 85A 펩타이드 단독으로의 발현과 대비하여 증진된 면역 반응 / 양성의 면역원성 결과들을 마우스 및 영장류 둘 다에서 유도한다.

SEQUENCE LISTING <110> ISIS Innovation Limited Imaxio SA Spencer, Alexandra J Cottingham, Matthew G Hill, Adrian V S Hill, Fergal <120> Mycobacterial Vaccines <130> D29951 <140> PCT/GB2010/051741 <141> 2010-10-15 <150> GB 0918154.6 <151> 2009-10-16 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 1 Lys Lys Gln Gly Asp Ala Asp Val Cys Gly Glu Val Ala Tyr Ile Gln 1 5 10 15 Ser Val Val Ser Asp Cys His Val Pro Thr Ala Glu Leu Arg Thr Leu 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ile Gln Lys Leu Lys Val Glu 35 40 45 Leu Gln Gly Leu Ser Lys Glu 50 55 <210> 2 <211> 171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 aagaagcaag gtgatgctga tgtgtgcgga gaggttgctt atattcagag cgtcgtctcc 60 gattgccacg tgcctacagc ggaactgcgt actctgctgg aaatacgaaa actcttcctg 120 gagattcaaa aactgaaggt ggaattgcaa ggactgagca aggagtaata a 171 <210> 3 <211> 338 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 3 Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met Ser Arg 1 5 10 15 Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly Leu Val 20 25 30 Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly 35 40 45 Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp Asp Ile 85 90 95 Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser Val Val 100 105 110 Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Gln Pro 115 120 125 Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu 130 135 140 Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val Lys Pro 145 150 155 160 Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser Ala Leu 165 170 175 Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly Ala Met 180 185 190 Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu Ile Gly 195 200 205 Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly 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Gly Val Ser 145 150 155 160 Pro Thr Gly Asn Ala Ala Val Gly Leu Ser Met Ser Gly Gly Ser Ala 165 170 175 Leu Ile Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Gln Gln Phe Pro Tyr Ala Ala Ser 180 185 190 Leu Ser Gly Phe Leu Asn Pro Ser Glu Gly Trp Trp Pro Thr Leu Ile 195 200 205 Gly Leu Ala Met Asn Asp Ser Gly Gly Tyr Asn Ala Asn Ser Met Trp 210 215 220 Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Lys Arg Asn Asp Pro Met Val Gln 225 230 235 240 Ile Pro Arg Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Ile Trp Val Tyr Cys Gly 245 250 255 Asn Gly Thr Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asp Asn Ile Pro Ala Lys Phe 260 265 270 Leu Glu Gly Leu Thr Leu Arg Thr Asn Gln Thr Phe Arg Asp Thr Tyr 275 280 285 Ala Ala Asp Gly Gly Arg Asn Gly Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly 290 295 300 Thr His Ser Trp Pro Tyr Trp Asn Glu Gln Leu Val Ala Met Lys Ala 305 310 315 320 Asp Ile Gln His Val Leu Asn Gly Ala Thr Pro Pro Ala Ala Pro Ala 325 330 335 Ala Pro Ala Ala 340 <210> 6 <211> 95 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 6 Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly 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Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro 50 55 60 Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr 65 70 75 80 Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln 85 90 95 Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro 100 105 110 Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu 115 120 125 Thr Leu Leu Lys Gly Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Glu Gln Ile Ala 130 135 140 Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile 145 150 155 160 Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu 165 170 175 Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg 180 185 190 Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Pro Glu Arg 195 200 205 Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys 210 215 220 Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Lys Pro 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Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu 450 455 460 Lys Val Arg Asn Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Ala Gln Thr Gly 465 470 475 480 Val Tyr Glu Asp Leu Leu Ala Ala Gly Val Ala Asp Pro Val Lys Val 485 490 495 Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu 500 505 510 Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Glu Lys Ala Ser 515 520 525 Val Pro Gly Gly Gly Asp Met Gly Gly Met Asp Phe 530 535 540 <210> 12 <211> 199 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 12 Met Ala Glu Asn Ser Asn Ile Asp Asp Ile Lys Ala Pro Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Ala Asp Leu Ala Leu Ala Thr Val Asn Glu Leu Ile 20 25 30 Thr Asn Leu Arg Glu Arg Ala Glu Glu Thr Arg Thr Asp Thr Arg Ser 35 40 45 Arg Val Glu Glu Ser Arg Ala Arg Leu Thr Lys Leu Gln Glu Asp Leu 50 55 60 Pro Glu Gln Leu Thr Glu Leu Arg Glu Lys Phe Thr Ala Glu Glu Leu 65 70 75 80 Arg Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Ala Thr Ser Arg Tyr Asn 85 90 95 Glu Leu Val Glu Arg Gly Glu Ala Ala Leu Glu Arg Leu Arg Ser Gln 100 105 110 Gln Ser Phe Glu Glu Val Ser Ala Arg Ala Glu Gly Tyr Val Asp Gln 115 120 125 Ala Val Glu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Gly Thr Val Ala Ser Gln Thr 130 135 140 Arg Ala Val Gly Glu Arg Ala Ala Lys Leu Val Gly Ile Glu Leu Pro 145 150 155 160 Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala 165 170 175 Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala 180 185 190 Ala Lys Lys Val Thr Gln Lys 195 <210> 13 <211> 375 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 13 Val Thr Gln Thr Gly Lys Arg Gln Arg Arg Lys Phe Gly Arg Ile Arg 1 5 10 15 Gln Phe Asn Ser Gly Arg Trp Gln Ala Ser Tyr Thr Gly Pro Asp Gly 20 25 30 Arg Val Tyr Ile Ala Pro Lys Thr Phe Asn Ala Lys Ile Asp Ala Glu 35 40 45 Ala Trp Leu Thr Asp Arg Arg Arg Glu Ile Asp Arg Gln Leu Trp Ser 50 55 60 Pro Ala Ser Gly Gln Glu Asp Arg Pro Gly Ala Pro Phe Gly Glu Tyr 65 70 75 80 Ala Glu Gly Trp Leu Lys Gln Arg Gly Ile Lys Asp Arg Thr Arg Ala 85 90 95 His Tyr Arg Lys Leu Leu Asp Asn His Ile Leu Ala Thr Phe Ala 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305 310 315 320 Ser Gly Ala Val Leu Ala Ala Ser Thr Gly Ala Thr Leu Ala Glu Leu 325 330 335 Met Gln Arg Leu Gly His Ser Thr Ala Gly Ala Ala Leu Arg Tyr Gln 340 345 350 His Ala Ala Lys Gly Arg Asp Arg Glu Ile Ala Ala Leu Leu Ser Lys 355 360 365 Leu Ala Glu Asn Gln Glu Met 370 375 <210> 14 <211> 75 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 14 Val Ile Ala Gly Val Asp Gln Ala Leu Ala Ala Thr Gly Gln Ala Ser 1 5 10 15 Gln Arg Ala Ala Gly Ala Ser Gly Gly Val Thr Val Gly Val Gly Val 20 25 30 Gly Thr Glu Gln Arg Asn Leu Ser Val Val Ala Pro Ser Gln Phe Thr 35 40 45 Phe Ser Ser Arg Ser Pro Asp Phe Val Asp Glu Thr Ala Gly Gln Ser 50 55 60 Trp Cys Ala Ile Leu Gly Leu Asn Gln Phe His 65 70 75 <210> 15 <211> 144 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 15 Met Ala Thr Thr Leu Pro Val Gln Arg His Pro Arg Ser Leu Phe Pro 1 5 10 15 Glu Phe Ser Glu Leu Phe Ala Ala Phe Pro Ser Phe Ala Gly Leu Arg 20 25 30 Pro Thr Phe Asp Thr Arg Leu Met Arg Leu Glu Asp Glu Met Lys Glu 35 40 45 Gly Arg Tyr Glu Val Arg Ala Glu Leu Pro Gly Val Asp Pro Asp Lys 50 55 60 Asp Val Asp Ile Met Val Arg Asp Gly Gln Leu Thr Ile Lys Ala Glu 65 70 75 80 Arg Thr Glu Gln Lys Asp Phe Asp Gly Arg Ser Glu Phe Ala Tyr Gly 85 90 95 Ser Phe Val Arg Thr Val Ser Leu Pro Val Gly Ala Asp Glu Asp Asp 100 105 110 Ile Lys Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Ser Val Ala Val 115 120 125 Ser Glu Gly Lys Pro Thr Glu Lys His Ile Gln Ile Arg Ser Thr Asn 130 135 140 <210> 16 <211> 407 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 16 Met Ser Gly Arg His Arg Lys Pro Thr Thr Ser Asn Val Ser Val Ala 1 5 10 15 Lys Ile Ala Phe Thr Gly Ala Val Leu Gly Gly Gly Gly Ile Ala Met 20 25 30 Ala Ala Gln Ala Thr Ala Ala Thr Asp Gly Glu Trp Asp Gln Val Ala 35 40 45 Arg Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ser Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr 50 55 60 Leu Gly Gly Leu Gln Phe Thr Gln Ser Thr Trp Ala Ala His Gly Gly 65 70 75 80 Gly Glu Phe Ala Pro Ser Ala Gln Leu Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile 85 90 95 Ala Val Gly Glu Arg Val Leu Ala Thr Gln Gly Arg Gly Ala Trp Pro 100 105 110 Val Cys Gly Arg Gly Leu Ser Asn Ala Thr Pro Arg Glu Val Leu Pro 115 120 125 Ala Ser Ala Ala Met Asp Ala Pro Leu Asp Ala Ala Ala Val Asn Gly 130 135 140 Glu Pro Ala Pro Leu Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Val 145 150 155 160 Glu Leu Ala Ala Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro 165 170 175 Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala 180 185 190 Pro Ala Asp Val Ala Pro Pro Val Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ala Pro 210 215 220 Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Val 245 250 255 Glu Leu Ala Val Asn Asp Leu Pro Ala Pro Leu Gly Glu Pro Leu Pro 260 265 270 Ala Ala Pro Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Asp Leu Ala Pro Ala Ser 275 280 285 Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Pro 290 295 300 Ala Glu Leu Ala Pro Pro Ala Pro Ala Asp Leu Ala Pro Pro Ala Ala 305 310 315 320 Val Asn Glu Gln Thr Ala Pro Gly Asp Gln Pro Ala Thr Ala Pro Gly 325 330 335 Gly Pro Val Gly Leu Ala Thr Asp Leu Glu Leu Pro Glu Pro Asp Pro 340 345 350 Gln Pro Ala Asp Ala Pro Pro Pro Gly Asp Val Thr Glu Ala Pro Ala 355 360 365 Glu Thr Pro Gln Val Ser Asn Ile Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln 370 375 380 Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val Cys Gly Asn Asp Ala Leu Asp Ser Leu 385 390 395 400 Ala Gln Pro Tyr Val Ile Gly 405 <210> 17 <211> 362 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 17 Met Leu Arg Leu Val Val Gly Ala Leu Leu Leu Val Leu Ala Phe Ala 1 5 10 15 Gly Gly Tyr Ala Val Ala Ala Cys Lys Thr Val Thr Leu Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Ala Met Arg Val Thr Thr Met Lys Ser Arg Val Ile Asp Ile 35 40 45 Val Glu Glu Asn Gly Phe Ser Val Asp Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Pro 50 55 60 Ala Ala Gly Val Gln Val His Asp Ala Asp Thr Ile Val Leu Arg Arg 65 70 75 80 Ser Arg Pro Leu Gln Ile Ser Leu Asp Gly His Asp Ala Lys Gln Val 85 90 95 Trp Thr Thr Ala Ser Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Met 100 105 110 Thr Asp Thr Ala Pro Ala Ala Ala Ser Arg Ala Ser Arg Val Pro Leu 115 120 125 Ser Gly Met Ala Leu Pro Val Val Ser Ala Lys Thr Val Gln Leu Asn 130 135 140 Asp Gly Gly Leu Val Arg Thr Val His Leu Pro Ala Pro Asn Val Ala 145 150 155 160 Gly Leu Leu Ser Ala Ala Gly Val Pro Leu Leu Gln Ser Asp His Val 165 170 175 Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ile Val Glu Gly Met Gln Ile Gln Val 180 185 190 Thr Arg Asn Arg Ile Lys Lys Val Thr Glu Arg Leu Pro Leu Pro Pro 195 200 205 Asn Ala Arg Arg Val Glu Asp Pro Glu Met Asn Met Ser Arg Glu Val 210 215 220 Val Glu Asp Pro Gly Val Pro Gly Thr Gln Asp Val Thr Phe Ala Val 225 230 235 240 Ala Glu Val Asn Gly Val Glu Thr Gly Arg Leu Pro Val Ala Asn Val 245 250 255 Val Val Thr Pro Ala His Glu Ala Val Val Arg Val Gly Thr Lys Pro 260 265 270 Gly Thr Glu Val Pro Pro Val Ile Asp Gly Ser Ile Trp Asp Ala Ile 275 280 285 Ala Gly Cys Glu Ala Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr Gly Asn Gly 290 295 300 Tyr Tyr Gly Gly Val Gln Phe Asp Gln Gly Thr Trp 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Ser Lys Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln 145 150 155 160 Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg 165 170 175 <210> 19 <211> 154 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 19 Met Thr Pro Gly Leu Leu Thr Thr Ala Gly Ala Gly Arg Pro Arg Asp 1 5 10 15 Arg Cys Ala Arg Ile Val Cys Thr Val Phe Ile Glu Thr Ala Val Val 20 25 30 Ala Thr Met Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Ser Thr Ile Ser Ser Lys 35 40 45 Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly 50 55 60 Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr 100 105 110 Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp 115 120 125 Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp 145 150 <210> 20 <211> 172 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 20 Leu Lys Asn Ala Arg Thr Thr Leu Ile Ala Ala Ala Ile Ala Gly Thr 1 5 10 15 Leu Val Thr Thr Ser Pro Ala Gly Ile Ala Asn Ala Asp Asp Ala Gly 20 25 30 Leu Asp Pro Asn Ala Ala Ala Gly Pro Asp Ala Val Gly Phe Asp Pro 35 40 45 Asn Leu Pro Pro Ala Pro Asp Ala Ala Pro Val Asp Thr Pro Pro Ala 50 55 60 Pro Glu Asp Ala Gly Phe Asp Pro Asn Leu Pro Pro Pro Leu Ala Pro 65 70 75 80 Asp Phe Leu Ser Pro Pro Ala Glu Glu Ala Pro Pro Val Pro Val Ala 85 90 95 Tyr Ser Val Asn Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn 100 105 110 Trp Ser Ile Asn Thr Gly Asn Gly Tyr Tyr Gly Gly Leu Arg Phe Thr 115 120 125 Ala Gly Thr Trp Arg Ala Asn Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ala Asn Ala 130 135 140 Ser Arg Glu Glu Gln Ile Arg Val Ala Glu Asn Val Leu Arg Ser Gln 145 150 155 160 Gly Ile Arg Ala Trp Pro Val Cys Gly Arg Arg Gly 165 170 <210> 21 <211> 210 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 21 Met Ile Ala Thr Thr Arg Asp Arg Glu Gly Ala Thr Met Ile Thr Phe 1 5 10 15 Arg Leu Arg Leu Pro Cys Arg Thr Ile Leu Arg Val Phe Ser Arg 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Leu Thr Met Asn Pro Ala Leu Asp Ile Thr Thr Ser Val Asp Val Val 20 25 30 Arg Pro Thr Glu Lys Met Arg Cys Gly Ala Pro Arg Tyr Asp Pro Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ile Asn Val Ala Arg Ile Val His Val Leu Gly Gly Cys 50 55 60 Ser Thr Ala Leu Phe Pro Ala Gly Gly Ser Thr Gly Ser Leu Leu Met 65 70 75 80 Ala Leu Leu Gly Asp Ala Gly Val Pro Phe Arg Val Ile Pro Ile Ala 85 90 95 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Phe Thr Val Asn Glu Ser Arg Thr Ala Lys 100 105 110 Gln Tyr Arg Phe Val Leu Pro Gly Pro Ser Leu Thr Val Ala Glu Gln 115 120 125 Glu Gln Cys Leu Asp Glu Leu Arg Gly Ala Ala Ala Ser Ala Ala Phe 130 135 140 Val Val Ala Ser Gly Ser Leu Pro Pro Gly Val Ala Ala Asp Tyr Tyr 145 150 155 160 Gln Arg Val Ala Asp Ile Cys Arg Arg Ser Ser Thr Pro Leu Ile Leu 165 170 175 Asp Thr Ser Gly Gly Gly Leu Gln His Ile Ser Ser Gly Val Phe Leu 180 185 190 Leu Lys Ala Ser Val Arg Glu Leu Arg Glu Cys Val Gly Ser Glu Leu 195 200 205 Leu Thr Glu Pro Glu Gln Leu Ala Ala Ala His Glu Leu Ile Asp Arg 210 215 220 Gly Arg Ala Glu Val Val Val Val Ser Leu Gly Ser Gln Gly Ala Leu 225 230 235 240 Leu Ala Thr Arg His Ala Ser His Arg Phe Ser Ser Ile Pro Met Thr 245 250 255 Ala Val Ser Gly Val Gly Ala Gly Asp Ala Met Val Ala Ala Ile Thr 260 265 270 Val Gly Leu Ser Arg Gly Trp Ser Leu Ile Lys Ser Val Arg Leu Gly 275 280 285 Asn Ala Ala Gly Ala Ala Met Leu Leu Thr Pro Gly Thr Ala Ala Cys 290 295 300 Asn Arg Asp Asp Val Glu Arg Phe Phe Glu Leu Ala Ala Glu Pro Thr 305 310 315 320 Glu Val Gly Gln Asp Gln Tyr Val Trp His Pro Ile Val Asn Pro Glu 325 330 335 Ala Ser Pro <210> 23 <211> 331 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 Met Pro Asp Thr Met Val Thr Thr Asp Val Ile Lys Ser Ala Val Gln 1 5 10 15 Leu Ala Cys Arg Ala Pro Ser Leu His Asn Ser Gln Pro Trp Arg Trp 20 25 30 Ile Ala Glu Asp His Thr Val Ala Leu Phe Leu Asp Lys Asp Arg Val 35 40 45 Leu Tyr Ala Thr Asp His Ser Gly Arg Glu Ala Leu Leu Gly Cys Gly 50 55 60 Ala Val Leu Asp His Phe Arg Val Ala Met Ala Ala Ala Gly Thr Thr 65 70 75 80 Ala Asn Val Glu Arg Phe Pro 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Leu Val Arg Val Gly Leu Ala 290 295 300 Pro Glu Met Glu Glu Pro Pro Pro Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ile Asp 305 310 315 320 Glu Val Phe His Val Arg Ala Lys Asp His Arg 325 330 <210> 24 <211> 143 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 Met Thr Thr Ala Arg Asp Ile Met Asn Ala Gly Val Thr Cys Val Gly 1 5 10 15 Glu His Glu Thr Leu Thr Ala Ala Ala Gln Tyr Met Arg Glu His Asp 20 25 30 Ile Gly Ala Leu Pro Ile Cys Gly Asp Asp Asp Arg Leu His Gly Met 35 40 45 Leu Thr Asp Arg Asp Ile Val Ile Lys Gly Leu Ala Ala Gly Leu Asp 50 55 60 Pro Asn Thr Ala Thr Ala Gly Glu Leu Ala Arg Asp Ser Ile Tyr Tyr 65 70 75 80 Val Asp Ala Asn Ala Ser Ile Gln Glu Met Leu Asn Val Met Glu Glu 85 90 95 His Gln Val Arg Arg Val Pro Val Ile Ser Glu His Arg Leu Val Gly 100 105 110 Ile Val Thr Glu Ala Asp Ile Ala Arg His Leu Pro Glu His Ala Ile 115 120 125 Val Gln Phe Val Lys Ala Ile Cys Ser Pro Met Ala Leu Ala Ser 130 135 140 <210> 25 <211> 413 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 Met Ala Ser Ser Ala Ser Asp Gly Thr His Glu Arg Ser Ala Phe Arg 1 5 10 15 Leu Ser Pro Pro Val Leu Ser Gly Ala Met Gly Pro Phe Met His Thr 20 25 30 Gly Leu Tyr Val Ala Gln Ser Trp Arg Asp Tyr Leu Gly Gln Gln Pro 35 40 45 Asp Lys Leu Pro Ile Ala Arg Pro Thr Ile Ala Leu Ala Ala Gln Ala 50 55 60 Phe Arg Asp Glu Ile Val Leu Leu Gly Leu Lys Ala Arg Arg Pro Val 65 70 75 80 Ser Asn His Arg Val Phe Glu Arg Ile Ser Gln Glu Val Ala Ala Gly 85 90 95 Leu Glu Phe Tyr Gly Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys Pro Ser Gly Phe 100 105 110 Phe Ala Gln Pro Pro Pro Leu Thr Glu Val Ala Val Arg Lys Val Lys 115 120 125 Asp Arg Arg Arg Ser Phe Tyr Arg Ile Phe Phe Asp Ser Gly Phe Thr 130 135 140 Pro His Pro Gly Glu Pro Gly Ser Gln Arg Trp Leu Ser Tyr Thr Ala 145 150 155 160 Asn Asn Arg Glu Tyr Ala Leu Leu Leu Arg His Pro Glu Pro Arg Pro 165 170 175 Trp Leu Val Cys Val His Gly Thr Glu Met Gly Arg Ala Pro Leu Asp 180 185 190 Leu Ala Val Phe Arg Ala Trp Lys Leu His Asp Glu Leu Gly Leu Asn 195 200 205 Ile Val Met Pro Val Leu Pro Met His Gly Pro Arg Gly Gln Gly Leu 210 215 220 Pro Lys Gly Ala Val Phe Pro Gly Glu Asp Val Leu Asp Asp Val His 225 230 235 240 Gly Thr Ala Gln Ala Val Trp Asp Ile Arg Arg Leu Leu Ser Trp Ile 245 250 255 Arg Ser Gln Glu Glu Glu Ser Leu Ile Gly Leu Asn Gly Leu Ser Leu 260 265 270 Gly Gly Tyr Ile Ala Ser Leu Val Ala Ser Leu Glu Glu Gly Leu Ala 275 280 285 Cys Ala Ile Leu Gly Val Pro Val Ala Asp Leu Ile Glu Leu Leu Gly 290 295 300 Arg His Cys Gly Leu Arg His Lys Asp Pro Arg Arg His Thr Val Lys 305 310 315 320 Met Ala Glu Pro Ile Gly Arg Met Ile Ser Pro Leu Ser Leu Thr Pro 325 330 335 Leu Val Pro Met Pro Gly Arg Phe Ile Tyr Ala Gly Ile Ala Asp Arg 340 345 350 Leu Val His Pro Arg Glu Gln Val Thr Arg Leu Trp Glu His Trp Gly 355 360 365 Lys Pro Glu Ile Val Trp Tyr Pro Gly Gly His Thr Gly Phe Phe Gln 370 375 380 Ser Arg Pro Val Arg Arg Phe Val Gln Ala Ala Leu Glu Gln Ser Gly 385 390 395 400 Leu Leu Asp Ala Pro Arg Thr Gln Arg Asp Arg Ser Ala 405 410 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 26 Met Ser Thr Gln Arg Pro Arg His Ser Gly Ile Arg Ala Val Gly Pro 1 5 10 15 Tyr Ala Trp Ala Gly Arg Cys Gly Arg Ile Gly Arg Trp Gly Val His 20 25 30 Gln Glu Ala Met Met Asn Leu Ala Ile Trp His Pro Arg Lys Val Gln 35 40 45 Ser Ala Thr Ile Tyr Gln Val Thr Asp Arg Ser His Asp Gly Arg Thr 50 55 60 Ala Arg Val Pro Gly Asp Glu Ile Thr Ser Thr Val Ser Gly Trp Leu 65 70 75 80 Ser Glu Leu Gly Thr Gln Ser Pro Leu Ala Asp Glu Leu Ala Arg Ala 85 90 95 Val Arg Ile Gly Asp Trp Pro Ala Ala Tyr Ala Ile Gly Glu His Leu 100 105 110 Ser Val Glu Ile Ala Val Ala Val 115 120 <210> 27 <211> 1017 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 27 atgcagcttg ttgacagggt tcgtggcgcc gtcacgggta tgtcgcgtcg actcgtggtc 60 ggggccgtcg gcgcggccct agtgtcgggt ctggtcggcg ccgtcggtgg cacggcgacc 120 gcgggggcat tttcccggcc gggcttgccg gtggagtacc tgcaggtgcc gtcgccgtcg 180 atgggccgtg acatcaaggt ccaattccaa agtggtggtg ccaactcgcc cgccctgtac 240 ctgctcgacg gcctgcgcgc gcaggacgac ttcagcggct gggacatcaa caccccggcg 300 ttcgagtggt acgaccagtc gggcctgtcg gtggtcatgc cggtgggtgg ccagtcaagc 360 ttctactccg actggtacca gcccgcctgc ggcaaggccg gttgccagac ttacaagtgg 420 gagaccttcc tgaccagcga gctgccgggg tggctgcagg ccaacaggca cgtcaagccc 480 accggaagcg ccgtcgtcgg tctttcgatg gctgcttctt cggcgctgac gctggcgatc 540 tatcaccccc agcagttcgt ctacgcggga gcgatgtcgg gcctgttgga cccctcccag 600 gcgatgggtc ccaccctgat cggcctggcg atgggtgacg ctggcggcta caaggcctcc 660 gacatgtggg gcccgaagga ggacccggcg tggcagcgca acgacccgct gttgaacgtc 720 gggaagctga tcgccaacaa cacccgcgtc tgggtgtact gcggcaacgg caagccgtcg 780 gatctgggtg gcaacaacct gccggccaag ttcctcgagg gcttcgtgcg gaccagcaac 840 atcaagttcc aagacgccta caacgccggt ggcggccaca acggcgtgtt cgacttcccg 900 gacagcggta cgcacagctg ggagtactgg ggcgcgcagc tcaacgctat gaagcccgac 960 ctgcaacggg cactgggtgc cacgcccaac accgggcccg cgccccaggg cgcctag 1017 <210> 28 <211> 978 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 28 atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca 60 gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg 120 ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgc 180 gacatcaagg ttcagttcca gagcggtggg aacaactcac ctgcggttta tctgctcgac 240 ggcctgcgcg cccaagacga ctacaacggc tgggatatca acaccccggc gttcgagtgg 300 tactaccagt cgggactgtc gatagtcatg ccggtcggcg ggcagtccag cttctacagc 360 gactggtaca gcccggcctg cggtaaggct ggctgccaga cttacaagtg ggaaaccttc 420 ctgaccagcg agctgccgca atggttgtcc gccaacaggg ccgtgaagcc caccggcagc 480 gctgcaatcg gcttgtcgat ggccggctcg tcggcaatga tcttggccgc ctaccacccc 540 cagcagttca tctacgccgg ctcgctgtcg gccctgctgg acccctctca ggggatgggg 600 cctagcctga tcggcctcgc gatgggtgac gccggcggtt acaaggccgc agacatgtgg 660 ggtccctcga gtgacccggc atgggagcgc aacgacccta cgcagcagat ccccaagctg 720 gtcgcaaaca acacccggct atgggtttat tgcgggaacg gcaccccgaa cgagttgggc 780 ggtgccaaca tacccgccga gttcttggag aacttcgttc gtagcagcaa cctgaagttc 840 caggatgcgt acaacgccgc gggcgggcac aacgccgtgt tcaacttccc gcccaacggc 900 acgcacagct gggagtactg gggcgctcag ctcaacgcca tgaagggtga cctgcagagt 960 tcgttaggcg ccggctga 978 <210> 29 <211> 1023 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 29 atgacgttct tcgaacaggt gcgaaggttg cggagcgcag cgacaaccct gccgcgccgc 60 gtggctatcg cggctatggg ggctgtcctg gtttacggtc tggtcggtac cttcggcggg 120 ccggccaccg cgggcgcatt ctctaggccc ggtcttccag tggaatatct gcaggtgcca 180 tccgcgtcga tgggccgcga catcaaggtc cagttccagg gcggcggacc gcacgcggtc 240 tacctgctcg acggtctgcg ggcccaggat gactacaacg gctgggacat caacaccccg 300 gccttcgagg agtactacca gtcagggttg tcggtgatca tgcccgtggg cggccaatcc 360 agtttctaca ccgactggta tcagccctcg cagagcaacg gccagaacta cacctacaag 420 tgggagacct tccttaccag agagatgccc gcctggctac aggccaacaa gggcgtgtcc 480 ccgacaggca acgcggcggt gggtctttcg atgtcgggcg gttccgcgct gatcctggcc 540 gcgtactacc cgcagcagtt cccgtacgcc gcgtcgttgt cgggcttcct caacccgtcc 600 gagggctggt ggccgacgct gatcggcctg gcgatgaacg actcgggcgg ttacaacgcc 660 aacagcatgt ggggtccgtc cagcgacccg gcctggaagc gcaacgaccc aatggttcag 720 attccccgcc tggtcgccaa 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ctcgaggcgg tcgtcatgct gctggccgtc acggtctcgc tgctgactat cccgttcgcc 180 gccgcggccg gcaccgcagt ccaggattcc cgcagccacg tctatgccca ccaggcccag 240 acccgccatc ccgcaaccgc gaccgtgatc gatcacgagg gggtgatcga cagcaacacg 300 accgccacgt cagcgccgcc gcgcacgaag atcaccgtgc ctgcccgatg ggtcgtgaac 360 ggaatagaac gcagcggtga ggtcaacgcg aagccgggaa ccaaatccgg tgaccgcgtc 420 ggcatttggg tcgacagtgc cggtcagctg gtcgatgaac cagctccgcc ggcccgtgcc 480 attgcggatg cggccctggc cgccttggga ctctggttga gcgtcgccgc ggttgcgggc 540 gccctgctgg cgctcactcg ggcgattctg atccgcgttc gcaacgccag ttggcaacac 600 gacatcgaca gcctgttctg cacgcagcgg tga 633 <210> 46 <211> 1020 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 46 atgacggagc cagcggcgtg ggacgaaggc aagccgcgaa tcatcacttt gaccatgaac 60 cccgccttgg acatcacgac gagcgtcgac gtggtgcgcc cgaccgagaa aatgcgttgt 120 ggcgcacctc gctacgatcc cggcggcggc ggtatcaatg tcgcccgcat tgtgcatgtc 180 ctcggcggtt gctcgacagc actgttcccg gccggcgggt cgaccgggag cctgctgatg 240 gcgctgctcg gtgatgcggg agtgccattt cgcgtcattc cgatcgcggc ctcgacgcgg 300 gagagcttca cggtcaacga gtccaggacc gccaagcagt atcgtttcgt gcttccgggg 360 ccgtcgctga ccgtcgcgga gcaggagcaa tgcctcgacg aactgcgcgg tgcggcggct 420 tcggccgcct ttgtggtggc cagtggcagc ctgccgccag gtgtggctgc cgactactat 480 cagcgggttg ccgacatctg ccgccgatcg agcactccgc tgatcctgga tacatctggt 540 ggcgggttgc agcacatttc gtccggggtg tttcttctca aggcgagcgt gcgggaactg 600 cgcgagtgcg tcggatccga actgctgacc gagcccgaac aactggccgc cgcacacgaa 660 ctcattgacc gtgggcgcgc cgaggtcgtg gtggtctcgc ttggatctca gggcgcgcta 720 ttggccacac gacatgcgag ccatcgattt tcgtcgattc cgatgaccgc ggttagcggt 780 gtcggcgccg gcgacgcgat ggtggccgcg attaccgtgg gcctcagccg tggctggtcg 840 ctcatcaagt ccgttcgctt gggaaacgcg gcaggtgcag ccatgctgct gacgccaggc 900 accgcggcct gcaatcgcga cgatgtggag aggttcttcg agctggcggc cgaacccacc 960 gaagtcgggc aggatcaata cgtttggcac ccgatcgtta acccggaagc ctcgccatga 1020 <210> 47 <211> 996 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 47 atgccggaca ccatggtgac caccgatgtc atcaagagcg cggtgcagtt ggcctgccgc 60 gcaccgtcgc tccacaacag ccagccctgg cgctggatag ccgaggacca cacggttgcg 120 ctgttcctcg acaaggatcg ggtgctttac gcgaccgacc actccggccg ggaagcgctg 180 ctggggtgcg gcgccgtact cgaccacttt cgggtggcga tggcggccgc gggtaccacc 240 gccaatgtgg aacggtttcc caaccccaac gatcctttgc atctggcgtc aattgacttc 300 agcccggccg atttcgtcac cgagggccac cgtctaaggg cggatgcgat cctactgcgc 360 cgtaccgacc ggctgccttt cgccgagccg ccggattggg acttggtgga gtcgcagttg 420 cgcacgaccg tcaccgccga cacggtgcgc atcgacgtca tcgccgacga tatgcgtccc 480 gaactggcgg cggcgtccaa actcaccgaa tcgctgcggc tctacgattc gtcgtatcat 540 gccgaactct tttggtggac aggggctttt gagacttctg agggcatacc gcacagttca 600 ttggtatcgg cggccgaaag tgaccgggtc accttcggac gcgacttccc ggtcgtcgcc 660 aacaccgata ggcgcccgga gtttggccac gaccgctcta aggtcctggt gctctccacc 720 tacgacaacg aacgcgccag cctactgcgc tgcggcgaga tgctttccgc cgtattgctt 780 gacgccacca tggctgggct tgccacctgc acgctgaccc acatcaccga actgcacgcc 840 agccgagacc tggtcgcagc gctgattggg cagcccgcaa ctccgcaagc cttggttcgc 900 gtcggtctgg ccccggagat ggaagagccg ccaccggcaa cgcctcggcg accaatcgat 960 gaagtgtttc acgttcgggc taaggatcac cggtag 996 <210> 48 <211> 432 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 48 atgaccaccg cacgcgacat catgaacgca ggtgtgacct gtgttggcga acacgagacg 60 ctaaccgctg ccgctcaata catgcgtgag cacgacatcg gcgcgttgcc gatctgcggg 120 gacgacgacc ggctgcacgg catgctcacc gaccgcgaca ttgtgatcaa aggcctggct 180 gcgggcctag acccgaatac cgccacggct ggcgagttgg cccgggacag catctactac 240 gtcgatgcga acgcaagcat ccaggagatg ctcaacgtca tggaagaaca tcaggtccgc 300 cgtgttccgg tcatctcaga gcaccgcttg gtcggaatcg tcaccgaagc cgacatcgcc 360 cgacacctgc ccgagcacgc cattgtgcag ttcgtcaagg caatctgctc gcccatggcc 420 ctcgccagct ag 432 <210> 49 <211> 1242 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 49 atggcaagtt ctgcgagcga cggcacccac gaacgctcgg cttttcgcct gagtccaccg 60 gtcttgagcg gcgccatggg accgttcatg cacaccggtc tgtacgtcgc tcaatcgtgg 120 cgcgactatc tgggtcaaca gcccgataaa ctgccgatcg cacggcccac tattgcctta 180 gcggcgcaag cctttcgaga cgaaatcgtc ctgctgggcc tcaaggcacg acgtccggtc 240 agcaatcatc gagtgttcga gcgcatcagc caagaagtgg ccgctggact ggagttctat 300 gggaatcgca gatggctgga gaagcctagc ggattttttg cccagccccc accgctcacc 360 gaggtcgcgg tccgaaaggt caaggaccgc agacgctcct tttatcgcat cttcttcgac 420 agtgggttta cgccgcatcc gggtgaaccg ggcagccaac ggtggctctc atacactgcg 480 aacaatcgcg agtacgccct gttactgcgg cacccagagc cgcgtccctg gctggtttgt 540 gtacacggca ccgagatggg cagggccccg ttggatctcg cggtgttccg cgcctggaag 600 ctgcatgacg aactcggcct gaacattgtc atgccggttc ttccgatgca tggtccccgc 660 gggcaaggtc tgccgaaggg cgccgttttt cccggagaag atgttctcga cgatgtgcat 720 gggacggctc aagcggtgtg ggatatccgg cggctgttgt cctggatacg atcgcaggag 780 gaggagtcgc tgatcgggtt gaacggtctc tcgctgggcg gctacatcgc gtcattggtc 840 gccagcctcg aagaaggtct cgcctgcgcg attctcggtg tcccagtggc tgatctgatc 900 gagttgttgg gccgccactg cggtcttcgg cacaaagacc cccgccgcca caccgtcaag 960 atggccgaac cgatcggccg aatgatctcg ccgctctcac ttacgccact ggtgcccatg 1020 ccgggccgct ttatctacgc gggcattgcc gaccgactcg tgcatccacg cgaacaggtg 1080 actcgcctct gggagcactg gggcaaaccc gaaatcgtgt ggtatccagg cggtcacact 1140 ggcttcttcc agtcgcggcc ggtacgacgg tttgtccagg ctgcgctgga gcagtcgggc 1200 ctgttggacg cgccacggac acagcgcgac cgttccgcct aa 1242 <210> 50 <211> 363 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 50 atgtccacgc aacgaccgag gcactccggt attcgggctg ttggccccta cgcatgggcc 60 ggccgatgtg gtcggatagg caggtggggg gtgcaccagg aggcgatgat gaatctagcg 120 atatggcacc cgcgcaaggt gcaatccgcc accatctatc aggtgaccga tcgctcgcac 180 gacgggcgca cagcacgggt gcctggtgac gagatcacta gcaccgtgtc cggttggttg 240 tcggagttgg gcacccaaag cccgttggcc gatgagcttg cgcgtgcggt gcggatcggc 300 gactggcccg ctgcgtacgc aatcggtgag cacctgtccg ttgagattgc cgttgcggtc 360 taa 363 <210> 51 <211> 1119 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 51 atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtgttcgtg 60 tcccccagcc aggaaatcca cgcccggttc agacggggca gcatgcagct ggtggacaga 120 gtcagaggcg ccgtgaccgg catgagcaga cggctggtcg tgggagctgt cggagccgct 180 ctggtgtctg gactcgtggg agccgtgggc ggaacagcta cagccggcgc tttcagcaga 240 cccggcctgc ccgtggaata tctgcaggtc cccagcccca gcatgggccg ggacatcaag 300 gtgcagttcc agtctggcgg agccaacagc cctgctctgt acctgctgga cggcctgaga 360 gcccaggacg acttcagcgg ctgggacatc aacacccccg ccttcgagtg gtacgaccag 420 agcggcctgt ctgtggtcat gcctgtgggc ggccagagca gcttctacag cgactggtat 480 cagcccgctt gtggcaaggc cggctgccag acctacaagt gggagacatt cctgaccagc 540 gagctgcccg gctggctgca ggccaacaga cacgtgaagc ccaccggctc tgccgtcgtg 600 ggcctgtcta tggctgccag ctctgccctg accctggcca tctaccaccc ccagcagttc 660 gtgtacgctg gcgccatgtc tggcctgctg gatccttctc aggccatggg acccaccctg 720 atcggactgg ctatgggaga tgccggcgga tacaaggcca gcgacatgtg gggccctaaa 780 gaggaccccg cctggcagag aaacgacccc ctgctgaacg tgggcaagct gatcgccaac 840 aacaccagag tgtgggtgta ctgcggcaac ggcaagctga gcgacctggg cggcaacaac 900 ctgcccgcca agttcctgga aggcttcgtg cggaccagca acatcaagtt ccaggacgcc 960 tacaacgctg gcggcggaca caacggcgtg ttcgacttcc ccgacagcgg cacccacagc 1020 tgggagtatt ggggagccca gctgaatgcc atgaagcccg acctgcagag agccctgggc 1080 gccaccccta atactggacc tgctcctcag ggcgcatga 1119 <210> 52 <211> 372 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 52 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 20 25 30 Gly Ser Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met 35 40 45 Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly 50 55 60 Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg 65 70 75 80 Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly 85 90 95 Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala 100 105 110 Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp 115 120 125 Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser 130 135 140 Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr 165 170 175 Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val 180 185 190 Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser 195 200 205 Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly 210 215 220 Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu 225 230 235 240 Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met 245 250 255 Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu 260 265 270 Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys 275 280 285 Gly Asn Gly Lys Leu Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys 290 295 300 Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala 305 310 315 320 Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser 325 330 335 Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys 340 345 350 Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn Thr Gly Pro Ala 355 360 365 Pro Gln Gly Ala 370 <210> 53 <211> 168 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 53 aagaagcagg gcgacgccga cgtgtgtggc gaggtggcct acatccagag cgtggtgtcc 60 gactgccacg tgccaaccgc cgagctgcgg accctgctgg aaatccggaa gctgttcctg 120 gaaatccaga aactgaaggt ggaactgcag ggcctgagca aagagtga 168 <210> 54 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 54 atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtgttcgtg 60 tcccccagcc aggaaatcca cgcccggttc agacggggca gcatgcagct ggtggacaga 120 gtcagaggcg ccgtgaccgg catgagcaga cggctggtcg tgggagctgt cggagccgct 180 ctggtgtctg gactcgtggg agccgtgggc ggaacagcta cagccggcgc tttcagcaga 240 cccggcctgc ccgtggaata tctgcaggtc cccagcccca gcatgggccg ggacatcaag 300 gtgcagttcc agtctggcgg agccaacagc cctgctctgt acctgctgga cggcctgaga 360 gcccaggacg acttcagcgg ctgggacatc aacacccccg ccttcgagtg gtacgaccag 420 agcggcctgt ctgtggtcat gcctgtgggc ggccagagca gcttctacag cgactggtat 480 cagcccgctt gtggcaaggc cggctgccag acctacaagt gggagacatt cctgaccagc 540 gagctgcccg gctggctgca ggccaacaga cacgtgaagc ccaccggctc tgccgtcgtg 600 ggcctgtcta tggctgccag ctctgccctg accctggcca tctaccaccc ccagcagttc 660 gtgtacgctg gcgccatgtc tggcctgctg gatccttctc aggccatggg acccaccctg 720 atcggactgg ctatgggaga tgccggcgga tacaaggcca gcgacatgtg gggccctaaa 780 gaggaccccg cctggcagag aaacgacccc ctgctgaacg tgggcaagct gatcgccaac 840 aacaccagag tgtgggtgta ctgcggcaac ggcaagctga gcgacctggg cggcaacaac 900 ctgcccgcca agttcctgga aggcttcgtg cggaccagca acatcaagtt ccaggacgcc 960 tacaacgctg gcggcggaca caacggcgtg ttcgacttcc ccgacagcgg cacccacagc 1020 tgggagtatt ggggagccca gctgaatgcc atgaagcccg acctgcagag aggcagcaag 1080 aagcagggcg acgccgacgt gtgtggcgag gtggcctaca tccagagcgt ggtgtccgac 1140 tgccacgtgc caaccgccga gctgcggacc ctgctggaaa tccggaagct gttcctggaa 1200 atccagaaac tgaaggtgga actgcagggc ctgagcaaag agtga 1245 <210> 55 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 55 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg 20 25 30 Gly Ser Met Gln Leu Val Asp Arg Val Arg Gly Ala Val Thr Gly Met 35 40 45 Ser Arg Arg Leu Val Val Gly Ala Val Gly Ala Ala Leu Val Ser Gly 50 55 60 Leu Val Gly Ala Val Gly Gly Thr Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg 65 70 75 80 Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly 85 90 95 Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala Asn Ser Pro Ala 100 105 110 Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Phe Ser Gly Trp 115 120 125 Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln Ser Gly Leu Ser 130 135 140 Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr 145 150 155 160 Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr 165 170 175 Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala Asn Arg His Val 180 185 190 Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met Ala Ala Ser Ser 195 200 205 Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe Val Tyr Ala Gly 210 215 220 Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met Gly Pro Thr Leu 225 230 235 240 Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ser Asp Met 245 250 255 Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn Asp Pro Leu Leu 260 265 270 Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val Trp Val Tyr Cys 275 280 285 Gly Asn Gly Lys Leu Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn Leu Pro Ala Lys 290 295 300 Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys Phe Gln Asp Ala 305 310 315 320 Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp Phe Pro Asp Ser 325 330 335 Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys 340 345 350 Pro Asp Leu Gln Arg Gly Ser Lys Lys Gln Gly Asp Ala Asp Val Cys 355 360 365 Gly Glu Val Ala Tyr Ile Gln Ser Val Val Ser Asp Cys His Val Pro 370 375 380 Thr Ala Glu Leu Arg Thr Leu Leu Glu Ile Arg Lys Leu Phe Leu Glu 385 390 395 400 Ile Gln Lys Leu Lys Val Glu Leu Gln Gly Leu Ser Lys Glu 405 410 <210> 56 <211> 1017 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 56 atgcagctgg tggacagagt cagaggcgcc gtgaccggca tgagcagacg gctggtcgtg 60 ggagctgtcg gagccgctct ggtgtctgga ctcgtgggag ccgtgggcgg aacagctaca 120 gccggcgctt tcagcagacc cggcctgccc gtggaatatc tgcaggtccc cagccccagc 180 atgggccggg acatcaaggt gcagttccag tctggcggag ccaacagccc tgctctgtac 240 ctgctggacg gcctgagagc ccaggacgac ttcagcggct gggacatcaa cacccccgcc 300 ttcgagtggt acgaccagag cggcctgtct gtggtcatgc ctgtgggcgg ccagagcagc 360 ttctacagcg actggtatca gcccgcttgt ggcaaggccg gctgccagac ctacaagtgg 420 gagacattcc tgaccagcga gctgcccggc tggctgcagg ccaacagaca cgtgaagccc 480 accggctctg ccgtcgtggg cctgtctatg gctgccagct ctgccctgac cctggccatc 540 taccaccccc agcagttcgt gtacgctggc gccatgtctg gcctgctgga tccttctcag 600 gccatgggac ccaccctgat cggactggct atgggagatg ccggcggata caaggccagc 660 gacatgtggg gccctaaaga ggaccccgcc tggcagagaa acgaccccct gctgaacgtg 720 ggcaagctga tcgccaacaa caccagagtg tgggtgtact gcggcaacgg caagctgagc 780 gacctgggcg gcaacaacct gcccgccaag ttcctggaag gcttcgtgcg gaccagcaac 840 atcaagttcc aggacgccta caacgctggc ggcggacaca acggcgtgtt cgacttcccc 900 gacagcggca cccacagctg ggagtattgg ggagcccagc tgaatgccat gaagcccgac 960 ctgcagagag ccctgggcgc cacccctaat actggacctg ctcctcaggg cgcatga 1017

Claims (35)

1. 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한
   융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는,
   첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 비-보체 조절 단백질 (CCP)/C4bp 단백질의 올리고중합 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 85A/Rv3804c, 85B/Rv1886c, 85C/Rv0129c, ESAT6/Rv3875, TB10.4/Rv0288, Rv0125, PPE18/Rv1196, P27/Rv1411c, HSP65/Rv0440, HBHA/Rv0475, Rv2659c, Rv2660c, HspX/Rv2031c, RPFA/Rv0867c, RPFB/Rv1009, RPFC/Rv1884c, RPFD/Rv2389c, RPFE/Rv2450c, Rv1733c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626c, Rv2627c, Rv2628, Rv0111, Rv1806/1807, Rv0198, 또는 Rv3812로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 26 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
6. 제 1항 내지 제 5항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한
   상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
7. 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 2 또는 서열번호 53으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 70%의 일치도를 가지는 핵산 서열, 또는 그의 적어도 60개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편에 의해 인코드되는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
8. 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 27 내지 29, 51 또는 56으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 70%의 일치도를 가지는 핵산 서열, 또는 그의 적어도 30개의 연속된 뉴클레오타이드들을 포함하는 그의 단편에 의해 인코드되는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
9. 제 1항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서,
   상기 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 상기 융합 단백질의 두 번째 도메인의 C-말단에 배열되는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
10. 제 1항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 54와 적어도 70%의 일치도를 가지는 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 단편을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
11. 제 1항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인코드되는 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 항원을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드 서열.
12. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터.
13. 제 12항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드와 같은 DNA 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터 또는 MVA 바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터인, 벡터.
14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    상기 벡터는 인간 아데노바이러스인, 벡터.
15. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    상기 벡터는 원숭이 아데노바이러스인, 벡터.
16. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    상기 벡터는 침팬지 아데노바이러스인, 벡터.
17. 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 20개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하고; 또한
    융합 단백질의 두 번째 도메인은 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는,
    첫 번째 및 두 번째 도메인들을 포함하는 융합 단백질.
18. 제 17항에 있어서,
    상기 첫 번째 도메인은 비-보체 조절 단백질 (CCP)/C4bp 단백질의 올리고중합 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
19. 제 17항 또는 제 18항에 있어서,
    상기 두 번째 도메인은 85A/Rv3804c, 85B/Rv1886c, 85C/Rv0129c, ESAT6/Rv3875, TB10.4/Rv0288, Rv0125, PPE18/Rv1196, P27/Rv1411c, HSP65/Rv0440, HBHA/Rv0475, Rv2659c, Rv2660c, HspX/Rv2031c, RPFA/Rv0867c, RPFB/Rv1009, RPFC/Rv1884c, RPFD/Rv2389c, RPFE/Rv2450c, Rv1733c, Rv2029c, Rv2032, Rv2626c, Rv2627c, Rv2628, Rv0111, Rv1806/1807, Rv0198, 또는 Rv3812로부터 선택되는 마이코박테리아 항원 또는 그의 항원성 단편을 포함하는, 융합 단백질.
20. 제 19항에 있어서,
    상기 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 26 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 적어도 10개의 연속된 아미노산들을 포함하는 그의 단편을 포함하는, 융합 단백질.
21. 제 17항 내지 제 20항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질의 첫 번째 도메인은 서열번호 1과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열을 포함하고; 또한
    상기 융합 단백질의 두 번째 도메인은 서열번호 3 내지 5 또는 52로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 일치도를 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 융합 단백질.
22. 제 17항 내지 제 21항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 첫 번째 도메인은 상기 두 번째 도메인의 C-말단에 배열되는, 융합 단백질.
23. 제 17항 내지 제 22항의 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 55와 적어도 70%의 일치도를 가지는 아미노산 서열, 또는 그의 단편을 포함하는, 융합 단백질.
24. 제 17항 내지 제 23항의 어느 한 항에 있어서,
    적어도 하나의 추가적인 항원을 포함하는, 융합 단백질.
25. 제 17항 내지 제 24항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코드되는, 융합 단백질.
26. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터를 숙주세포에서 발현하는 과정을 포함하는 융합 단백질을 생산하는 방법.
27. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제 17항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 숙주세포.
28. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터, 또는 제 17항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또한 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
29. 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 데 사용하기 위한 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터, 제 17항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제 28항에 따른 면역원성 조성물.
30. M. 투버쿨로시스 감염과 같은 마이코박테리아 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터, 제 17항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제 28항에 따른 면역원성 조성물.
31. 제 1항 내지 제 11항의 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 제 12항 내지 제 16항의 어느 한 항에 따른 벡터, 제 17항 내지 제 25항의 어느 한 항에 따른 융합 단백질, 또는 제 28항에 따른 면역원성 조성물을 개체에게 투여하는 과정을 포함하는, 개체에서 면역 반응을 자극하거나 유도하는 방법.
32. 제 31항에 있어서,
    M. 투버쿨로시스와 같은 마이코박테리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법.
33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드 서열, 벡터, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 또 다른 면역원성 조성물의 투여 이전에 실질적으로, 이와 함께 동시적으로 또는 연속적으로 투여되는, 방법.
34. 제 33항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오타이드 서열, 벡터, 융합 단백질 또는 면역원성 조성물은 감작 (priming) 백신 조성물의 투여 이후 1, 2, 3, 4 또는 5년까지 추가자극 (booster) 백신 조성물로서 투여되고, 바람직하게 상기 감작 백신 조성물은 두 번째의 마이코박테리아 항원 (예로, BCG)을 포함하거나 인코드하는, 방법.
35. 상기 본 명세서에서 실질적으로 기술된 바와 같이 실시예들을 기준으로 한 폴리뉴클레오타이드 서열, 벡터, 융합 단백질, 면역원성 조성물 또는 방법.

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