KR20150038380A - 키메라 ospa 분자를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 라임 백신에서 사용하기 위한 키메라 OspA 분자의 개발에 관한 것이다. 더 구체적으로, 키메라 OspA 분자는 하나의 OspA 혈청형으로부터의 근위 부분을 다른 OspA 혈청형으로부터의 원위 부분과 함께 포함하면서, 모 폴리펩타이드들 둘 다의 항원 특성을 보유한다. 키메라 OspA 분자는 다양한 보렐리아 동유전자종에 대해 보호를 제공하도록 단독으로 또는 조합으로 전달된다. 본 발명은 또한 라임병 또는 보렐리아증의 예방 및 치료에서 피험자에 키메라 OspA 분자를 투여하는 방법을 제공한다.

Description

키메라 OSPA 분자를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법{COMPOSITIONS COMPRISING CHIMERIC OSPA MOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2012년 7월 27일자에 출원된 미국 가출원 제61/676,668호(본 명세서에 참조문헌으로 그 전체가 편입됨)에 대한 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 키메라 OspA 폴리펩타이드, 이 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 이 분자를 포함하는 조성물, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

라임병은 보렐리아 부르그도르페리센수 라토(s.l.)에 의해 야기되는 진드기 매개 질환이다. 상기 질환은 통상적으로 진드기 물린 자리에서 연장되는 적색 발진의 전개와 그 뒤에 일어날 수 있는 뇌수막염, 심장염 또는 관절염을 포함하는 전신 합병증을 특징으로 한다. 라임병의 대부분의 모든 원인은 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니 및 보렐리아부르그도르페리센수 스트릭토(s.s.)의 3가지 동유전자종 중 하나에 의해 야기된다. 유럽에서, 인간을 감염시키는 모든 3가지 종이 발견되었다. 그러나, 북아메리카에서 보렐리아 부르그도르페리센수 스트릭토의 단일 종이 오직 발견되었다. 보렐리아 부르그도르페리는 보렐리아 속의 나선상균 종류의 그람 양성 박테리아의 종이다. 라임병의 항생제 치료는 일반적으로 효과적이지만, 일부 환자는 비경구 항생제 치료 후에도 실질적으로 개선되지 않는 관절 또는 신경계를 포함하는 만성 장애 형태의 질환이 발생하고, 따라서 고위험 집단에 대한 백신에 대한 필요성이 강조된다.

외부 표면 단백질 A(OspA)는 이소데스(Ixodes) 진드기의 중장에 존재하는 보렐리아 부르그도르페리 s.l. 종에 의해 발현된 31kDa 항원이다. OspA는 북아메리카에서 라임병을 예방하는 데 효과적인 것으로 증명되었다(Steere 등, N. Engl . J. Med . 339: 209-15,1998; Sigal 등, N. Engl . J. Med . 339:216-22, 1998; erratum in: N. Engl . J. Med . 339:571, 1998). 완전 처리된 OspA의 아미노 말단은 박테리아 막의 외부 표면에 단백질을 고정하는 3개의 지방-아실 사슬에 의해 번역후 변형된 시스테인 잔기이다(Bouchon 등, Anal . Biochem . 246: 52-61, 1997). OspA의 지질화(lipidation)는 분자를 안정화시키는 것으로 보고되었고(Luft, personal communication), 강한 애주번트의 부재 하에 보호에 필수적이다(Erdile 등, Infect . Immun. 61: 81-90, 1993). 아미노 말단 지질 막 앵커가 결여된 단백질의 가용성의 재조합 형태는 응집 마우스 단일클론 항체의 Fab 단편과 동시 결정화되어 OspA의 구조를 결정하고, 이것은 21개의 역평형 β-가닥, 이어서 단일 α-나선을 포함하는 것으로 나타났다(Li 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 94:3584-9, 1997).

1가 OspA 기반 백신(LYMErix®)은 라임병의 예방을 위해 미국에서 시판되었다. 그러나, 유럽에서 3가지 동유전자종에 걸친 OspA 서열의 이질성은 단일 균주로부터의 OspA에 기초한 백신에 의한 광범위한 보호가 불가능하게 한다(Gern 등, Vaccine 15:1551-7, 1997). 7개의 주요 OspA 혈청형이 유럽 단리물 중에서 인식되었다(혈청형 1 내지 7이라 지칭, Wilske 등, J. Clin . Microbiol . 31:340-50, 1993). OspA 혈청형은 종과 상관되고; 혈청형 1은 B. 부르그도르페리 s.s.에 상응하고, 혈청형 2는 B. 아프젤리에 상응하고, 혈청형 3 내지 7은 B. 가리니에 상응한다.

OspA에 의한 면역화를 통해 획득된 보호 면역력은 비일반적인데, 왜냐하면 숙주의 면역 반응과 병원균 사이의 상호작용이 숙주에서가 아니라, 진드기 벡터의 중장에서 발생하기 때문이다. 라임병의 경우, 진드기는 동물로부터 인간으로의 라임병의 전파 대한 벡터 또는 캐리어로서 작용한다. 감염된 진드기에 의한 섭식 동안 획득된 OspA 특이적 항체는 면역화 포유동물 숙주에 대한 B. 부르그도르페리 s.l.의 전달을 방지한다(de Silva 등, J. Exp . Med . 183: 271-5, 1996). 진드기 장 상피의 내막에서 수용체에 대한 나선상균의 부착을 방해하는 항체가 또한 효과적일 수 있지만, 보호는 항체 매개이고 살균 항체를 통해 주로 영향을 받는다(Pal 등, J. Immunol . 166: 7398-403, 2001).

효과적인 OspA 백신에 대한 합리적인 개발은 보호 단일클론 항체 LA-2에 의해 정의된 것과 같은 보호 에피토프의 동정을 요한다(Golde 등, Infect . Immun . 65: 882-9, 1997). X선 결정학 및 NMR 분석은 OspA에서 면역학적으로 중요한 초가변 도메인을 동정하기 위해 이용되고 LA-2 에피토프를 203-257번 아미노산에 맵핑하였다(Ding 등, J. Mol . Biol. 302: 1153-64, 2000; Luft 등 J Infect Dis . 185 (Suppl. 1): S46-51, 2002).

미국, 유럽 및 그 외 어느 곳에 존재하는 보렐리아의 다양한 종에 대해 광범위한 보호를 제공할 수 있는 OspA 백신의 개발에 대한 수요가 당해 분야에서 존재한다. 하기 개시내용은 이러한 백신의 종을 기재한다.

발명의 요약

본 발명은 당해 분야에서 라임병 또는 라임 보렐리아증의 예방 및 치료에 관한 하나 이상의 수요를 해결한다.

본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1, 서열 번호 3, 또는 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 더 추가의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 치환을 가짐); (b) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 삽입을 가짐); (c) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 내부 결실을 가짐); (d) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 아미노산의 C- 및/또는 N-말단 절두를 가짐); (e) 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두, 또는 N-말단 절두로부터 선택된 1개 내지 25개의 아미노산의 변형을 가짐); 및 (f) 임의의 (a)-(e)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 단리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 7, 서열 번호 9, 또는 서열 번호 11에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) (a)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 더 추가의 양상에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 치환을 가짐); (b) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 삽입을 가짐); (c) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 보존적 아미노산의 내부 결실을 가짐); (d) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 1개 내지 25개의 아미노산의 C- 및/또는 N-말단 절두를 가짐); (e) 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(폴리펩타이드는 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실, C-말단 절두, 또는 N-말단 절두로부터 선택된 1개 내지 25개의 아미노산의 변형을 가짐); 및 (f) 임의의 (a)-(e)에 상보성인 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다.

본 발명은 벡터, 숙주 세포, 및 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 배양함으로써 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 몇몇 양상에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 다른 양상에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 다양한 양상에서, 폴리펩타이드를 제조하는 방법은 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 조건 하에 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 배양물로부터 폴리펩타이드를 단리하는 단계를 포함한다. 다양한 양상에서, 본 발명은 임의의 이 키메라 핵산 분자 또는 이러한 핵산 분자를 포함하는 임의의 벡터 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 담체들을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 핵산 분자, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 벡터, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 적어도 2개의 핵산 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 핵산 분자는 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 특정한 양상에서, 본 발명은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5에 기재된 뉴클레오타이드 서열의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 양상에서, 본 발명은 서열 번호 8, 서열 번호 10, 및 서열 번호 12에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 더 추가의 양상에서, 본 발명은 서열 번호 8, 서열 번호 10, 및 서열 번호 12에 기재된 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 단리된 폴리펩타이드를 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 서열 번호 8, 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩타이드를 포함한다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 적어도 2개의 폴리펩타이드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 폴리펩타이드는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 특정한 양상에서, 본 발명은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드의 조합을 포함하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 면역원성 조성물을 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다양한 양상에서, 면역원성 조성물은 외부 표면 단백질 A(OspA) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도하는 특성을 갖는다. 소정의 양상에서, 면역원성 조성물은 보렐리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도하는 특성을 갖는다. 특정한 양상에서, 면역원성 조성물은 보렐리아를 중화시키는 항체의 생성을 유도하는 특성을 갖는다. 소정의 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토이다. 특정한 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 또는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토이다. 추가의 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 야포니카, 보렐리아 안데르소니, 보렐리아 비세티, 보렐리아 시니카, 보렐리아 투르디, 보렐리아 타누키, 보렐리아 발라이시아나, 보렐리아 루시타니아에, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 미야토모이 또는 보렐리아 로네스타이다. 몇몇 양상에서, 항체는 동물에 의해 생성된다. 추가의 양상에서, 동물은 포유동물이다. 더 추가의 양상에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명은 백신 조성물을 포함한다. 몇몇 양상에서, 본 발명의 백신 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다양한 양상에서, 본 발명은 조합 백신을 포함한다. 소정의 양상에서, 본 발명의 조합 백신은 본 명세서에 기재된 임의의 백신 조성물을 적어도 제2 백신 조성물과 조합하여 포함한다. 몇몇 양상에서, 제2 백신 조성물은 진드기 매개 질환에 대해 보호한다. 다양한 양상에서, 진드기 매개 질환은 로키산 홍반열, 바베시아증, 회귀열, 콜로라도 진드기 열, 인간 단핵구 에를리히증(Human monocytic ehrlichiosis: HME), 인간 과립구 에를리히증(Human granulocytic ehrlichiosis: HGE), 사우던 진드기 연관 발진 질병(Southern Tick-Associated Rash Illness: STARI), 야토병, 진드기 마비, 포와산 뇌염, Q열, 크림-콩고 출혈열, 범안열원충감염증(Cytauxzoonosis), 부톤네즈열, 또는 진드기 매개 뇌염이다. 다른 양상에서, 제2 백신 조성물은 진드기 매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신, 및 로키산 홍반열 백신으로 이루어진 군으로부터 선택된 백신이다. 다양한 양상에서, 제2 백신 조성물은 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 면역화에 적절한 계절성 면역화 스케줄을 갖는다.

본 발명은 피험자에서 면역학적 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 다양한 양상에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 면역학적 반응을 유도하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 양상에서, 면역학적 반응은 항-OspA 항체의 생성을 포함한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 다양한 양상에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 백신 조성물 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조합 백신을 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 양상에서, 이러한 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 항체를 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 양상에서, 이러한 방법은 청구항 28 내지 34 중 어느 한 항의 백신 조성물로 포유동물을 면역화함으로써 생성된 항체 또는 이의 단편을 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 양상에서, 항체 또는 이의 단편은 고도면역 혈청, 고도면역 혈장, 또는 이의 정제된 면역글로불린 분획이다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 소극적으로 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 백신 조성물로 포유동물을 면역화함으로써 생성된 항-OspA 항체 또는 이의 단편을 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함하고, 항체 또는 이의 단편은 정제된 면역글로불린 제제 또는 면역글로불린 단편 제제이다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 백신 조성물로 피험자를 면역화한 후 생성된 항-OspA 단일클론 항체 또는 이의 단편을 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하기 위한 유효량으로 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 양상에서, 단일클론 항체 또는 이의 단편은 인간화된다. 특정한 양상에서, 단일클론 항체는 F237/BK2이다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량으로 제형화된다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 면역학적 유효량의 임의의 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대해 보호 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 몇몇 양상에서, 조성물의 면역학적 유효량은 단일 단위 용량으로 투여된다. 몇몇 양상에서, 조성물의 면역학적 유효량은 다수의 단위 용량으로 투여된다. 몇몇 양상에서, 다수의 단위 용량은 거의 달 간격으로 투여된다. 추가의 양상에서, 조성물의 부스터는 조성물의 초기 단위 용량 후 약 6달 내지 약 18달에 투여된다. 다른 양상에서, 부스터는 초기 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 추가로 투여된다. 더 특정한 양상에서, 조성물은 달 간격으로, 예를 들어, 약 1일, 약 29일, 및 약 57일에 투여된다. 이 특정한 양상의 몇몇에서, 부스터는 제1 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 투여된다. 몇몇 양상에서, 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg이다. 특정한 양상에서, 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg이다.

본 발명은 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

본 발명은 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물의 용도를 포함하고, 여기서 조합된 폴리펩타이드의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 양으로 제형화된다.

다양한 양상에서, 본 발명의 조성물은 애주번트를 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 애주번트는 수산화알루미늄이다.

본 발명의 특정한 양상에서, 조성물 내의 폴리펩타이드의 조합은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 각각의 폴리펩타이드의 동일한 양을 포함한다. 본 발명의 양상에서, 조성물은 면역원성 조성물 또는 백신 조성물이다.

본 발명의 몇몇 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 센수 라토 또는 보렐리아 센수 스트릭토이다. 더 특정한 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토, 보렐리아 야포니카, 보렐리아 안데르소니, 보렐리아 비세티, 보렐리아 시니카, 보렐리아 투르디, 보렐리아 타누키, 보렐리아 발라이시아나, 보렐리아 루시타니아에, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 미야토모이 또는 보렐리아 로네스타이다. 훨씬 더 특정한 양상에서, 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 또는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토이다.

다양한 양상에서, 본 발명의 조성물은 초기 투약 후 약 60일에 약 1,000 내지 10,000의 기하 평균 역가(geometric mean titer: GMT) 수준으로 피험자에서의 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 초기 투약 후 약 90일에 약 2,000 내지 30,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 피험자에서의 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 부스터 투여 후 약 15,000 내지 50,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 피험자에서의 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다.

몇몇 양상에서, 본 발명의 조성물은 단일 용량으로 투여하기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 다수의 용량으로 투여하기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 달 간격으로 다수의 용량으로 투여하기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 초기 단위 용량 후 약 6달 내지 약 18달에 부스터로서의 투여를 위해 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 초기 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 부스터로서의 투여를 위해 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 거의 달 간격으로, 예를 들어, 약 1일, 약 29일, 및 약 57일에 다수의 단위 용량의 투여를 위해 제형화된다. 몇몇 양상에서, 조성물은 제1 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 다수의 용량, 이후 부스터로서의 투여를 위해 제형화된다. 몇몇 양상에서, 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg이다. 특정한 양상에서, 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg이다. 훨씬 더 특정한 양상에서, 단위 용량은 약 30 μg이다. 몇몇 양상에서, 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg이다. 몇몇 양상에서, 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg이다.

본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 용도를 포함한다. 다른 관련 양상은 또한 본 발명에서 제공된다.

상기 요약은 본 발명의 모든 양상을 한정하도록 의도되지 않고, 추가의 양상은 다른 부문, 예컨대 하기 상세한 설명에 기재되어 있다. 전체 문헌은 통합된 개시내용으로서 관련된 것으로 의도되고, 본 명세서에 기재된 특징의 조합이 본 문헌의 동일한 문장 또는 문단, 또는 부문에서 함께 발견되지 않더라도, 이 특징의 모든 조합이 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 다른 특징 및 이점이 하기 상세한 설명으로부터 명확할 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변화 및 변형이 상세한 설명으로부터 당해 분야의 당업자에게 명확해지므로, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 특정 실시양태를 나타내면서, 오직 예의 방식으로 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 지질화 OspA 키메라 작제물의 제조를 위한 개략적 개관이다.
도 2는 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 아미노산 서열(서열 번호: 2)이다.
도 3은 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 뉴클레오타이드(서열 번호: 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호: 2)을 나타낸다.
도 4는 lipB sOspA 6/4의 아미노산 서열(서열 번호: 4)이다.
도 5는 lipB sOspA 6/4의 뉴클레오타이드(서열 번호: 3) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호: 4)을 나타낸다.
도 6은 lipB sOspA 5/3의 아미노산 서열(서열 번호: 6)이다.
도 7은 lipB sOspA 5/3의 뉴클레오타이드(서열 번호: 5) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호: 6)을 나타낸다.
도 8은 고수준 발현에 대한 코돈 사용빈도의 최적화를 도시한 것이다.
도 9는 지질화 작제물과 비지질화 작제물 사이의 서열 차이를 나타낸다.
도 10은 T7 발현 시스템의 설명이다.
도 11은 유도된 배양물 및 비유도 배양물로부터의 신규한 재조합 OspA 단백질의 발현을 나타내는 SDS-PAGE이다.
도 12는 플라스미드 pUC18의 맵이다.
도 13은 플라스미드 pET30a의 맵이다.
도 14는 lipB sOspA 5/3 Kpn I - Bam HI 단편의 생성을 위한 전략을 나타낸다.
도 15는 lipB sOspA 1/2²⁵¹에서의 아미노산 변화(서열 번호: 39) 및 이 변화(lipB OspA 1/2 mod(서열 번호: 38); 공통 서열(서열 번호: 40))를 도입하기 위해 사용된 PCR 프라이머 서열(서열 번호: 21 및 41)을 강조하는 정렬이다.
도 16은 변형된 분자 lipB sOspA 1/2²⁵¹을 갖는 Blip OspA BPBP/A1의 OspA 서열의 정렬이다. 상부 가닥은 원래 서열(서열 번호: 42)이고, 하부 가닥은 최적화 서열(서열 번호: 43)이다. 주의: 서열의 시작 시 3개의 염기(CAT)가 도시되어 있지 않고; 이들은 Nde I 자리 CATATG의 일부를 형성한다.
도 17은 변형된 분자 lipB sOspA 6/4를 갖는 Blip OspA KT의 OspA 서열의 정렬이다. 상부 가닥은 원래 서열(서열 번호: 44)이고, 하부 가닥은 최적화 서열(서열 번호: 45)이다. 주의: 서열의 시작 시 단일 염기(C)가 도시되어 있지 않고; 이들은 Nde I 자리 CATATG의 일부를 형성한다.
도 18은 변형된 분자 lipB sOspA 5/3을 갖는 Blip OspA 5/3의 OspA 서열의 정렬이다. 상부 가닥은 원래 서열(서열 번호: 46)이고, 하부 가닥은 최적화 서열(서열 번호: 47)이다.
도 19는 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31에 의한 공격 전의 3ng의 OspA 1/2로 면역화된 보호되고 감염된 동물 중에서 항체 표면 결합 및 성장 억제 검정에서 기능적 항-OspA 반응의 분포를 나타낸다. 만-휘트니 p 값은 보호되고 감염된 동물 사이의 기능적 항체 함량의 매우 유의적인 차이를 나타낸다.
도 20은 돌아다니는 진드기에 의한 공격 전의 3ng의 OspA 1/2로 면역화된 보호되고 감염된 동물 중에서 항체 표면 결합 및 성장 억제 검정에서 기능적 항-OspA 반응의 분포를 나타낸다. 만-휘트니 p 값은 보호되고 감염된 동물 사이의 기능적 항체 함량의 매우 유의적인 차이를 나타낸다.
도 21은 3 용량의 3-구획 키메라 OspA 백신에 의한 면역화 후 혼주된 마우스 혈청에서의 표면 결합(평균 형광 강도(MFI)) 및 성장 억제(GI-50 역가)를 나타낸다. 효과적인 표면 결합 및 성장 억제는 백신에서의 OspA 유형(1-6형)에 상동성인 OspA 유형을 발현하는 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 검출되었다.
도 22는 표면 결합 검정(SBA)에서 rOspA 백신의 조합으로 면역화된 각각의 마우스로부터의 42일 혈청을 사용하여 얻은 평균 형광 강도(MFI) 역가를 나타낸다. 결과는 모든 3개의 rOspA 구성성분(1/2, 6/4, 및 5/3)이 C3H 마우스에서의 모든 6개의 균주에 대해 표면 결합 IgG 항체의 높은 역가를 유도하기 위해 다가 백신에서 필요하다는 것을 나타낸다. 2성분 백신은 2개의 손실 균주를 완전히 커버하지 않았다.
도 23은 rOspA 백신의 조합으로 면역화된 (10개의 군에서의) 각각의 마우스로부터의 42일 혈청을 사용한 보렐리아에의 성장 억제를 나타낸다. 오직 다가 백신(모든 3개의 균주를 포함하는 백신)이 90% 초과의 동물(n=10)에서 50% 초과의 성장 억제를 제공하였다. 검정 막대(채워진 막대)는 사용된 백신에 상동성인 균주를 나타낸다.
도 24는 OspA의 내부형 변이체를 발현하는 보렐리아에의 커버리지(coverage)를 나타낸다. 표면 결합은 강한 결합(10배 초과로 형광 증가) 또는 약한 결합(2-10배로 형광 증가)으로 분류되었다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 라임병 또는 보렐리아 감염에 대한 면역원성 조성물 또는 백신 조성물로서 전달될 수 있는 항원으로서 유용한 키메라 OspA 분자를 제공한다. 본 발명의 임의의 실시양태를 자세히 설명하기 전에, 본 발명은 하기 설명에 기재되거나 도면 및 실시예에 도시된 구성성분의 구성 및 배열의 상세내용으로 이의 적용에서 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 도입 부문은 오직 구성 목적이고 기술된 발명의 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 참조문헌은 본 명세서에 참조문헌으로 명확히 포함된다.

본 발명은 다른 실시양태를 포괄하고, 다양한 방식으로 실행되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 어법 및 전문용어는 설명 목적이고 제한으로 고려되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "함유하는", "포함하는" 또는 "갖는" 및 이의 변형어는 하기 기재된 항목 및 이의 등가물, 및 추가의 항목을 포괄하는 것으로 의도된다.

본 발명의 실시양태는 3개의 명확한 지질화 OspA 분자(이들 모두는 몇몇 공통 특징을 공유함)를 코딩하는 3개의 키메라 OspA 코딩 서열의 설계 및 합성에서 예시된다. 각각의 키메라 코딩 서열은 2개의 OspA 혈청형을 나타내고, 키메라 코딩 서열은 안전하고 고 면역원성인 안정한 키메라 OspA 분자를 코딩하고, B. 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)에 의한 감염에 대해 피험자 보호를 제공하도록 설계되었다.

일 양상에서, 키메라 OspA 분자는 모 폴리펩타이드의 둘 다의 보호 특성을 유지하면서 1개의 OspA 혈청형으로부터의 근위 부분을 다른 OspA 혈청형으로부터의 원위 부분과 함께 포함한다. 키메라 OspA 핵산 분자는 에스체리치아 콜라이(이. 콜라이)에서 발현되어, 조합 백신으로 제형화된 항원을 제공하여 유럽에서 라임병 또는 보렐리아 감염과 관련된 모든 6개의 우세한 혈청형(1-6 혈청형) 및 북아메리카에서 라임병 또는 보렐리아 감염과 관련된 단일 OspA 혈청형에 대한 보호를 제공한다. 1-6 혈청형을 포함하는 백신이 B. 아프젤리, B. 가리니, B. 바바리엔시스, 및 B. 부르그도르페리에 대해 보호를 제공하므로, 백신은 전세계 사용을 위해 설계된다.

본 발명은 또한 지질화 OspA 분자를 생성하기 위해 필요한 선도 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제거함으로써 일 양상에서 제1 세트의 3개의 유전자로부터 유도된, 제2 세트의 키메라 OspA 코딩 서열의 제조를 포함한다. 2개 세트의 작제물(지질화 및 비지질화 폴리펩타이드를 발생시킴)은 발효기에서 이의 제조 용이성(바이오매스, 안정성, 생성물 수율 등)을 평가하고, 상이한 유형의 항원이 어떻게 용이하게 정제될 수 있는지를 평가하고, 이의 생물학적 특성(안전성 프로필 및 보호 효능)을 비교하기 위해 필요하다.

본 발명은 본 발명의 키메라 OspA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 본 발명은 마찬가지로 이러한 OspA 분자를 포함하는 백신 및 백신 키트, 면역원성 조성물 및 백신의 제조 방법 및 인간 및 수의학적 의학 치료 및 예방에서의 면역원성 조성물 및 백신의 용도를 포함한다. 본 발명은 추가로 본 명세서에 기재된 OspA 조성물을 사용하여 라임병 또는 보렐리아 감염에 대해 면역화하는 방법 및 라임병 또는 보렐리아 감염의 예방을 위한 약제의 제조에서의 OspA 조성물의 용도를 포함한다.

정의

달리 정의되지 않은 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 분야의 당업자가 보통 이해하는 동일한 의미를 갖는다. 하기 참조문헌은 본 발명에서 사용된 많은 용어의 일반적 정의를 당업자에게 제공한다: Singleton, 등, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, 등 (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991).

하기 약어가 전체에 걸쳐 사용된다.

AA 아미노산

Amp 암피실린

bp 염기쌍

B. 아프젤리 보렐리아 아프젤리

B. 바바리엔시스보렐리아 바바리엔시스

B. 부르그도르페리 보렐리아 부르그도르페리

B. 가르니 보렐리아 가리니

DNA 데옥시리보핵산

dNTP 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트

이. 콜라이 에스체리치아 콜라이

GC 함량 염기 구아닌 및 사이토신을 포함하는 서열의 백분율

hLFA-1 인간 백혈구 기능-관련 항원-1

HPLC 고성능 액체 크로마토그래피

IP 지적 재산권

IPTG 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드

Kan 카나마이신

kDa 킬로달톤

LB 루리아 브로쓰

Lip B 외부 표면 단백질 B로부터의 선도 서열

Mab 단일클론 항체

OD 광학 밀도

OspA 외부 표면 단백질 A

OspB 외부 표면 단백질 B

PCR 중합효소 사슬 반응

RNA 리보핵산

s.l. 센수 라토

s.s. 센수 스트릭토

SDS 황산 도데실 나트륨

SMK 이. 콜라이에 대한 성장 배지(케토글루타레이트 소비톨 배지)

tRNA 운반 리보핵산

WCB 작업 세포 은행

본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바대로, 단수 용어 "하나" "일" 및 "그"는, 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한, 복수 지칭을 포함한다는 것을 본원에서 유의한다.

본 명세서에 사용되는 바대로, 하기 용어는, 달리 기술하지 않는 한, 이들에 속하는 의미를 갖는다.

용어 "유전자"는 하나 이상의 폴리펩타이드, 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 서열을 코딩하는 DNA 서열을 의미하고, 인트론, 및 유전자가 발현되는 조건에 영향을 미치는, 조절 DNA 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서 서열, 5'-비번역 구역, 또는 3'-비번역 구역을 포함하거나 포함할 수 않을 수 있다. 본 개시내용에서, OspA 유전자는 박테리아이고, 따라서 인트론이 없다. 용어 "코딩 서열"은 아미노산의 서열을 코딩하지만, 인트론 또는 조절 서열을 포함하지 않는 DNA 서열을 의미한다. 마찬가지로, 본 개시내용에서 OspA 코딩 서열은 조절 서열을 포함하지 않는다.

"핵산" 또는 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자"는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 의미한다. 상기 용어는 합성, 천연 발생 및 비천연 발생이고, 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는, 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 펩타이드-핵산(PNA)을 포함한다. 상기 용어는 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체로부터 형성된 분자, 예컨대, 4-아세틸사이토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데닌, 아지리디닐-사이토신, 슈도이소사이토신, 5-(카복시하이드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카복시-메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 이노신, N6-이소-펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸-구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노-메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀴오신, 5' -메톡시카보닐-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부토톡신, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오사이토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 우라실-5-옥시아세트산, 슈도우라실, 퀴오신, 2-티오사이토신, 및 2,6-다이아미노푸린(이들로 제한되지는 않음)을 포괄한다.

달리 기재되지 않은 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열, 및 명확히 표시된 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은, 몇몇 양상에서, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 성취된다(Batzer 등, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka 등, J. Biol . Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini 등, Mol . Cell . Probes 8:91-98 (1994)). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드, 및 폴리뉴클레오타이드와 상호 교환되어 사용된다.

용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"는 펩타이드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 의미하도록 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체, 및 천연 발생 아미노산 중합체 및 비천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 용어 "단백질"는 통상적으로 큰 폴리펩타이드를 의미한다. 용어 "펩타이드"는 통상적으로 짧은 폴리펩타이드를 의미한다. 합성 폴리펩타이드는 예를 들어 자동화 폴리펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.

용어 "Osp A 분자" 또는 "키메라 OspA 분자"는 일 양상에서 서열 번호 1(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 3(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 5(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 7(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 9(sOspA 6/4), 서열 번호 11(sOspA 5/3), 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산", 또는, 다른 양상에서, 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 의미한다.

용어 "lipB sOspA 분자"는 일 양상에서 서열 번호 1(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 3(lipB sOspA 6/4), 또는 서열 번호 5(lipB sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산", 또는, 다른 양상에서, 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 또는 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 의미한다. 서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11의 핵산 서열은 lipB 선도 서열(MRLLIGFALALALIG(서열 번호: 13))을 코딩하는 핵산 서열이 결여된다. 또한, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11의 핵산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에서의 lipB 선도 서열의 카복시 말단에 존재하는 시스테인 잔기 대신에 서열 번호 8, 서열 번호 10, 및 서열 번호 12의 아미노 말단에서 메티오닌 잔기를 코딩한다.

용어 "orig sOspA 분자" 또는 "원래 sOspA 분자"는 일 양상에서 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 "OspA 핵산", 또는, 다른 양상에서, 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하는 "OspA 폴리펩타이드"를 의미한다. 이 "원래" 분자는 돌연변이가 없고 코돈 최적화가 없는 키메라 작제물이다.

본 발명은 "지질화 OspA" 및 "비지질화 OspA" 키메라 분자를 포함한다. 다양한 양상에서, 지질화는 OspA에 애주번트 특성을 부여한다. 본 발명의 몇몇 양상에서, 지질화 OspA 분자는 OspB 선도 서열을 포함한다. 본 발명의 몇몇 양상에서, OspB 선도 서열은 아미노산 MRLLIGFALALALIG(서열 번호: 13)를 포함한다. 다른 양상에서, OspB 선도 서열은 다른 아미노산을 포함한다.

당해 분야에서 공지된 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자 사이의 관계를 의미한다. 당해 분야에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서 2개 이상의 뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 아미노산 서열의 스트링 사이의 일치성에 의해 결정될 수 있는 핵산 분자 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관련 정도를 의미한다. "동일성"은 특정한 기계 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 어드레스되는 (있다면) 갭 정렬을 갖는 2개 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 일치성의 퍼센트를 의미한다. "실질적인 동일성"은 특정 서열에 대한 적어도 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 의미한다. 몇몇 양상에서, 동일성은 적어도 약 50-100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 구역에 걸쳐 존재한다. 다른 양상에서, 동일성은 적어도 약 100-200개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 구역에 걸쳐 존재한다. 다른 양상에서, 동일성은 적어도 약 200-500개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 구역에 걸쳐 존재한다. 소정의 양상에서, 퍼센트 서열 동일성은 GAP, BLASTP, BLASTN, FASTA, BLASTA, BLASTX, BestFit 및 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘으로 이루어진 군으로부터 선택된 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정된다.

본 명세서에 인용된 임의의 숫자 값이 낮은 값에서 높은 값으로의 모든 값을 포함하는 것으로, 즉 열거된 가장 낮은 값과 가장 높은 값 사이의 모든 가능한 조합이 본원에서 명확히 설명되는 것으로 고려되는 것으로 구체적으로 또한 이해된다. 예를 들어, 농도 범위가 약 1% 내지 50%로 설명된 경우, 2% 내지 40%, 10% 내지 30%, 또는 1% 내지 3% 등과 같은 값은 본 명세서에서 열거된 것으로 의도된다. 상기 기재된 값은 오직 구체적으로 의도되는 예이다.

범위는, 다양한 양상에서, 본 명세서에 "약" 또는 "대략" 하나의 특정 값으로부터 및/또는 "약" 또는 "대략" 다른 특정 값으로서 표시된다. 선행사 "약"의 사용에 의해 값이 근사치로 표시될 때, 약간의 변화 양이 범위에 포함된다는 것을 의미한다.

용어 "유사성"은 관련 개념이지만, "동일성"과 반대로, 동일한 일치성 및 보존적 치환 일치성 둘 다를 포함하는 유사성의 측정치를 의미한다. 2개의 폴리펩타이드 서열이 예를 들어 20개 중 10개의 동일한 아미노산을 갖고, 나머지가 모두 비보존적 치환인 경우, 퍼센트 동일성 및 유사성은 둘 다 50%일 것이다. 동일한 예에서, 보존적 치환이 있는 5개 초과의 위치가 있는 경우, 퍼센트 동일성은 50%에 머무르지만, 퍼센트 유사성은 75%(15/20)일 것이다. 따라서, 보존적 치환이 있는 경우, 2개의 폴리펩타이드 사이의 퍼센트 유사성은 2개의 폴리펩타이드 사이의 퍼센트 동일성보다 높을 것이다.

용어 "단리된 핵산 분자"는 (1) 단백질, 지질, 탄수화물 또는 전체 DNA가 소스 세포로부터 단리될 때 본 발명의 핵산 분자가 자연에서 발견되는 다른 물질로부터 임의의 정도로 분리되거나, (2) "단리된 핵산 분자"가 자연에서 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부에 연결되지 않거나, (3) 이것이 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되거나, (4) 더 큰 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부로서 자연에서 존재하지 않는 본 발명의 핵산 분자를 의미한다. 본 명세서에 사용되는 실질적으로 포함하지 않는다는 것은 핵산 분자가 임의의 다른 오염 핵산 분자(들) 또는 폴리펩타이드 제조에서의 이의 용도 또는 이의 치료학적, 진단학적, 예방적 또는 조사 용도를 방해하지 않는 이의 자연 환경에 존재하는 다른 오염물질을 포함하지 않는다는 것을 의미한다.

용어 "단리된 폴리펩타이드"는 (1) 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물 또는 본 발명의 폴리펩타이드가 소스 세포로부터 단리될 때 자연에서 발견되는 다른 물질로부터 임의의 정도로 분리되고, (2) "단리된 폴리펩타이드"가 자연에서 연결된 폴리펩타이드의 전부 또는 일부에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 연결되지 않거나, (3) 이것이 자연에서 연결되지 않은 폴리펩타이드에 (공유 또는 비공유 상호작용에 의해) 작동적으로 연결되거나, (4) 자연에서 존재하지 않는 본 발명의 폴리펩타이드를 의미한다. 일 양상에서, 단리된 폴리펩타이드는 임의의 다른 오염 폴리펩타이드 또는 이의 치료학적, 진단학적, 예방적 또는 조사 용도를 방해하지 않는 이의 자연 환경에 존재하는 다른 오염물질을 실질적으로 포함하지 않는다.

본 명세서에 사용되는 폴리펩타이드의 "단편"는 전장 폴리펩타이드 또는 단백질 발현 생성물보다 작은 폴리펩타이드의 임의의 부분을 의미한다. 단편은 통상적으로 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노 말단으로부터 제거되고/되거나 전장 폴리펩타이드의 카복시 말단으로부터 제거된 전장 폴리펩타이드의 결실 유사체이다. 따라서, "단편"는 하기 기재된 결실 유사체의 하위세트이다.

본 명세서에 사용되는 "유사체"는 소정의 경우 정도가 다르지만 천연 발생 분자와 실질적으로 구조가 유사하고 동일한 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 유사체는 (i) (상기 기재된 단편을 포함하는) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단 및/또는 천연 발생 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 구역에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, (ii) 폴리펩타이드의 하나 이상의 말단(통상적으로 "부가" 유사체) 및/또는 천연 발생 폴리펩타이드 서열의 하나 이상의 내부 구역(통상적으로 "삽입" 유사체)에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입 또는 부가 또는 (iii) 천연 발생 폴리펩타이드 서열에서의 다른 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 하나 이상의 돌연변이에 기초하여 유사체가 유도된 천연 발생 폴리펩타이드와 비교하여 이의 아미노산 서열의 조성이 다르다. 치환은 치환되는 아미노산 및 이를 치환하는 아미노산의 물리-화학적 또는 기능적 관련성에 기초하여 보존적 또는 비보존적이다.

"보존적으로 변형된 유사체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 핵산은 동일한 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우 실질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능상 동일한 핵산은 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 가령, 코돈 GCA, GCC, GCG와 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 표시된 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변경하는 일 없이 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 유사체의 일 종인 "침묵 변이"다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본 명세서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 기술한다. 당업자는 핵산에서의 각각의 코돈(메티오닌에 대한 원래 유일한 코돈인 AUG, 및 트립토판에 대한 원래 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있는 것으로 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열을 내포한다.

아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 단일 아미노산 또는 코딩된 서열에서의 적은 퍼센트의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 각각의 치환, 삽입, 결실, 부가, 또는 절두는 "보존적으로 변형된 유사체"라는 것을 인식할 것이고, 여기서 변경은 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 발생시킨다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 테이블은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형 변이체, 종간 동족체, 및 대립유전자 이외에 있고 이를 배제하지 않는다.

하기 8개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:

1) 알라닌(A), 글라이신(G);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V);

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W);

7) 세린(S), 트레오닌(T); 및

8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들면 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).

본 명세서에 사용되는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 변형을 포함하되, 변이체가 네이티브 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 유사체를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 "대립유전자 변이체"는 동일한 유전자 좌위를 차지하는 유전자의 임의의 2개 이상의 다형 형태를 의미한다. 대립유전자 변이는 돌연변이를 통해 자연히 발생하고, 몇몇 양상에서, 집단 내에 표현형 다형을 발생시킨다. 소정의 양상에서, 유전자 돌연변이는 침묵이거나(코딩된 폴리펩타이드에서의 변화가 없음), 다른 양상에서, 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. "대립유전자 변이체"는 또한 유전자 대립유전자 변이체의 mRNA 전사물로부터 유래한 cDNA, 및 이에 의해 코딩된 단백질을 의미한다.

용어 "유도체"는 치료학적 또는 진단학적 물질에 대한 접합, (예를 들어, 방사성 핵종 또는 다양한 효소에 의한) 표지, 공유 중합체 부착, 예컨대 페길화(폴리에틸렌 글라이콜에 의한 유도체화) 및 비천연 아미노산의 화학 합성에 의한 삽입 또는 치환에 의해 공유 변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 몇몇 양상에서, 유도체는 보통 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 모이어티를 포함하도록 변형된다. 이러한 모이어티는, 다양한 양상에서, 분자의 용해도, 흡수 및/또는 생물학적 반감기를 조절한다. 모이어티는, 다양한 다른 양상에서, 대안적으로 분자의 독성을 감소시키고 분자 등의 임의의 비바람직한 부작용을 제거하거나 약화시킨다. 이러한 부작용을 조절할 수 있는 모이어티는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (1980)]에 기재되어 있다. 이러한 모이어티를 분자에 커플링하는 절차는 당해 분야에서 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 몇몇 양상에서, OspA 유도체는 생체내 단백질에 더 긴 반감기를 부여하는 화학 변형을 갖는 OspA 분자이다. 일 실시양태에서, 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 수용성 중합체의 부가에 의해 변형된다. 관련 실시양태에서, 폴리펩타이드는 글라이코실화, 페길화 및/또는 폴리시알릴화에 의해 변형된다.

용어 "재조합"은, 예를 들어, 세포, 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대한 지칭과 사용될 때, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 비상동성 핵산 또는 단백질의 도입, 또는 네이티브 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한다는 것을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 네이티브(비재조합) 형태 내에 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 달리 비정상적으로 발현되거나, 발현되지 않거나 전혀 발현되지 않는 유전자를 발현한다.

본 명세서에 사용되는 "선택 가능한 마커"는 유전자가 발현된 세포 또는 유기체에 확인 가능한 표현형 변화, 예컨대 약물, 항생제 또는 다른 물질에 대한 내성을 부여하여, 마커의 발현 또는 활성이 (예를 들어, 그러나 제한 없이, 양성 마커, 예컨대 neo 유전자)에 대하여 또는 (예를 들어, 제한 없이, 음성 마커, 예컨대 디프테리아 유전자)에 대항하여 선택되는 효소 또는 다른 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. "비상동성 선택 가능한 마커"는 정상에서 발견되지 않는 동물의 게놈으로 삽입된 선택 가능한 마커 유전자를 의미한다.

선택 가능한 마커의 예는 항생제 내성 유전자, 예컨대 네오마이신(neo), 푸로마이신(Puro), 디프테리아, 독소, 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 잔틴구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 단순 포진 바이러스 1형 티미딘 키나제, 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 및 하이포잔틴 포스폰보실트랜스퍼라제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 당해 분야의 기술자는 당해 분야에 공지된 임의의 선택 가능한 마커가 본 명세서에 기재된 방법에서 유용하다는 것을 이해할 것이다.

용어 "비상동성"은, 핵산의 부분을 언급 시 사용될 때, 핵산이 자연에서 서로에 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 새로운 기능성 핵산을 제조하기 위해 배열된 비관련 유전자로부터의 2개 이상의 서열, 예를 들어, 하나의 소스로부터 프로모터 및 다른 소스로부터 코딩 구역을 갖는 핵산은 통상적으로 재조합으로 생성된다. 유사하게, 비상동성 단백질은 단백질이 자연에서 서로에 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열(예를 들어, 융합 단백질)을 포함한다는 것을 나타낸다.

본 명세서에 사용되는, 용어 "상동성"은 상위부류로부터의 단백질(예를 들어, 면역글로불린 슈퍼패밀리) 및 상이한 종으로부터의 상동성 단백질(예를 들어, 미오신 경쇄 등)을 포함하는 "일반 진화 기원"를 갖는 단백질 사이의 관계를 의미한다 (Reeck 등, Cell 50:667, 1987). 이러한 단백질(및 이의 코딩 유전자)은, 퍼센트 유사성 또는 보존된 위치에서의 특이적 잔기 또는 모티프의 존재의 면인지에 따라, 이의 서열 유사성에 의해 반영되는 것처럼 서열 상동성을 갖는다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 제한 없이 문헌[ Appl . Math . 2:482, 1981 ]의 국소 상동성 알고리즘; 문헌[Needleman 등, J. Mol . Biol . 48:443, 1970]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌[Pearson 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 85:2444, 1988] 의 유사성 방법에 대한 연구에 의해; 이 알고리즘(Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행에 의해 또는 육안 검사(일반적으로 상기 Ausubel 등의 문헌 참조)에 의해 수행된다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하는데 적합한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 알고리즘(문헌[Altschul 등, J. Mol . Biol . 215:403-410, 1990]에 기재됨)이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 생물과학 정보 국제 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공중에게 이용 가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787, 1993] 참조).

용어 "벡터"는 숙주 세포에 코딩 정보를 전달하는 데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드 또는 바이러스)를 의미하도록 사용된다.

"클로닝 벡터"는 외래 DNA 단편이 삽입될 수 있는 작은 DNA이다. 비히클 및 외래 DNA를 동일한 제한 효소로 처리한 후 단편을 함께 결찰함으로써 클로닝 벡터로의 단편의 삽입을 수행한다. 많은 유형의 클로닝 벡터가 있고, 클로닝 벡터의 모든 유형이 본 발명에 사용된다. 유전적으로 조작된 플라스미드 및 박테리오파지(예컨대, 파지 λ)는 아마도 이 목적에 가장 흔히 사용된다. 클로닝 벡터의 다른 유형은 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC)를 포함한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정한 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특이적 핵산 구성요소를 갖는 재조합으로 또는 합성으로 생성된 핵산 작제물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 소정의 양상에서, 발현 벡터는 프로모터에 작동적으로 연결된 전사하고자 하는 핵산을 포함한다.

용어 "코딩 서열"은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치할 때 폴리펩타이드로 번역된, mRNA로 전사된 핵산 서열로서 본 명세서에 정의된다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 mRNA의 5' 말단에서 보통 오픈 리딩 프레임의 시작인 ATG 시작 코돈 및 mRNA의 3' 말단에서 오픈 리딩 프레임의 바로 하류의 전사 종결자 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열은 게놈 DNA, cDNA, 반합성, 합성 및 재조합 핵산 서열을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 양상에서, 프로모터 DNA 서열은 그에 연계된 코딩 서열의 상류에 위치한 DNA 서열이 됨으로써 그리고 이 코딩 서열의 발현을 조절할 수 있음으로써 정의된다.

"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 어레이로서 정의된다. 본 명세서에 사용되는, 프로모터는 예컨대 TATA 구성요소인 중합효소 II형 프로모터의 경우에 전사의 시작 자리 근처의 필요한 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 임의로 전사의 시작 자리로부터 수천개의 염기쌍이 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 리프레서 구성요소를 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건 하에 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 및 발달 조절 하에 활성인 프로모터이다.

용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 자리의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.

용어 "형질도입"는 일반적으로 파지에 의한 하나의 박테리아로부터 다른 박테리아로의 핵산의 전달을 의미하도록 사용된다. "형질도입"는 또한 레트로바이러스에 의한 진핵생물 세포 서열의 획득 및 전달을 의마한다.

용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하도록 사용되고, 세포는 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될 때 "형질감염"된다. 다수의 형질감염 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있고 본 명세서에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham 등, Virology, 52:456 (1973); Sambrook 등, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, (1989); Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, (1986); 및 Chu 등, Gene, 13:197 (1981)]을 참조한다. 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주 세포로 도입하기 위해 이용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "형질전환"은 세포 유전자 특징의 변화를 의미하고, 세포는 새로운 DNA를 포함하도록 변형될 때 형질전환된다. 예를 들어, 세포는 이의 네이티브 상태로부터 유전적으로 변형될 때 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, DNA의 형질전환은 세포의 염색체로 물리적으로 통합함으로써 세포의 형질전환과 재조합될 수 있다. 몇몇 경우에, DNA는 복제될 필요 없이 에피솜으로서 일시적으로 유지되거나, 이것은 플라스미드로서 독립적으로 복제한다. 세포는 DNA가 세포 분열로 복제될 때 안정하게 형질전환되는 것으로 생각된다.

용어 "내인성"은 숙주 유기체에서 자연히 발현되거나 세포, 조직 또는 유기체로부터 기원하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 화합물을 의미한다. "외인성"은 세포, 조직 또는 유기체의 밖으로부터 기원하는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 다른 화합물을 의미한다.

용어 "물질" 또는 "화합물"은 본 발명에서 생물학적 매개변수에 영향을 미치는 능력을 갖는 임의의 분자, 예를 들어 단백질 또는 의약품을 기술한다.

본 명세서에 사용되는 "제어"는 활성, 양성, 음성 또는 비히클 제어를 의미할 수 있다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 바대로, 제어는 실험 결과의 관련성을 확립하도록 이용되고, 치료하고자 하는 병증에 대한 비교를 제공한다.

용어 "중증도를 감소시킨다"는, 라임 또는 라임병의 증상을 언급할 때, 증상이 개시 지연되거나, 중증도가 감소하거나, 피험자에 덜 손상을 발생시킨다는 것을 의미한다. 일반적으로, 증상의 중증도는 예를 들어 활성 예방적 또는 치료학적 조성물을 수용하지 않는 대조군과 비교된다. 이런 경우에, 상기 조성물은 증상이 증상의 대조군 수준과 비교하여 10%, 25%, 30%, 50%, 80%, 또는 100%(즉, 실질적으로 제거) 감소할 때 라임의 증상의 중증도를 감소시킨다고 말해질 수 있다.

용어 "항원"은 선택적 결합제, 예컨대 항체에 의해 결합될 수 있고, 추가로 각각의 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성하기 위해 피험자에서 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은, 다양한 양상에서, 하나 이상의 에피토프를 갖는다.

용어 "항체"는 OspA 폴리펩타이드에 대한 특이성을 갖는 분자 또는 분자들을 의미한다. 본 명세서에 사용되는, 용어 "특이적", "특이성" 및 "특이적으로 결합한다"는 OspA 폴리펩타이드에 결합하고 비-OspA 폴리펩타이드에 결합하지 않는 항체의 능력을 의미한다. 소정의 양상에서, 항체가 감염성 물질과 반응하고 이의 감염 또는 독력을 파괴하거나 억제할 때 항체는 "중화 항체"다. 본 발명은 보렐리아를 "중화시키는" 항체를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 담체"는 약제학적 조성물로서 OspA 폴리펩타이드, OspA 핵산 분자 또는 OspA 항체의 전달을 성취하거나 증대시키기에 적합한 하나 이상의 제제 물질을 의미한다.

용어 "안정화제"는 부작용으로부터 백신의 면역원성 조성물을 보호하는 물질 또는 백신 부형제, 예컨대 가열 또는 동결 동안 발생하고/하거나 안정한 면역원성 병증 또는 상태에서 면역원성 조성물의 안정성 또는 반감기를 연장하는 것을 의미한다. 안정화제의 예는 당, 예컨대 수크로스, 락토스 및 만노스; 당 알콜, 예컨대 만니톨; 아미노산, 예컨대 글라이신 또는 글루탐산; 및 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 젤라틴을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

용어 "항균성 보존제"는 다용량 바이알의 반복 찌르기 시(이 용기가 사용되어야 함) 도입될 수 있는 미생물유기체의 성장을 억제하는 면역원성 조성물 또는 백신에 첨가되는 임의의 물질을 의미한다. 항균성 보존제의 예는 티메로살, 2-페녹시에탄올, 벤즈에토늄 클로라이드, 및 페놀과 같은 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

용어 "면역원성 조성물"은 항원-특이적 항체가 길러진 항원(예를 들어, 키메라 OspA 분자), 피험자 숙주의 면역 반응을 자극하는 애주번트, 및 적합한 면역학적 불활성인 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 의미한다. 임의로, 면역원성 조성물은 하나 이상의 안정화제를 포함한다. 임의로, 면역원성 조성물은 하나 이상의 항균성 보존제를 포함한다.

용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 특정 질환(예를 들어, 라임병 또는 보렐리아 감염)에 대한 면역을 개선하는 생물학적 제제를 의미한다. 백신은 통상적으로 질환 유발 미생물유기체를 닮은 물질(예를 들어, 보렐리아의 키메라 OspA 분자(항원))을 포함한다. 상기 물질은 물질을 외래로서 인식하도록 체내의 면역계를 자극하고, 이를 파괴하고, 이를 "기억"하여, 면역계는 이것이 나중 마주치는 임의의 이 미생물유기체를 더 쉽게 인식하고 파괴할 수 있다. 백신은, 다양한 양상에서, 예방적(임의의 천연 또는 "야생형" 병원균에 의한 미래의 감염의 효과를 예방하거나 경감), 또는 치료학적(존재하는 감염에 대한 백신)이다. 상기 기재된 바대로, 이러한 백신 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제제를 포함한다. 임의로, 백신은 또한 하나 이상의 안정화제 및/또는 하나 이상의 항균성 보존제를 포함한다.

용어 "유효량" 및 "치료학적 유효량"는 각각 본 명세서에 기재된 OspA 폴리펩타이드의 하나 이상의 생물학적 활성의 관찰 가능한 수준을 지지하기 위해 사용되는 핵산 분자, 폴리펩타이드, 조성물, 또는 항체의 양을 의미한다. 예를 들어, 유효량은, 본 발명의 몇몇 양상에서, 보렐리아 감염을 예방하거나 중화시키거나 감소시키는 데 필요한 양일 것이다.

용어 "조합"은 본 발명의 2개 이상의 핵산 분자, 또는 본 발명의 2개 이상의 폴리펩타이드를 의미한다. 몇몇 양상에서, 본 발명의 분자의 조합은 본 명세서에 기재된 보렐리아의 6개의 혈청형(1-6) 중 적어도 4개로부터 면역을 제공하거나 감염과 싸우도록 투여된다. 다양한 양상에서, 본 발명의 2개 또는 3개의 분자 또는 폴리펩타이드의 조합이 사용된다. 소정의 양상에서, 본 발명의 분자의 조합은 본 명세서에 기재된 보렐리아의 모든 6개의 혈청형(1-6)으로부터 면역을 제공하도록 피험자에 투여된다. 후자의 조합은 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 조합에 존재하지 않는 OspA 유형을 발현하는 보렐리아의 비상동성 균주에 면역을 제공하는 것으로 나타났다.

용어 "조합 백신"은 하나 이상의 질환에 대한 하나 초과의 백신 조성물 또는 하나 초과의 보호 항원을 포함하는 백신 제제를 의미한다. 본 발명은 하나 이상의 다른 질환에 대한 항원 이외에 라임병 또는 보렐리아에 대한 OspA 키메라 항원을 포함하는 조합 백신을 포함한다. 다양한 양상에서, 다른 질환 중 하나 이상은 진드기 매개 질환이다. 소정의 양상에서, 다른 진드기 매개 질환은 로키산 홍반열, 바베시아증, 회귀열, 콜로라도 진드기 열, 인간 단핵구 에를리히증(HME), 인간 과립구 에를리히증(HGE), 사우던 진드기 연관 발진 질병(STARI), 야토병, 진드기 마비, 포와산 뇌염, Q열, 크림-콩고 출혈열, 범안열원충감염증, 부톤네즈열, 또는 진드기 매개 뇌염이다. 특정한 양상에서, 본 발명은 진드기 매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신, 및 로키산 홍반열 백신을 포함하는 하나 이상의 백신을 포함하는 조합 백신을 포함한다. 몇몇 양상에서, 조합 백신은 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 면역화에 적합한 계절성 면역화 스케줄을 갖는 백신 조성물을 포함한다. 더 특정한 양상에서, 조합 백신은 이 질환이 우세한 지리학적 위치에서 사용하기 위해 다수의 질환의 예방에 유용하다.

용어 "보렐리아"는 보렐리아 속의 나선상균 유형의 그람 양성 박테리아의 종을 의미한다. 일 양상에서, "보렐리아 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)"는 더 넓은 의미에서 보렐리아 부르그도르페리를 의미한다. 라임병 또는 보렐리아증의 거의 모든 경우가 보렐리아아프젤리, 보렐리아 가리니 및 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토(s.s.)(더 엄격한 의미에서 B. 부르그도르페리 를 의미)의 3개의 동유전자종 중 1개에 의해 발생한다. 보렐리아의 OspA 혈청형은 종과 상관되고; 혈청형 1은 B. 부르그도르페리 s.s.에 상응하고, 혈청형 2는 B. 아프젤리에 상응하고, 혈청형 3 내지 7은 B. 가리니에 상응한다. 최신 문헌은 OspA 혈청형 4가 보렐리아 바바리엔시스로서 그 자체의 종 상태로 제안된다는 것을 나타낸다(Margos 등, Appl. Environ. Microbiol. 75: 5410-6, 2009). 다양한 양상에서, 본 발명의 면역원성 또는 백신 조성물은 또한 보렐리아 야포니카, 보렐리아 안데르소니, 보렐리아 비세티, 보렐리아 시니카, 보렐리아 투르디, 보렐리아 타누키, 보렐리아 발라이시아나, 보렐리아 루시타니아에, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 미야토모이 또는 보렐리아 로네스타(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 보렐리아의 다른 종에 대한 보호를 제공한다.

"피험자"는 비식물, 비원생생물의 이의 종래의 의미가 제공된다. 대부분의 양상에서, 피험자는 동물이다. 특정한 양상에서, 동물은 포유동물이다. 더 특정한 양상에서, 포유동물은 인간이다. 다른 양상에서, 포유동물은 애완 또는 반려 동물, 사육된 농장 동물, 또는 동물원 동물이다. 소정의 양상에서, 포유동물은 고양이, 개, 말 또는 소이다. 다양한 다른 양상에서, 포유동물은 사슴, 마우스, 얼룩다람쥐(chipmunk), 다람쥐, 주머니쥐 또는 라쿤이다.

라임병( 보렐리아증 또는 라임 보렐리아증 )

몇몇 양상에서, 본 발명은 라임병 또는 보렐리아 감염의 예방에서 이 분자를 포함하는 키메라 OspA 분자 및 조성물을 포함한다. 라임병은 또한 보렐리아증 또는 라임 보렐리아증으로서 당해 분야에 공지되어 있고, 따라서 이 용어의 모두는 본 발명에 포함된다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 키메라 OspA 분자를 투여하는 단계를 포함하는 라임병을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다. 라임병, 또는 보렐리아증은 보렐리아 속에 속하는 그람 음성 나선상균 박테리아의 적어도 3개의 종에 의해 유발된 감염성 질환이다. 적어도 13개의 보렐리아 종이 발견되었고, 이들 중 3개가 라임 관련된 것으로 공지되어 있다. 라임병을 발생시키는 보렐리아 종은 총체적으로 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토로 공지되어 있고, 매우 큰 유전 다양성을 나타낸다. 그룹 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토는 대부분의 경우에 대해 아마도 원인이 되는 3개의 밀접히 관련된 종으로 구성된다. 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토는 미국에서 라임병의 주요 원인이고(그러나 유럽에서도 존재), 보렐리아 아프젤리 및 보렐리아 가리니는 대부분의 유럽 경우를 발생시킨다. 최신 문헌은 바바리아(Bavaria)에서 처음 발견된 보렐리아 바바리엔시스가 새로운 종으로 생각된다는 것을 나타낸다. 그러나, 현재까지, OspA 혈청형 4는 보렐리아 가리니의 균주인 것으로 생각된다(Margos 등, Id). 몇몇 연구는 또한 보렐리아 종(예를 들어 보렐리아비세티, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 루시타니아에, 및 보렐리아 발라이시아나)이 때때로 인간을 감염시킬 수 있다는 것을 제안한다. 이 종이 질환의 중요한 원인인 것으로 보이지 않지만, 이 종에 대한 면역원성 보호가 또한 본 발명에 포함된다.

라임병은 북반구에서 가장 흔한 진드기 매개 질환이다. 질환은 많은 경우에 1975년에 확인된 코네티컷 라임의 마을의 이름을 따서 명명된다. 보렐리아는 이소데스 속("참진드기")의 몇몇 종에 속하는 감염된 진드기의 교상에 의해 인간에게 전염된다. 초기 증상은, 몇몇 경우에, 열, 두통, 피로, 우울증 및 유주성 홍반이라 불리는 특징적인 원형 피부 발진을 포함한다. 치료되지 않고 방치되면, 차후의 증상은 대개 관절, 심장 및 중추 신경계를 수반할 수 있다. 대부분의 경우에, 감염 및 이의 증상은 특히 질병이 초기에 치료되는 경우 항생제에 의해 제거된다. 그러나, 늦은, 지연된 또는 부적절한 치료는 불능이 되거나 치료하기 어려울 수 있는 더 심각한 증상을 발생시킬 수 있다. 가끔, 감염이 항생제에 의해 제거된 후 관절염과 같은 증상은 지속된다.

몇몇 그룹은 "만성" 라임병이, 늦은 라임병의 인식된 증상을 넘어서는, 의학적으로 설명되지 않는 증상의 범위의 원인이고, 추가의 장기간 항생제 치료가 필요하다고 주장한다. 그러나, 장기간 치료는 논란이 많고, 이러한 치료에 관한 논쟁은 치료 가이드라인에 대한 소송을 발생시킨다.

라임병이 설치류 및 조류를 포함하는 천연 저장소로부터 숙주 둘 다를 섭식하는 진드기에 의해 인간에게 전염되면서 이것은 인수공통전염병(zoonosis)으로서 분류된다. 이소데스 속의 참진드기는 라임병의 주요 벡터이다. 약충 진드기가 매우 작고 검출되지 않는 긴 시간 동안 섭식할 수 있으므로, 대부분의 인간 감염은 자충기의 진드기에 의해 발생한다. 유충기에서의 진드기의 작은 크기, 및 교상으로부터의 어떠한 가려움 또는 통증을 숙주가 느끼지 않게 하는 진드기 분비물로 인해 진드기 교상은 대개 알아차리지 못하고 지나간다.

라임병은 증상, 객관적인 신체 발견(예컨대, 유주성 홍반, 안면 마비, 또는 관절염), 감염된 진드기에 대한 가능한 노출의 병력, 및 혈청학적 혈액 시험에 기초하여 임상적으로 진단된다. 라임병을 앓는 환자의 대략 절반이 특징적인 황소 눈(bulls-eye) 발진을 발생시키지만, 많은 사람은 진드기 교상을 생각해내지 못할 수 있다. 실험실 시험은 라임병의 증상을 갖지 않는 사람에 추천되지 않는다.

실험실에서 보렐리아 박테리아를 배양하는 어려움 때문에, 라임병의 진단은 통상적으로 임상적 실험 발견 및 풍토적인 라임 지역에 대한 노출의 병력에 기초한다. 모든 경우의 불과 50%에서 발생하는 유주성 홍반(EM: erythema migrans) 발진은 혈청학적 혈액 시험이 음성일 때에도 라임병의 진단을 확립하기에 충분한 것으로 생각된다. 혈청학적 시험은 임상적으로 의심되는 경우를 지지하도록 이용될 수 있지만, 그 자체가 진단학적이지 않다. 진행된 라임병의 진단은 많은 다른 질환의 증상을 모방할 수 있는 다면적인 출현으로 인해 대개 어렵다. 이러한 이유로, 검토자는 라임을 새로운 "위대한 모방자"라 불렀다. 라임병은, 몇몇 경우에, 다수의 경화증, 류마티스성 관절염, 섬유근육통, 만성 피로 증후군(CFS), 루푸스, 또는 다른 자가면역 및 신경퇴행성 질환으로 잘못 진단된다. 따라서, 당해 분야에서 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 백신에 대한 큰 수요가 존재한다.

보렐리아 의 외부 표면 단백질 A( OspA )

다양한 양상에서, 본 발명은 라임병 또는 보렐리아 감염의 예방 및 치료에서 보렐리아의 키메라 OspA 분자 및 이 분자를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 보렐리아 외부 표면 단백질은 이 나선상균이 진드기로부터 포유동물로 감염되면서 온도 및/또는 포유동물 숙주 특이적 신호에 의해 상향 조절되는 지난 10년 동안 확인되었다.

보렐리아 부르그도르페리의 OspA인 주요 외부 표면 단백질은 백신 후보물질로서의 이의 가능성으로 인해 매우 관심 있는 지단백이다. 보렐리아의 유럽 및 북아메리카 균주 둘 다로부터의 OspA의 혈청형 및 유전자 분석은 항원 및 구조적 이질성을 나타낸다. OspA는 공개 PCT 특허 출원 WO 92/14488(Jiang 등)에 기재되어 있고(Clin . Diagn . Lab. Immunol . 1: 406-12, 1994), 당해 분야에서 공지되어 있다. Osp A는 마우스, 햄스터 및 개 공격 연구에서 보호 면역을 유도하는 것으로 나타났다. 인간에서의 임상 실험은 OspA의 제제가 인간에서 안전하고 면역원성이라는 것을 보여준다(Keller 등, JAMA (1994) 271:1764 1768).

OspA가 북아메리카로부터의 보렐리아 부르그도르페리의 아주 많은 임상적 단리물에서 발현되지만, 유럽에서의 임상적 보렐리아 단리물의 실험으로부터 다른 사진이 나타났다. 유럽에서, 라임병은 주로 보렐리아의 3개의 동유전자종, 즉 B. 부르그도르페리, B. 가리니 및 B. 아프젤리에 의해 발생한다. 최신 문헌은 보렐리아 바바리엔시스가 그 자체의 동유전자종일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 보렐리아 바바리엔시스는 보렐리아 가리니의 균주로도 공지된 OspA 혈청형 4에 대한 새로운 이름으로서 제안되었다(상기 Margos 문헌). 본 발명은 보렐리아의 모든 동유전자종에 대한 보호 면역을 제공하는 키메라 OspA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 공통 특징을 공유하는 3개의 명확한 지질화 OspA 분자를 코딩하는 3개의 키메라 OspA 유전자의 설계 및 합성을 기술한다. 각각의 유전자는 2개의 OspA 혈청형을 나타내고, 유전자는 안전하고 고 면역원성인 안정한 OspA 분자를 코딩하고, B. 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)에 의한 감염에 대해 피험자 보호를 제공하도록 설계된다. 본 발명은 또한 돌연변이가 없고 공통 특징을 공유하는 3개의 명확한 지질화 OspA 분자를 코딩하는 코돈 최적화가 없는 3개의 원래 키메라 OspA 유전자를 기술한다. 각각의 유전자는 2개의 OspA 혈청형을 나타내고, B. 부르그도르페리 센수 라토(s.l.)에 의한 감염에 대해 피험자 보호를 제공하는 분자를 코딩한다.

7개의 주요 OspA 혈청형이 유럽 단리물 중에서 인식되었다(혈청형 1 내지 7이라 지칭, Wilske 등, J. Clin . Microbiol . 31:340-50, 1993). OspA 혈청형은 종과 상관되고; 혈청형 1은 B. 부르그도르페리 s.s.에 상응하고, 혈청형 2는 B. 아프젤리에 상응하고, 혈청형 3 내지 7은 B. 가리니에 상응한다. 혈청형 4는, 몇몇 양상에서, 대안적으로 보렐리아 바바리엔시스로 생각된다. (상기 마고스(Margos) 등의 문헌을 참조). 유럽 보렐리아 단리물의 역학적 연구는 OspA 1형, 2 형, 3 형, 4 형, 5 형 및 6 형에 기초한 백신이 유럽에서 라임병의 98.1%의 이론적 커버리지를 제공하고 침습 질환 단리물의 96.7%를 커버한다는 것을 나타낸다. 본 발명은 모든 6개의 혈청형 1-6에 대한 보호 면역을 제공할 수 있는 6개의 키메라 OspA 핵산 분자(서열 번호: 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5, 및 서열 번호 168, 170, 및 172) 및 6개의 키메라 OspA 폴리펩타이드 분자(서열 번호: 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6, 및 서열 번호 169, 서열 번호 171, 및 서열 번호 173)를 제공한다. 6개의 합성 OspA 유전자는 OspA 혈청형 1 및 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹(서열 번호: 1(핵산) 및 서열 번호 2(아미노산) 및 orig sOspA 1/2(서열 번호: 168(핵산) 및 서열 번호 169(아미노산)); OspA 혈청형 6 및 4(lipB sOspA 6/4(서열 번호: 3(핵산) 및 서열 번호 4(아미노산) 및 orig sOspA 6/4(서열 번호: 170(핵산) 및 서열 번호 171(아미노산)); 및 OspA 혈청형 5 및 3(lipB sOspA 5/3(서열 번호: 5(핵산) 및 서열 번호 6(아미노산) 및 orig sOspA 5/3(서열 번호: 172(핵산) 및 서열 번호 173(아미노산))으로부터 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 코딩하도록 설계되었다. 합성 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 키메라 OspA 유전자를 만들었다. 이 재조합 단백질은, 소정의 양상에서, 높은 수율 및 순도로 제조되고, 다양한 양상에서, 바람직한 활성을 최대화하고 바람직하지 않은 활성을 최소화하도록 조작된다.

키메라 OspA 핵산 분자 및 폴리펩타이드 분자

다양한 양상에서, 본 발명은 보렐리아의 키메라 OspA 핵산 및 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 본 발명의 OspA 핵산은 서열 번호 1(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 3(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 5(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 7(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 9(sOspA 6/4), 서열 번호 11(sOspA 5/3), 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.

서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11의 핵산 서열은 lipB 선도 서열(MRLLIGFALALALIG(서열 번호: 13))을 코딩하는 핵산 서열이 결여된다. 또한, 서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11의 핵산 서열은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에서의 lipB 선도 서열의 카복시 말단에 존재하는 시스테인 잔기 대신에 서열 번호 8, 서열 번호 10, 및 서열 번호 12의 아미노 말단에서 메티오닌 잔기를 코딩한다. 서열 번호 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5는 lipB sOspA 폴리뉴클레오타이드이고, 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6은 lipB sOspA 폴리펩타이드이다.

몇몇 양상에서, 본 발명은 돌연변이가 없고 코돈 최적화가 없는 보렐리아의 원래("orig") 키메라 OspA 핵산 및 폴리펩타이드 분자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 OspA 핵산은 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 또는 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 핵산 분자를 포함한다.

DNA에 대한 서열 확인 번호 및 키메라 OspA 분자에 대한 아미노산 서열은 하기 표 1에 기재되어 있다.

표 1. 키메라 OspA DNA 및 아미노산 서열

lipB sOspA 1/2 ²⁵¹

아미노산 서열(서열 번호: 2)

DNA 서열(서열 번호: 1)

상보석 가닥(서열 번호: 48)

lipB sOspA 6/4

아미노산 서열(서열 번호: 4)

DNA 서열(서열 번호: 3)

상보성 가닥(서열 번호: 49)

lipB sOspA 5/3

아미노산 서열(서열 번호: 6)

DNA 서열(서열 번호: 5)

상보성 가닥(서열 번호: 50)

sOspA 1/2 ²⁵¹

아미노산 서열(서열 번호: 8)

DNA 서열(서열 번호: 7)

상보성 가닥(서열 번호: 56)

sOspA 6/4

아미노산 서열(서열 번호: 10)

DNA 서열(서열 번호: 9)

상보성 가닥(서열 번호: 57)

sOspA 5/3

아미노산 서열(서열 번호: 12)

DNA 서열(서열 번호: 11)

상보성 가닥(서열 번호: 58)

Orig sOspA 1/2

아미노산 서열(서열 번호: 169)

DNA 서열(서열 번호: 168)

Orig sOspA 6/4

아미노산 서열(서열 번호: 171)

DNA 서열(서열 번호: 170)

Orig sOspA 5/3

아미노산 서열(서열 번호: 173)

DNA 서열(서열 번호: 172)

본 발명의 OspA 폴리펩타이드는 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열을 포함하거나, 이들로 실질적으로 이루어지거나, 이들로 이루어진 폴리펩타이드 및 관련 폴리펩타이드를 포함한다. 관련 폴리펩타이드는 OspA 폴리펩타이드 유사체, OspA 폴리펩타이드 변이체 및 OspA 폴리펩타이드 유도체를 포함한다. 몇몇 양상에서, OspA 폴리펩타이드는 이들이 제조된 방법에 따라 아미노 말단 메티오닌 잔기를 갖는다. 관련 양상에서, 본 발명의 OspA 폴리펩타이드는 OspA 활성을 포함한다.

일 실시양태에서, 관련 핵산 분자는 서열 번호 1(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 3(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 5(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 7(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 9(sOspA 6/4), 서열 번호 11(sOspA 5/3), 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 약 70퍼센트(70%) 동일하거나 유사한 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지고, 소정의 양상에서, 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)에 기재된 폴리펩타이드와 약 70퍼센트(70%) 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 이것으로 실질적으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다. 다양한 실시양태에서, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 1(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 3(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 5(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 7(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 9(sOspA 6/4), 서열 번호 11(sOspA 5/3), 서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 서열 번호 170(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 172(orig sOspA 5/3)에 기재된 뉴클레오타이드 서열과 약 70퍼센트, 또는 약 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79퍼센트, 또는 약 80퍼센트, 또는 약 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89퍼센트, 또는 약 90퍼센트, 또는 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99퍼센트 동일하거나, 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)에 기재된 폴리펩타이드 서열과 약 70퍼센트, 또는 약 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 또는 79퍼센트, 또는 약 80퍼센트, 또는 약 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 또는 89퍼센트, 또는 약 90퍼센트, 또는 약 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99퍼센트 동일한 폴리펩타이드를 코딩한다.

몇몇 실시양태에서, 서열 동일성 및/또는 유사성을 결정하는 방법은 시험된 서열 사이의 가장 큰 일치성을 제공하도록 설계된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 몇몇 양상에서, 2개의 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP(Devereux 등, Nucl . Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA(Altschul 등, J. Mol . Biol ., 215:403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. BLASTX 프로그램은 생물과학 정보 국제 센터(NCBI) 및 다른 소스(BLAST Manual, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; 상기 Altschul 등의 문헌(1990))로부터 공중에게 이용 가능하다. 동일성을 결정하기 위해 널리 공지된 스미스 워터만 알고리즘이 또한 이용된다.

2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 소정의 정렬 체계는, 몇몇 양상에서, 오직 2개의 서열의 짧은 구역의 일치성을 발생시키고, 이 작은 정렬된 구역은 2개의 전장 서열 사이의 유의적인 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 일 실시양태에서 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 표적 폴리펩타이드의 적어도 50개의 인접 아미노산에 걸친 정렬을 발생시킬 것이다. 예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) 를 사용하여, 퍼센트 서열 동일성이 결정되는 2개의 폴리펩타이드는 이의 각각의 아미노산의 최적 일치성(알고리즘에 의해 결정된 "일치된 폭")에 대해 정렬된다. 간격 벌어짐 페널티(gap opening penalty)(평균 대각선의 3배로 계산됨; "평균 대각선"는 사용된 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"는 특정한 비교 매트릭스에 의한 각각의 완벽한 아미노산 일치로 배정된 점수 또는 숫자임) 및 간격 연장 페널티(일반적으로 간격 벌어짐 페널티의 1/10배임), 및 비교 매트릭스, 예컨대 PAM 250 또는 BLOSUM 62는 알고리즘과 함께 이용된다. 표준 비교 매트릭스(PAM 250 비교 매트릭스를 위해 문헌[Dayhoff 등, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978)]; BLOSUM 62 비교 매트릭스를 위해 문헌[Henikoff 등, Proc . Natl. Acad . Sci USA, 89:10915-10919 (1992)] 참조)는 또한 알고리즘에 의해 이용된다.

다양한 양상에서, 폴리펩타이드 서열 비교를 위한 매개변수는 하기를 포함한다:

알고리즘: Needleman 등, J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);

비교 매트릭스: 상기 Henikoff 등(1992)으로부터의 BLOSUM 62;

간격 패널티: 12

간격 길이 패널티: 4

유사성의 쓰레스홀드: 0

GAP 프로그램은 상기 매개변수로 유용하다. 상기 언급된 매개변수는 GAP 알고리즘을 이용하는 폴리펩타이드 비교를 위한(말단 간격에 대한 패널티 없이) 디폴트 매개변수이다.

몇몇 양상에서, 핵산 분자 서열 비교를 위한 매개변수는 하기를 포함한다:

알고리즘: Needleman 등, supra (1970);

비교 매트릭스: 일치도 = +10, 불일치도 = 0

간격 패널티: 50

간격 길이 패널티: 3

GAP 프로그램은 또한 상기 매개변수로 유용하다. 상기 언급된 매개변수는 핵산 분자 비교를 위한 디폴트 매개변수이다. 프로그램 매뉴얼, 위스콘신 패키지, 버전 9(1997년 9월)에 기재된 것을 포함하여, 다른 예시적인 알고리즘, 간격 벌어짐 패널티, 간격 연장 패널티, 비교 매트릭스, 유사성의 쓰레스홀드 등은 당해 분야의 당업자에 의해 이용된다. 이루어지는 특정한 선택은 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이고 이루어지는 특수한 비교, 예컨대 DNA-대-DNA, 단백질-대-단백질, 단백질-대-DNA; 추가로, 소정의 쌍의 서열 사이에(이런 경우 GAP 또는 BestFit이 일반적으로 바람직함) 또는 하나의 서열과 서열의 큰 데이터베이스 사이에(이런 경우 FASTA 또는 BLASTA가 바람직함) 비교되는지에 따라 달라질 것이다.

핵산 서열의 차이는, 몇몇 양상에서, 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열에 대한 아미노산 서열의 보존적 및/또는 비보존적 변형을 발생시킨다.

서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)(및 코딩 뉴클레오타이드에 상응하는 변형)의 아미노산 서열에 대한 보존적 변형은 천연 발생 OspA 폴리펩타이드의 기능 및 화학 특징과 유사한 이 특징을 갖는 OspA 폴리펩타이드를 생성할 것이다. 반대로, OspA 폴리펩타이드의 기능 및/또는 화학 특징의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 시트 또는 나선 입체형태로서의 치환의 부위에서의 분자 골격의 구조, (b) 표적 자리에서의 분자의 전하 또는 소수화도, 또는 (c) 측쇄의 벌크의 유지에 대한 이의 효과가 상당히 다른 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 4(lipB sOspA 6/4), 서열 번호 6(lipB sOspA 5/3), 서열 번호 8(sOspA 1/2²⁵¹), 서열 번호 10(sOspA 6/4), 서열 번호 12(sOspA 5/3), 서열 번호 169(orig sOspA 1/2), 서열 번호 171(orig sOspA 6/4), 또는 서열 번호 173(orig sOspA 5/3)의 아미노산 서열에서의 치환을 선택함으로써 성취된다.

예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 몇몇 양상에서, 비네이티브 잔기에 의한 네이티브 아미노산 잔기의 치환을 수반하여 그 위치에서의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 대한 효과가 없거나 거의 없다. 더욱이, 폴리펩타이드에서의 임의의 네이티브 잔기는, 소정의 양상에서, "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"에 대해 이전에 기재된 바대로 알라닌으로 또한 치환된다.

보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서 합성이라기보다는 화학 펩타이드 합성에 의해 통상적으로 편입된 비천연 발생 아미노산 잔기를 포괄한다. 이는 펩티도미메틱 및 아미노산 모이어티의 다른 뒤집힌 또는 역전된 형태를 포함한다.

천연 발생 잔기는, 다양한 양상에서, 공통 측쇄 특성에 기초하여 종류로 분할된다:

1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) 산성: Asp, Glu;

4) 염기성: His, Lys, Arg;

5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.

예를 들어, 비보존적 치환은, 몇몇 양상에서, 다른 종류로부터의 구성원에 대한 이 종류 중 하나의 구성원의 교환을 수반한다. 이러한 치환된 잔기는, 다양한 양상에서, OspA 폴리펩타이드 오솔로그와 상동성 또는 유사한 OspA 폴리펩타이드의 구역, 또는 분자의 비상동성 구역으로 도입된다.

이러한 변화를 만드는 데 있어서, 아미노산의 수치 지수가 대개 고려된다. 각각의 아미노산은 이의 소수화도 및 전하 특징에 기초하여 수지 지수가 배정된다. 이들은 하기와 같다: 이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질에 대한 상호작용 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서의 수치 아미노산 지수의 중요성은 당해 분야에서 이해된다. Kyte 등, J. Mol . Biol., 157:105-131 (1982). 소정의 아미노산이 유사한 수치 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있고, 유사한 생물학적 활성을 여전히 보유하는 것으로 공지되어 있다. 수치 지수에 기초하여 변화를 만드는 데 있어서, 수치 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 소정의 양상에서 바람직하고, ±1 내인 것이 다른 양상에서 특히 바람직하며, ±0.5 내인 것이 다양한 양상에서 더 특히 바람직하다.

유사한 아미노산의 치환이 특히 생물학적 기능적 동등한 단백질 또는 펩타이드의 경우 친수화도에 기초하여 효과적으로 이루어질 수 있어서 생성된 것은, 부분적으로, 본 경우에서처럼 면역학적 실시양태에서 사용하도록 의도되는 것으로 당해 분야에서 또한 이해된다. 단백질의 가장 큰 국소 평균 친수화도는, 이의 인접 아미노산의 친수화도에 의해 지배되면서, 이의 면역원성 및 항원성, 즉 단백질의 생물학적 특성과 상관된다.

하기 친수화도 값은 이 아미노산 잔기에 배정된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 이소류신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수화도 값에 기초하여 변화를 만드는 데 있어서, 친수화도 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 소정의 양상에서 바람직하고, ±1 내인 것이 다른 양상에서 특히 바람직하고, ±0.5 내인 것이 다양한 양상에서 더 특히 바람직하다. 당업자는 또한 친수화도에 기초하여 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인한다. 이 구역은 또한 "에피토프 코어 구역"이라 칭한다.

원하는 아미노산 치환(보존적이든 또는 비보존적이든)은 이러한 치환이 바람직한 때에 당해 분야의 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 OspA 폴리펩타이드의 중요한 잔기를 확인하거나, 본 명세서에 기재된 기질에 대한 OspA 폴리펩타이드의 친화도를 증가시키거나 감소시키기 위해 이용될 수 있다.

몇몇 양상에서, 뉴클레오타이드 서열에서의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에서의 아미노산의 치환이 본 발명에 포함된다. 치환은 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 1 내지 35, 1 내지 40, 1 내지 45, 1 내지 50, 1 내지 55, 1 내지 60, 1 내지 65, 1 내지 70, 1 내지 75, 1 내지 80, 1 내지 85, 1 내지 90, 1 내지 95, 1 내지 100, 1 내지 150, 및 1 내지 200개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 마찬가지로, 치환은 1 내지 5, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 20, 1 내지 25, 1 내지 30, 1 내지 35, 1 내지 40, 1 내지 45, 1 내지 50, 1 내지 55, 1 내지 60, 1 내지 65, 1 내지 70, 1 내지 75, 1 내지 80, 1 내지 85, 1 내지 90, 1 내지 95, 및 1 내지 100개의 아미노산을 포함한다. 치환은 다양한 양상에서 보존적 또는 비보존적이다.

예시적인 아미노산 치환은 표 2에 기재되어 있다.

표 2. 아미노산 치환

당업자는 널리 공지된 기술을 이용하여 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 기재된 폴리펩타이드의 적합한 유사체 또는 변이체를 결정할 수 있다. 활성을 파괴하지 않고 변화될 수 있는 분자의 적합한 부위의 확인을 위해, 당해 분야의 당업자는 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 부위를 표적화할 수 있다. 예를 들어, 동일한 종 또는 다른 종으로부터 유사한 활성을 갖는 유사한 폴리펩타이드가 알려질 때, 당해 분야의 당업자는 OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 이러한 유사한 폴리펩타이드과 비교할 수 있다. 이러한 비교에 의해, 유사한 폴리펩타이드 중에서 보존된 분자의 부분 및 잔기를 확인할 수 있다. 이러한 유사한 폴리펩타이드에 대해 보존되지 않은 OspA 폴리펩타이드의 부위에서의 변화는 OspA 폴리펩타이드의 생물학적 활성 및/또는 구조에 부정적으로 영향을 미치지 않을 것으로 이해된다. 당해 분야의 당업자는, 비교적 보존된 구역에서도, 활성을 유지시키면서(보존적 아미노산 잔기 치환) 자연 발생 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산을 치환할 수 있다는 것을 또한 알 것이다.

몇몇 실시양태에서, OspA 폴리펩타이드 변이체는 글라이코실화 자리의 번호 및/또는 유형이 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 변경된 글라이코실화 변이체를 포함한다. 일 실시양태에서, OspA 폴리펩타이드 변이체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 기재된 아미노산 서열보다 더 많거나 더 적은 N 연결 글라이코실화 자리를 포함한다. N 연결 글라이코실화 자리는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr의 서열을 특징으로 하고, X로 지칭된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이 서열을 생성시키는 아미노산 잔기의 치환은 N 연결 탄수화물 사슬의 부가에 대한 가능한 새로운 자리를 제공한다. 대안적으로, 이 서열을 제거하는 치환은 기존의 N 연결 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 하나 이상의 N 연결 글라이코실화 자리(통상적으로 자연 발생인 것)가 제거되고 하나 이상의 새로운 N 연결 자리가 생성된 N 연결 탄수화물 사슬의 재배열이 또한 제공된다. 추가의 OspA 변이체는 하나 이상의 시스테인 잔기가 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 기재된 아미노산 서열과 비교하여 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로부터 결실되거나 이에 대해 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. OspA 폴리펩타이드가 예컨대 불용성 봉입체의 단리 후 생물학적 활성 입체형태로 재폴딩되어야 할 때 시스테인 변이체가 유용하다. 시스테인 변이체는 일반적으로 네이티브 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 갖고, 통상적으로 쌍을 이루지 않은 시스테인으로부터 생긴 상호작용을 최소화하는 짝수를 갖는다.

본 발명은 추가로 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173에 기재된 단백질의 에피토프 보유 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 용어 "에피토프"는 항체가 결합할 수 있는 단백질의 구역을 의미한다. 예를 들어, 문헌[Geysen 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 81:3998-4002 (1984)]을 참조한다. 에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있고, 후자는 단백질의 폴딩 시 에피토프를 형성하는 단백질의 불연속 구역으로 이루어진다. 선형 에피토프는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기 길이이다. 단백질 서열의 일부를 모방하는 비교적 짧은 합성 펩타이드는 통상적으로 부분적으로 모방된 단백질과 반응하는 항혈청을 이끌어낼 수 있다. 문헌[Sutcliffe 등, Science 219:660-666 (1983)]을 참조한다. 짧은 선형 에피토프를 인식하는 항체는 변성 단백질을 사용하는 분석적 및 진단학적 분야, 예컨대 웨스턴 블로팅에서 특히 유용하다. 문헌[Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4356 (1979)]을 참조한다. 짧은 펩타이드에 대한 항체는 소정의 경우에 또한 네이티브 입체형태의 단백질을 인식하고, 따라서 단백질 발현 및 단백질 단리를 모니터링하고, 예컨대 ELISA에 의해 또는 면역침강 연구에서 용액 중의 OspA 단백질을 검출하는 데 있어서 유용할 것이다.

키메라 OspA 핵산 분자 및 폴리펩타이드 분자의 합성

핵산 분자는 OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하고, 제한 없이, 재조합 DNA 방법 및 화학 합성을 포함하는 다양한 방식으로 용이하게 얻어질 수 있다.

재조합 DNA 방법은 일반적으로 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 및/또는 Ausubel 등, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY (1994)]에 기재된 것이다. 하기 기재된 설명에 따라 수행되는 재조합 발현 기술은, 다양한 양상에서, 이 폴리뉴클레오타이드를 제조하고 코딩된 폴리펩타이드를 발현하도록 뒤따른다. 예를 들어, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 적절한 벡터로 삽입함으로써, 당해 분야의 당업자는 많은 분량의 원하는 뉴클레오타이드 서열을 용이하게 제조할 수 있다. 서열은 이후 검출 프로브 또는 증폭 프라이머를 생성하도록 사용될 수 있다. 대안적으로, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 발현 벡터를 적절한 숙주로 도입함으로서, 코딩된 OspA 폴리펩타이드 또는 OspA 폴리펩타이드는 몇몇 양상에서 다량으로 제조된다.

마찬가지로, 핵산 및 폴리펩타이드의 화학 합성은 당해 분야, 예컨대 문헌[Engels 등, Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 (1989)]에 기재된 것에 널리 공지되어 있다. 이 방법은 특히 핵산 합성을 위한 포스포트리에스터, 포스포르아미다이트 및 H-포스포네이트 방법을 포함한다. 일 양상에서, 이러한 화학 합성을 위한 방법은 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용하는 중합체 지지 합성이다. 통상적으로, OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA는 수천 개 길이의 뉴클레오타이드일 것이다. 약 100개의 뉴클레오타이드보다 큰 핵산은 이 방법을 이용하여 몇몇 단편으로서 합성된다. 단편은 이후 본 발명의 전장 뉴클레오타이드 서열을 형성하도록 함께 결찰된다. 특정한 양상에서, 폴리펩타이드의 아미노 말단을 코딩하는 DNA 단편은 메티오닌 잔기를 코딩하는 ATG를 갖는다.

본 발명의 특정한 양상에서, 키메라 OspA 코딩 서열은 합성 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조한다. 보렐리아 세포로부터의 DNA가 사용되지 않으므로, 합성 접근법의 추가의 이점은 보렐리아 배양 배지에 존재하는 동물 기원의 물질(즉, 혈청 또는 혈청 알부민)에 포함된 우연한 물질에 의한 오염의 회피이다. 이 전략은 발현을 최적화하기 위한(OspB 선도 서열), 클로닝을 수월하게 하도록 제한 자리를 도입하기 위한, 또는 잠재적인 지적 재산권 쟁점을 피하기 위한 변형과 같은 서열 변경이 단일 단계로 이루어지게 하므로, 이는 또한 키메라 유전자를 제조하는 데 필요한 조작의 수를 실질적으로 감소시킨다. 이. 콜라이에서 드물게 사용되는 코돈의 존재가 외래 유전자의 고수준 발현에 잠재적 장애를 제시하는 것으로 알려져 있으므로, 이는 또한 코돈 사용빈도가 이. 콜라이 숙주에 대해 최적화되게 한다(Makoff 등, Nucleic Acids Res . 17:10191-202, 1989; Lakey 등, Infect . Immun . 68:233-8, 2000). 당업자에게 공지된 다른 방법을 또한 이용한다.

소정의 실시양태에서, 핵산 변이체는 주어진 숙주 세포에서 OspA 폴리펩타이드의 최적 발현에 변경된 코돈을 포함한다. 특정한 코돈 변경은 발현에 선택된 OspA 폴리펩타이드(들) 및 숙주 세포(들)에 따라 달라진다. 이러한 "코돈 최적화"는 예를 들어 주어진 숙주 세포에서 고도로 발현된 유전자에서 사용하기에 바람직한 코돈을 선택함으로써 다양한 방법으로 실행될 수 있다. 고도로 발현된 박테리아 유전자의 코돈 선호도에 대해 코돈 빈도 테이블을 포함한 컴퓨터 알고리즘, 예컨대 "Ecohigh.cod"가 몇몇 경우에 이용되고, 위스콘신 대학교 패키지 버전 9.0(Genetics Computer Group, Madison, WI)에 의해 제공된다. 다른 유용한 코돈 빈도 테이블은 "Celegans_high.cod", "Celegans_low.cod", "Drosophila_high.cod", "Human_high.cod", "Maize_high.cod", 및 "Yeast_high.cod"를 포함한다.

OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 소정의 양상에서 표준 결찰 기술을 이용하여 적절한 발현 벡터로 삽입된다. 벡터는 통상적으로 사용된 특정한 숙주 세포에서 기능적이도록 선택된다(즉, 벡터는 숙주 세포 기계에 알맞아서 유전자의 증폭 및/또는 유전자의 발현이 발생할 수 있다). OspA 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 다양한 양상에서 원핵생물, 효모, 곤충(바큘로바이러스 시스템) 및/또는 진핵생물 숙주 세포에서 증폭/발현된다. 숙주 세포의 선택은 부분적으로 OspA 폴리펩타이드가 번역 후 변형(예를 들어, 글라이코실화 및/또는 포스포릴화)되는지에 따라 달라진다. 그렇다면, 효모, 곤충, 또는 포유동물 숙주 세포가 바람직하다. 발현 벡터의 검토를 위해, 문헌[Meth. Enz., vol.185, D.V. Goeddel, ed., Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)]을 참조한다.

클로닝 벡터는 당해 분야에 공지된 모두를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 일 양상에서, pUC18은 모든 중간 단계에 대해 클로닝 벡터로서 사용되는데, 왜냐하면 유전 조작 및 서열분석이 벡터 pET30a보다 이 플라스미드로 더 쉽기 때문이다. 주요 특징은 특히나 염기쌍 149 내지 469의 LacZ 알파 펩타이드를 코딩하는 lacZ 유전자 단편(염기쌍 507에서의 lac 프로모터), 염기쌍 1629 내지 2486의 암피실린 내성 결정부위를 코딩하는 bla 유전자(염기쌍 2521에서의 bla 프로모터), 염기쌍 867에서의 복제 기원 및 염기쌍 185 내지 451의 다수의 클로닝 자리이다(도 12).

발현 벡터는 제한 없이 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 네이키드 또는 리포솜에 포함됨) 및 재조합 폴리뉴클레오타이드를 편입한 바이러스를 포함하여 당해 분야에 공지된 것 모두를 포함한다. 발현 벡터는 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 형질전환 또는 형질감염을 통해 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현을 위해 적절한 숙주 세포로 (예를 들어, 형질전환 또는 형질도입을 통해) 도입된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]을 참조한다. 일 양상에서, pET30a(Novagen)는 최종 완전한 OspA 유전자 삽입체에 대한 발현 벡터로서 사용된다. pET 벡터에서, 유전자는 T7 프로모터의 제어 하에 클로닝되고, 발현은 숙주 세포에서 T7 RNA 중합효소의 소스를 제공함으로써 유도된다(T7 RNA 중합효소의 소스가 제공될 때까지 발현이 발생하지 않는다). 주요 특징은 염기쌍 4048 내지 4860에서의 카나마이신 내성을 코딩하는 유전자(kan), 염기쌍 826 내지 1905에서의 lacI 유전자, 염기쌍 4956 내지 5411에서의 F1 복제 기원 및 염기쌍 158 내지 346으로부터의 다수의 클로닝 자리이다(도 13).

벡터가 작제되고 OspA 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 분자가 벡터의 적절한 자리로 삽입된 후, 완성된 벡터를 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위해 적합한 숙주 세포로 삽입한다. 선택된 숙주 세포로의 OspA 폴리펩타이드에 대한 발현 벡터의 형질전환은 다양한 양상에서 널리 공지된 방법, 예컨대 형질감염, 감염, 염화칼슘 매개 형질전환, 전기천공, 미량주사, 리포펙션 또는 DEAE-덱스트란 방법 또는 다른 공지된 기술에 의해 성취된다. 선택된 방법은 부분적으로 사용되는 숙주 세포의 유형의 기능일 것이다. 이 방법 및 다른 적합한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 상기 Sambrook 등의 문헌에 기재되어 있다.

숙주 세포는 몇몇 양상에서 원핵생물 숙주 세포(예컨대, 이. 콜라이) 또는 진핵생물 숙주 세포(예컨대 효모, 곤충 또는 척추동물 세포)이다. 숙주 세포는, 적절한 조건 하에 배양될 때, OspA 폴리펩타이드를 합성하고, 이 폴리펩타이드는 후속하여 배양 배지로부터 수집되거나(숙주 세포가 이를 배지로 분비하는 경우), 이를 생성하는 숙주 세포로부터 직접(이것이 분비되지 않는 경우) 수집될 수 있다. 적절한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자, 예컨대 원하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩타이드 변형(예컨대, 글라이코실화 또는 포스포릴화), 및 생물학적 활성 분자로의 용이한 폴딩에 따라 달라진다. 이러한 숙주 세포는 박테리아, 효모, 진균, 바이러스, 무척추동물, 및 포유동물 소스의 숙주 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 숙주 세포의 예에 대해, 문헌[Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조한다. 추가의 양상에서, 당해 분야에서 사용되는 숙주 세포는 (상기) 마니아티스(Maniatis) 매뉴얼의 공개 이후 또한 본 발명에서 사용된다.

일 양상에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 세포이다. 이. 콜라이의 적합한 균주는 BL21, DH5α, HMS174(DE3), DH10B, 또는 E. CLONI 10G(Lucigen, Middleton, Wis.)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 벡터의 형질전환 효율 및/또는 유지를 증대시키도록 조작된다.

일 양상에서, 이. 콜라이 균주 DH5α[유전자형: 말단 A1 hsdR17(rK-mK+) supE44 thi-1 recA1 gyrA(Nalr) relA1 D(lacZYA-argF)U169 deoR(F80dlacD(lacZ)M15](Gibco BRL)는 모든 중간 클로닝 단계에 사용된다. 이 균주는 유전자 조작에서 가장 널리 사용되는 숙주 중 하나인 이. 콜라이 균주 K12로부터 유래한다. 이 균주는 암피실린 내성 유전자(amp)를 포함하는 벡터에 의한 형질전환체의 선택을 허용하는 amp-이다.

다른 양상에서, 이. 콜라이 균주 HMS174(DE3)는 발현을 위해 숙주로서 사용된다. 이. 콜라이 HMS174(DE3) 숙주 세포[유전자형: F-recA1 hsdR(rk12- mk12+) RifR (DE3)](Novagen)는 최종 클로닝 단계에 대해 본 명세서에 기재된 다양한 예에서 사용된다. 이 균주는 카나마이신 내성 유전자(kan)를 포함하는 벡터에 의한 형질전환체의 선택을 허용하는 kan-이다.

OspA 폴리펩타이드 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포는 당업자에게 널리 공지된 표준 배지를 사용하여 배양된다. 배지는 일반적으로 세포의 성장 및 생존에 필요한 모든 영양소를 포함할 것이다. 이. 콜라이 세포를 배양하기에 적합한 배지는 예를 들어 루리아 브로쓰(LB) 및/또는 테리픽 브로쓰(Terrific Broth: TB)를 포함한다. 진핵생물 세포를 배양하기에 적합한 배지는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute) 배지 1640(RPMI 1640), 최소 필수 배지(MEM) 및/또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)를 포함하고, 이들 모두 몇몇 경우에 배양되는 특정한 세포주에 의해 표시되는 바대로 혈청 및/또는 성장 인자로 보충된다. 곤충 배양물에 적합한 배지는 필요한 바대로 이스톨레이트(yeastolate), 락트알부민 가수분해물 및/또는 소 태아 혈청이 보충된 그레이스 배지이다.

통상적으로, 형질전환된 세포의 선택적 성장에 유용한 항생제 또는 다른 화합물은 배지에 대한 보충물로서 첨가된다. 사용되는 화합물은 숙주 세포가 형질전환된 플라스미드에 존재하는 선택 가능한 마커 구성요소에 의해 지시될 것이다. 예를 들어, 선택 가능한 마커 구성요소가 카나마이신 내성인 경우, 배양 배지에 첨가되는 화합물은 카나마이신일 것이다. 선택적 성장을 위한 다른 화합물은 암피실린, 테트라사이클린 및 네오마이신을 포함한다.

숙주 세포에 의해 생성된 OspA 폴리펩타이드의 양은 당해 분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 이러한 방법은, 제한 없이, 웨스턴 블롯 분석, SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 비변성 겔 전기영동, 크로마토그래피 분리, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 면역검출, 예컨대 면역침강 및/또는 활성 검정, 예컨대 DNA 결합 겔 이동 검정을 포함한다.

몇몇 경우에, OspA 폴리펩타이드는 단리 시 생물학적으로 활성이 아니다. 폴리펩타이드를 "재폴딩"하거나 이를 이의 3차 구조로 변환시키고 이황화 결합을 생성하기 위한 다양한 방법이 생물학적 활성을 복구하도록 이용된다. 이러한 방법은 가용화 폴리펩타이드를 특정 농도의 카오트로프(chaotrope)의 존재 하에 일반적으로 7 초과의 pH에 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프의 선택은 봉입체 가용화에 이용된 선택과 매우 유사하지만, 일반적으로 카오트로프는 더 낮은 농도로 사용되고 반드시 가용화에 사용된 카오트로프와 동일하지는 않는다. 몇몇 경우에, 재폴딩/산화 용액은 또한 단백질의 시스테인 브릿지(들)의 형성 시 이황화 셔플링이 발생하게 하는 특정한 산화환원 전위를 생성시키는 특정 비율의 환원제와 함께 이의 산화된 형태 또는 환원제를 포함한다. 흔히 사용되는 산화환원 커플 중 몇몇은 시스테인/시스타민, 글루타티온(GSH)/디티오비스 GSH, 염화제1구리, 티티오트레이톨(DTT)/디티안 DTT, 및 2-2 머캅토에탄올(bME)/디티오-b(ME)를 포함한다. 공용매는 대개 재폴딩의 효율을 증가시키도록 사용되고, 이러한 목적에 사용되는 가장 흔한 시약은 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글라이콜, 아르기닌 등을 포함한다.

봉입체가 OspA 폴리펩타이드의 발현 시 상당한 정도로 형성되지 않는 경우, 폴리펩타이드는 세포 균질액의 원심분리 후 상청액 중에 주로 발견될 것이다. 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재되거나 당해 분야에서 달리 공지된 것과 같은 방법을 이용하여 상청액으로부터 추가로 단리된다.

용액으로부터의 OspA 폴리펩타이드의 정제는 당해 분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 성취될 수 있다. 폴리펩타이드가 이의 카복실 또는 아미노 말단에서 태그, 예컨대 헥사히스티딘(OspA 폴리펩타이드/헥사His) 또는 다른 작은 펩타이드, 예컨대 FLAG(Eastman Kodak Co.(코네티컷주 뉴 헤븐)) 또는 myc(인비트로겐(캘리포니아주 칼스바드))를 포함하도록 합성되는 경우, 폴리펩타이드는 칼럼 매트릭스가 태그에 대해 고친화도를 갖는 친화도 칼럼을 통해 용액을 통과시킴으로써 1단계 공정으로 대개 정제된다. 예를 들어, 폴리히스티딘은 높은 친화도 및 특이성으로 니켈에 결합하고; 따라서 니켈의 친화도 칼럼(예컨대, 퀴아젠® 니켈 칼럼)은 OspA 폴리펩타이드/폴리His의 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel 등, eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York (1993)]을 참조한다.

추가로, OspA 폴리펩타이드는 OspA 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하고 이에 결합할 수 있는 단일클론 항체의 사용을 통해 정제될 수 있다. 정제를 위한 적합한 절차는 따라서 제한 없이, 친화도 크로마토그래피, 면역친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 분자체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 전기영동(네이티브 겔 전기영동 포함), 이어서 겔 용리, 및 준비용 등전 초점화("이소프라임(Isoprime)" 기계/기술, Hoefer Scientific(캘리포니아주 샌 프란시스코))를 포함한다. 몇몇 경우에, 순도 증가를 성취하기 위해 2 이상의 정제 기술을 조합한다.

OspA 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 기술, 예컨대 문헌[Merrifield 등, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 (1963), Houghten 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985), 및 Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)]에 기재된 것을 이용하여 화학 합성 방법(예컨대, 고상 펩타이드 합성)에 의해 또한 제조된다. 이러한 폴리펩타이드는 아미노 말단에서의 메티오닌으로 또는 이것 없이 합성된다. 화학적으로 합성된 OspA 폴리펩타이드는 몇몇 양상에서 이황화 브릿지를 형성하기 위해 이 문헌에 기재된 방법을 이용하여 산화된다. 화학적으로 합성된 OspA 폴리펩타이드는 재조합으로 생성되거나 천연 소스로부터 정제된 상응하는 OspA 폴리펩타이드에 필적하는 생물학적 활성을 갖는 것으로 예상되고, 따라서 대개 재조합 OspA 폴리펩타이드와 상호 교환되어 사용된다. 핵산 및 폴리펩타이드를 제조하기 위한 수많은 추가의 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 상기 방법은 OspA 폴리펩타이드를 제조하기 위해 이용될 수 있는 것으로 이해된다.

OspA 폴리펩타이드 분자의 화학 유도체

OspA 폴리펩타이드의 화학적으로 변형된 유도체는 하기 본 명세서에 기재된 개시내용을 고려하여 당해 분야의 당업자에 의해 제조된다. OspA 폴리펩타이드 유도체는 폴리펩타이드에 천연 부착된 분자의 유형 또는 위치에서 상이한 방식으로 변형된다. 유도체는 몇몇 양상에서 하나 이상의 천연 부착 화학기의 결실에 의해 형성된 분자를 포함한다. 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체는 일 양상에서 하나 이상의 중합체의 공유 부착에 의해 변형된다. 예를 들어, 선택된 중합체는 통상적으로 수용성이어서 이것이 부착된 단백질은 수성 환경, 예컨대 생리학적 환경에서 참여하지 않는다. 적합한 중합체의 범위 내에 중합체의 혼합물이 포함된다. 소정의 양상에서, 최종 생성물 제조의 치료학적 용도를 위해, 중합체는 약학적으로 허용될 것이다.

중합체는 각각 다양한 양상에서 임의의 분자량을 갖고 분지 또는 비분지이다. 중합체는 각각 통상적으로 약 2kDa 내지 약 100kDa(용어 "약"는 수용성 중합체의 제조에서 몇몇 분자는 시작된 분자량보다 더 높거나, 몇몇은 더 작다는 것을 나타냄) 사이의 평균 분자량을 갖는다. 각각의 중합체의 평균 분자량은 다양한 양상에서 약 5kDa 내지 약 50kDa, 약 12kDa 내지 약 40kDa, 및 약 20kDa 내지 약 35kDa이다.

적합한 수용성 중합체 또는 이의 혼합물은 N 연결 또는 O 연결 탄수화물; 당; 인산염; 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)(모노-(C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글라이콜을 포함하는 단백질을 유도체화하기 위해 사용된 PEG의 형태를 포함); 모노메톡시-폴리에틸렌 글라이콜; 덱스트란(예컨대, 약 6kDa 등의 저분자량 덱스트란); 셀룰로스; 또는 다른 탄수화물계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알콜을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체의 공유 부착된 다합체를 제조하기 위해 때때로 사용되는 이작용성 가교결합 분자가 또한 본 발명에 포함된다.

몇몇 양상에서, 단백질을 활성화 중합체 분자와 반응시키기 위해 이용되는 임의의 적합한 조건 하에 화학 유도체화를 수행한다. 폴리펩타이드의 화학 유도체를 제조하는 방법은 일반적으로 (a) 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 또는 173의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 OspA 폴리펩타이드 변이체가 하나 이상의 중합체 분자에 부착되게 하는 조건 하에 폴리펩타이드를 활성화 중합체 분자(예컨대, 중합체 분자의 반응성 에스터 또는 알데하이드 유도체)와 반응시키는 단계, 및 (b) 반응 생성물(들)을 얻는 단계를 포함한다. 최적 반응 조건은 공지된 매개변수 및 원하는 결과에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 중합체 분자:단백질의 비율이 더 높을수록, 부착된 중합체 분자의 백분율이 더 높다. 일 실시양태에서, OspA 폴리펩타이드 유도체는 아미노 말단에서 단일 중합체 분자 모이어티를 갖는다(예를 들어, 미국 특허 제5,234,784호 참조).

폴리펩타이드의 페길화는 소정의 양상에서 예를 들어 하기 참조문헌에 기재된 바대로 당해 분야에 공지된 임의의 페길화 반응에 의해 구체적으로 수행된다: Francis 등, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); EP 0154316; EP 0401384 및 미국 특허 제4,179,337호. 예를 들어, 페길화는 본 명세서에 기재된 반응성 폴리에틸렌 글라이콜 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 아실화 반응을 위해, 선택된 중합체(들)는 단일 반응성 에스터기를 가져야 한다. 환원 알킬화를 위해, 선택된 중합체(들)는 단일 반응성 알데하이드기를 가져야 한다. 반응성 알데하이드는 예를 들어 물에 안정한 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온알데하이드, 또는 모노 C1-C10 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(미국 특허 제5,252,714호 참조)이다.

다른 실시양태에서, OspA 폴리펩타이드는 바이오틴에 화학적으로 커플링되고, 접합된 바이오틴/OspA 폴리펩타이드 분자는 이후 아비딘에 결합하여, 4가 아비딘/바이오틴/OspA 폴리펩타이드 분자를 발생시킨다. OspA 폴리펩타이드는 또한 디나이트로페놀(DNP) 또는 트리나이트로페놀(TNP)에 공유 커플링되고, 생성된 접합체는 항-DNP 또는 항-TNP-IgM에 의해 침전되어 10의 원자가를 갖는 십합체 접합체를 형성한다. 본 명세서에 개시된 OspA 폴리펩타이드 유도체는 소정의 양상에서 비유도체화 분자와 비교하여 추가의 활성, 증대된 또는 감소된 생물학적 활성, 또는 다른 특징, 예컨대 증가된 또는 감소된 반감기를 갖는다.

면역원성 조성물, 백신, 및 항체

본 발명의 몇몇 양상은 면역원성 조성물 및 백신을 포함한다. 본 발명의 면역원성 키메라 OspA 분자는 피험자에서 항-OspA 면역 반응을 발생시키기 위해(즉, 백신으로 작용) 항원(들)으로서 조합되어 사용된다. 예시적인 면역원성 OspA 폴리펩타이드(서열 번호 2, 4, 6, 169, 171, 및 173)는 보렐리아의 임의의 하나 이상의 혈청형 1-6, 및 더 일반적으로 본 명세서에 기재된 보렐리아의 많은 다른 종에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 조합되어 전달된다. 면역 반응은 또한 본 발명의 OspA 폴리펩타이드를 코딩하는 플라스미드 벡터의 전달(즉, "네이키드 DNA"의 투여) 에 의해 상승될 수 있다. 몇몇 양상에서, OspA 핵산 분자(서열 번호 1, 3, 5, 168, 170, 및 172)는 주사에 의해, 리포솜을 통해, 또는 본 명세서에 기재된 다른 투여 방식에 의해 전달된다. 면역화되면, 피험자는 보렐리아의 혈청형 1-6의 OspA 단백질 및 보렐리아의 다른 종에 대해 고조된 면역 반응을 발생시킨다.

상기 기재된 바대로, 따라서, OspA 폴리펩타이드 및 OspA 핵산 분자 둘 다는 본 발명의 면역원성 및/또는 백신 조성물에 사용되는 항원으로서 포함된다. 소정의 양상에서, 핵산 및 단백질 둘 다는 피험자에 전달된다. 특정한 양상에서, 핵산 백신에 대한 면역 반응은 동족 단백질의 동시 투여에 의해 증대되는 것으로 제안된다(WO 99/30733 참조). 핵산 및 단백질은 동일한 조성물로 투여될 필요는 없다. 둘 다는 단지, 몇몇 양상에서, 핵산이 면역계를 초회 감작한 후까지 감춰지거나 저지되는, 단백질에 의한 면역 반응의 유도 단계 동안 투여되어야 한다. 특정한 양상에서, 백신은 핵산 및 단백질 항원을 항원 제시 세포로 전달하도록 의도된다(WO 97/28818 참조). 다양한 양상에서, 핵산 및 단백질은 예를 들어 공유 접합에 의해 복합체화된다. 추가의 양상에서, 리포솜 제제는 또한 백신 항원의 면역원성을 증대시키도록 포함된다.

소정의 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 OspA 분자를 약제학적 담체와 조합하여 포함하고, 상기 조성물은 외부 표면 단백질 A(OspA) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도한다. 몇몇 양상에서, 면역원성 조성물은 또한 안정화제 또는 항균성 보존제를 포함한다. 특정한 양상에서, 면역원성 조성물은 보렐리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 유도한다. 다른 양상에서, 상기 조성물은 보렐리아를 중화시키는 항체의 생성을 유도한다.

몇몇 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 키메라 OspA 분자(항원)를 포함하는 면역원성 조성물에서의 애주번트의 용도를 포함한다. 소정의 양상에서, 항원이 애주번트와 동시 투여되는 경우 면역원성은 상당히 개선된다. 몇몇 양상에서, 애주번트는 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 0.001% 내지 50% 용액으로서 사용된다. 애주번트는 항원의 면역원성을 증대시키지만 반드시 그 자체가 면역원성은 아니다.

애주번트는 다양한 양상에서 백신접종에 대한 수많은 긍정적인 효과를 갖는다. 몇몇 경우에, 애주번트는 피험자에서의 강력한 면역 반응의 생성을 가속시킨다. 애주번트는 다른 경우에 면역 반응의 수준을 증가시키고, 이의 기간을 연장하고, 면역 기억을 개선한다. 애주번트는 대개 특정한 피험자 군(예를 들어, 고령 또는 면역 억제 환자)의 약해진 면역력을 극복하거나 특정한 "위험군"(예컨대, 유아 또는 노인(이들로 제한되지는 않음))의 면역원성을 개선하기 위해 사용된다. 애주번트의 면역 증대 효과는 다양한 경우에 보호 반응을 제공하기 위해 최종 제제에서 필요한 항원의 양의 감소(즉, 용량 절약)를 발생시킨다.

일반적으로, 애주번트는 이의 주요 작용 기전에 기초하여 2개의 주요 군으로 분류된다: 제1 군은 선천성 면역력 시스템 수용체 또는 센서의 효현제, 예컨대 톨 유사 수용체(TLR) 효현제, C형 렉틴 수용체 효현제, 레티노산 유도성 유전자 1(RIG-1) 유사 수용체(RLR) 효현제, 및 뉴클레오타이드-결합 도메인 및 류신 농후 반복부 함유 수용체(NLR) 효현제이다. 제2 군은 TLR 독립적 애주번트로도 공지된 전달 시스템으로 작용하는 물질이다. TLR 효현제 애주번트의 예는 상업용 B형 간염 및 유두종 바이러스 백신에서의 애주번트로서 사용되는 TLR-4 효현제인 ASO4(Glaxo Smith Kline); 플라젤린-융합 단백질 TLR-5 효현제인 박시네이트(Vaxinate); 및 다수의 TLR-9 효현제 애주번트, 예컨대 이중 가닥 DNA(dsDNA) 및 올리고뉴클레오타이드 CpG 또는 ODN1a를 사용하는 것이다. 애주번트의 이 카테고리에 해당하는 다른 TLR-효현제는 글라이코리피드(TLR-1), 리포테이코산 및 지단백(TLR-1/TLR-2 및 TLR-2/TLR-6) 리포폴리사카라이드, 리포올리고사카라이드 및 모노포스포리트 지질 A(MPL)(TLR-4), 이중 가닥 RNA(TLR-3); 펩티도글라이칸(TLR-6), 단일 가닥 RNA(TLR-7)를 포함한다. 2개의 C형 렉틴 수용체 효현제 애주번트의 예는 β-글루칸(덱틴(Dectin)-1) 및 만나스(덱틴-2)(둘 다 진균 세포벽으로부터 유래)를 포함한다. RLR 수용체 효현제 애주번트는 단일 가닥 바이러스 RNA 및 이중 가닥 바이러스 DNA를 포함하지만, NLR 효현제 애주번트는 펩티도글라이칸 분해 생성물, 미생물 생성물, 및 비감염성 결정 입자를 포함한다. 모든 경우에, 효현제는 면역 증대 염증 반응을 촉발하기 위해 선천성 면역계 수용체를 직접 활성화함으로써 작용한다. TLR 독립적 애주번트인 애주번트의 제2 군은 대부분 전달 시스템으로서 작용하고 항원 제시 세포에 의한 항원 흡수 및 제시를 증대시킨다. 몇몇 경우에, 이 애주번트는 또한 면역계의 세포에 대한 항원의 느린 지속 방출을 수월하게 하는 데폿(depot) 효과를 생성하도록 투여 자리 근처에 항원을 국부적으로 보유함으로써 작용할 수 있다. 애주번트는 또한 항원 데폿에 대한 면역계의 세포를 끌어당기고 이러한 세포를 자극하여 면역 반응을 발생시킨다. TLR 독립적 애주번트의 예는 미네랄 염, 예컨대 수산화알루미늄 및 인산알루미늄(총체적으로 명반이라 칭함) 및 인산칼슘; 수중유 에멀션(예를 들어, MF59, AS03 및 ProVax); 유중수 에멀션(Montanide, TiterMax); 바이오중합체(Advax); 식물 유도체, 특히 남아메리카 몰리나 숍 나무 퀼라야 사포나리아(Quillaja saponaria)(SFA-1, QS21, Quil A)의 껍질로부터의 트리테르페노이드 추출물인 사포닌의 분획; 사포닌 분획, 스테롤 및, 임의로, 인지질(ISCOMATRIX 및 Matrix-M)로 이루어진 면역 자극 복합체(ISCOM 및 ISCOM 매트릭스); 다양한 크기 및 전하의 인지질 구인 리포솜(Vaxfectin 및 Vaxisome); 인플루엔자 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제와 같은 바이러스 표면 항원을 함유하는 리포솜인 비로솜 및 바이러스 유사 입자; 다양한 조성물의 나노입자; 키토산, 펩타이드, 예컨대 폴리아르기닌 및 KLK 펩타이드로 공지된 펩타이드를 포함한다.

상기 본 명세서에 기재된 애주번트는 단독으로 또는 조합되어 사용된다. TLR 의존적 애주번트 및 TLK 독립적 애주번트의 조합이 대개 바람직한데, 항원 및 TLR 의존적 애주번트가 TLR 독립적 애주번트에 의해 항원 제시 세포로 통행하는 것으로 생각되기 때문이고, 이는 또한 흡수 및 안정성을 자극할 것이고, TLR 의존적 애주번트는 TLR 신호전달의 활성화를 통해 면역을 직접 증대시킬 것이다.

TLR 의존적 애주번트 및 TLR 독립적 애주번트 조합의 예는 AS01: MPL(TLR-4 효현제), 리포솜 및 QS-21(둘 다 TLR 독립적 애주번트)의 혼합물; AS04: MPL(TLR-4 효현제) 및 수산화/인산 알루미늄; IC31: ODN1a(TLR-9 효현제) 및 KLK 펩타이드(TLR 독립적 애주번트); 및 프로인트 완전 애주번트, 마이코박테리움 튜버큘로시스(TLR-4 효현제)의 막 추출물 및 수중유 에멀션(TLR 독립적 애주번트)을 포함한다.

다수의 TLR 의존적 애주번트로 이루어진 조합이 또한 애주번트 첨가 백신 제제의 면역 증대 효과를 최대화하기 위해 사용된다. 상이한 어댑터(adaptor) 단백질을 사용하는 TLR의 효현제는 대개 조합된다(예를 들어, 엔도솜 또는 리소좀 소기관에서 발현되고 MyD88(골수 분화 1차 반응 단백질) 어댑터 단백질 경로를 이용하는, TLR(TLR-7, TLR-8 및 TLR-9)의 효현제에 의해 TRIF(INF-β 유도하는 톨/인터류킨 1 수용체 도메인 함유 어댑터 단백질) 어댑터 경로를 이용하는, 혈장 막 결합 TLR-3 또는 TLR-4 수용체에 대한 효현제의 조합).

이 면역자극 물질 또는 애주번트는 또한 백신에서 숙주 면역 반응을 개선한다. 몇몇 경우에, 리포폴리사카라이드와 같은 물질은 백신으로서 사용되는 사멸된 또는 약독화된 박테리아의 성분이므로 내인성 애주번트로서 작용할 수 있다. 외인성 애주번트, 예컨대 상기 본 명세서에 기재된 것은 통상적으로 항원에 비공유 결합되고 숙주 면역 반응을 증대시키도록 제형화되는 면역조절제이다.

광범위한 외인성 애주번트가 항원에 대한 강력한 면역 반응을 유발할 수 있다. 이는 막 단백질 항원에 복합체화된 사포닌(면역 자극 복합체), 광유와의 플루로닉 중합체, 광유 중의 사멸된 마이코박테리아, 프로인트 완전 애주번트, 박테리아 생성물, 예컨대 무라밀 디펩타이드(MDP) 및 리포폴리사카라이드(LPS), 및 지질 A, 및 리포솜을 포함한다. 체액성 면역 반응(HIR) 및 세포 매개 면역(CMI)을 효과적으로 유도하기 위해, 면역원은 소정의 양상에서 애주번트 중에 유화된다.

이상적인 애주번트의 바람직한 특징은 하기 중 임의 또는 모두를 포함한다: 독성 결여; 장기간 지속되는 면역 반응을 자극하는 능력; 제조의 단순성 및 장기간 저장 시 안정성; 다양한 경로에 의해 투여된 항원에 대한 CMI 및 HIR 둘 다를 발생시키는 능력; 다른 애주번트와의 상승작용; 항원 제시 세포(APC)의 집단과 선택적으로 상호작용할 수 있는 능력; 적절한 T_H1 또는 T_H2 세포 특이적 면역 반응을 특이적으로 발생시키는 능력; 및 항원에 대한 적절한 항체 아이소타입 수준(예를 들어 IgA)을 선택적으로 증가시키는 능력.

미국 특허 제4,855,283호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)는 이에 대해 N-글라이코실아마이드, N-글라이코실우레아 및 N-글라이코실카바메이트를 포함하는 글라이코리피드 유사체를 교시하고, 이들 각각은 당 잔기에서 면역조절제 또는 애주번트로서 아미노산에 의해 치환된다. 미국 특허 제4,855,283호는 천연 발생 글라이코리피드, 예컨대 글라이코스핑고리피드 및 글라이코글리세로리피드에 구조 유사성을 나타내는 N-글라이코리피드 유사체가 단순 포진 바이러스 백신 및 위광견병 바이러스 백신 둘 다에서 강한 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 보고하였다. 몇몇 글라이코리피드는 천연 발생 지질 잔기의 기능을 모방하도록 아노머 탄소 원자를 통해 당에 직접 연결된 지방산 및 장쇄 알킬아민으로부터 합성되었다.

몇몇 양상에서, 면역원성 조성물은 면역원에 대한 면역 반응을 증대시키기에 충분한 애주번트의 양을 포함한다. 적합한 애주번트는 알루미늄염(인산알루미늄 또는 수산화알루미늄), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 뮤라밀 펩타이드, 사포닌 유도체, 마이코박테리움 세포벽 제제, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, 퀼(Quil) A, 콜라라 독소 B 아단위, 폴포스파젠 및 유도체, 및 면역자극 복합체(ISCOM), 예컨대 다카하시(Takahashi) 등에 의해 기재된 것(Nature 344:873-875, 1990)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 양상에서, 애주번트는 합성 애주번트이다. 특정한 양상에서, 합성 애주번트는 글루코피라노실 지질 애주번트(GLA)이다. 예시적인 양상에서, 애주번트는 수산화알루미늄이다.

본 발명의 추가의 양상은 본 발명의 면역원성 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신이다. 상기 본 명세서에 기재된 바대로, 백신은 소정의 양상에서 하나 이상의 안정화제 및/또는 하나 이상의 보존제를 포함한다.

일 양상에서, 항원을 코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 적어도 하나의 재조합 발현 작제물(본 명세서에 기재된 키메라 OspA 폴리펩타이드) 및 애주번트를 포함하는 백신이 제공된다. 일 실시양태에서, 재조합 발현 작제물(OspA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터)은 바이러스 벡터에 존재하고, 이 벡터는 소정의 추가의 실시양태에서 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 및 레트로바이러스로부터 선택된 바이러스에 존재한다.

본 발명의 추가의 양상은 본 명세서에 기재된 키메라 OspA 분자에 대한 항체를 포함한다. 다양한 양상에서, 본 발명은 항-OspA 항체를 제조하기 위해 및 보렐리아 감염으로부터 면역을 제공하기 위해 키메라 OspA 분자를 포함한다.몇몇 양상에서, 이 항-OspA 항체, 예를 들어, 쥣과, 인간, 또는 인간화 단일클론 항체 또는 단일 사슬 항체는 보렐리아의 임의의 하나 이상의 혈청형 1-6의 OspA 단백질에 대해 면역 반응을 수행하기 위해 피험자에 투여된다(예를 들어, 수동 면역). 본 명세서에 사용되는, 용어 "항체"는 하나 이상의 OspA 폴리펩타이드에 대한 특이성을 갖는 분자를 의미한다. 적합한 항체는 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 제조된다. 소정의 양상에서, OspA 항체는 OspA 폴리펩타이드의 소정 부분에 결합하여 OspA 폴리펩타이드 수용체(들)에 대한 폴리펩타이드의 결합을 억제할 수 있다. 본 발명의 키메라 OspA 폴리펩타이드에 결합하는 항체 및 항체 단편은 본 발명의 범위 내에 있다.

몇몇 양상에서, 본 발명의 항체는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 169, 171, 및 173으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 동물을 면역화함으로써 생성된 하나 이상의 OspA 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다른 양상에서, 본 발명은 서열 번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 168, 170, 및 172로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해 코딩된 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 다양한 양상에서, 항체 또는 이의 단편은 인간, 인간화, 다중클론, 또는 단일클론이다. 추가의 양상에서, 항체는 Fab 또는 Fab' 항체이다. 특정한 양상에서, 항체는 검출 가능한 라벨을 포함한다. 몇몇 양상에서, 항체는 항체의 화학적으로 변형된 유도체이다.

본 발명에 따른 키메라 OspA 분자의 투여는 인간 또는 동물에서의 면역 또는 항체 반응을 자극한다. 몇몇 양상에서, 3개의 키메라 OspA 분자(예를 들어, 지질화 OspA 1/2 ²⁵¹, 지질화 OspA 6/4 OspA, 및 지질화 OspA 5/3; 또는 원래 OspA 1/2, 원래 OspA 6/4, 및 원래 OspA 5/3)는 본 명세서에 기재된 모든 6개의 혈청형(1-6)에 대한 항체 반응을 발생시키도록 함께 투여된다. 이 항체 반응은, 생성된 항체(보호 없음)가 그럼에도 불구하고 유용하므로, 본 발명의 방법이 다양한 양상에서 (또한 보호 반응인 것에 반대로서) 단지 면역 반응을 자극하기 위해 사용된다는 것을 의미한다. 당해 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 항체를 발생시키는 것으로부터, 단일클론 항체가 제조되고; 이 단일클론 항체는 보렐리아 부르그도르페리 s.l.의 존재 또는 부재를 결정하거나 나선상균에 대한 면역 반응이 단순히 자극되는지를 결정하도록 널리 공지된 항체 결합 검정, 진단학적 키트 또는 시험에서 사용된다. 단일클론 항체는 소정의 양상에서 보렐리아 항원, 예컨대 OspA를 회수하거나 단리하기 위해 면역흡착 크로마토그래피에서 이용된다.

본 발명의 OspA 항체는 다양한 양상에서 다중클론(단일특이적 다중클론, 단일클론(MAb), 재조합, 키메라, 인간화, 예컨대 CDR-그래프팅된, 인간, 단일 사슬 및/또는 이중특이적 포함), 및 이의 단편, 변이체 또는 유도체이다. 항체 단편은 OspA 폴리펩타이드에서 에피토프에 결합하는 항체의 일부를 포함한다. 이러한 단편의 예는 전장 항체의 효소 개열에 의해 생성된 Fab 및 F(ab') 단편을 포함한다. 다른 결합 단편은 재조합 DNA 기술, 예컨대 항체 가변 구역을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 플라스미드의 발현에 의해 생성된 것을 포함한다.

OspA 폴리펩타이드에 대해 지시된 다중클론 항체는 일반적으로 OspA 폴리펩타이드 및 애주번트의 다수의 피하, 근육내 또는 복강내 주사에 의해 피험자(래빗, 마우스, 또는 다른 동물 또는 포유동물 포함)에서 생성된다. 소정의 양상에서 본 발명의 OspA 폴리펩타이드를 면역화하고자 하는 종에서 면역원성인 운반 단백질, 예컨대 키홀-림펫 헤모사이아닌, 혈청, 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 접합시키는 것이 유용하다. 또한, 애주번트, 예컨대 명반은 면역 반응을 증대시키도록 사용된다. 면역 후, 혈액 샘플을 피험자 면역으로부터 채취하고, 혈청을 항-OspA 폴리펩타이드 항체 역가에 대해 평가한다.

OspA 폴리펩타이드에 대해 지시된 단일클론 항체(mAb)는 배양물 중에 연속 세포주에 의해 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 방법을 이용하여 생성된다. 단일클론 항체를 제조하기 위한 적합한 방법의 예는 문헌[Kohler 등, Nature, 256:495-497 (1975)]의 하이브리도마 방법 및 인간 B-세포 하이브리도마 방법[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) 및 Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]을 포함한다. OspA 폴리펩타이드와 반응성인 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주가 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명의 단일클론 항체는 몇몇 경우에 치료제로서 사용하도록 변형된다. 일 실시양태는 "키메라" 항체로서, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래한 또는 특정한 항체 종류 또는 하위종류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이고, 사슬(들)의 나머지가 다른 종으로부터 유래한 또는 다른 항체 종류 또는 하위종류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 키메라 항체이다. 이러한 항체의 단편이 원하는 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 한, 이것이 또한 포함된다. 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌[Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1985)]을 참조한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 단일클론 항체는 "인간화" 항체이다. 비인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(미국 특허 제 5,585,089호, 및 제5,693,762호 참조). 일반적으로, 인간화 항체는 비인간인 소스로부터 이것으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 인간화를 예를 들어 인간 항체의 상응하는 구역에 대해 설치류 상보성 결정 구역(CDR)의 적어도 일부를 치환함으로써 당해 분야에 기재된 방법(Jones 등, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann 등, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen 등, Science 239:1534-1536 (1988))을 이용하여 수행할 수 있다.

대안적인 실시양태에서, 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 생성된다(Hoogenboom 등, J. Mol . Biol . 227:381 (1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581 (1991)). 이 과정은 섬질 박테리오파지의 표면에서의 항체 레퍼토리의 디스플레이, 및 선택된 항원에 대한 이의 결합에 의한 이의 결합의 후속 선택을 통해 면역 동정을 모방한다. 이러한 하나의 기술은 PCT 출원 PCT/US98/17364(Adams 등)에 기재되어 있고, 이는 이러한 접근법을 이용한 MPL- 및 msk-수용체에 대한 고 친화도 및 기능적 효현제 항체의 단리를 기술한다.

키메라, CDR 그래프팅된, 및 인간화 항체는 통상적으로 재조합 방법에 의해 생성된다. 항체를 코딩하는 핵산은 본 명세서에 기재되거나 당해 분야에서 공지된 물질 및 절차를 이용하여 숙주 세포로 도입되고 발현된다. 일 실시양태에서, 항체는 포유동물 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포에서 생성된다. 단일클론(예를 들어, 인간) 항체는 다양한 양상에서 숙주 세포에서의 재조합 DNA의 발현에 의해 또는 본 명세서에 기재된 하이브리도마 세포에서의 발현에 의해 생성된다. 몇몇 양상에서, 단일클론 항체 또는 이의 단편은 인간화된다. 특정한 양상에서, 단일클론 항체는 본 명세서에 기재된 F237/BK2이다.

소정의 양상에서, 본 발명은 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 보렐리아 감염 또는 라임병을 치료하거나 예방하기 위한 유효량으로 본 명세서에 기재된 항체 또는 이의 단편을 피험자에 투여하는 단계를 포함한다. 특정한 양상에서, 항체 또는 이의 단편은 고도면역 혈청, 고도면역 혈장, 또는 이의 정제된 면역글로불린 분획이다. 다른 양상에서, 항체 또는 이의 단편은 정제된 면역글로불린 제제 또는 면역글로불린 단편 제제이다.

본 발명의 항-OspA 항체는 다양한 양상에서 OspA 폴리펩타이드의 검출 및 정량화를 위해 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대 경쟁적 결합 검정, 직접 및 간접 샌드위치 검정, 및 면역침강 검정(Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987))에서 사용된다. 항체는 이용되는 검정 방법에 적절한 친화도로 OspA 폴리펩타이드에 결합할 것이다.

진단학적 또는 임상학적 용도를 위해, 소정의 실시양태에서, 항-OspA 항체는 검출 가능한 모이어티로 표지된다. 검출 가능한 모이어티는, 직접적으로 또는 간접적으로, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 소정의 양상에서, 검출 가능한 모이어티는 방사선 동위원소, 예컨대 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시퍼린; 또는 효소, 예컨대 알칼리 포스파타제, β- 갈락토시다제, 또는 겨자무과산화효소이다(Bayer 등, Meth . Enzym. 184:138-163 (1990)).

경쟁적 결합 검정은 제한된 양의 항-OspA 항체에 의한 결합에 대해 시험 샘플 분석물(OspA 폴리펩타이드)과 경쟁하는 표지된 표준품(예를 들어, OspA 폴리펩타이드, 또는 이의 면역학적으로 반응성 부분)의 능력에 의존한다. 시험 샘플에서의 OspA 폴리펩타이드의 양은 항체에 결합된 표준품의 양에 역비례한다. 결합된 표준품의 양의 결정을 수월하게 하기 위해, 항체는 통상적으로 경쟁 전에 또는 후에 불용화되어, 항체에 결합된 표준품 및 분석물은 결합되지 않은 표준품 및 분석물로부터 편리하게 분리된다.

샌드위치 검정은 통상적으로 검출하고/하거나 정량화하고자 하는 단백질의 상이한 면역원성 부분, 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 2개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 검정에서, 시험 샘플 분석물은 통상적으로 고체 지지체에 부동화된 제1 항체에 의해 결합되고, 이후 제2 항체는 분석물에 결합하여 불용성 3부분 복합체를 형성한다. 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체 그 자체는 몇몇 경우에 검출 가능한 모이어티로 표지되거나(직접 샌드위치 검정), 검출 가능한 모이어티(간접 샌드위치 검정)로 표지된 항면역글로불린 항체를 이용하여 측정된다. 예를 들어, 일 유형의 샌드위치 검정은 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)(이 경우 검출 가능한 모이어티는 효소임)이다.

항-OspA 항체는 또한 생체내 영상화에 유용하다. 검출 가능한 모이어티로 표지된 항체는 소정의 양상에서 동물에 혈류로 투여되고, 숙주에서의 표지된 항체의 존재 및 위치가 평가된다. 항체는 다양한 양상에서 핵 자기 공명, 방사선학, 또는 당해 분야에 공지된 다른 검출 수단에 의해 동물에서 검출 가능한 임의의 모이어티로 표지된다. 본 발명의 몇몇 양상에서, OspA 항체는 치료제로서 사용된다.

키메라 OspA 조성물 및 투여

본 명세서에 기재된 OspA 키메라 폴리펩타이드를 피험자에 투여하기 위해, OspA 폴리펩타이드는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물 중에 제형화된다. 구절 "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"는 하기 기재된 바대로 당해 분야에 널리 공지된 경로를 이용하여 투여될 때 알레르기, 또는 다른 부작용을 생성시키지 않는 분자 집합체 및 조성물을 의미한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 배지, 코팅, 항박테리아 및 항진균 물질, 등장성 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 몇몇 양상에서, 상기 조성물은 물 또는 일반 유기 용매와 용매화물을 형성한다. 이러한 용매화물은 또한 포함된다.

본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 다양한 양상에서 경구로, 국소로, 진피내로, 비경구로, 흡입 스프레이로, 질내로, 직장으로, 또는 두개내 주사로 투여된다. 본 명세서에 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 낭내 주사, 또는 점적주사 기술을 포함한다. 정맥내, 진피내, 근육내, 유방내, 복강내, 척추강내, 후안와, 폐내 주사 및 또는 특정한 자리에서의 수술 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 일반적으로, 상기 조성물은 발열원 및 수혜자에게 해로울 수 있는 다른 불순물을 실질적으로 포함하지 않는다.

약제학적 조성물의 제제는 선택된 투여 경로(예를 들어, 용액, 에멀션)에 따라 변할 수 있다. 투여하고자 하는 조성물을 포함하는 적절한 조성물은 생리학적으로 허용되는 비히클 또는 담체 중에 제조된다. 용액 또는 에멀션의 경우, 적합한 담체는 예를 들어 식염수 및 완충 배지를 포함하는 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 몇몇 양상에서 염화나트륨 용액, 덱스트로스 링거액, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락트산염 링거액 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 소정의 양상에서 다양한 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함한다.

활성 성분으로서 OspA 폴리펩타이드를 포함하는 본 발명의 화합물 및 방법에 유용한 약제학적 조성물은 다양한 양상에서 투여 경로에 따라 약학적으로 허용되는 담체 또는 첨가제를 포함한다. 이러한 담체 또는 첨가제의 예는 물, 약제학적 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카복시비닐 중합체, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 잔탄 검, 아라비아 검, 카세인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소비톨, 락토스, 약학적으로 허용되는 계면활성제 등을 포함한다. 사용된 첨가제는 본 발명의 제형에 따라 적절한 바대로 상기 또는 이들의 조합(이들로 제한되지는 않음)으로부터 선택된다.

다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글라이신, 또는 수성 현탁액은 다양한 양상에서 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합된 활성 화합물을 포함한다. 이러한 부형제는 현탁제, 예를 들어 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아라비아 검이고; 분산 또는 습윤제는 몇몇 경우에 천연 발생 포스파타이드, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨로부터 유래한 부분 에스터의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소비톨 모노올레에이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산 및 헥시톨 언하이드라이드로부터 유래한 부분 에스터의 축합 생성물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트이다. 수성 현탁액은 몇몇 양상에서 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트를 포함한다.

몇몇 양상에서, OspA 조성물은 저장을 위해 동결건조되고 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성된다. 이 기술은 종래의 면역글로불린에 효과적인 것으로 나타났다. 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 이용된다. 동결건조 및 재구성이 다양한 정도의 항체 활성 손실을 발생시키고 사용 수준은 대개 보상하도록 조정된다는 것으로 당해 분야의 당업자에게 이해된다.

물의 첨가에 의한 수성 현탁액의 제조에 적합한 분산성 분말 및 과립은 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와 혼합된 활성 화합물을 제공한다. 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 이미 언급된 것으로 예시된다.

소정의 양상에서, 이 제제 내의 OspA의 농도는 예를 들어 약 0.5중량% 미만으로부터, 일반적으로 적어도 약 1% 내지 15 또는 20중량%로 광범위하게 변하고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 유체 용적, 점도 등에 주로 기초하여 선택될 것이다. 따라서, 예를 들어, 제한 없이, 비경구 주사를 위한 통상적인 약제학적 조성물은 1ml의 무균 완충수, 및 50mg의 혈액 응고 인자를 포함하도록 제조된다. 정맥내 점적주사에 통상적인 조성물은 250ml의 무균 링거액, 및 150mg의 혈액 응고 인자를 포함하도록 제조된다. 비경구로 투여 가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있거나 명확하고, 예를 들어, 하기 에 더 자세히 기재되어 있다: 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980). 유효 용량은 일반적으로 투여마다 체중 1kg당 0.01mg 내지 1000mg 범위 내에 있다.

다양한 양상에서, 약제학적 조성물은 무균 주사용 용액 또는 분산액의 임시 제제를 위해 무균 주사용 수성, 유성 현탁액, 분산액 또는 무균 분말의 형태이다. 현탁액은 몇몇 양상에서 상기 언급된 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화된다. 무균 주사용 제제는 소정의 양상에서, 예를 들어 1,3-부탄 디올 중의 용액으로서, 비독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 무균 주사용 용액 또는 현탁액이다. 몇몇 실시양태에서, 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함하는 용매 또는 분산 배지이다. 또한, 무균, 고정유는 종래대로 용매 또는 현탁 배지로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 다양한 양상에서 합성 모노- 또는 디글라이세라이드를 포함하는 임의의 완하성 고정유를 사용한다. 또한, 지방산, 예컨대 올레산은 주사제의 제조에서 용도가 발견된다.

모든 경우에, 형태는 무균이어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도로 유체이어야 한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 미생물유기체, 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 미생물유기체의 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 발생한다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 소정의 양상에서, 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 발생한다.

투여에 유용한 조성물은 소정의 양상에서 이의 효율을 증가시키기 위해 유입 또는 흡수 인핸서로 제형화된다. 이러한 인핸서는 예를 들어 살리실레이트, 글라이코콜레이트/리놀레에이트, 글리콜레이트, 아프로티닌, 바시트라신, SDS, 카프레이트 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fix (J. Pharm . Sci ., 85:1282-1285, 1996) 및 Oliyai 등 (Ann . Rev . Pharmacol. Toxicol., 32:521-544, 1993)]을 참조한다.

또한, 본 발명의 화합물 및 방법에서 사용된 조성물의 친수화도 및 소수화도의 특성은 훌륭히 균형을 이루어, 실험실내 및 특히 생체내 용도 둘 다에 대한 이의 유용성을 증대시키고, 이러한 균형이 결여된 다른 조성물은 실질적으로 유용성이 더 적다. 구체적으로, 본 발명에서의 조성물은 체내 흡수 및 생체이용률을 허용하는 수성 배지 중의 적절한 정도의 용해도를 가지면서, 또한 화합물이 추정적 작용 자리로 세포막을 횡단하게 하는 지질 중의 특정 정도의 용해도를 갖는다.

특정한 양상에서, 본 명세서에 기재된 OspA 폴리펩타이드는 애주번트를 포함하는 백신 조성물 중에 제형화된다. 유성 애주번트, 예컨대 프로인트 완전 애주번트 및 프로인트 불완전 애주번트, 마이콜레이트계 애주번트(예를 들어, 트레할로스 디마이콜레이트), 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS), 펩티도글라이칸(즉, 무레인, 뮤코펩타이드, 또는 글라이코단백질, 예컨대 N-Opaca, 뮤라밀 디펩타이드[MDP], 또는 MDP 유사체), 프로테오글라이칸(예를 들어, 클레브시엘라 뉴모니아 에( Klebsiella pneumoniae )로부터 추출됨), 스트렙토코커스 제제(예를 들어, OK432), Biostim^TM (예를 들어, 01K2), EP 109 942, EP 180 564 및 EP 231 039의 "Iscom", 수산화알루미늄, 사포닌, DEAE-덱스트란, 천연 오일(예컨대, 미글리올), 식물성 오일(예컨대, 아라키스 오일), 리포솜, 플루로닉(Pluronic)® 폴리올, 리비(Ribi) 애주번트 시스템(예를 들어, GB-A-2 189 141 참조), 또는 인터류킨, 특히 세포 매개 면역을 자극하는 것을 포함하여 당해 분야에 공지된 임의의 애주번트가 백신 조성물의 다양한 양상에서 사용된다. 액티노마이세탈레스(Actinomycetales) 목 내의 박테리아 속인 아미콜라타( Amycolata)의 추출물로 이루어진 대안적인 애주번트가 미국 특허 제4,877,612호에 기재되어 있다. 추가로, 독점적인 애주번트 혼합물이 상업적으로 구입 가능하다. 사용된 애주번트는 부분적으로 수혜자 피험자에 따라 달라진다. 투여하는 애주번트의 양은 피험자의 유형 및 몸집에 따라 달라진다. 최적 용량은 일상적 방법에 의해 용이하게 결정된다.

백신 조성물은 약제학적 비히클, 부형제, 또는 매질로서 작용하는 백신과 상용성인 약학적으로 허용되는(즉, 무균 및 비독성) 액체, 반고체, 또는 고체 희석제를 임의로 포함한다. 당해 분야에 공지된 임의의 희석제를 사용한다. 예시적인 희석제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 스테아르산마그네슘, 메틸- 및 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 알기네이트, 전분, 락토스, 수크로스, 덱스트로스, 소비톨, 만니톨, 아카시아 검, 인산칼슘, 광유, 코코아 버터, 및 테오브로마의 오일을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

백신 조성물은 전달에 편리한 형태로 포장된다. 상기 조성물은 캡슐, 캐플릿, 샤셋(sachet), 카셋(cachet), 젤라틴, 종이, 또는 다른 용기 내에 밀봉된다. 이 전달 형태는 수혜자 유기체로의 면역원성 조성물의 진입과 상용성일 때 및 특히 면역원성 조성물이 단위 용량 형태로 전달될 때 바람직하다. 용량 단위는 예를 들어 정제, 캡슐, 좌제, 바이알, 또는 카셋 중에 포장된다.

본 발명은, 본 명세서에 기재된 유효량의 Osp A 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물 숙주에서 OspA 항체를 포함하는, 피험자에서 면역학적 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 유효량의 백신 조성물을 피험자에 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하는 방법을 포함한다.

백신 조성물은 본 명세서에 상기 자세히 기재된 임의의 종래의 방법에 의해 면역화하고자 하는 피험자에 도입된다. 소정의 양상에서, 상기 조성물은 일정 기간 동안(하기 더 자세히 기재된 바대로) 단일 용량 또는 복수 용량으로 투여된다. 몇몇 양상에서, 용어 "용량" 및 "단위 용량"는 본 명세서에서 상호 교환되어 사용된다.

키메라 OspA 조성물의 투약/면역학적 반응을 유도하기 위한 방법

투여하고자 하는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 유용한 용량은 약물의 작용을 변경하는 다양한 인자, 예를 들어 피험자의 연령, 컨디션, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간, 투여 방식, 및 다른 임상학적 인자에 따라 변할 것이다.

몇몇 양상에서, 본 발명의 제제 또는 조성물은 일정 기간이 지난 후 초기 볼루스, 이어서 부스터 전달에 의해 투여된다. 부스터 면역화(또는 "부스터")는 몇몇 양상에서 박테리아에 대한 보호를 위해 순환 항체의 높은 역가를 성취하는 데 중요하다. 몇몇 양상에서, 본 발명의 조성물은 피험자의 기하 평균 역가(GMT) 수준을 증가시키기 위해 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 용량 또는 단위 용량으로 제형화된다. 몇몇 양상에서, GMT 수준은 초기 투약 후 약 60일에 약 1,000 내지 약 10,000의 수준으로 증가한다. 추가의 양상에서, GMT 수준은 초기 투약 후 약 90일에 약 2,000 내지 약 30,000의 수준으로 증가한다. 더 추가의 양상에서, GMT 수준은 부스터의 투여 후 더 높은 수준으로 증가한다. 예를 들어, GMT 수준은 부스터 투여 후 약 15,000 내지 50,000의 수준으로 증가한다. 소정의 양상에서, GMT 수준은 부스터 투여 후 50,000 초과로 증가한다. 소정의 양상에서, 본 발명의 제제는 약물 생성물의 치료학적 순환 수준을 유지시키기 위해 초기 볼루스, 이어서 연속 점적주사로 투여된다. 특정한 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물은 다양한 기간 후 백신접종 계획에서 투여된다. 몇몇 양상에서, 백신접종은 보렐리아 감염에 걸리기 쉬운 구역으로의 여행자에 대한 신속한 면역 계획으로 전달된다. 다른 예로서, 본 발명의 조성물 또는 제제는 1회 용량으로 투여된다. 당해 분야의 당업자는 우수 의학 기준 및 개별 피험자의 임상 상태에 의해 결정되는 바대로 효과적인 용량 및 투여 섭생을 용이하게 최적화한다. 투약 빈도는 투여 경로 및 투여 물질의 약동학적 매개변수에 따라 달라진다.

약제학적 제제는 투여 경로 및 원하는 용량에 따라 당해 분야의 당업자에 의해 결정된다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) 1435-1712 페이지(이의 개시내용은 참조문헌으로 본 명세서에 의해 포함됨)]을 참조한다. 이러한 제제는 몇몇 경우에 신체 상태, 안정성, 생체내 방출 속도, 및 투여된 조성물의 생체내 청소율에 영향을 미친다. 투여 경로에 따라, 적합한 용량은 특정한 양상에서 체중, 신체 표면적 또는 장기 크기에 따라 계산된다. 몇몇 양상에서, 적절한 용량은 적절한 용량-반응 데이터와 함께 혈액 수준 용량을 결정하기 위한 확립된 검정의 이용에 의해 확인된다. 소정의 양상에서, 개인의 항체 역가는 최적 용량 및 투여 섭생을 결정하도록 측정된다. 약제학적 조성물의 작용을 변경하는 다양한 인자, 예를 들어 조성물의 비활성, 피험자의 반응성, 피험자의 연령, 컨디션, 체중, 성별 및 식이, 임의의 감염 또는 악성 증상의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상 인자를 고려하여 주치의 또는 의사가 최종 용량 섭생을 결정할 것이다. 연구가 수행되면서, 관련 병증의 예방 및/또는 치료를 위해 적절한 용량 수준 및 치료 기간을 고려한 추가의 정보가 생길 것이다.

소정의 양상에서, OspA 면역원성 또는 백신 조성물은 피험자에서 면역 반응을 발생시키기에 충분한 임의의 용량의 OspA 핵산 분자(들) 또는 폴리펩타이드(들)를 포함한다. 치료학적으로 사용되는 유효량의 OspA 면역원성 또는 백신 조성물은 예를 들어 치료학적 문맥 및 목적에 따라 달라질 것이다. 당해 분야의 당업자는 백신접종 또는 치료를 위한 적절한 용량 수준이 따라서 부분적으로 전달된 분자, OspA 분자(들)가 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 몸집(체중, 신체 표면 또는 장기 크기) 및 컨디션(연령 및 일반 건강상태)에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 임상의는 몇몇 경우에 용량을 적정하고 최적의 치료학적 효과를 얻기 위해 투여 경로를 변경한다.

통상적인 용량은 다양한 양상에서 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 약 100 mg/kg 또는 그 이상 범위이다. 다른 실시양태에서, 용량은 0.1μg/kg 내지 약 100mg/kg; 또는 1μg/kg 내지 약 100mg/kg; 또는 5μg/kg 내지 약 100mg/kg 범위일 수 있다. 예의 방식으로, 본 발명에서 유용한 OspA 폴리펩타이드의 용량은 대략 10μg/ml, 20μg/ml, 30μg/ml, 40μg/ml, 50μg/ml, 60μg/ml, 70μg/ml, 80μg/ml, 90μg/ml, 100μg/ml, 110μg/ml, 120 μg/ml, 130 μg/ml, 140 μg/ml, 150 μg/ml, 160 μg/ml, 170 μg/ml, 180 μg/ml, 190μg/ml, 200μg/ml, 210μg/ml, 220μg/ml, 230μg/ml, 240μg/ml, 250μg/ml, 260μg/ml, 270μg/ml, 280μg/ml, 290μg/ml, 300μg/ml, 320μg/ml, 340μg/ml, 360μg/ml, 380μg/ml, 400μg/ml, 420μg/ml, 440μg/ml, 460μg/ml, 480μg/ml, 500μg/ml, 520μg/ml, 540μg/ml, 560μg/ml, 580μg/ml, 600μg/ml, 620μg/ml, 640μg/ml이고, 특정한 양상에서, 통상적인 용량은 피험자마다 0.1 내지 5.0ml를 포함한다. 더 특정한 양상에서, 통상적인 용량을 피험자마다 0.2 내지 2.0ml를 포함한다. 소정의 양상에서, 용량은 피험자마다 0.5 내지 1.0ml를 포함한다.

더 특정한 양상에서, 피험자에 투여되는 용량 또는 단위 용량은 약 10μg, 약 20μg, 약 30μg, 약 40μg, 약 50μg, 약 60μg, 약 70μg, 약 80μg, 약 90μg, 또는 약 100μg이다. 따라서, OspA 키메라 폴리펩타이드를 포함하는 조성물 및 제제는 피험자에 대한 이 용량의 용이한 투여를 위해 설계된다. 훨씬 더 특정한 양상에서, 피험자에 투여되는 용량 또는 단위 용량은 1회 투여되거나, 2달 이상 동안 1달 약 1회 투여되고 이후, 임의로, 부스터가 후행한다. 몇몇 양상에서, 부스터는 초기 단위 용량 또는 초기 다수의 단위 용량 후 약 2달, 약 3달, 약 4달, 약 5달, 약 6달, 약 7달, 약 8달, 약 9달, 약 10달, 약 11달, 약 12달에 투여된다. 몇몇 양상에서, 부스터는 보호 면역을 제공하기 위해 약 1년마다 또는 2년 또는 3년 또는 4년 또는 5년 또는 6년 또는 7년 또는 8년 또는 9년마다 약 1회 투여된다.

투약 빈도는 사용된 제제에서의 OspA 분자의 약동학적 매개변수에 따라 달라진다. 통상적으로, 임상의는 원하는 효과를 성취하는 용량이 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 상기 조성물은 다양한 양상에서 따라서 시간에 걸친 단일 용량으로, 또는 2 이상의 용량으로(동일한 양의 원하는 분자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있음), 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 점적주사로서 투여된다. 적절한 용량의 추가의 개선은 일상적으로 당해 분야의 당업자에 의해 이루어지고, 이들에 의해 일상적으로 수행된 업무의 영역 내에 있다. 적절한 용량은 대개 일상적으로 얻어진 적절한 용량-반응 데이터에 의해 확인된다.

키트

추가의 양상으로서, 본 발명은 피험자에 대한 투여를 위해 이의 사용을 수월하게 하는 방식으로 포장된 피험자에 대한 OspA 폴리펩타이드(들)의 투여를 위한 하나 이상의 약제학적 제제를 포함하는 키트를 포함한다.

구체적인 실시양태에서, 본 발명은 단일 용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 다양한 양상에서 각각 건조된 단백질을 갖는 제1 컨테이너 및 수성 제제를 갖는 제2 컨테이너 둘 다를 포함한다. 단일 및 다중 챔버 프리필드 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결주사기)를 포함하는 키트가 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다.

다른 실시양태에서, 이러한 키트는, 컨테이너에 부착되거나 패키지 내에 포함된 상기 방법을 실행하는 데 있어서 화합물 또는 조성물의 용도를 기술하는 라벨을 갖는, 컨테이너, 예컨대 밀봉 병 또는 용기에 포장된, 본 명세서에 기재된 약제학적 제제(예를 들어, 치료학적 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물)를 포함한다. 일 실시양태에서, 약제학적 제제는 컨테이너의 두부간격의 양(예를 들어, 액체 제제와 컨테이너의 상부 사이의 공기의 양)이 매우 적도록 컨테이너에 포장된다. 바람직하게는, 두부간격의 양은 무시할만하다(즉, 거의 없음).

일 양상에서, 키트는 치료학적 단백질 또는 펩타이드 조성물을 갖는 제1 컨테이너 및 조성물을 위한 생리학적으로 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 컨테이너를 포함한다. 일 양상에서, 약제학적 제제는 단위 용량 형태로 포장된다. 키트는 임의로 특정 투여 경로에 따라 약제학적 제제를 투여하기에 적합한 장치를 추가로 포함한다. 몇몇 양상에서, 키트는 약제학적 제제의 용도를 기술하는 라벨을 포함한다.

본 명세서에 인용된 각각의 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 본 개시내용과 불일치하지 않는 정도로 그 전체가 참조문헌으로 포함된다.

본 명세서에 기재된 예 및 실시양태는 오직 예시 목적이고, 이의 견지에서의 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 당업자에게 제안될 것이고, 본원의 정신 및 이해범위 및 특허청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 의해 포함된다.

실시예

본 발명의 추가의 양상 및 상세내용은 제한이기보다는 예시적인 것으로 의도되는 하기 실시예로부터 명확할 것이다.

실시예 1:

OSPA 백신 제제의 결정을 위한 유럽 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토 균주(분자 역학) 로부터의 OSPA 의 서열의 분석

연구의 목적은 유럽에 대한 라임병 OspA 백신에 적합한 제제를 결정하는 것이다. 본 연구는, 유럽의 광범위한 지리학적 커버리지, 질환과 관련된 다양한 임상 증후군, 및 라임병과 관련된 3개의 병원균 동유전자종(B. 아프젤리, B. 가리니 및 B. 부르그도르페리 ss)의 각각을 적절히 나타내는, B. 부르그도르페리 센수 라토의 크고 다양한 균주 수집으로부터의 OspA 유전자의 서열 분석(분자 역학)에 기초하였다. 라임병은 전체 13개의 동유전자종을 포함하는 보렐리아 부르그도르페리 센수 라토에 의해 발생하고, 이들 중 3개(B. 아프젤리, B. 가리니 및 B. 부르그도르페리 ss)는 인간에서 병원균인 것으로 인식된다.

기재된 바대로, 유럽의 21개 국가로부터 라임병을 앓는 환자(및 진드기)로부터의 보렐리아 부르도페리 센수 라토 균주를 평가한 큰 규모의 역학적 연구(하기 표 3 참조)를 수행하였다. 16개의 유럽 국가로부터 수집된 전체 553개의 유럽 보렐리아 단리물을 연구하였다. 각각의 종의 16s rRNA 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 각각의 종을 결정하였다.

유럽에서 인간 라임병을 발생시키는 것으로 공지된 3개의 보렐리아 종의 각각으로부터의 단리물이 잘 나타났다: B. 아프젤리(n=309, 55.9%), B. 부르그도르페리 센수 스트릭토(n=67, 12.1%), 및 B. 가리니(n=173, 31.3%). 359개의 인간 단리물 중, 56.8%가 B. 아프젤리이고, B. 아프젤리는 대부분의 위치에서 인간 단리물로부터 결정된 주요 종이었다. 유사하게, B. 아프젤리는 진드기 단리물 중 54.1%로부터 단리되었다. B. 부르그도르페리 s.s.는 인간 균주 중 11.7% 및 진드기 단리물 중 12.9%로부터 단리되었다. B. 부르그도르페리 s.s.는 남동부 유럽, 특히 이탈리아, 헝가리, 슬로베니아 및 오스트리아로부터의 인간 단리물로부터 단리되었다. B. 가리니 균주는 인간 단리물 중 30.4%로부터 단리되었고 진드기 단리물 중 33%를 차지하였다. 인간 및 진드기로부터 단리된 B. 가리니 균주는 유럽에 걸친 대부분의 지리학적 위치로부터 얻어졌다. 본 연구로부터의 데이터는 다른 유럽 연구로부터 제시된 데이터와 매우 상관되고, 연구된 단리물의 수집이 유럽에서 라임병의 정확한 상황을 나타낸다는 것을 제안한다.

유럽에 대한 최적 백신 제제를 결정하기 위해 OspA 서열분석을 수행하였다. 이 데이터에 기초하여, OspA 1형 내지 6형을 포함하는 백신은 균주의 98.1% 및 침습 질환 사례의 96.7%를 커버할 것이다. 유럽 보렐리아 단리물의 역학적 연구 결과는 OspA 1형, 2형, 3형, 4형, 5형 및 6형에 기초한 백신이 라임병 중 98% 및 침습적 신경보렐리아증 단리물 중 96.7%의 유럽에서의 이론적 커버리지를 제공한다는 것을 나타낸다.

표 3. 역학적 연구 결과

¹ 다수의 단리물에 기초한 예측된 백신 커버리지; 전체는 누적이다.

² 신경보렐리아증의 사례로부터의 단리물의 예측된 백신 커버리지; 전체는 누적이다.

³ 혈청형 4는 대안적으로 생각되는 보렐리아 바바리엔시스이다. (상기 마고스(Margos) 등의 문헌을 참조).

그러므로, 3개의 새로운 재조합 OspA(1/2, 6/4, 및 5/3)(각각 2개의 OspA 혈청형을 나타냄)를 포함하는 백신은 유럽에서 라임 보렐리아증과 관련된 모든 6개의 우세한 OspA 혈청형(1-6) 및 USA에서 라임 보렐리아증과 관련된 단일 OspA 혈청형에 대한 보호에 필요한 중요한 구조적 구성요소를 보유할 것이다.

(OspA 혈청형 1/2 및 6/4와 함께) B. 가리니 OspA 혈청형 5 및 3을 나타내는 OspA 5/3 작제물의 봉입은 질환 중 98.1% 및 침습적 단리물 중 96.7%에 대해 보호를 제공해야 한다. OspA 5/3이 없는 백신은 질환 중 불과 약 88.9%, 및 침습적 질환 중 불과 약 73.4%를 보호하는 것으로 예상될 것이다. 따라서, 모든 6개의 혈청형을 포함하는 백신은 오직 4개의 혈청형을 갖는 백신보다 라임병의 예방에서 더 효과적이다.

실시예 2:

지질화 OSPA 를 코딩하는 합성 OSPA 유전자의 작제를 위한 전략

이 연구의 목표는 보렐리아의 임의의 이 몇몇 균주에 의해 발생한 라임병으로부터 수혜자를 보호하는 백신을 만들기 위해 보렐리아의 몇몇 균주로부터 지질화 OspA 키메라 작제물을 제조하는 것이다. 일반적인 전략은 도 1에 요약되어 있고 하기 기재되어 있다.

각각의 신규한 OspA 유전자의 경우, 30개 내지 60개의 염기의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트는 8개 내지 12개의 상보성 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. 각각의 세트로부터의 올리고뉴클레오타이드는 별개의 환경에서 함께 어닐링되어 어느 한 말단에서 특이적 제한 효소 인식 자리를 갖는 이중 가닥 DNA 단편, 즉 단편 N-H(Nde I - Hind III), H-K(Hind III - Kpn I), K-E(Kpn I - EcoR I) 및 E-B(EcoR I - BamH I)를 생성시켰다. 4개의 단편의 각각은 pUC18로 독립적으로 클로닝되고, 상응하는 제한 효소로 절단되고, 클로닝 단편의 서열이 검증된 후 이. 콜라이 숙주 DH5α로 형질전환되었다.

이. 콜라이 균주 DH5α [유전자형: 말단 A1 hsdR17(r_k ^-m_k ⁺) supE44 thi -1 recA1 gyrA(Nal^r) relA1 Δ ( lacZYA - argF ) U169 deoR(Φ80dlac Δ ( lacZ ) M15](Gibco BRL)를 모든 중간 클로닝 단계에 사용하였다. 이 균주는 유전자 조작에서 가장 널리 사용되는 숙주 중 하나인 이. 콜라이 균주 K12로부터 유래한다. 균주는 암피실린 내성 유전자 (amp)를 포함하는 벡터에 의한 형질전환체의 선택을 허용하는 amp ^- 이다. 이. 콜라이 HMS174(DE3)는 발현을 위한 숙주로서 선택되었다. 이. 콜라이 HMS174(DE3) 숙주 세포[유전자형: F-recA1 hsdR(r_k12 ^- m_k12 ⁺) Rif^R(DE3)](Novagen)를 최종 클로닝 단계에 사용하였다. 균주는 카나마이신 내성 유전자 (kan)를 포함하는 벡터에 의한 형질전환체의 선택을 허용하는 kan ^- 이다.

pUC18(Gibco BRL(스위스 바젤))을 모든 중간 단계에 대한 클로닝 벡터로서 사용하는데, 왜냐하면 유전자 조작 및 서열분석이 pET30a에 의한 것보다 이 플라스미드에 의해 더 쉽기 때문이다. 주요 특징은 특히 염기쌍 149 내지 469의 LacZ 알파 펩타이드를 포함하는 lacZ 유전자 단편(염기쌍 507에서의 lac 프로모터), 염기쌍 1629 내지 2486의 암피실린 내성 결정부위를 코딩하는 bla 유전자(염기쌍 2521에서의 bla 프로모터), 염기쌍 867에서의 복제 기원 및 염기쌍 185 내지 451의 다수의 클로닝 자리이다(도 12).

pET30a(Novagen)를 최종 완전 OspA 유전자 삽입체를 위한 발현 벡터로서 사용하였다. pET 벡터에서, 유전자는 T7 프로모터의 조절 하에 클로닝되고, 숙주 세포에서 T7 RNA 중합효소의 소스를 제공함으로써(T7 RNA 중합효소의 소스가 제공될 때까지 발현이 일어나지 않음) 발현이 유도된다. 주요 특징은 염기쌍 4048 내지 4860에서의 카나마이신 내성을 코딩하는 유전자(kan), 염기쌍 826 내지 1905의 lacI 유전자, 염기쌍 4956 내지 5411에서의 F1 복제 기원 및 염기쌍 158 내지 346의 다수의 클로닝 자리이다(도 13).

전장 OspA 유전자를 제조하는 데 필요한 4개의 단편은 DNA 미니프렙(miniprep)으로부터 절제되었다. 원래 클로닝 단계에 사용된 동일한 제한 효소를 사용하여 4개의 클론의 각각으로부터 DNA를 단리하였다. DNA 단편을 정제하고, Nde I 및 BamH I로 절단된 pUC18 DNA와 함께 결찰하고 이. 콜라이 DH5α 경쟁 세포로 형질전환하였다. pUC18에서 클로닝된 전장 OspA 유전자를 서열분석하여 이 단계에서 오차가 도입되지 않았다는 것을 확인하였다.

이후, OspA 유전자를 제한 효소 Nde I 및 BamH I를 사용하여 pET-30a 발현 벡터로 서브클로닝하고, 이. 콜라이 숙주 HMS 174(DE3)로 형질전환하였다. pET30a 벡터에서, OspA 유전자는 박테리오파지 T7 프로모터에 의해 조절된다.

3개의 합성 OspA 유전자는 보렐리아의 혈청형 1 및 2 OspA(lipB sOspA 1/2²⁵¹), 혈청형 6 및 4 OspA(lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA(lipB sOspA 5/3)로부터의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 코딩하도록 설계되었다. 이 분자의 1차 아미노산 서열(각각 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6)은 이의 설계로 도입된 주요 특징의 완전한 설명과 함께 도 2-8에 도시되고 본 명세서에 기재되어 있다.

lipB sOspA 1/2 작제물에 대한 올리고뉴클레오타이드를 ABI 394 DNA/RNA 합석기에서 인하우스로 합성하였다. lipB sOspA 5/3 및 lipB sOspA 6/4 작제물에 대한 올리고뉴클레오타이드를 GenXpress(오스트리아 비너 노이도르프)로부터 구입하고 HPLC 정제하였다.

표 4. lipB sOspA 1/2* 유전자 단편에 대한 올리고뉴클레오타이드

표 5. lipB sOspA 5/3 유전자 단편에 대한 올리고뉴클레오타이드

표 6. lipB sOspA 6/4 유전자 단편에 대한 올리고뉴클레오타이드

이. 콜라이 경쟁 세포의 제조. 단일 콜로니를 사용하여 5ml의 변형 LB 브로쓰(물 1리터당 5.5g NaCl, 5g 효모 추출물, 10g 대두 펩톤(동물 또는 유전자 변형 식물 소스로부터 얻지 않음))를 접종하였다. 배양물이 혼탁해질 때까지 항온처리하고, 이후 배양물을 예열된 변형 LB 브로쓰로 25ml의 용적으로 희석하였다. 배양물이 0.2 내지 0.6의 OD600nm에 도달할 때까지(40 내지 60분) 배양물을 추가로 항온처리하고, 125ml의 용적으로 희석하고, 500ml 플라스크로 옮기고, 0.6의 OD600nm이 도달될 때까지 항온처리하였다. 배양물을 얼음 욕 내에서 5분 동안 온화하게 진탕시켜 신속히 냉각시키고 세포를 직접 펠렛화하고(베크만(Beckman) 원심분리기, 10분 동안 4000rpm), TfBI 완충제(Teknova Hollister, CA)(30mM K-아세테이트, 50mM MnCl₂, 100mM KCL, 10mM CaCl₂ 15% 글리세롤)로 조심스럽게 세척하고, 5ml의 TfBII(10mM Na-MOPS, 75mM CaCl₂, 10mM KCL, 15% 글리세롤) 중에 재현탁시키고, 15분 동안 얼음에서 유지시켰다. 이후, 세포를 100? 분취량으로 피펫팅하고 아이스 드라이에서 직접 급속 냉동시켰다.

OspA 유전자 단편을 형성하기 위한(신생 합성) 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 . 혈청형 1 및 2 OspA(lipB sOspA 1/2), 혈청형 6 및 4 OspA(lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA(lipB sOspA 5/3)로부터의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 코딩하도록 3개의 합성 OspA 유전자를 설계하였다. 각각의 신규한 OspA 유전자(지질화)를 위해, 30개 내지 60개의 염기쌍의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다(표 4-6 참조). 도 16 내지 도 18은 공개된 서열로부터 예측된 뉴클레오타이드 서열과 정렬된 각각의 작제물에 대해 코돈 최적화된 서열을 나타낸다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트는 8개 내지 12개의 상보성 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. 각각의 세트로부터의 올리고뉴클레오타이드를 별개의 실험에서 함께 어닐링하여 어느 한 말단에서 특이적 제한 효소 인식 자리를 갖는 이중 가닥 DNA 단편, 즉 단편 N-H(Nde I - Hind III), H-K(Hind III - Kpn I), K-E(Kpn I - EcoR I) 및 E-B(EcoR I - BamH I)를 생성하였다.

동결건조된 올리고뉴클레오타이드를 증류수로 재구성하고, OD260nm을 측정하고, 농도를 10μM로 조정하였다. 각각의 OspA 단편을 위해, 2μl의 각각의 올리고뉴클레오타이드를 1μl의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 및 T4 DNA 리가제 완충제(10x)와 함께 혼합하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 항온처리하여 올리고물의 포스포릴화가 가능하게 하였다(lipB sOspA 6/4 작제물의 경우, 올리고물이 이미 포스포릴화되면서 이 단계는 생략됨). 혼합물을 1분 동안 95 ℃로 가열하고(변성 단계), 이후 혼합물이 실온으로 천천히 냉각되게 하여 올리고물이 어닐링되게 하였다. 어닐링된 혼합물을 결찰에서 직접 사용하거나, 추가로 필요할 때까지 -20 ℃에서 저장하였다.

OspA 유전자 단편의 클로닝 . 개별 합성 OspA 유전자를 작제하는 데 필요한 4개의 단편의 각각을 pUC18로 독립적으로 클로닝하고 이. 콜라이 숙주 DH5α로 형질전환하였다(도 1 참조).

각각의 신규한 OspA 유전자의 경우, 30개 내지 60개의 염기의 4개 세트의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 세트는 8개 내지 12개의 상보성 중첩 올리고뉴클레오타이드로 이루어진다. 각각의 세트로부터의 올리고뉴클레오타이드를 별개의 실험에서 어닐링하여 어느 한 말단에서 특이적 제한 효소 인식 자리를 갖는 이중 가닥 DNA 단편, 즉 단편 N-H(Nde I - Hind III), H-K(Hind III - Kpn I), K-E(Kpn I - EcoR I) 및 E-B(EcoR I - BamH I)를 생성하였다. 네 개(4)의 단편의 각각을 상응하는 제한 효소로 절단된 pUC18로 독립적으로 클로닝하고, 클로닝된 단편의 서열이 검증된 후 이. 콜라이 숙주 DH5α로 형질전환하였다.

플라스미드 DNA(pUC18)를 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 플라스미드 정제 시스템으로 밤새 이. 콜라이 배양물(LB 브로쓰)로부터 정제하였다. 이후, 벡터 DNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 제한 효소의 쌍으로 분해하였다; Nde I 및 Hind III, Hind III 및 Kpn I, Kpn I 및 EcoRI, EcoR I 및 BamH I. 분해된 샘플을 0.8% 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 선형화된 벡터 DNA를 절제하고 제조업자의 프로토콜에 따라 상업용 겔 용리 키트(QIAquick Gel Extraction Kit, 퀴아젠)를 사용하여 용리하고, T4 DNA 리가제를 사용하여 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 혼합물에 결찰하였다. 결찰 생성물을 이. 콜라이 DH5a의 경쟁 세포로 형질전환하고, 플라스미드를 포함하는 형질전환체는 암피실린(100μg/ml)을 포함하는 LB 한천에서 선택되었다.

플라스미드 DNA를 정제하고, 클로닝에 사용된 효소로 DNA를 분해하고, 이전에 기재된 절차를 이용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 DNA 단편을 분석함으로써 pUC18인 클로닝 벡터에서의 예상된 크기의 삽입체의 존재를 확인하였다. DNA 주형으로서 정제된 플라스미드 DNA 및 서열분석 프라이머 5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG-3(서열 번호 14) 및 5'-GCTTCCGGCTCGTAT(서열 번호 15)(각각 bp 130-150 및 bp 530-515의 다수의 클로닝 자리 밖의 pUC18 벡터에 있음)를 사용하여 클로닝된 DNA 단편을 서열분석하였다. 서열 반응을 자동 서열기(ABI 310)에서 실행하였다. 서열에디터를 사용하여 서열을 에디팅하고, 분석을 위해 서열을 VectorNTI로 불러왔다. 정확한 서열을 갖는 클론만을 전장 OspA 유전자를 작제하기 위한 빌딩 블록으로서 사용하였다.

lipB sOspA 5/3 유전자를 위해, 적합한 독특한 내부 자리가 Kpn I - BamH I 단편 내에 발견되지 않고, 아미노산 서열은 내부 EcoR I 자리의 사용을 허락하지 않으므로 상이한 전략을 이용하였다(도 14 참조). Pvu II 자리는 Kpn I - BamH I 단편 내에 존재하지만, pUC18 벡터에서의 2개의 Pvu II 자리가 존재하고, 이는 pUC18에서의 단편의 직접 클로닝이 가능하지 않다는 것을 의미한다. 그러므로, 작제물을 위한 올리고물은 Pvu II 자리의 외부에 및 이에 인접하게 삽입된 EcoR I 자리를 가져, pUC18로의 Kpn I - EcoR I 및 EcoR I - BamHI 단편의 클로닝을 허용하도록 설계되었다. Kpn I, EcoR I 및 BamH I에 의한 삽입된 단편의 후속 분해는 단편을 생성시켰고, 이 단편은 후속하여 Pvu II에 의해 분해되었다. 이후, Pvu II 분해된 단편(Kpn I -Pvu II및 Pvu II- BamH I)을 Kpn I 및 BamHI로 절단된 pUC18 벡터 DNA로 3중 결찰에서 사용하여 Kpn I - BamH I 단편을 생성시켰다.

전장 OspA 유전자의 작제 . 다음 단계에서, 개별 합성 OspA 유전자의 작제에 필요한 4개의 단편의 각각을 pUC18 벡터로부터 절제하고, 단일 단계에서 pUC18 벡터로 재클로닝하여 전장 OspA 유전자를 생성시켰다(도 1 참조).

전장 유전자를 만드는 데 필요한 4개의 단편을 미니프렙으로부터 절제하였다. DNA는 원래 클로닝 단계에 사용된 동일한 제한 효소를 사용하여 단리되었다. 분해된 샘플을 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 개개의 4개의 삽입체 단편의 각각에 대한 DNA를 절제하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 상업용 겔 용리 키트(QiaQuick Gel Extraction Kit)를 사용하여 용리하고, Nde I 및 BamH I로 분해된 선형화된 벡터 DNA에 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰시키고, QIAquick Gel Extraction Kit를 사용하여 정제하였다. 결찰된 DNA를 이. 콜라이 DH5α의 경쟁 세포로 형질전환하고, 플라스미드를 포함하는 클론은 암피실린(100μg/ml)을 포함하는 LB 한천에서 선택되었다. 콜로니는 예상된 크기(대략 830bp)의 삽입체의 존재에 대해 PCR에 의해 스크리닝되었다.

단일 클로니를 10X 완충제(15mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂), 200μM dNTP, 1.25U 암플리타크(Amplitaq) DNA 중합효소, 400nM 정방향 프라이머 5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG-3(서열 번호 14) 및 400nM 역방향 프라이머 5'-GCTTCCGGCTCGTAT(서열 번호 15)를 포함하는 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용하였다. PCR 반응 조건은 하기와 같다; 5분 동안 94 ℃, 35x(30초 동안 94 ℃, 30초 동안 48 ℃, 1분 30초 동안 72 ℃), 이어서 5분 동안 72 ℃에서 침지 및 4 ℃에서 유지. PCR 생성물을 직접 사용하거나 추가의 사용까지 ≤ -15 ℃에서 저장하였다. PCR 생성물을 정확한 크기(대략 980bp)의 삽입체의 존재에 대해 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 정확한 크기의 삽입체를 서열분석하여 오류가 도입되지 않았다는 것을 확인하고, 즉 서열 반응이 밤새 배양물(LB amp 브로쓰)로부터 단리된 플라스미드 DNA(퀴아젠 플라스미드 정제 키트)를 사용하고 클로닝 자리를 플랭킹하는 서열분석 프라이머(각각 bp 130-150 및 530-510의 5'-TCGGGGCTGGCTTAACTATG-3'(서열 번호 14) 및 5'-GCTTCCGGCTCGTATGTTGT-3'(서열 번호 16))를 사용하여 설정되었다. 서열 반응을 자동 서열기(ABI 310)에서 실행하였다. 서열에디터를 사용하여 서열을 에디팅하고, 분석을 위해 서열을 VectorNTI로 불러왔다.

pET30a 발현 벡터로의 신규한 OspA 유전자의 서브클로닝 . 전장 OspA 유전자가 pUC18에서 검증되면, 이후 OspA 유전자를 제한 효소 NdeI 및 BamH I를 사용하여 pET-30a 발현 벡터로 서브클로닝하고, 이. 콜라이 숙주 HMS 174(DE3)로 형질전환하였다.

정확한 서열을 갖는 pUC18 클론으로부터의 미니프렙 DNA를 Nde I 및 BamH I로 분해하였다. 유사하게, pET30a 벡터 DNA를 Nde I 및 BamH I로 분해하였다. 분해된 DNA를 아가로스 겔에서 실행하고 전기영동으로 분리하였다. 대략 830bp의 삽입체 단편 및 선형화된 벡터 DNA를 절제하고 상기 기재된 바대로 정제하였다. 벡터 및 삽입체 DNA를 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰하고, 결찰 생성물을 이. 콜라이 HMS174(DE3)(Novagen)의 경쟁 세포로 형질전환하였다. 형질전환체를 카나마이신(30μg/ml)을 포함하는 LB 플레이트에서 평판배양하였다. 단일 콜로니를 프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'(서열 번호 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3'(서열 번호 18)을 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 후속하여, 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 플라스미드 정제 키트를 사용하여 미니프렙 DNA가 단리된 밤새 배양물을 설정하도록 정확한 크기(대략 1kb)의 생성물을 생성시킨 콜로니를 사용하였다. 서열은 다시 (각각 bp 65-86 및 395-373의 프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'(서열 번호 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3'(서열 번호 18)을 사용하여) 확인되었고, 콜로니는 발현 시험에 대해 선택되었다.

lipB sOspA 1/2로부터의 lipB sOspA 1/2 ²⁵¹ 의 생성. 단일 아미노산은 면역원성을 증대시키도록 lipB sOspA 1/2 작제물에서 변화되었고, 즉 251번 위치의 아미노산 알라닌은 아스파라긴 잔기로 변화되었다. 아미노산 변화는 PCR에 의해 도입되었다. 처음에, PCR은 외부 정방향 프라이머 및 내부 역방향 프라이머로 설정되어 도입된 아미노산 변화로 약 730bp의 생성물을 생성시켰다(도 15 참조). 둘째로, PCR은 내부 정방향 프라이머 및 외부 역방향 프라이머로 설정되어 도입된 아미노산 변화로 100bp의 생성물을 생성시켰다. 이후, 서열에서 중첩된 2개의 PCR 생성물을 외부 정방향 및 외부 역방향 프라이머에 의한 최종 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용하여, 도입된 아미노산 변화를 포함하는 최종 전장 OspA 생성물을 생성시켰다.

pET30a 작제물을 주형 DNA의 소스로서 사용하였다. 10X 완충제[15mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2], 200μm dNTP, 1.25U 암플리타크 DNA 중합효소, 및 400nM의 각각의 프라이머 쌍(프라이머 쌍 5'-GGA ATT CCA TAT GCG TCT GTT GAT CGG CT(서열 번호 19) 및 5'-TTG GTG CCT GCG GAG TCG(서열 번호 20) 및 프라이머 쌍 5'-AAT ACG ACT CCG CAG GCA CC(서열 번호 21) 및 5'-CTG-GGA TCC GCT CAG CTT ATT TCA(서열 번호 22))을 포함하는 PCR 반응을 설정하였다. PCR 반응은 하기 조건으로 설정되었다; 5분 동안 94 ℃, 35x(30초 동안 94 ℃, 30초 동안 48 ℃, 1분 30초 동안 72 ℃), 이어서 5분 동안 72 ℃에서의 침지 및 4 ℃에서의 유지. 반응은 2개의 별개의 중첩 생성물을 생성시켰고, 2개의 생성물은 Nde I 및 BamH I에 대한 제한 자리에 대해 도입된 외부 프라이머 5'-GGA ATT CCA TAT GCG TCT GTT GAT CGG CT(서열 번호 19) 및 5'-CTG-GGA TCC GCT CAG CTT ATT TCA(서열 번호 22)를 사용하여 제3 PCR 반응에서 주형 DNA로서 사용되었다. 반응 조건은 60초 동안 94 ℃, 이어서 (30초 94 ℃, 60초 49 ℃, 90초 72 ℃)의 35회 사이클, 이어서 5분 동안 72 ℃이었다. 증폭된 생성물을 제조업자의 규격에 따라 퀴아퀵 정제 키트(퀴아젠)를 정제하고, 생성물을 Nde I 및 BamH I로 분해하고, Nde I 및 BamH I로 절단된 pET30a 벡터 DNA에 결찰하였다. 결찰 생성물을 이. 콜라이 DH5α의 경쟁 세포로 형질전환하였다. 형질전환체를 카나마이신(30μg/ml)을 포함하는 LB 플레이트에 평판배양하였다. 단일 콜로니를 프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'(서열 번호 17) 및 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3'(서열 번호 18)을 사용하여 PCR에 의해 클로닝하였다. PCR 생성물을 아가로스 겔에 적용하고 전기영동으로 분리하였다. 후속하여, 정확한 크기(대략 1kb)의 생성물을 생성시킨 콜로니를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아젠 플라스미드 정제 키트를 사용하여 미니프렙 DNA가 단리된 밤새 배양물을 설정하였다. 서열을 (프라이머 5'-TTATGCTAGTTATTGCTCAGCG-3'(서열 번호 17) 및 5-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGT-3'(서열 번호 18)을 사용하여) 확인하고, 생성된 작제물을 이. 콜라이 HMS174(DE3) 경쟁 세포로 형질전환하고, 생성된 양성 형질전환체는 lipB sOspA 1/2²⁵¹로 명칭하였다.

선도 서열이 없는 작제물의 생성. 지질 모이어티가 아미노 말단 시스테인 잔기에서 통상적으로 부착된 lipB 선도 서열로 작제물을 제조하였다. 재조합 지질화 OspA의 실험적 시험은 지질 모이어티의 존재를 검증하였다. 그러나, lipB 선도 서열을 포함하지 않는 작제물을 또한 제조하였다. 선도 서열을 코딩하는 핵산 서열이 없고 메티오닌 잔기에 대한 코돈으로 대체된 시스테인 잔기에 대한 코돈을 갖는 769-771bp의 최종 생성물을 생성하도록 선택된 프라이머를 사용하여 (pET30a에서) 3개의 lipB 작제물의 각각으로부터 PCR 증폭에 의해 lipB 선도 서열을 포함하지 않는 작제물을 만들었다.

PCR 반응은 10X 완충제[15mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50mM KCl, 1.5mM MgCl2], 200μm dNTP, 1.25U 암플리타크 DNA 중합효소, 400nM 정방향 프라이머 5'-cgtgcgtaccatATGGCACAGAAAGGTGCTGAGTCT-3'(서열 번호 23) 및 400nM 역방향 프라이머 5'-CTGGGATCCGCTCAGCTTATTTCA-3'(서열 번호 22) 및 주형 DNA를 포함한다. PCR 반응은 하기와 같다; 5분 동안 94 ℃, 35x(30초 동안 94 ℃, 30초 동안 48 ℃, 1분 30초 동안 72 ℃), 이어서 5분 동안 72 ℃에서의 침지 및 4 ℃에서의 유지. PCR 반응을 직접 사용하거나 추가의 사용까지 ≤15 ℃에서 저장하였다.

PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하고, Nde I 및 BamH I로 분해하고, Nde I 및 BamH I로 분해된 pET30a 벡터 DNA에 결찰하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 HMS174(DE3)를 형질전환하고, 재조합 플라스미드를 포함하는 콜로니는 카나마이신에 대한 이의 내성에 의해 선택되었고, PCR 생성물로부터 서열을 검증하였다.

이. 콜라이 HMS 174( DE3 )에서의 발현의 평가. 선택된 콜로니는 각각의 신규한 OspA 단백질을 발현시키는 이의 능력에 대해 시험되었다. 각각의 경우에, 단일 콜로니를 사용하여 카나마이신(30μg/ml)을 포함하는 LB 브로쓰를 접종하고, 0.6 초과 및 1 미만의 OD(600nm) 값이 도달될 때까지 1 내지 5시간 동안 37 ℃에서 접종하였다. 이때, 배양물의 샘플이 보유되었고(비유도 샘플을 나타냄), 배양물의 나머지는 1mM의 최종 농도로 IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 비유도 샘플(1ml)을 원심분리하고, 펠렛을 -20 ℃에서 보유하고 저장하였다. 유도된 배양물이 추가로 3시간 동안 성장하게 하고, 이후 1ml의 샘플을 취하고, OD(600nm)를 측정하고, 샘플을 원심분리하고. 펠렛을 -20 ℃에서 보유하고 저장하였다.

1차 세포의 제조. 1차 세포를 3개의 지질화 작제물의 각각에 대해 및 3개의 비지질화 작제물의 각각에 대해 제조하였다. 1차 세포는 각각의 OspA를 발현하는 pET30a 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 세포(HMS174(DE3))로 이루어진다. 1차 세포의 제조를 위해, 각각의 스톡으로부터의 단일 콜로니를 카나마이신(30μg/ml) 및 리팜피신(200μg/ml)을 포함하는 플레이트로부터 집고, 500μl의 SMK 배지(SOP 8114)를 접종하도록 사용하고 밤새 항온처리하였다. 이후, 100리터의 이 배양물을 사용하여 100ml의 SMK 배지를 (2회) 접종하고 배양물을 37 ℃에서 진탕시키면서 17 내지 20시간 동안 항온처리하였다. 이후, 무균 글리세롤을 15%의 최종 농도로 배양물에 첨가하고 물질을 500μl 양의 분취량으로 60개의 앰플에 피펫팅하여, -80 ℃에서 바로 저장된 1차 세포의 60개의 앰플을 생성시켰다.

혈청형 1 및 2 OspA(lipB sOspA 1/2251), 혈청형 6 및 4 OspA(lipB sOspA 6/4) 및 혈청형 5 및 3 OspA(lipB sOspA 5/3)로부터의 보호 에피토프를 갖는 OspA 분자를 코딩하도록 3개의 합성 OspA 유전자를 설계하였다. 이 분자의 1차 아미노산 서열 및 이 설계로 도입된 주요 특징의 설명이 하기 실시예에 기재되어 있다.

실시예 3:

지질화 1/2 ²⁵¹ OSPA ( LIPB SOSPA1 /2 ²⁵¹ )의 설명

본 연구의 목표는 혈청형 1 및 2를 포함하는 신규한 OspA 항원, 지질화 1/2 ²⁵¹ OspA(lipB sOspA 1/2²⁵¹)를 설계하는 것이다. LipB sOspA 1/2²⁵¹은 혈청형 2 서열(균주 Pko, 유전자은행 수탁 번호 S48322)의 원위 부분에 융합된 혈청형 1 OspA 서열(균주 B31, 유전자은행 수탁 번호 X14407)의 근위 부분을 포함한다. 2형 혈청형에 독특한 서열의 시작은 216번 위치의 리신(K) 잔기이다. 작제물을 원래 251번 위치의 아미노산 알라닌(A)을 코딩하도록 설계하였다. 그러나, 면역원성을 증대시키기 위해 아스파라긴(N) 잔기(Pko로부터 공개된 서열에서의 실제 잔기)를 코딩하고, 따라서 명칭 lipB sOspA 1/2²⁵¹을 코딩하도록 PCR에 의해 이후 작제물을 변경하였다.

lipB sOspA 1/2²⁵¹의 2차 특징은 도 2에서의 lipB sOspA 1/2²⁵¹의 주석이 달린 아미노산 서열에 도시되어 있고 하기를 포함한다:

● 분자의 근위 부분(161번 내지 185번 아미노산)에서의 hLFA-1(YVLEGTLTA)(서열 번호 24)인 추정상 관절염 유발 에피토프(Gross 등, 1998)의, 혈청형 2 OspA 서열(균주 Pko; 유전자은행 수탁 번호 S48322)로부터의 동등한 서열(이탤릭체로 표시됨 및 플랭킹 서열)(hLFA-1 에피토프와 구별되는 서열)에 의한 대체;

● OspB 선도 서열(도 2의 1번 내지 15번 아미노산) 및 선행 기술을 피하는 다양한 치환. 44번 및 46번 위치에서의 아스파라긴(N) 및 아스파르트산(D) 잔기는 각각 아스파르트산(D) 및 아스파라긴(N)으로 대체되어, 서열 KEKDKN(서열 번호 25)을 생성한다. 78번 및 79번 위치에서의 알라닌(A) 및 아스파르트산(D) 잔기는 각각 트레오닌(T) 및 아스파라긴(N)으로 대체되어, 서열 KTNKSK(서열 번호 26)를 생성한다;

● 국제 특허 공보 WO 제02/16421A2호(Luft & Dunn)에 기재된 안정화 돌연변이. 예를 들어, 136번 아미노산에서 메티오닌(M) 대체된 아르기닌(R)(R139M); 157번 아미노산에서의 티로신(Y) 대체된 글루탐산(E)(E160Y); 및 아미노산 186번 아미노산에서 메티오닌(M) 대체된 리신(K)(K189M); 및

● 추가의 안정화 돌연변이. 예를 들어, 173번 아미노산에서 트레오닌(T) 대체된 발린(V)(본 개시내용의 176번 aa). 추정상 관절염 유발 에피토프(161-185번 위치)의 제거는, B. 부르그도르페리 서열을 B. 아프젤리 서열로 대체함으로써, 173번 아미노산과 174번 아미노산 사이의 수소 결합을 파괴하였다(본 개시내용의 176번 및 177번 aa). 이는 보호 단일클론 항체(105.5 및 LA-2)에 대해 감소된 결합을 발생시켰다(Jiang 등, J. Immunol . 144: 284-9, 1990; Golde 등, Infect . Immun . 65: 882-9, 1997; 및 Ding 등, J. Mol . Biol . 302: 1153-64, 2000). 트레오닌(T)은 발린(V) 대신에 173번 위치에서 도입되어, 수소 결합을 복구하고 보호 단일클론 항체 105.5 및 LA2에 대한 반응성을 증가시켰다.

또한, 16-25번 아미노산(성숙 단백질의 시작)은 OspB 서열(유전자은행 수탁 번호 X74810)과 동일하다.

lipB sOspA 1/2²⁵¹의 추론된 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드는 도 3에 도시되어 있다. 선도 서열(녹색)은 단백질 분비 동안 개열된다. 성숙 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 자리를 형성하는 시스테인 잔기(밑줄)로 시작한다.

실시예 4:

지질화 6/4 OSPA ( LIPB SOSPA 6/4)의 설명

본 연구의 목표는 혈청형 4 및 6을 포함하는 지질화 sOspA 6/4 OspA(lipB sOspA 6/4)인 신규한 OspA 항원을 설계하는 것이다. LipB sOspA 6/4는 혈청형 4 서열(균주 pTroB; 유전자은행 수탁 번호 I40089)의 원위 부분에 융합된 혈청형 6 OspA 서열(균주 K48, 유전자은행 수탁 번호 I40098)의 근위 부분을 포함한다. 4형 혈청형에 독특한 서열이 시작은 217번 위치에서의 아스파라긴(N) 잔기이다. 2차 특징은 도 4에서의 lipB sOspA 6/4의 주석이 달린 아미노산 서열에 도시되어 있고 하기를 포함한다:

● 국제 특허 출원 WO 제02/16421A2호(Luft 및 Dunn)에 기재된 안정화 돌연변이: 136번 아미노산에서의 아르기닌(R) 대신에 메티오닌(M), 157번 아미노산에서의 글루탐산(E) 대신에 티로신(Y), 및 187번 아미노산에서의 리신(K) 대신에 메티오닌(M); 및

● 상기 기재된 lipB sOspA 1/2²⁵¹와 같이, OspB 선도 서열이 사용되고(도 4에서의 1번 내지 15번 아미노산), 16-25번 아미노산은 OspB(유전자은행 수탁 번호 X74810)로부터의 서열과 동일하다.

펩타이드 서열 KEKNKD(서열 번호 27)가 모 OspA 6형 서열(KEKDKD)(서열 번호 28)로부터 부재하지만, 46번 위치에서의 아스파르트산(D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 이루어진 동등한 변화와 일치하게 아스파라긴 잔기(N)로 대체되어 서열 KEKDKN(서열 번호 25)을 생성한다.

펩타이드 서열 KADKSK(서열 번호 29)가 모 OspA 6형 서열(KTDKSK)(서열 번호 30)로부터 부재하지만, 79번 위치에서의 아스파르트산(D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 이루어진 동등한 변화와 일치하게 아스파라긴 잔기(N)로 대체되어 서열 KTNKSK(서열 번호 26)를 생성한다.

37번 아미노산은 모 서열(균주 K48; 유전자은행 수탁 번호 I40098)에 존재하는 글루탐산(E)으로부터 발린(V)으로 변경되는데, 왜냐하면 거의 모든 6형 서열이 이 위치에서 발린을 가지기 때문이다.

lipB sOspA 6/4의 추론된 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드는 도 5에 도시되어 있다. 선도 서열(녹색)은 단백질 분비 동안 개열된다. 성숙 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 자리를 형성하는 시스테인 잔기(밑줄, 도 5 참조)로 시작한다.

실시예 5:

지질화 5/3 OSPA ( lipB SOSPA 5/3)의 설명

본 연구의 목표는 혈청형 3 및 5를 포함하는 지질화 sOspA 5/3 OspA(lipB sOspA 5/3)인 신규한 OspA 항원을 설계하는 것이다. LipB sOspA 5/3은 서열 번호 5 및 6에 기재된 변형을 갖는 혈청형 3 서열(균주 PBr; 유전자은행 수탁 번호 X80256, B. 가리니 OspA 유전자)의 원위 부분에 융합된 혈청형 5 OspA 서열[데이터베이스 수탁 번호 emb|X85441|BGWABOSPA, B. 가리니 OspA 유전자(WABSou 하위균주)]의 근위 부분을 포함한다. 3형 혈청형에 독특한 서열의 시작은 216번 위치에서의 아스파르트산(D) 잔기이다. 2차 특징은 도 6에서의 lipB sOspA 5/3의 주석이 달린 아미노산 서열에 도시되어 있고 하기를 포함한다:

● 국제 특허 출원 WO 제02/16421A2(Luft 및 Dunn)에 기재된 안정화 돌연변이: 136번 아미노산에서의 아르기닌(R) 대신에 메티오닌(M); 157번 아미노산에서의 글루탐산(E) 대신에 티로신(Y); 및 187번 아미노산에서의 리신(K) 대신에 메티오닌(M); 및

● 상기 기재된 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 및 lipB sOspA 6/4와 같이, OspB 선도 서열이 사용되고(도 6에서의 1번 내지 15번 아미노산), 16-25번 아미노산은 OspB(유전자은행 수탁 번호 X74810)로부터의 서열과 동일하다.

펩타이드 서열 KEKNKD(서열 번호 27)가 모 OspA 5형 서열(KEKDKD)(서열 번호 28)로부터 부재하지만, 46번 위치에서의 아스파르트산(D) 잔기는 lipB sOspA 1/2²⁵¹ 작제물에서 이루어진 동등한 변화와 일치하게 아스파라긴 잔기(N)로 대체되어 서열 KEKDKN(서열 번호 25)을 생성한다.

펩타이드 서열 KADKSK(서열 번호 29)가 모 OspA 5형 서열(KTDKSK)(서열 번호 30)로부터 부재하지만, 79번 위치에서의 아스파르트산(D) 잔기는 lipB sOspA 1/2251 작제물에서 이루어진 동등한 변화와 일치하게 아스파라긴 잔기(N)로 대체되어 서열 KTNKSK(서열 번호 26)를 생성한다.

lipB sOspA 5/3의 추론된 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드는 도 7에 도시되어 있다. 선도 서열(녹색)은 단백질 분비 동안 개열된다. 성숙 OspA 단백질의 서열은 단백질의 지질 앵커에 대한 부착 자리를 형성하는 시스테인 잔기(밑줄, 도 7 참조)로 시작한다.

실시예 6:

이. 콜라이 에서의 높은 수준 발현을 위한 코돈 사용빈도의 최적화

이. 콜라이에서 드문 코돈의 존재는 외래 유전자의 높은 수준 발현에 대한 잠재적 장애를 제시하는 것으로 공지되어 있으므로, 사용빈도가 적은 코돈은 이. 콜라이에서 고도로 발현된 유전자에 의해 사용된 코돈으로 대체되었다. 신규한 OspA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 이. 콜라이 유전자인 고도로 발현된 종류 II 중에서 가장 빈번히 발견되는 코돈(바람직한 코돈)을 사용하도록 설계되었다(Guerdoux-Jamet et. al., DNA Research 4:257-65, 1997). 신규한 OspA 유전자 중에 코돈 사용빈도 및 이. 콜라이 유전자인 고도로 발현된 종류 II에 대한 데이터가 표 7 및 표 8에 요약되어 있다. tRNA 분자가 속도 제한이 아닐 것 같은 덜 빈번한 아미노산에 대한 데이터가 가장 자주 발생하는 아미노산에 대한 데이터(표 8)로부터 별도로 제시되어 있다(표 7).

표 7. 새로운 OspA 유전자에서의 코돈 사용빈도(덜 흔한 아미노산 ^* )

* 즉, 전체 아미노산의 수의 2.5% 미만을 개별적으로 구성하는 아미노산.

표 8. 새로운 OspA 유전자에서의 코돈 사용빈도(더 흔한 아미노산)

신규한 OspA 유전자(오직 일반 아미노산)에 대해 선택된 코돈 사용빈도 사이의 및 이. 콜라이 II 종류 유전자 중에서 높은 정도의 일치도는 명확하다(즉, 각각의 신규한 OspA 유전자에 대한 II 종류 유전자에 대한 표 8로부터의 백분율 도면의 작도; 도 8 참조). 3개의 지질화 작제물의 경우, 원래 서열은 32.8% 내지 33.8% 범위의 GC 함량을 갖고, 코돈 최적화 서열은 이. 콜라이의 50%의 GC 함량과 유사한 43.8% 내지 46.8%의 GC 함량을 갖는다.

실시예 7:

합성 비지질화 OSPA 유전자의 작제

lipB 선도 서열을 포함하지 않는 작제물을 또한 제조하였다. 2개 세트의 작제물(지질화 및 비지질화)은 발효기에서 이의 제조 용이성(바이오매스, 안정성, 생성물 수율 등)을 평가하고, 상이한 유형의 항원이 어떻게 용이하게 정제될 수 있는지를 평가하고, 이의 생물학적 특성(안전성 프로필 및 보호 효능)을 비교하기 위해 필요하다.

도입된 제한 자리를 갖는 PCR 프라이머를 사용하여 각각의 3개의 lipB OspA 작제물(서열 번호 1, 서열 번호 3, 및 서열 번호 5)로부터 PCR 증폭에 의해 작제물(서열 번호 7, 서열 번호 9, 및 서열 번호 11)을 생성하였다. PCR 생성물을 정제하고, Nde I 및 BamH I로 분해하고, 분해된 pET30a 벡터 DNA에 결찰하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 DH5α를 형질전환하고, OspA 서열을 검증하였다. 미니프렙 DNA를 제조하고, 단리하고, 사용하여 HMS 174(DE3) 숙주 세포를 형질전환하였다. 비지질화 유도체의 서열은 선도 서열을 코딩하는 처음의 45개의 염기쌍이 결여되고 지질화 버전에서 시스테인 코돈을 대체하는 메티오닌 코돈을 포함하는 Nde I 자리를 포함한다는 것을 제외하고는 지질화 버전과 동일하다(도 9 참조).

실시예 8:

신규한 재조합 OSPA 항원의 발현

항원 목적을 위한 신규한 재조합 OspA 유전자를 발현/제조하기 위해, 박테리오파지 T7 RNA 중합효소에 의해 조절된 이. 콜라이 발현 시스템(Studier 등, J. Mol . Biol . 189:113-30, 1986)을 사용하였다. 이 발현 시스템에서, 신규한 OspA 유전자를 플라스미드의 pET 시리즈 중 하나(예를 들어, pET30a)에서의 다수의 클로닝 자리로 클로닝하였다. 외래 유전자의 발현은 이. 콜라이 RNA 중합효소에 의해 인식되지 않는 박테리오파지 T7 프로모터의 조절 하에 있으므로, 발현은 T7 RNA 중합효소의 소스에 따라 달라진다. 재조합 플라스미드가 T7 RNA 중합효소 유전자의 염색체 카피를 포함하는 적절한 발현 숙주, 예컨대 이. 콜라이 HMS174(DE3)로 운반될 때 이 효소가 제공된다. 염색체상 통합된 T7 RNA 중합효소 유전자의 발현은 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 또는 락토스의 첨가에 의해 전환(즉, 유도)될 수 있는 lacUV5 프로모터의 제어 하에 있다(도 10 참조). 결과적으로, 외래 유전자의 발현은 또한 인듀서 분자의 첨가에 의해 조절된다.

세포를 후기 대수기에서 유도하고 유도 3-4시간 후 수확하였다. 유도된 세포에서, 키메라 OspA 항원은 세포 용해물의 SDS-PAGE에 의해 결정된 가장 고도로 발현된 단백질이다. 대부분의 OspA 키메라는 상청액에서 발견되었다. 오염시키는 이. 콜라이 단백질을 음이온-교환 크로마토그래피에 의해 제거하고, 보이드 용적에서 용리된 키메라 OspA 단백질을 한외여과로 농축하였다.

각각의 작제물로부터의 신규한 재조합 OspA 단백질의 발현을 시험하고, 유도된 및 비유도된 배양물로부터의 샘플을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 수행하였다(도 11). 지질화(서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6) 및 비지질화(서열 번호 8, 서열 번호 10, 및 서열 번호 12) 항원을 위해, 대략 31kDa의 밴드가 각각의 경우에 관찰되었다(도 11 참조). 단백질을 규명하고, 말단 메티오닌이 개열된다는 가정 하에 결정된 분자량은 이론상 분자량과 상관되었다(+/- 0.5 달톤). 도 11은 발현된 재조합 지질화 OspA 단백질이 전체 단백질 수율 중 적어도 10%를 포함한다는 것을 나타내어, 작제물이 이의 의도되는 목적에 유용하다는 것을 입증한다.

실시예 9:

단일 재조합 OSPA 항원(R OSPA 1/2)은 B. 부르그도르페리 s.s. 및 B. 아프젤리 에 의한 감염에 대해 보호한다

본 연구의 목적은 OspA 혈청형 1 및 2의 보호 특성을 보유하도록 설계된 단일 재조합 항원(rOspA 1/2; 서열 번호 2(lipB sOspA 1/2²⁵¹)를 포함하는 폴리펩타이드)이 B. 부르그도르페리 s.s. (OspA 혈청형 1) 또는 B. 아프젤리 (OspA 혈청형 2)에 의한 감염에 대해 마우스를 보호하는 항체 반응을 유도할 수 있는지를 결정하는 것이다. 추가의 rOspA 항원의 포함이 rOspA 1/2 항원에 의해 제공된 보호 면역에 대한 길항 작용을 갖지 않는다는 것을 나타내는 증거가 제공된다.

rOspA 1/2의 설계 및 작제 . 우연한 물질을 도입하는 위험을 제거하기 위해, 상보성 중첩 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 함께 결찰되고 벡터 pET30a로 클로닝된 DNA 단편을 생성하고, 서열을 검증하였다. 이 접근법은 또한 OspA 유전자를 발현하도록 설계된 이. 콜라이 숙주 HMS174 (DE3)에 대해 코돈 사용빈도가 최적화되게 한다. 신규한 유전자는 혈청형-2 서열(219번 내지 273번 아미노산, 균주 Pko; 수탁 번호 S48322)의 원위 부분에 융합된 혈청형-1 OspA 서열(29번 내지 218번 아미노산, 균주 B31; 유전자은행 수탁 번호 X14407)의 근위 부분에 기초한다. B. 부르그도르페리 균주 B31로부터의 25개의 아미노산 단편(164번 내지 188번 aa)을 B. 아프젤리 균주 PKo로부터의 서열(164번 내지 188번 aa)로 대체하는데, 왜냐하면 B31 OspA의 이 구역(165-173번 aa)이 hLFA-1 에피토프를 포함하는 구역(332-340번 aa)과 매우 관련되기 때문이다. 선도 서열을 포함하는 N-말단 서열 및 처음의 11개의 아미노산은 지질화 단백질 발현을 최적화하기 위해 OspB(균주 B31; 유전자은행 수탁 번호 X74810)로부터 유래한다. rOspA 1/2 분자의 면역원성 및 입체형태 안정성을 개선하도록 다른 특이적 아미노산 변화가 이루어지고, rOspA 1/2(lipB sOspA 1/2²⁵¹)의 서열이 서열 번호 2에 기재되어 있다.

동물 시험. 상이한 OspA 항원을 발현하는 보렐리아의 2개의 종에 의한 감염을 방지하는 단일 재조합 OspA 항원(rOspA 1/2)의 능력은 애주번트로서 0.2%의 (w/v) 수산화알루미늄과 제형화된 정제된 OspA 항원(0.1μg 또는 0.03μg의 용량)에 의해 피하로 면역화된(0일 및 28일) C3H/HeJ 마우스에서 평가되었다. 진피내 주사(니들 공격; 7 x 10⁴ 세포) 또는 천연 감염 경로(진드기 공격)에 의해 부스터 면역 2주 후 마우스를 공격하였다. 후자 실험의 경우, 8마리의 약충 진드기를 마우스마다 적용하고 최대 5일 동안 사육하였다. 라임병의 풍토 지역인 부트바이스(Budweis)(체코) 근처에서 약충을 수집하였다. 대부분의 이 진드기를 PCR에 의해 비사육된 진드기를 시험하여 결정된 B. 아프젤리로 감염시켰다. 마우스의 감염 상태를 4주 후에 결정하였다. 진드기 공격 실험에서, 보렐리아의 존재는 배양(방광)에 의해 및 실시간 PCR(심장)에 의한 보렐리아 DNA의 검출에 의해 확인되었다. 동물 실험은 동물 실험에 대한 오스트리아 법규 및 국제 가이드라인(AAALAC 및 OLAW)에 따라 수행되고, 동물 실험 관리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 검토되고, 오스트리아 규제 기관에 의해 승인받았다. 면역원성. 표준품으로서 한정된 IgG 함량을 갖는 OspA 특이적 단일클론 항체(인하우스 제조) 및 코팅 항원으로서의 rOspA 1/2를 사용하여 ELISA에 의해 rOspA 1/2 항원에 대한 항체 반응(μg의 IgG/ml)을 결정하였다.

진단학적 절차. 니들 공격 실험의 경우, 표면 노출된 지단백 VlsE 단백질에서의 보존된 에피토프(C6 ELISA; Immunetics® C6 Lyme ELISA^TM로부터의 코팅된 플레이트) 또는 OspA 면역원 이외의 보렐리아 항원(웨스턴 블로팅)에 대한 항체의 존재를 이용하여 감염을 진단하였다. 웨스턴 블로팅은 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 ZS7로부터 제조된 세포 용해물을 사용하였는데, 이것이 공격 유기체이기 때문이다. 동물은 검정 둘 다에서 양성인 경우 감염된 것으로 간주되었다.

진드기 공격 실험의 경우, C6 ELISA 및 웨스턴 블로팅을 또한 수행하였다. 그러나, 웨스턴 블로팅은 B. 부르그도르페리 s.s. ZS7, B. 아프젤리 ACA1 및 B. 가리니 KL11로부터의 용해물을 사용하는데, 감염시키는 유기체의 실체가 알려져 있지 않기 때문이다. 검정 둘 다가 양성인 경우 동물은 혈청전환을 겪는 것으로 생각되었다. 또한, 방광으로부터의 배양에 의해 및 OspA의 5'-구역을 표적화하는 실시간 PCR 검정 및 16S rRNA 유전자 기반 검정을 이용하여 심장 조직으로부터 추출된 게놈 DNA에서 B. 부르그도르페리 s.l. 핵산의 검출에 의해 보렐리아 감염을 평가하였다. PCR 생성물이 검정 둘 다로 검출된 경우에만 동물을 PCR-양성으로 점수 매겼다. 전체적으로, 동물을 감염된 것으로 판단하기 위해, 마우스는 배양, PCR 또는 혈청학에 의해 양성일 필요가 있다.

감염시키는 보렐리아의 규명. 가능한 경우, 감염시키는 유기체를 배양하고, OspA 서열 및 추론된 아미노산 서열을 38-262번 OspA 잔기(B. 아프젤리 VS461, 유전자은행 수탁 번호 Z29087)에 대해 결정하였다. 이 정보를 OspA 기준 서열과 비교하여 OspA 유형 및 보렐리아 종이 추론될 수 있었다. 단일 OspA 혈청형을 발현하는 종의 경우, 종에 대한 균주 유형에 대한 OspA 서열, 예를 들어, B. 아프젤리 VS461 또는 B. 발라이시아나 VS116(유전자은행 수탁 번호 Z29087; AF095940)은 기준으로서 선택되었다. B. 가리니가 다수의 OspA 유형을 가지면서, OspA 유전자형 3-7에 대한 OspA 서열을 사용하였다(즉, 균주 PBr, PTrob, WABSou, TlsI 및 T25; 각각 유전자은행 수탁 번호 X80256, X80186, X85441, X85440 및 X80254). 실시간 PCR 기반 타이핑의 경우, 유전자은행에 수탁된 124 B. 부르그도르페리 s.l. 종의 OspA 유전자의 서열 정렬을 혈청형 특이적 서열에 대해 검사하고, 프라이머 익스프레스(Primer Express) 3.0(Applied Biosystems)을 사용하여 적합한 프라이머-프로브 조합을 설계하였다. 모든 검정을 유니버셜 순환 조건을 이용하여 ABI Prism® 7900HT 서열 검출 유닛에서 실행하였다.

rOspA 1/2에 의한 면역화에 의한 B. 부르그도르페리 s.s( OspA 혈청형-1) 감염의 예방. rOspA 1/2 항원의 2개의 상이한 롯트의 저용량으로 면역화된 모든 마우스는 ELISA에 의해 결정된 면역원에 특이적인 IgG 항체를 발생시켰다. 수산화알루미늄을 포함하는 백신 제제 완충제로 처리된 대조군 마우스에서 항체가 검출되지 않았다. 혈청형-1 OspA를 코딩하는 종인, B. 부르그도르페리 s.s.에 의한 감염을 방지하는 이 면역 반응의 능력을 평가하기 위해, 마우스를 7 x 10⁴의 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 ZS7의 세포로 진피내 감염시켰다. 애주번트를 포함하는 완충제로 처리된 모든 대조군 마우스는 C6 ELISA 및 웨스턴 블로팅에 의해 입증된 바대로 감염의 혈청학적 증거를 나타냈다. rOspA 1/2 항원으로 면역화된 마우스는 감염되지 않았고, 이 마우스로부터의 혈청은 검정 둘 다에 의해 음성이었다. 적은 0.03μg의 rOspA 1/2 항원은, 애주번트로서 수산화알루미늄과 제형화되고 2개 용량 면역화 섭생으로 투여될 때, 약독화 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 ZS7에 의한 니들 공격에 대해 100% 보호(P < 0.0001, 피셔(Fisher)의 정확한 2중 테일 시험)를 부여하였다.

rOspA 1/2에 의한 면역화에 의한 B. 아프젤리 ( OspA 혈청형-2) 감염의 예방. 혈청형-2 OspA를 코딩하는 종인, B. 아프젤리에 의한 감염을 방지하는 rOspA 1/2 항원에 의한 면역화의 능력을 평가하기 위해, 상기 기재된 니들 공격 실험에서 사용된 동일한 항원 롯트 및 연구 설계를 갖는 2개의 별개의 실험에서 마우스를 면역화하였다. 그러나, 이 경우에, 면역화된 마우스는 주로 B. 아프젤리에 의해 감염되는 것으로 공지된 돌아다니는 진드기(약충)에 의해 공격받았다. 이 돌아다니는 진드기가 B. 부르그도르페리 s.l.을 마우스로 전달하는 능력은 비면역화된 대조군 동물을 공격함으로써 확인되었다.

대부분의 대조군 마우스(전체 11/14, 79%)는 감염되었다. 모든 감염된 대조군 동물은 2개의 독립적인 실시간 PCR 검정(16S rRNA 및 OspA 유전자)에 의해 보렐리아 DNA에 대해 양성이었다. 10/11 사례에서, 방광의 배양에 의해 보렐리아를 단리할 수 있었다. 남은 마우스는 혈청학 및 PCR에 의해 양성이었다. 10개 중 9개의 배양 단리물의 경우, OspA 서열이 회수되었고 모두 B. 아프젤리(99% 초과의 OspA 서열 동일성)로서 타이핑되었다. 더욱이, 모든 감염시키는 유기체를 혈청형 2 OspA 유전자를 특이적으로 표적화하는 실시간 PCR 검정을 이용하여 심장으로부터 추출된 DNA의 PCR 분석에 의해 B. 아프젤리로서 타이핑되었다. 이 데이터는 B. 아프젤리가 감염된 돌아다니는 진드기로부터 이의 마우스 숙주로 전달되는 주요 보렐리아 종이라는 것을 확인시켜준다.

rOspA 1/2로 면역화된 적은 마우스(전체 3/32, 9%)가 감염되었다. 이 3개의 마우스 중에, 1마리는 모든 3개의 진단학적 기준(혈청학, PCR 및 배양)에 의해 결정된 바대로 감염되었고, 서열 분석은 감염시키는 유기체가 B. 가리니 혈청형 6(99% 초과의 OspA 서열 동일성)이라는 것을 나타냈다. 감염된 것으로 생각된 남은 2마리의 동물은 3개 중 2개의 진단학적 기준에 의해서만 양성이었다. 1마리의 마우스는 혈청학 및 PCR에 의해 양성이었다. 그러나, 감염시키는 유기체는 배양에서 회수되지 않았다. 그럼에도 불구하고, 이 유기체는 혈청형 7 OspA 유전자에 특이적인 PCR을 이용하여 심장으로부터 추출된 DNA의 PCR 분석에 의해 B. 가리니 혈청형 7로서 타이핑될 수 있었다. 세 번째 마우스는 PCR 및 배양 양성이지만, 혈청학적으로 음성이었다. 이 마우스로부터 배양된 단리물은 서열분석에 의해 결정된 바대로 B. 발라이시아나이었다(B. 발라이시아나 균주 VS116과의 OspA 서열 동일성). 중요한 것은, 면역화된 마우스 중 어느 것도(0/32) B. 아프젤리에 의해 감염되지 않는다는 것이다. 적은 0.03μg의 rOspA 1/2 항원은, 애주번트로서 수산화알루미늄과 제형화되고 2개 용량 면역화 섭생으로 투여될 때, 돌아다니는 진드기에 의해 전달된 B. 아프젤리에 대해 완전 보호를 부여하였다.

결론. 2개의 상이한 OspA 혈청형(1 및 2)으로부터의 보호 구성요소를 포함하도록 설계된 단일 재조합 외부 표면 단백질 A(OspA) 항원은 B. 부르그도르페리 센수 스트릭토(OspA 혈청형-1) 또는 B. 아프젤리(OspA 혈청형-2)에 의한 감염에 대해 마우스를 보호하는 항체 반응을 유도할 수 있었다. B. 부르그도르페리 s.s. 균주 ZS7에 의한 감염에 대한 보호는 니들 공격 모델에서 입증되었다. B. 아프젤리 종에 대한 보호는 돌아다니는 진드기를 사용하는 진드기 공격 모델에서 나타났다. 모델 둘 다에서, 적은 0.03μg의 항원은, 애주번트로서 수산화알루미늄과 2개 용량 면역화 스케줄로 투여될 때, 표적화된 종에 대한 완전한 보호를 제공하기에 충분하다. 예상된 바대로, 이 신규한 항원에 의해 제공된 보호는 B. 가리니 및 B. 발라이시아나 균주에 의한 감염에 대한 보호를 제공하는 항원의 불능에 의해 입증된 바대로 다른 보렐리아 종으로 확대되지 않았다. 주요 연구의 이 증거는 보호 에피토프의 정보가 더 적은 OspA 항원을 요하는 효과적인, 유전적으로 변형된 백신의 합리적인 설계를 위해 이용될 수 있다는 것을 입증하고, 이 접근법은 세계적 사용을 위한 OspA 백신의 개발을 수월하게 할 수 있다는 것을 제시한다.

실시예 10:

살아있는 보렐리아의 표면에 결합하거나 이의 성장을 억제하는 마우스 항- OSPA 항체의 효력은 B . 부르그도르페리 S.S. 1형 균주를 사용한 니들 공격에 대한 보호와 상관된다

본 연구의 목적은 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토 OspA 1형 균주를 사용한 니들 공격 모델에서 rOspA 1/2 항원에 의해 면역화된 마우스에 대한 보호의 상관물을 확립하는 것이다. 분석된 매개변수는 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하거나 보렐리아에의 성장을 억제하는 항- OspA 항체의 효력이었다.

98마리의 마우스를 실시예 9에 사용된 더 적은 용량보다 10배 낮은 0.2% AI(OH)3과 애주번트된 차선의 3ng의 용량의 rOspA 1/2 항원으로 고의적으로 면역화하여,공격 시, 보호되고 감염된 동물 둘 다가 관찰될 수 있었다. 백신접종을 0일, 14일 및 28일에 100 μl의 용량 용적을 사용하여 피하로 수행하였다. 38일에, 예비 공격 혈청 샘플을 96마리의 마우스로부터 취하고, 동물을 배양 성장된 B. 부르그도르페리 s.s. ZS7의 19.4 x ID₅₀로 10일 후 공격하고, 감염 상태를 4주 후 결정하였다. 96마리 중 71마리의 마우스(72%)는 이 낮은 용량의 항원으로 면역화한 후 보호되는 것으로 밝혀졌다.

예비 공격 후 4주에 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 ZS7의 막 분획에 대해 이의 혈청을 웨스턴 블로팅함으로써 감염된 마우스를 확인하도록 혈액을 채취하였다. 사용된 공격 용량에서, 오직 감염된 마우스가 OspA 이외의 균주 ZS7의 막 항원에 대해 항체 반응을 가졌다(백신에 의해 유도된 OspA에 대한 반응은 채점되지 않았다).

살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 OspA 항체 결합의 정량. 이 검정에서, OspA 1형을 발현하는 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31를 보체 활성화를 방지하는 EDTA의 존재 하에 실온에서 예비 공격 마우스 혈청과 고정된 희석률(1:100)로 항온처리하였다. 비결합 항체를 제거하도록 세척한 후, 처리된 세포를 r-피코에리쓰린-접합 항마우스 Ig 다중클론 항체와 항온처리함으로써 세포 표면에 특이적으로 결합하는 항체를 표지하였다. 이후, 적색 형광을 방출하여 검출을 증대시키는 DNA 균주(LDS-751)를 사용하고, 박테리아를 이후 유세포분석기(FACSCalibur, Beckton-Dickinson)에 분석하였다. 세포 표면에 부착된 항체 분자의 수와 상관되는 형광 강도를 적어도 2,000개의 개별적인 보렐리아에에 대해 기록하고, 형광 강도의 평균(MFI)을 계산하였다. 정상 마우스 혈청은 항체의 비특이적 표면 결합의 정도를 평가하기 위한 음성 대조군으로서 작용하지만, OspA 혈청형 1-특이적 mAb는 OspA 유형의 실체를 확인하고 박테리아 배양물에서 세포의 OspA 발현의 수준을 검증하기 위한 양성 대조군으로서 작용하였다.

박테리아 성장 억제 검정. 보렐리아에의 성장을 억제하는 예비 공격 혈청의 효력을 측정하기 위해, OspA 1형을 발현하는 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31를 보체(정상 기니아 피그 혈청)의 존재 하의 열 불활화 예비 공격 또는 비면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 연속 희석물의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. 현미경으로 결정된 바대로 비면역 혈청과 항온처리된 대조군 배양물에서의 박테리아가 충분히 성장할 때, 정확한 세포수를 유세포 분석적 분석에 의해 만들었다. 세포 배양물을 한정된 수의 형광 표지된 비드를 포함하는 용액과 혼합하고, 보렐리아 세포를 형광으로 표지하도록 DNA-염료를 사용하였다. 100개의 비드가 계수될 때까지 샘플을 FACSCalibur 유세포 분석기를 사용하여 처리하고, 비드를 한정하는 게이트와 보렐리아에를 한정하는 게이트에서의 사건의 수를 비교함으로써 절대 세포 농도(세포/ml)를 계산하였다. 박테리아 성장을 50%로 억제한 혈청 희석은 NMS 대조군과 비교하여 계산되고 GI-50 역가로서 보고되었다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 검정 사이에 역가를 정규화하였다. 측정된 혈청 매개변수의 분포를 비모수적 만-휘트니 U 시험( Graphpad Prism Vers . 5.0)에 의해 감염되고 보호된 동물 중에 비교하였다.

본 연구의 결과(도 19 참조)는 공격 시 면역 혈청의 기능성 항체 함량과 B. 부르그도르페리 s.s. (ZS7)의 고용량(19.4 x ID₅₀) 니들 공격에 의한 감염에 대한 보호 사이에 매우 상당한 상관관계가 존재한다는 것을 명확히 나타낸다. 세포 표면에 부착된 항-OspA 항체 분자의 수를 반영하는 OspA 1형을 발현하는 살아있는 보렐리아에의 FACS 기반 형광 강도 측정을, 고정된 희석률에서의 예비 공격 혈청과의 박테리아의 항온처리 후 수행하고, 보호와 훌륭히 상관시켰다(p<0.0001 만-휘트니 U 시험). 그러나, 성장 억제 역가는 또한 보호와 훌륭히 상관되었다(p =0.0002 만-휘트니 U 시험, 도 19).

실시예 11:

살아있는 보렐리아 의 표면에 결합하거나 성장을 억제하는 마우스 항- OSPA 항체의 효율은 B. 아프젤리 2형 균주를 사용한 진드기 공격에 대한 보호와 상관된다.

본 연구의 목적은 마우스를 감염시키는 체코의 부트바이스로부터 수집된 돌아다니는 진드기를 사용함으로써 자연 감염 경로를 이용하는 진드기 공격 모델에서 키메라 OspA 1/2 항원으로 면역화된 마우스의 보호의 상관물을 확립하는 것이다. 이 풍토 지역으로부터의 약충 진드기가 주로 B. 아프젤리로 감염되므로, 이들은B. 아프젤리 OspA 2형 균주 공격을 제공하는 것으로 생각된다. 실시예 10에 기재된 바대로, 분석된 매개변수는 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하거나 보렐리아에의 성장을 억제하는 항- OspA 항체의 효력이고, 이들 둘 다는 보렐리아 부르그도르페리 s.s에 의한 니들 공격에 대해 훌륭히 상관되는 것으로 나타났다.따라서, 본 연구는 유럽에서 가장 주요한 인간 질환 관련 동유전자종인 B. 아프젤리의 자연 감염에 대한 보호의 상관물로서 이 2개의 매개변수를 사용하는 것의 적용을 연장하도록 작용한다.

40마리의 마우스를 프라임-부스터 섭생에서 실시예 9에 사용된 더 적은 용량보다 10배 낮은 0.2% AI(OH)3과 애주번트된 준최적 3ng의 용량의 rOspA 1/2 항원으로 면역화하였다. 실시예 10에서처럼, 보호되고 감염된 동물 둘 다가 공격 후 관찰된다는 것을 보장하도록 이 차선의 용량을 선택하였다. 백신접종을 0일, 14일 및 28일에 100 μl의 용량 용적을 사용하여 피하로 수행하였다. 40일에, 예비 공격 혈청을 생성하도록 마우스로부터 개별적인 혈액 샘플을 취했다. 이용 가능한 제한된 수의 진드기가 모든 40마리의 마우스의 공격을 허용하지 않으므로, 광범위한 반응을 커버하도록 표면 결합 및 항 2형 IgG 농도에 기초하여 20마리의 마우스를 선택하였다. 8마리의 진드기를 각각의 마우스에 적용하고 5일 동안 마우스에 섭식하도록 하였다. 공격 4주 후, 마우스를 희생시키고, 면역화된 마우스 및 대조군 마우스의 감염 상태를 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 및 B. 가리니로부터의 막 항원에 대한 혈청의 웨스턴 블로팅; 방광으로부터의 보렐리아 유기체의 배양물; 및 방광으로부터 추출된 DNA로부터의 보렐리아의 실시간 PCR 검출에 의해 결정하였다.

살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 OspA 항체 결합의 정량. 이 검정에서, OspA 2형을 발현하는 B. 아프젤리 균주 아르콘(Arcon)을 보체 활성화를 방지하기 위해 EDTA의 존재 하에 실온에서 예비 공격 마우스 혈청과 고정된 희석률(1:100)로 항온처리하였다. 비결합 항체를 제거하도록 세척한 후, 처리된 세포를 r-피코에리쓰린-접합 항마우스 Ig 다중클론 항체와 항온처리함으로써 세포 표면에 특이적으로 결합하는 항체를 표지하였다. 검정에서의 모든 후속 단계는 실시예 10에 기재된 것과 유사하였다. 정상 마우스 혈청은 비특이적 항체 결합에 대한 음성 대조군으로서 작용하였다. 3중 보체 rOspA 백신 제제에 대해 길러진 높은 역가의 마우스 혈청은, OspA 혈청형 2-특이적 mAb와 함께, 양성 대조군으로서 작용하여 박테리아 배양물에서 OspA 혈청형 특이성 및 세포의 OspA 발현 수준을 확인시켜주었다.

박테리아 성장 억제 검정. 보렐리아에의 성장을 억제하는 예비 공격 혈청의 역가를 측정하기 위해, OspA 2형을 발현하는 B. 아프젤리 균주 아르콘을 보체 없이 열 불활화 예비 공격 또는 비면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 연속 희석물의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. 현미경으로 결정된 바대로 비면역 혈청과 항온처리된 대조군 배양물에서의 박테리아가 충분히 성장할 때, 정확한 세포수를 유세포 분석적 분석에 의해 만들었다. 박테리아를 계수하기 위해 이용된 절차는 실시예 10에서의 성장 억제 검정을 위해 상기 기재된 것과 유사하였다. 박테리아 성장은 50%로 억제한 혈청 희석을 NMS 대조군과 비교하여 계산되고 GI-50 역가로서 보고되었다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 검정 사이에 역가를 정규화하였다.

통계학적 분석. 측정된 혈청 매개변수의 분포를 비모수적 만-휘트니 U 시험(Graphpad Prism Version 5.0)에 의해 감염되고 보호된 동물에서 비교하였다.

결과. 0.003pg의 rOspA 1/2로 3회 면역화되고 8마리의 돌아다니는 진드기로 공격된 20마리의 동물 중에서, 7/20(35%)이 감염되는 것으로 밝혀졌다. 제한된 진드기 이용가능성으로 인해, 비면역화된 마우스의 대조군을 공격함으로써 공격의 정확한 감염률을 결정할 수 없었다. 그러나, 이 공격은 본 연구의 목적에 필요하지 않고, 통상적으로 70-80%의 감염률이 부트바이스로부터의 돌아다니는 진드기에 의한 공격 실험에 의해 성취되었다.

표면 결합(p = 0.007) 및 성장 억제(p = 0.03) 검정의 결과에 대한 보호되고 감염된 군 사이에 상당한 차이가 검출되었다(도 20).

결론. 본 연구에서, 공격 시 마우스 혈청에서의 기능성 항체 함량과 마우스마다 8마리의 진드기를 적용하는 돌아다니는 진드기 공격에 의한 감염에 대한 보호 사이에 통계학적으로 유의적인 상관관계가 존재하는 것으로 나타났다. 세포 표면에 부착된 항-OspA 항체 분자의 수를 반영하는 OspA 2형을 발현하는 살아있는 보렐리아에의 FACS 기반 형광 강도 측정을, 고정된 희석률에서의 예비 공격 혈청과의 박테리아의 항온처리 후 수행하고, 보호와 훌륭히 상관시켰다. 성장 억제 역가는 또한 보호와 훌륭히 상관되었다. 효과적인 사멸에 보체가 필요한 보렐리아 부르그도르페리 s.s. 균주와 반대로, rOspA1/2 항원은 보체의 부재 하에서도 보렐리아 성장을 효과적으로 억제하는 항체를 유도하였다.

실시예 10 및 11에 제시된 연구의 결과는, 함께 취해질 때, 활성 마우스 보호 모델, 예를 들어, 즉, B. 부르그도르페리 s.s..OspA 1형 균주에 대한 니들 공격 모델 및 B. 아프젤리 OspA 2형 균주에 대한 진드기 공격 모델이 현재 이용 가능한 실시예 둘 다에서의, "보호의 상관물"로서의, 살아있는 보렐리아에 대한 표면 비결합 항체의 평균 형광 강도(MFI) 및 면역 마우스 혈청의 GI-50 역가의 실험실내 매개변수를 확립한다. 더구나, OspA 3-6형을 발현하는 상동성 B. 가리니 균주에 대한 보호를 평가하기 위한 신뢰성 있는 활성 보호 모델의 부재 하에, 추론하자면, 상기 언급된 모델은 모든 백신 상동성 OspA 유형을 발현하는 균주에 대한 및 심지어 비상동성 OspA 유형을 발현하는 균주에 대한 다양한 백신 제제의 보호 잠재력 및 교차 균주 커버리지를 평가하기 위한 실험실내 "보호의 대리 마커"로서 사용되었다. 실제로, 이 기능성 면역 반응 검정을 이용한 연구를 3성분 키메라 rOspA 백신 제제에 의해 면역화된 마우스로부터의 면역 혈청에서 수행할 때, B. 가리니(OspA 3형, 4형, 5형, 6형)(실시예 13 참조)에 대해 필적하는 MFI 및 GI-50 역가를 얻었고, 따라서, 이 보호의 대리 마커를 통해, 현재 활성 마우스 보호 모델이 존재하지 않는 균주에 대해 보호 반응이 또한 성취된다는 것을 나타낸다. 더욱이, (a) 개별적인 키메라 rOspA 항원; (b) 또는 가능한 2성분 키메라 rOspA 항원 백신 제제 조합 중 임의의 하나; 또는 (c) 3성분 키메라 rOspA 항원 제제에 의해 면역화된 마우스의 면역 반응을 비교함으로써, OspA 1-6형을 발현하는 균주를 최적으로 커버하는 데에 후자의 3성분 백신이 필요하다는 것(실시예 14)을 밝혀낼 수 있었다. 더구나, 이 실험실내 대리 마커 검정을 이용함으로써, 3성분 키메라 rOspA 백신 제제(rOspA 1/2, rOspA 6/4 및 rOspA 5/3)로 마우스를 면역화한 후 생성된 면역 반응이 현재까지 시험된 1형, 2형, 3형, 5형 및 6형의 모든 유형간 변이체(또는 아형)(실시예 15 참조) 및 심지어 백신 내에 존재하는 상동성 OspA 1-6형 이외의 비상동성 OspA 유형(실시예 16 참조)에 대해 기능성 면역 반응을 유도한다는 것을 나타낼 수 있었다.

실시예 12:

3개의 항원(1/2, 6/4, 및 5/3)을 포함하는 다가 재조합 OSPA 제제는 마우스에서 고도로 면역원성이다.

다가 OspA 백신(rOspA 1/2, rOspA 5/3, 및 rOspA 6/4)은 진드기 공격 모델에서 평가되었다. OspA 혈청형 1 및 2(서열 번호 2), OspA 혈청형 6 및 4(서열 번호 4), 및 OspA 혈청형 5 및 3(서열 번호 6)으로부터의 보호 에피토프를 포함하는 3개의 재조합 OspA 항원은 백신에서 조합되었다.

10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스의 군(면역시 연령: 11주령)을 0.3μg의 다가 백신(0.1μg의 각각의 rOspA 1/2, rOspA 5/3, 및 rOspA 6/4)의 고정된 용량으로 0일 및 28일에 피하로 면역화하였다. 진드기 공격을 체코 부트바이스로부터의 진드기로 본 명세서에 상기 기재된 바대로 수행하였다. B. 부르그도르페리 s.l.을 마우스로 전달하는 돌아다니는 진드기의 능력은 비면역화된 대조군 동물을 공격함으로써 확인되었다. 공격된 마우스의 감염 상태는 웨스턴 블로팅, 실시간 PCR 및 배양에 의해 결정되었다.

중간 혈액 샘플을 안와 천자에 의해 41일에 취했다. 최종 혈액 샘플(70/71일)을 심장 천자에 의해 수집하였다. 개별 혈청을 원심분리(10분; 1000-2000xG; 실온)에 의해 전혈로부터 제조하였다. 혈청을 사용까지 ≤ - 20 ℃에서 저장하였다.

이 실험에서, 전체 감염률을 결정하고 감염시키는 유기체의 종을 확인하기 위해 마우스를 공격하기 위해 사용된 동일한 뱃치로부터 얻은 비섭식된 진드기를 규명하였다. 80마리의 약충 진드기가 B. 부르그도르페리 s.l. DNA의 존재에 대해 16S rRNA 실시간 PCR에 의해 시험될 때, 32.5%(26/80)가 감염된 것으로 밝혀졌다. OspA-혈청형은 26마리 중 22마리의 감염된 약충에 대해 PCR-ELISA에 의해 결정될 수 있었고; 86%(19/22)는 B. 아프젤리로서 타이핑되고 14%(3/22)는 B. 부르그도르페리 s.s.로서 타이핑되었다.

모든 비면역화된 마우스 마우스(100%; 10/10)가 감염되지만, 다가 rOspA 백신으로 면역화된 마우스 중 1마리만이 감염되었다(10%; 1/10). 감염된 마우스를 확인하기 위해 이용된 상이한 방법 사이의 100% 일치가 존재하였다. 다가 rOspA 백신은 대조군과 비교할 때 통계학적으로 매우 유의적인 보호(p=0.00012; 피셔의 정확한 2중 테일 시험)를 생성시켰다.

이 데이터는 rOspA 1/2 항원을 포함하는 다가 rOspA 백신에 의한 면역화가 혈청형 2 OspA를 발현하는 보렐리아 종인 B. 아프젤리에 의한 감염을 방지할 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 추가의 rOspA 항원의 포함이 rOspA 1/2 항원에 의해 제공된 보호 면역에 대한 길항 효과를 갖는다는 증가가 없다.

이 백신은 OspA 1/2 항원에 의해 관찰되는 것과 동등한 B. 아프젤리에 의한 진드기 매개 감염에 대한 보호를 제공하고; 0.2% Al(OH)3와 제형화되고 2개 용량 스케줄로 투여된 0.3μg의 백신(0.1μg의 각각의 항원)은 웨스턴 블롯, 보 렐리아의 배양 및 PCR에 의한 보렐리아 DNA의 검출에 의해 결정되는 바대로 90% 보호를 제공하였다.

실시예 13:

3성 분 백신( OSPA 1/2, OSPA 6/4, 및 OSPA 5/3)을 포함하는 백신은 OSPA 1-6형을 발현하는 보렐리아 균주에 결합하고 이의 성장을 억제하는 높은 수준의 기능성 항- OSPA 항체를 유도한다

표면 결합(MFI) 및 성장 억제(GI-50 역가) 둘 다가 니들 공격(B. 부르그도르페리 s.s.) 모델(실시예 10) 및 진드기 공격(B. 아프젤리) 마우스 모델(실시예 11)에서 보호의 우수한 상관물인 것으로 나타나면서, 백신의 효율을 조사하기 위해 생체내 보호 모델이 이용 가능하지 않는 B. 가리니 OspA 혈청형 3-6에 대한 3성분 키메라 rOspA 항원 백신 제제에 의해 동등한 기능성 면역 반응이 유도되는지를 결정하기 위해 본 연구를 수행하였다.

마우스 면역화. 10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스의 군을 애주번트로서 0.2% Al(OH)3과 조합된 3개의 상이한 용량(용량당 1, 0.1, 0.03μg의 단백질)에서의 rOspA-1/2, rOspA-6/4 및 rOspA-5/3의 1:1:1 혼합물로 3회(0일, 14일, 28일) 피하로 면역화하였다. 40일에 채취한 혈액 샘플로부터 혈청을 생성하였다.

살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 OspA 항체 결합의 정량. 이 검정에서, OspA 1-6형(B. 부르그도르페리 센수 스트릭토 B31/OspA-1; B. 아프젤리 아르콘 /OspA-2; B. 가리니 PBr/OspA-3; B. 가리니 DK6/OspA-4; B. 가리니 W/OspA-5; 및 B. 가리니 KL11/0spA-6)을 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아 균주의 실험실내 성장한 배양물을 보체 활성화를 방지하기 위해 EDTA의 존재 하에 실온에서 피크 역가 마우스 혈청의 풀(pool)과 고정된 희석률(1:100)로 항온처리하였다. 후속하는 세척, 표지, 검출 및 분석 절차는 실시예 10에 기재된 것과 유사하였다. 정상 마우스 혈청은 항체의 비특이적 결합에 대한 음성 대조군으로서 작용하였다.

박테리아 성장 억제 검정. 보렐리아에의 성장을 억제하는 예비 공격 혈청의 효력을 측정하기 위해, OspA 1-6형(B31, 아르콘, PBr, DK6, W, 및 KL11)을 발현하는 6개의 대표적인 균주를 열 불활화 피크 역가 혈청 풀 또는 비면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 연속 희석물의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. B31을 보체(기니아 피그 혈청)의 존재 하에 배양하고, 다른 5개의 균주를 보체의 부재 하에 시험하였다. 다시 한번, 성장 억제 검정을 실시예 10에 기재된 바대로 수행하였다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 검정 사이에 역가를 정규화하였다.

표면 결합 및 항- OspA 항체 반응의 성장 억제 효과. 50 내지 200 범위의 MFI 값을 갖는 강한 형광 염색이 1:100의 희석률에서의 3성분 백신의 상이한 면역화 용량 그룹(용량마다 1.0, 0.1 및 0.03μg의 단백질)으로부터 유래한 3개의 혈청 풀과 시험될 때 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 관찰되었다(도 21). 3 용량 그룹으로부터의 혈청 풀이 박테리아 성장을 억제하는 이의 역량에 대해 시험될 때, 3성분 백신은 1000(4형 균주, 0.03μg의 용량) 내지 20,000(6형 균주) 범위의 모든 6개의 OspA 유형 균주에 대해 강한 GI-50 역가를 유도하는 것으로 또한 밝혀졌다.

결론. 종합하면, 이 결과는 rOspA 항원이 고도로 면역원성이고 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하고 보렐리아에의 성장을 억제할 수 있는 충분한 분량의 기능성 항체를 유도한다는 것을 나타낸다. 시험된 6개의 균주 중에 커버리지는, 높은 형광 강도 및 높은 성장 억제 역가가 검출되면서, OspA 1형 및 2형에 대해 관찰된 수준과 필적하게 완전하였다. 요약하면, 본 연구에 제시된 결과는 3성분 rOspA 백신(1/2 + 5/3 + 6/4)에 의해 유도된 항체 반응은, Al(OH)3과 제형화될 때, OspA 1-6형을 발현하는 균주에 의한 감염을 방지한다는 것을 나타내고, 이 균주는, 역학적 연구가 나타낸 바대로, 이론적으로 유럽 및 북아메리카에서의 인간 질환을 발생시키는 단리물의 99%에 걸쳐 커버하고, 따라서 라임 보렐리아증을 예방하는 데 매우 효과적이다.

실시예 14:

3성 분 백신( OSPA 1/2, OSPA 6/4, 및 OSPA 5/3)을 포함하는 백신은 OSPA 1-6형을 발현하는 보렐리아 를 최적으로 커버하는 데 필요하다

본 연구의 목적은, 보호의 상관물로서 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하고 실험실내 보렐리아에의 성장을 억제하는 항-OspA 항체의 효과를 다시 이용하여, rOspA 라임 보렐리아증 백신의 단일성분 및 다성분 제제에 의해 유도된 성장 억제 항체 및/또는 기능성 표면 결합의 면역원성 및 교차 균주 커버리지를 조사하고 비교하는 것이다.

마우스의 면역화. 그룹마다 10마리의 암컷 마우스(C3H)를 프라임-부스터 섭생에서 rOspA 1/2 항원, rOspA 6/4 항원, 또는 rOspA 5/3 항원을 포함하는 0.1μg의 단일 성분 백신; 0.1μg의 1/2 + 5/3 항원, 1/2 + 6/4 항원, 또는 5/3 + 6/4 항원 둘 다를 포함하는 2성분 백신; 또는 0.2% AI(OH)3과 애주번트된 0.1μg의 모든 3개의 1/2+ 5/3+ 6/4 항원의 조합을 포함하는 3성분 백신으로 면역화하였다. 백신접종을 0일, 14일 및 28일에 200 μl의 용량 용적을 사용하여 피하로 수행하였다. 42일에, 혈청을 생성하도록 마우스로부터 개별적인 혈액 샘플을 취했다.

항체 표면 결합 및 성장 억제 검정. 약간 변형된 버전의 표면 결합 검정을 이용하여 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하는 항-OspA IgG의 효과를 결정하였다. 한정된 MFI 역가를 갖는 혈청 풀의 연속 희석물은 비선형 회귀 곡선에 의한 외삽 후 시험 혈청의 상대 역가가 판독되는 표준 곡선을 생성하도록 분석물에 포함되었다. OspA 1-6형을 발현하는 개별 균주에 대한 표준 혈청의 MFI역가는 보렐리아에의 형광 강도가 정상 마우스 혈청에 의해 관찰된 형광 강도에 비해 적어도 3배인 것으로 결정된 가장 높은 희석으로 정의되었다. 모든 결정을 2회 수행하였다.

도 22에 제시된 산점도는 단일 rOspA 항원 또는 rOspA 항원 조합에 의한 면역화 후 개별 C3H 마우스의 면역 혈청에 대해 관찰된 상동성 OspA 유형을 발현하는 6개의 균주에 대한 MFI 역가를 비교한다. 결과는 모든 3개의 rOspA 항원(1/2, 5/3 및 6/4)을 포함하는 제제가 OspA 1-6형을 발현하는 모든 6개의 보렐리아 균주에 대한 높은 MFI 역가를 유도하는 데 필요하고, 2개의 rOspA 항원(즉, 4개의 균주를 커버함)으로 이루어진 제제는 제제에 존재하지 않는 2개의 OspA 유형을 발현하는 균주를 완전히 커버하지 않는다는 것을 나타낸다.

성장 억제 항체를 유도하는 다양한 백신 조합의 효력을 결정하기 위해, OspA 1-6형을 각각 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아에 균주(B31, 아르콘, PBr, DK6, W, KL11)를 열 불활화 면역 또는 비면역 마우스 혈청 풀의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. 모든 혈청을 단일 희석으로 시험하였다. 하기 희석을 사용하였다: B31, PBr 및 KL11 1:200, 아르콘, DK6 및 W 1:100. PBr을 20%의 보체의 부재 하에 배양하고, 다른 5개의 균주를 보체의 존재 하에 시험하였다. 베이비 래빗 보체를 DK6, W 및 KL11에 사용하고, 기니아 피그 혈청을 B31 및 아르콘에 사용하였다. 현미경으로 결정된 바대로 비면역 혈청과 항온처리된 대조군 배양물에서의 박테리아가 충분히 성장할 때, 정확한 세포수를 상기 기재된 바대로 만들었다(실시예 10 참조). 박테리아 성장 억제의 백분율을 정상 마우스 혈청 대조군에 대한 시험 혈청에 의해 관찰된 세포수로부터 결정하였다. 시험된 상이한 제제에 대해 관찰된 전체 성장 억제가 이후 50% 초과의 성장 억제를 나타낸 10마리의 C3H 마우스의 상이한 그룹 중에서 동물의 수로서 제시되었다(도 23). 결과는 3성분 제제가 OspA 1-6형을 발현하는 모든 6개의 대표적인 균주에 대한 성장 억제 항체의 높은 역가를 유도할 수 있는 유일한 제제라는 것을 나타낸다(도 23). 모든 경우에, 3성분 백신 제제는 90% 초과의 면역화된 동물에서 50% 초과의 성장 억제를 제공하였다. 2성분 백신 제제는 백신에 존재하지 않는 OspA 유형을 발현하는 2개의 균주를 완전히 커버하지 않았다. rOspA 1/2 + 6/4를 포함하는 제제는 3형 균주를 커버하지 않았고; rOspA 1/2 + 5/3 제제를 포함하는 제제는 4 또는 6형을 커버하지 않았고; rOspA 5/3 + 6/4를 포함하는 제제는 1형을 커버하지 않았다.

실시예 15:

다가 OSPA 백신 제제는 1-6형의 유형간 변이체 또는 아형을 발현하는 보렐리아 를 커버한다

보렐리아 OspA 1-6형이 다가 rOspA 백신의 설계 및 작제에 대한 기초로서 선택되지만, 1형, 2형, 3형, 5형, 및 6형의 OspA 단백질 변이체를 발현하는 보렐리아에가 또한 단리되었다. 이 변이체는, 동일한 유형 내에 있는 것으로 분류되지만, 약간 변경된 뉴클레오타이드 유전자 서열 및 아미노산 단백질 서열을 갖는다. 따라서, 유형간 변이체 또는 아형은 OspA 1형, 2형, 3형, 5형, 및 6형 중에 존재한다(도 24 참조). 유형간 변이체 또는 아형이 OspA 4형에 아직 관찰되지 않았다.

본 연구의 목적은 3성분 다가 rOspA 백신에 의해 마우스를 면역화함으로써 생성된 면역 혈청이 이 유형간 변이체 또는 아형을 발현하는 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합할 수 있는 기능성 항체를 포함한다는 것을 확인하는 것이다.

이 연구를 위해, 0일, 14일 및 28일에 0.3μg의 3성분 다가 rOspA 백신으로 70마리의 암컷 C3H 마우스를 3회 면역화함으로써 혼주된 마우스 면역 혈청을 생성하였다. 42일에, 마우스를 사혈시키고 혈청을 얻고 혼주시켰다. 혼주된 면역 혈청을 이후 사용하여 살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 항체의 결합에 대해 시험하였다. 보렐리아 배양물을 면역 혈청 풀 또는 대조군 정상 마우스 혈청과 1:100으로 2회 항온처리하고, 박테리아에 대한 항-OspA 항체의 결합을 측정하는 보렐리아에의 형광 강도를 본 명세서에 상기 기재된 바대로 FACS 분석에 의해 모니터링하였다.

1:100의 혈청 희석에서의 표면 결합 항체의 높은 수준(비면역화 마우스 대조군 혈청에 대해 관찰된 것의 10배 초과의 형광 강도로 정의됨)이 OspA 아형 1-6을 발현하는 대부분의 균주에 대해 검출되었다. 특히, 항체 결합의 높은 수준은 OspA 아형 1a, 1b, 1c, 1d, 1f, 1h, 1J, 1k, 및 1l; 2a, 2b, 2e, 2g, 2k, 2l, 및 2n; 3a, 3c, 3d, 및 3e; 5a 및 5c; 및 6a, 6e, 6f, 6g, 및 6k를 발현하는 보렐리아에 균주에 의해 검출되었다(도 24). 더 약한 결합(비면역화 마우스 대조군 혈청에 대해 관찰된 것의 2배 내지 10배의 형광 강도로 정의됨)이 OspA 아형 1g, 2j, 2m, 3b, 5d, 및 6l을 발현하는 보렐리아에 균주에 의해 관찰되었지만(도 24), 이 더 약한 결합은 주로 이용된 성장 조건 하에 OspA 단백질의 낮은 발현으로 인한다.

결론. 3성분 키메라 rOspA 백신은 C3H 마우스에서 OspA 1형, 2형, 3형, 5형, 및 6형의 모든 유형간 변이체 또는 아형에 대해 기능성, 표면-결합 항체를 유도한다.

실시예 16:

다가 OSPA 백신 제제는 OSPA 1-6형을 발현하는 것에 부가하여 보렐리아 의 다른 유형에 대해 보호를 제공한다

본 연구의 목적은 3성분 키메라 rOspA 항원 백신 제제(모든 3개의 키메라 항원 - 1/2, 6/4, 및 3/5를 포함)가 상동성 OspA 1-6형 이외의 OspA 유형을 발현하는 보렐리아에 대해 보호를 또한 제공할 수 있는지를 결정하는 것이다. 40마리의 C3H 마우스를 0일, 14일 및 28일에 0.3μg의 3성분 백신으로 3회 면역화하였다. 42일에, 마우스를 사혈시키고, 혈청 풀을 만들고 사용하여 비상동성 OspA 유형을 발현하는 균주에 대한 성장 억제 및 표면 결합의 효율을 평가하는 것이다.

본 연구의 결과는 3성분 키메라 rOspA 백신이 보렐리아에의 표면에 결합하고, B. 스피엘마니, B. 발라이시아니아, B. 루시타니아에 및 B. 야포니카의 균주를 포함하는 보렐리아에의 다른 유형의 성장을 억제하는 항체를 유도한다는 것을 나타낸다(표 9 참조). OspA 7형을 발현하는 B. 가리니의 경우, 오직 약한 표면 결합이 관찰되고 적은 또는 무의 성장 억제가 관찰되지만; 이 약한 결합 및 소량의 성장 억제는 면역 혈청 항체의 결합의 결여 때문이기보다는 사용된 실험실내 배양 조건 하에 OspA의 낮은 발현 수준 때문일 수 있다.

표 9. 보렐리아에 의 다른 유형에 대한 표면 결합 및 성장 억제

+: 상당한 표면 결합 및/또는 성장 억제

-: 미미한 결합/성장 억제

(+-): 낮은 강도의 표면 결합

실시예 17:

다가 ospA 백신 제제는 보렐리아 균주를 발현하는 임의의 OspA 에 대한 보호에 기여할 수 있는 OspA 분자의 n-말단에서 공통 에피토프에 대한 항체를 유도한다

다가 키메라 rOspA 제제의 보호 효과를 조사하는 중에, rOspA-1/2 및 rOspA-6/4를 포함하는 2성분 rOspA 백신에 대해 단일클론 항체(F237/BK2)를 생성하였다. F237/BK2는 지금껏 조사된 모든 OspA 유형(OspA 1-7형), 및 3개의 키메라 rOspA 항원(rOspA-1/2, rOspA-5/3 및 rOspA-6/4)에 결합하는 항-OspA ELISA에 의해 나타났다. 이러한 결과는 F237/BK2가 모든 OspA 분자에서 발견된 공통 에피토프를 인식한다는 것을 나타낸다. 더구나, 예비 에피토프 맵핑 연구는 이 공통 에피토프가 분자의 덜 가변적인 N-말단 절반에(즉, 130번 아미노산의 N-말단에서) 위치하고, 여기서 OspA 서열 상동성이 가장 흔히 관찰된다는 것을 나타낸다.

흥미로운 것은 F237/BK2가, 단일클론 항체보다 덜 효과적으로 C-말단 유형-특이적 에피토프에 대해 지시하지만, 또한 B. 스피엘마니, B. 발라이시아니아 및 B. 야포니카에 의해 발현된 것을 포함하는, 상동성 OspA 1-6형 및 비상동성 OspA 유형을 발현하는 보렐리아에의 표면에 결합하는 것으로 나타났다는 것이다. 이전 실시예에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여, F237/BK2는 OspA 1형, 2형, 4형, 5형 및 6형을 발현하는 대표적인 균주의 성장을 억제하는 것으로 또한 밝혀졌다.

F237/BK2가 마우스에서 생체내 수동 보호 모델에서 시험될 때, F237/BK2는 B. 아프젤리 2형 공격에 상응하는 돌아다니는 진드기 공격에 대한 보호를 부여하는 것으로 관찰되었다. B. 아프젤리에 의해 주로 감염된 것으로 공지된 분츄흐(Wundschuh)(오스트리아 스트리아)에서 진드기를 수집하였다. 10마리의 암컷 C3H 마우스에 500μg의 친화도-정제된 mAb F237/BK2를 복강내 주사하였다. 2시간 후, 8마리의 진드기를 동물마다 10마리의 수동 면역화 마우스 및 10마리의 샴-면역화된 동물에 적용하였다. 4일 후, 섭식된 진드기를 제거하였다. 90일에, 마우스를 희생시키고, 본 명세서에 상기 기재된 바대로 혈청학적 시험, PCR 분석 및 보렐리아 성숙에 의해 감염에 대해 분석하였다. F237/BK2로 치료된 그룹에서 동물은 감염되지 않았지만, 대조군에서 5마리의 동물(50%)은 B. 아프젤리로 감염되었다. 따라서, 단일클론 항체 F237/BK2는 샴-면역화된 대조군 마우스와 비교할 때 진드기 공격에 대한 통계학적으로 유의적인(p = 0.0325) 수동 보호를 제공하였다. 이는 분자의 N-말단 절반에서 공통 에피토프에 결합하는 단일클론 항체가 보호에 관여된 것으로 보고된 처음이었다. 더구나, 백신이 이 공통 에피토프를 인식하는 항체를 유도할 수 있는 경우, 이 항체는 백신의 교차 보호 효율에 확실히 기여할 것이다.

이 항체가 실제로 3성분 키메라 rOspA 백신 제제에 의해 유도되는지를 시험하기 위해, 퍼옥시다제 표지된 F237/BK2를 사용하여 단일클론 항체 억제 ELISA를 수행하였다. 이 실험에서, GST-OspA 3형 단백질을 코팅 항원으로서 사용하였고, 정상 마우스 혈청 또는 3성분 키메라 rOspA 백신으로 면역화된 C3H 마우스로부터의 혈청 풀을 1:100의 희석으로 웰에 첨가하였다. 60분 후, 퍼옥시다제 표지된 F237/BK2를 미리 최적화된 농도로 첨가하여 결국 비억제 정상 마우스 혈청 대조군에 대해 대략 1의 광학 밀도(OD) 값을 생성하고, 추가 60분 동안 항온처리를 계속하였다. 마지막으로, ELISA 플레이트를 세척하고 TMB 기질로 전개시켰다.

이 단일클론 항체 억제 ELISA 검정을 이용하여, 3성분 키메라 rOspA 제제가 mAb F237/BK2에 의해 인식된 에피토프와 동일하거나 이와 매우 근접한 에피토프에 결합하는 항체를 실제로 유도한다는 것을 입증할 수 있었다. OD 값은 비억제 정상 마우스 혈청 대조군과 비교하여 항-OspA 면역 혈청에 의해 상당히 감소하였다(예를 들어, 통상적으로 20-30%).

결론. 본 연구는 3성분 키메라 rOspA 백신이 유형-특이적 및 광범위한 교차-보호 면역 반응 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 18:

추가의 합성 OSPA 핵산 및 폴리펩타이드 분자

본 연구의 목표는 각각 혈청형 1 및 2, 6 및 4, 및 5 및 3을 포함하는 추가의 신규한 OspA 항원을 설계하는 것이다. 3개의 합성 OspA 유전자(서열 번호 168(orig sOspA 1/2), 170(orig sOspA 6/4), 및 172(orig sOspA 5/3))를 보렐리아의 OspA 혈청형 1 및 2(orig sOspA 1/2), OspA 혈청형 6 및 4(orig sOspA 6/4) 및 OspA 혈청형 5 및 3(orig sOspA 5/3)으로부터의 보호 에피토프를 갖는 OspA 폴리펩타이드 분자를 코딩하도록 설계되었다. 이 분자의 1차 아미노산 서열(각각 서열 번호 169, 171, 및 173)은 표 1에 제공되어 있다. 이 서열은 원래 키메라 작제물(즉, 돌연변이 무 및 코돈 최적화 무)을 포함한다.

실시예 19:

3개의 항원(1/2, 6/4, 및 5/3)을 포함하는 다가 재조합 OSPA 제제는 마우스에서 면역원성이다

코돈 최적화가 없고 돌연변이가 없는 원래 작제물 제제(orig OspA 1/2, orig OspA 5/3, 및 orig OspA 6/4)를 포함하는 다가 OspA 백신을 진드기 공격 모델에서 평가하였다. OspA 혈청형 1 및 2(서열 번호 169), OspA 혈청형 6 및 4(서열 번호 171), 및 OspA 혈청형 5 및 3(서열 번호 173)로부터의 보호 에피토프를 포함하는 3개의 재조합 OspA 항원은 백신에서 조합되었다.

10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스의 군(면역시 연령: 11주령)을 0.3μg의 다가 백신(0.1μg의 각각의 orig OspA 1/2, orig OspA 5/3, 및 orig OspA 6/4)의 고정된 용량으로 0일 및 28일에 피하로 면역화하였다. 진드기 공격을 체코 부트바이스로부터의 진드기로 본 명세서에 상기 기재된 바대로 수행하였다. B. 부르그도르페리 s.l.을 마우스로 전달하는 돌아다니는 진드기의 능력은 비면역화된 대조군 동물을 공격함으로써 확인되었다. 공격된 마우스의 감염 상태는 웨스턴 블로팅, 실시간 PCR 및 배양에 의해 결정되었다.

중간 혈액 샘플을 안와 천자에 의해 41일에 취했다. 최종 혈액 샘플(70/71일)을 심장 천자에 의해 수집하였다. 개별 혈청을 원심분리(10분; 1000-2000xG; RT)에 의해 전혈로부터 제조하였다. 혈청을 사용까지 ≤ - 20 ℃에서 저장하였다.

이 실험에서, 전체 감염률을 결정하고 감염시키는 유기체의 종을 확인하기 위해 마우스를 공격하기 위해 사용된 동일한 뱃치로부터 얻은 비섭식된 진드기를 규명하였다.

실시예 20:

3성 분 백신( ORIG OSPA 1/2, ORIG OSPA 6/4, 및 ORIG OSPA 5/3)을 포함하는 백신은 OSPA 1-6형을 발현하는 보렐리아 균주에 결합하고 이의 성장을 억제하는 높은 수준의 기능성 항- OSPA 항체를 유도한다

실시예 13에 기재된 결과는 3성분 rOspA 백신(lipB sOspA1/2 + lipB sOspA 5/3 + lipB sOspA 6/4)에 의해 유도된 항체 반응은, Al(OH)3과 제형화될 때, OspA 1-6형을 발현하는 균주에 의한 감염을 방지하고, 따라서 라임 보렐리아증을 예방하는 데 효과적이라는 것을 나타낸다. 따라서, 본 연구는 동등한 기능성 면역 반응이 키메라 원래(orig) OspA 항원(Orig sOspA1/2 + Orig sOspA 5/3 + Orig sOspA 6/4)을 포함하는 3성분 OspA 백신에 의해 유도되는지를 결정하기 위해 수행된다.

마우스 면역화. 10마리의 암컷 C3H/HeJ 마우스의 군을 애주번트로서 0.2% Al(OH)3과 조합된 3개의 상이한 용량(용량당 1, 0.1, 0.03μg의 단백질)에서의 Orig sOspA1/2 + Orig sOspA 5/3 + Orig sOspA 6/4의 1:1:1 혼합물로 3회(0일, 14일, 28일) 피하로 면역화하였다. 40일에 채취한 혈액 샘플로부터 혈청을 생성하였다.

살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 OspA 항체 결합의 정량. 이 검정에서, OspA 1-6형(B. 부르그도르페리 센수 스트릭토 B31/OspA-1; B. 아프젤리 아크론/OspA-2; B. 가리니 PBr/OspA-3; B. 가리니 DK6/OspA-4; B. 가리니 W/OspA-5; 및 B. 가리니 KL11/0spA-6)을 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아 균주의 실험실내 성장한 배양물을 보체 활성화를 방지하기 위해 EDTA의 존재 하에 실온에서 피크 역가 마우스 혈청의 풀과 고정된 희석률(1:100)로 항온처리하였다. 후속하는 세척, 표지, 검출 및 분석 절차는 실시예 10 및 실시예 13에 기재된 것과 유사하였다. 정상 마우스 혈청은 항체의 비특이적 결합에 대한 음성 대조군으로서 작용하였다.

박테리아 성장 억제 검정. 보렐리아에의 성장을 억제하는 예비 공격 혈청의 효력을 측정하기 위해, OspA 1-6형(B31, 아크론, PBr, DK6, W, 및 KL11)을 발현하는 6개의 대표적인 균주를 열 불활화 피크 역가 혈청 풀 또는 비면역 마우스 혈청(음성 대조군)의 연속 희석의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. B31을 보체(기니아 피그 혈청)의 존재 하에 배양하고, 다른 5개의 균주를 보체의 부재 하에 시험하였다. 성장 억제 검정을 실시예 10 및 실시예 13에 기재된 바대로 수행하였다. 표준 혈청 제제를 사용하여 상이한 검정 사이에 역가를 정규화하였다.

항- OspA 항체 반응의 표면 결합 및 성장 억제 효율. 형광 염색이 1:100의 희석에서의 3성분 백신의 상이한 면역화 용량 그룹(용량마다 1.0, 0.1 및 0.03μg의 단백질)으로부터 유래한 3개의 혈청 풀과 시험될 때 모든 6개의 보렐리아 균주에 대해 관찰되었다.

실시예 21:

3성 분 백신( OSPA 1/2, OSPA 6/4, 및 OSPA 5/3)을 포함하는 백신은 OSPA 1-6형을 발현하는 보렐리아 를 최적으로 커버하는 데 필요하다

본 연구의 목적은 보호의 상관물로서 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하고 실험실내 보렐리아에의 성장을 억제하는 항-OspA 항체의 효과를 다시 이용하여 sOspA 라임 보렐리아증 백신의 단일성분 및 다성분 제제에 의해 유도된 성장 억제 항체 및/또는 기능성 표면 결합의 면역원성 및 교차 균주 커버리지를 조사하고 비교하는 것이다.

마우스의 면역화. 그룹마다 10마리의 암컷 마우스(C3H)를 프라임-부스터 섭생에서 Orig sOspA1/2 항원, Orig sOspA 5/3 항원, 또는 Orig sOspA 6/4 항원을 포함하는 0.1μg의 단일 성분 백신; 0.1μg의 1/2 + 5/3 항원, 1/2 + 6/4 항원, 또는 5/3 + 6/4 항원 둘 다를 포함하는 2성분 백신; 또는 0.2% AI(OH)3과 애주번트된 0.1μg의 모든 3개의 1/2+ 5/3+ 6/4 항원의 조합을 포함하는 3성분 백신으로 면역화하였다. 백신접종을 0일, 14일 및 28일에 200 μl의 용량 용적을 사용하여 피하로 수행하였다. 42일에, 혈청을 생성하도록 마우스로부터 개별적인 혈액 샘플을 취했다.

항체 표면 결합 및 성장 억제 검정. 약간 변형된 버전의 상기 기재된 표면 결합 검정을 이용하여 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합하는 항-OspA IgG의 효과를 결정하였다. 한정된 MFI 역가를 갖는 혈청 풀의 연속 희석은 비선형 회귀 곡선에 의한 외삽 후 시험 혈청의 상대 역가가 판독되는 표준 곡선을 생성하도록 분석물에 포함되었다. OspA 1-6형을 발현하는 개별 균주에 대한 표준 혈청의 MFI역가는 보렐리아에의 형광 강도가 정상 마우스 혈청에 의해 관찰된 형광 강도에 비해 적어도 3배인 것으로 결정된 가장 높은 희석에서 정의되었다. 모든 결정을 2회 수행하였다.

성장 억제 항체를 유도하는 다양한 백신 조합의 효력을 결정하기 위해, OspA 1-6형을 각각 발현하는 6개의 대표적인 보렐리아에 균주(B31, 아르콘, PBr, DK6, W, KL11)를 열 불활화 면역 또는 비면역 마우스 혈청 풀의 존재 하에 33 ℃에서 배양하였다. 모든 혈청을 단일 희석으로 시험하였다. 하기 희석을 사용하였다: B31, PBr and KL11 1:200, 아크론, DK6 및 W 1:100. PBr을 20%의 보체의 부재 하에 배양하고, 다른 5개의 균주를 보체의 존재 하에 시험하였다. 베이비 래빗 보체를 DK6, W 및 KL11에 사용하고, 기니아 피그 혈청을 B31 및 아르콘에 사용하였다. 현미경으로 결정된 바대로 비면역 혈청과 항온처리된 대조군 배양물에서의 박테리아가 충분히 성장할 때, 정확한 세포수를 상기 기재된 바대로 만들었다(실시예 10 참조). 박테리아 성장 억제의 백분율을 정상 마우스 혈청 대조군에 대한 시험 혈청에 의해 관찰된 세포수로부터 결정하였다. 시험된 상이한 제제에 대해 관찰된 전체 성장 억제가 이후 50% 초과의 성장 억제를 나타낸 10마리의 C3H 마우스의 상이한 그룹 중에서 동물의 수로서 제시되었다.

실시예 22:

다가 OSPA 백신 제제는 1-6형의 유형간 변이체 또는 아형을 발현하는 보렐리아 를 커버한다

본 연구의 목적은 3성분 다가 orig OspA 백신(orig sOspA 1/2, orig sOspA 6/4, 및 orig sOspA 5/3)에 의해 마우스를 면역화함으로써 생성된 면역 혈청이 이 유형간 변이체 또는 아형을 발현하는 살아있는 보렐리아에의 표면에 결합할 수 있는 기능성 항체를 포함한다는 것을 확인하는 것이다.

이 연구를 위해, 0일, 14일 및 28일에 0.3μg의 3성분 다가 orig OspA 백신으로 70마리의 암컷 C3H 마우스를 3회 면역화함으로써 혼주된 마우스 면역 혈청을 생성하였다. 42일에, 마우스를 사혈시키고 혈청을 얻고 혼주시켰다. 혼주된 면역 혈청을 이후 사용하여 살아있는 보렐리아에의 표면에 대한 항체의 결합에 대해 시험하였다. 보렐리아 배양물을 면역 혈청 풀 또는 대조군 정상 마우스 혈청과 1:100으로 2회 항온처리하고, 박테리아에 대한 항-OspA 항체의 결합을 측정하는 보렐리아에의 형광 강도를 본 명세서에 상기 기재된 바대로 FACS 분석에 의해 모니터링하였다.

실시예 23:

다가 OSPA 백신 제제의 투약, 안전성, 면역원성, 및 기능성 항체 반응

Al(OH)₃ 애주번트와 함께 및 이것 없이 lipB sOspA 1/2²⁵¹(서열 번호 2), lipB sOspA 6/4(서열 번호 4), 및 lipB sOspA 5/3(서열 번호 6)을 포함하는 3가(즉, 3성분 다가) 백신의 3개 용량 수준(30, 60, 및 90μg)을 18-70 연령의 피험자에서 용량 상승 연구에서 시험하였다. 이중 맹검 무작위 다기관 용량 상승 연구에서 안전성, 면역원성, 항체 지속, 및 부스터 반응에 대해 백신 제제를 시험하였다. 피험자는 3의 백신접종을 달 간격으로(1일, 29일, 및 57일) 투여받았다. 부스터를 선택된 피험자에 9-12달에 투여하였다.

1차 면역화 후 안전성

1차 면역화 후, 안전성을 평가하였다. 애주번트된 제제는 전신 반응에 반응하여 비애주번트된 제제와 비교하여 더 우수한 관용성을 나타냈다. 전신 반응에 대해 애주번트된 제제 내에 상당한 용량 효과가 없었다. 국소 반응에 상당한 용량 또는 애주번트 효과가 없었다. 90μg의 비애주번트된 제제는 관용성 이유로 부스터 용량으로부터 제외되었다. 따라서, 예비 결과는 안전성 정보는 비애주번트된 제제에 비해 애주번트된 제제를 선호한다는 것을 나타낸다.

1차 면역화 후 면역원성

3 용량 프라이밍 후 실질적인 항체 반응이 있었다. 애주번트된 제제는 비애주번트된 제제와 비교하여 모든 OspA 유형에 대해 상당히 더 낮은 면역원성을 나타냈다(ANCOVA 분석). 모든 OspA 유형에 대해 85일에 애주번트된 제제 내에 통계학적으로 유의적인 용량 효과가 없었다.

혈청반응음성 및 혈청반응양성 피험자의 더 큰 집단에서의 추가의 연구를 위해 30μg 및 60μg의(백업으로서) 애주번트된 제제를 선택하였다. 데이터는 30μg의 애주번트된 용량이 더 높은 용량 수준에서 상당한 개선 없이 면역원성이라는 것을 나타낸다. 데이터는 애주번트된 제제에 더 우수한 관용성 프로필이 있다는 것을 나타낸다. 60μg의 애주번트된 용량은 혈청반응음성/혈청반응양성 피험자에서 부스터 백신접종 또는 1차 백신접종 후 임의의 더 우수한 반응이 나타나는지를 결정하기 위해 계속되었다.

1차 백신접종(271일) 후 9달까지 혈청지속이 관찰되지 않았다. 사실, 271일까지의 항체 지속은 3의 애주번트된 용량 수준에 필적하였고, 90μg의 애주번트된 제제는 약간 더 우수한 혈청지속을 나타냈다. 비애주번트된 제제에 의해 유도된 항체는 약간 더 높은 수준에서 지속되었다.

부스터 백신접종 후 면역원성

부스터 백신접종 후 항체 역가의 실질적인 증가가 있었다. ELISA 역가에 대한 애주번트화의 통계학적으로 유의적인 긍정적인 효과가 있었다. 부스터 후 ELISA 역가에 연령의 효과가 없었다. 기능성 항체 역가는 ELISA 역가와 훌륭히 상관되었다.

기능성 항체 반응 데이터

기능성 항체 반응을 표면 결합 검정, 단일클론 항체 경쟁적 억제(mAb CI) ELISA, 및 보렐리아 사멸/성장 억제 검정에 의해 측정하였다. 표면 결합 검정은 살아있는 보렐리아의 표면에 결합하는 시험 혈청 내의 항체의 수준을 정량화하는 유세포 분석기 기반 검정이다.mAb CI ELISA는, 마우스 항-OspA 유형 특이적 mAb에 의해 한정된, 공지된 보호적 또는 보렐리아 사멸 특이적 에피토프에 결합하는 시험 혈청 내의 항체의 양을 측정한다. 보렐리아 사멸/성장 억제 검정은 고민감성 루시퍼라제 발광 검정을 이용하는 ATP 수준에 기초하여 배양물 중의 생육성 세포의 수를 정량화함으로써 보체의 존재 하에 시험 혈청의 사멸/성장 억제 활성을 측정한다.

일반적으로, 1차 반응 및 6달 항체 지속 수준은 비애주번트된 제제에 의해 약간 더 높았다. 그러나, 부스터 후 기능성 항체 반응은 애주번트된 제제에 대해 우수하지는 않았지만 동등하였다. 부스터 후 애주번트된 기능성 항체 역가는 (1) 표면 결합 검정에 대한 피크 1차 반응 수준보다 10-12배 높고; (2) 보렐리아 사멸/성장 억제 검정에 대해 피크 1차 반응 수준보다 7-8배 높고; (3) mAb CI ELISA 검정에 대한 1차 반응보다 2-3배 높았다.

부스터 백신접종 후 안전성

부스터 백신접종 후, 안전성을 평가하였다. 전신 반응은 애주번트된 제제 및 비애주번트된 제제 둘 다에서 낮은 속도로 발생하였다. 대부분의 전신 반응은 경증이었다(오직 2의 중등도 반응). 오직 경증의 반응이 애주번트를 갖거나 갖지 않는 30μg의 용량 그룹에서 보고되었다. 부스터 후 7일 내에 중증의 국소 반응이 발생하지 않았다. 연구에서 임의의 용량/제제에 의한 관련 SAE가 여지까지 없었다.

실시예 24:

다가 OSPA 백신 제제에 의한 3상 연구에 대한 용량 추천

애주번트를 갖는 및 갖지 않는 3의 용량 수준을 다가 OspA 백신 제제의 1/2상 연구에서 다양한 피험자에서 시험하였다. 이 연구는 3 용량 프라이밍 후 애주번트된 제제의 더 우수한 관용성 및 실질적인 항체 반응이 있다는 것을 나타낸다. 애주번트된 제제 사이에 항체 지속의 임상적으로 관련된 차이가 없었다. 부스터 백신접종 후 항체 역가에 애주번트화의 유의적인 긍정적인 효과가 있었고, 부스터 백신접종 후 최적 면역 반응은 더 높은 용량 수준에서 유의적인 개선 없이 30μg의 애주번트된 제제에 의해 관찰되었다. 기능성 항체 결과는 항-OspA IgG ELISA 결과를 확인시켜주었다.

본 발명은 본 발명의 실행을 위한 구체적인 방식을 포함하도록 발견되거나 제안된 특정한 실시양태의 면으로 기재되어 있다. 기재된 발명의 다양한 변형 및 변경이 본 발명의 범위 및 정신으로부터 벗어남이 없이 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명이 구체적인 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 청구된 발명이 이러한 구체적인 실시양태로 부당하게 제한되지 않아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 실제로, 관련 분야에서 당업자에게 명확한 본 발명을 실행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 특허청구범위의 범위 내에 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> BAXTER INTERNATIONAL INC. BAXTER HEALTHCARE SA BARRETT, et al. <120> COMPOSITIONS COMPRISING CHIMERIC OSPA MOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF <130> 31315/47123A <150> 61/676,668 <151> 2012-07-27 <160> 173 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 829 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 1 catatgcgtc tgttgatcgg ctttgctctg gcgctggctc tgatcggctg cgcacagaaa 60 ggtgctgagt ctattggttc cgtttctgta gatctgcccg gtgaaatgaa ggttctggtg 120 agcaaagaaa aagacaagaa cggcaagtac gatctcatcg caaccgtcga caagctggag 180 ctgaaaggta cttctgataa aaacaacggc tctggtgtgc tggagggcgt caaaactaac 240 aagagcaaag taaagcttac gatctctgac gatctcggtc agaccacgct ggaagttttc 300 aaagaggatg gcaagaccct cgtgtccaaa aaagtaactt ccaaagacaa gtcctctacg 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa aggtgaggtg tctgaaaaga tcatcaccat ggcagacggc 420 acccgtcttg aatacaccgg tattaaaagc gatggtaccg gtaaagcgaa atatgttctg 480 aaaaacttca ctctggaagg caaagtggct aatgataaaa ccaccttgga agtcaaggaa 540 ggcaccgtta ctctgagcat gaatatctcc aaatctggtg aagtttccgt tgaactgaac 600 gacactgaca gcagcgctgc gactaaaaaa actgcagcgt ggaattccaa aacttctact 660 ttaaccatta gcgttaacag caaaaaaact acccagctgg tgttcactaa acaagacacg 720 atcactgtgc agaaatacga ctccgcaggc accaacttag aaggcacggc agtcgaaatt 780 aaaacccttg atgaactgaa aaacgcgctg aaataagctg agcggatcc 829 <210> 2 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu 85 90 95 Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Met 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tccggcaccc tggaaggtga aaaaactaac 240 aaaagcaaag tgaaactgac cattgctgat gacctcagcc agaccaaatt cgaaattttc 300 aaagaagatg ccaaaacctt agtatccaaa aaagtgaccc tgaaagacaa gtcctctacc 360 gaagaaaaat tcaacgaaaa gggtgaaacc tctgaaaaaa ccatcgtaat ggcaaatggt 420 acccgtctgg aatacaccga catcaaaagc gatggctccg gcaaagccaa atacgttctg 480 aaagacttca ccctggaagg caccctcgct gccgacggca aaaccacctt gaaagttacc 540 gaaggcactg ttgttttaag catgaacatc ttaaaatccg gtgaaatcac cgttgcgctg 600 gatgactctg acaccactca ggccactaaa aaaaccggca aatgggattc taacacttcc 660 actctgacca tcagcgtgaa ttccaaaaaa actaaaaaca tcgtgttcac caaagaagac 720 accatcaccg tccagaaata cgactctgcg ggcaccaacc tcgaaggcaa cgcagtcgaa 780 atcaaaaccc tggatgaact gaaaaacgct ctgaaataag ctgagcggat cc 832 <210> 4 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser 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ccagaaaact aaacagctgg tattcaccaa agaaaacact 720 atcaccgtac agaactataa ccgtgcaggc aatgcgctgg aaggcagccc ggctgaaatt 780 aaagatctgg cagagctgaa agccgctttg aaataagctg agcggatcc 829 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys Thr Thr Phe 85 90 95 Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr 130 135 140 Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu 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gacaagtcct ctacggaaga aaaattcaac gaaaaaggtg aggtgtctga aaagatcatc 360 accatggcag acggcacccg tcttgaatac accggtatta aaagcgatgg taccggtaaa 420 gcgaaatatg ttctgaaaaa cttcactctg gaaggcaaag tggctaatga taaaaccacc 480 ttggaagtca aggaaggcac cgttactctg agcatgaata tctccaaatc tggtgaagtt 540 tccgttgaac tgaacgacac tgacagcagc gctgcgacta aaaaaactgc agcgtggaat 600 tccaaaactt ctactttaac cattagcgtt aacagcaaaa aaactaccca gctggtgttc 660 actaaacaag acacgatcac tgtgcagaaa tacgactcca acggcaccaa cttagaaggc 720 acggcagtcg aaattaaaac ccttgatgaa ctgaaaaacg cgctgaaata agctgagcgg 780 atcc 784 <210> 8 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 8 Met Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu 1 5 10 15 Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly 20 25 30 Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Thr Asn 50 55 60 Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp 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Synthetic nucleotide <400> 165 gatccgctca gcttatttca gagcgttttt cagttcatcc agggttttga tttcgactgc 60 gttgccttcg a 71 <210> 166 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 166 ggttggtgcc cgcagagtcg tatttctgga cggtgatggt gtcttctttg 50 <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 167 gtgaacacga tgtttttagt ttttttgg 28 <210> 168 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 168 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcagcc ttgacgagaa aaacagcgtt tcagtagatt tgcctggtga aatgaaagtt 120 cttgtaagca aagaaaaaaa caaagacggc aagtacgatc taattgcaac agtagacaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aatggatctg gagtacttga aggcgtaaaa 240 gctgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt tctgacgatc taggtcaaac cacacttgaa 300 gttttcaaag aagatggcaa aacactagta tcaaaaaaag taacttccaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa tgaaaaaggt gaagtatctg aaaaaataat aacaagagca 420 gacggaacca gacttgaata cacaggaatt aaaagcgatg gatctggaaa agctaaagag 480 gttttaaaaa actttactct tgaaggaaaa gtagctaatg ataaagtaac attggaagta 540 aaagaaggaa ccgttacttt aagtaaaaat atttcaaaat ctggggaagt ttcagttgaa 600 cttaatgaca ctgacagtag tgctgctact aaaaaaactg cagcttggaa ttcaaaaact 660 tctactttaa caattagtgt taacagcaaa aaaactacac aacttgtgtt tactaaacaa 720 gacacaataa ctgtacaaaa atacgactcc gcaggtacca atttagaagg cacagcagtc 780 gaaattaaaa cacttgatga acttaaaaac gctttaaaat ag 822 <210> 169 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 169 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asn Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 80 Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln 85 90 95 Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val 165 170 175 Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln 225 230 235 240 Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu 245 250 255 Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys <210> 170 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 170 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcacgc ttgatgaaaa aaatagcgtt tcagtagatt tacctggtgg aatgacagtt 120 cttgtaagta aagaaaaaga caaagacggt aaatacagtc tagaggcaac agtagacaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aacggttctg gaacacttga aggtgaaaaa 240 actgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt gctgatgacc taagtcaaac taaatttgaa 300 attttcaaag aagatgccaa aacattagta tcaaaaaaag taacccttaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa cgaaaagggt gaaacatctg aaaaaacaat agtaagagca 420 aatggaacca gacttgaata cacagacata aaaagcgatg gatccggaaa agctaaagaa 480 gttttaaaag actttactct tgaaggaact ctagctgctg acggcaaaac aacattgaaa 540 gttacagaag gcactgttgt tttaagcaag aacattttaa aatccggaga aataacagtt 600 gcacttgatg actctgacac tactcaggct actaaaaaaa ctggaaaatg ggattcaaat 660 acttccactt taacaattag tgtgaatagc aaaaaaacta aaaacattgt atttacaaaa 720 gaagacacaa taacagtaca aaaatacgac tcagcaggca ccaatctaga aggcaacgca 780 gtcgaaatta aaacacttga tgaacttaaa aacgctttaa aataa 825 <210> 171 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 171 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Thr Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Gln 85 90 95 Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Ala Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr 195 200 205 Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe Thr Lys 225 230 235 240 Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu 245 250 255 Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala 260 265 270 Leu Lys <210> 172 <211> 822 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleotide <400> 172 atgaaaaaat atttattggg aataggtcta atattagcct taatagcatg taagcaaaat 60 gttagcagcc ttgatgaaaa aaatagcgtt tcagtagatt tacctggtgg aatgaaagtt 120 cttgtaagta aagaaaaaga caaagatggt aaatacagtc taatggcaac agtagaaaag 180 cttgagctta aaggaacttc tgataaaaac aacggttctg gaacacttga aggtgaaaaa 240 actgacaaaa gtaaagtaaa attaacaatt gctgaggatc taagtaaaac cacatttgaa 300 atcttcaaag aagatggcaa aacattagta tcaaaaaaag taacccttaa agacaagtca 360 tcaacagaag aaaaattcaa cgaaaagggt gaaatatctg aaaaaacaat agtaagagca 420 aatggaacca gacttgaata cacagacata aaaagcgata aaaccggaaa agctaaagaa 480 gttttaaaag actttactct tgaaggaact ctagctgctg acggcaaaac aacattgaaa 540 gttacagaag gcactgttac tttaagcaag aacatttcaa aatccggaga aataacagtt 600 gcacttgatg acactgactc tagcggcaat aaaaaatccg gaacatggga ttcagatact 660 tctactttaa caattagtaa aaacagtcaa aaaactaaac aacttgtatt cacaaaagaa 720 aacacaataa cagtacaaaa ctataacaga gcaggcaatg cgcttgaagg cagcccagct 780 gaaattaaag atcttgcaga gcttaaagcc gctttaaaat aa 822 <210> 173 <211> 273 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 173 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser 195 200 205 Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asp Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu Glu 245 250 255 Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Lys Ala Ala Leu 260 265 270 Lys

Claims (59)

1. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
2. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
3. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
4. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
5. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg 의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
6. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대한 보호 면역 반응을 유도하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
7. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물.
8. 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물은 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 것인 조성물.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 애주번트를 더 포함하는 것인 조성물.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 애주번트는 수산화알루미늄인 것인 조성물.
11. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드들의 조합은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 동일한 양의 각각의 폴리펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 면역원성 조성물 또는 백신 조성물인 것인 조성물.
13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 센수 라토 또는 보렐리아 센수 스트릭토인 것인 조성물.
14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 아프 젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토, 보렐리아 야포니카, 보렐리아 안데르소니, 보렐리아 비세티, 보렐리아 시 니카, 보렐리아 투르디, 보렐리아 타누키, 보렐리아 발라이시아나, 보렐리아 루시타니아에, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 미야토모이 또는 보렐리아 로네스타인 것인 조성물.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 또는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토인 것인 조성물.
16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 초기 투약 후 약 60일에 약 1,000 내지 10,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 피험자에서 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된 것인 조성물.
17. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 초기 투약 후 약 90일에 약 2,000 내지 30,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 피험자에서 보렐리 아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된 것인 조성물.
18. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 부스터 투여 후 약 15,000 내지 50,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 피험자에서 보렐리아 항체 생성을 증가시키기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된 것인 조성물.
19. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단일 용량으로 투여하기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된 것인 조성물.
20. 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 다수의 용량으로 투여하기에 효과적인 단위 용량으로 제형화된 것인 조성물.
21. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg인 것인 조성물.
22. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg인 것인 조성물.
23. 청구항 1 내지 20 중 어느 한 항에 따른 면역학적 유효량의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 피험자에서 보렐리아 감염 또는 라임병에 대해 보호 면역 반응을 유도하는 방법.
24. 청구항 23에 있어서, 상기 면역학적 유효량의 조성물은 단일 단위 용량으로 투여되는 것인 방법.
25. 청구항 23에 있어서, 상기 면역학적 유효량의 조성물은 다수의 단위 용량으로 투여되는 것인 방법.
26. 청구항 25에 있어서, 상기 다수의 단위 용량은 거의 달 간격으로 투여되는 것인 방법.
27. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 조성물의 부스터는 상기 초기 단위 용량 후 약 6달 내지 약 18달에 추가로 투여되는 것인 방법.
28. 청구항 24 또는 25에 있어서, 상기 조성물의 부스터는 상기 초기 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 추가로 투여되는 것인 방법.
29. 청구항 25 또는 26에 있어서, 상기 조성물은 약 1일, 약 29일, 및 약 57일에 투여되는 것인 방법.
30. 청구항 29에 있어서, 상기 조성물의 부스터는 제1 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 추가로 투여되는 것인 방법.
31. 청구항 21 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg인 것인 방법.
32. 청구항 31에 있어서, 상기 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg인 것인 방법.
33. 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
34. 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
35. 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
36. 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg 내지 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
37. 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
38. 보렐리아에 대한 항체 생성을 자극하기 위한 약제의 제조를 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
39. 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 적어도 200개의 아미노산 잔기들을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
40. 보렐리아 감염 또는 라임병을 예방하거나 치료하기 위한, 폴리펩타이드들의 조합을 포함하는 조성물의 용도로서, 조합된 폴리펩타이드들의 각각은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 조성물의 용도는 약 10 μg, 약 20 μg, 약 30 μg, 약 40 μg, 약 50 μg, 약 60 μg, 약 70 μg, 약 80 μg, 약 90 μg, 약 100 μg의 단위 용량 및 약학적으로 허용되는 담체로 제형화된 조성물의 용도.
41. 청구항 33 내지 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 용도는 애주번트를 더 포함하는 조성물의 용도.
42. 청구항 41에 있어서, 상기 애주번트는 수산화알루미늄인 조성물의 용도.
43. 청구항 33 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드들의 조합은 서열 번호 2, 서열 번호 4, 및 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열들을 포함하는 동일한 양의 각각의 폴리펩타이드들을 포함하는 조성물의 용도.
44. 청구항 33 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 용도는 면역원성 조성물 또는 백신 조성물의 용도.
45. 청구항 33 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 센수 라토 또는 보렐리아 센수 스트릭토인 조성물의 용도.
46. 청구항 33 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 보렐리아 부르그도르페리 센수 스 트릭토, 보렐리아 야포니카, 보렐리아 안데르소니, 보렐리아 비세티, 보렐리아 시니카, 보렐리아 투르디, 보렐리아 타누키, 보렐리아 발라이시아나, 보렐리아 루시타니아에, 보렐리아 스피엘마니, 보렐리아 미야토모이 또는 보렐리아 로네스타인 조성물의 용도.
47. 청구항 46에 있어서, 상기 보렐리아는 보렐리아 아프젤리, 보렐리아 가리니, 보렐리아 바바리엔시스, 또는 보렐리아 부르그도르페리 센수 스트릭토인 조성물의 용도.
48. 청구항 33 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 초기 투약 후 약 60일에 약 1,000 내지 10,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 보렐리아 항체 생성을 증가시키는 양으로 제형화된 조성물의 용도.
49. 청구항 33 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 초기 투약 후 약 90일에 약 2,000 내지 30,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 보렐리아 항체 생성을 증가시키는 양으로 제형화된 조성물의 용도.
50. 청구항 33 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 부스터 투여 후 약 15,000 내지 50,000의 기하 평균 역가(GMT) 수준으로 보렐리아 항체 생성을 증가시키는 양으로 제형화된 조성물의 용도.
51. 청구항 33 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단일 단위 용량의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
52. 청구항 33 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 다수의 단위 용량의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
53. 청구항 52에 있어서, 상기 조성물은 거의 달 간격으로 다수의 단위 용량의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
54. 청구항 51 또는 52에 있어서, 상기 조성물은 상기 초기 단위 용량 후 약 6달 내지 약 18달에 부스터로서의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
55. 청구항 51 또는 52에 있어서, 상기 조성물은 상기 초기 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 부스터로서의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
56. 청구항 52에 있어서, 상기 조성물은 약 1일, 약 29일, 및 약 57일에 다수의 단위 용량의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
57. 청구항 56에 있어서, 상기 조성물은 제1 단위 용량 후 약 9달 내지 약 12달에 다수의 용량, 이후 부스터의 투여를 위해 제형화된 조성물의 용도.
58. 청구항 33 내지 57 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 약 10 μg 내지 약 90 μg인 조성물의 용도.
59. 청구항 33 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단위 용량은 약 30 μg 또는 약 60 μg인 조성물의 용도.
    
    
    

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