CN106771250B - 一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒 - Google Patents

一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒，包含以下组分：(1)样本稀释液；(2)海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。本发明采用荧光素酶免疫共沉淀法，根据荧光强度可以用于检测莱姆病及其发病时期，该方法快速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。

Description

一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒。
背景技术
莱姆病是一种以蜱为媒介的螺旋体感染性疾病，是由伯氏疏螺旋体所致的自然疫源性疾病。我国于1985年首次在黑龙江省林区发现本病病例，以神经系统损害为该病最主要的临床表现。其神经系统损害以脑膜炎、脑炎、颅神经炎、运动和感觉神经炎最为常见。其中一期莱姆病仅用抗生素即可奏效，至二期、三期用抗生素无济于事，特别是神经系统损害更乏特效疗法。早期以皮肤慢性游走性红斑为特点，以后出现神经、心脏或关节病变，通常在夏季和早秋发病，可发生于任何年龄，男性略多于女性。发病以青壮年居多，与职业相关密切。以野外工作者、林业工人感染率较高。
现有莱姆病的检测方法如下：
一、病原学检测
1.直接检测法：取感染动物的组织、血液或者蜱中肠等直接进行涂片后用显微镜暗视野观察，这种常规的直接法较可靠，但需要丰富的检测经验，同时，无法检测到混合感染的情况，容易漏检，与其他检测方法相比，直接检查的检出率相对较低。
2.分离培养法：采集感染动物的血液、尿液等，接种到培养基上进行培养；或者用传播媒介蜱类分组，75％酒精浸泡、生理盐水漂洗、无菌水清洗，然后置于无菌研磨器中研磨，研磨过程中加入少量BSK培养基，研磨后离心取上清接种至BSK培养基中，33℃培养7～10d，采用常规显微镜暗视野观察。螺旋体生长缓慢，对大部分样品老说很难分离培养出螺旋体，分离率低、耗时较长、敏感性差。
二、血清学检测
3.免疫荧光法(IFA)：将抗原固定在载体上，利用阳性血清检测样本的抗原性，再用荧光二抗来显色，判断样本的感染情况。但IFA只能检测到菌体表面的抗原，灵敏度和特异性都比较低。IFA受实验影响大，人为干扰因素比较多，易造成假阳性或假阴性。
4.酶联免疫法(ELISA)：酶联免疫主要是对莱姆病特异性抗体IgG进行检测，对于酶的活性和灵敏度要求很高，其特异性取决于抗原制备的优劣；且其结合物制备尚未标准化，这使得实验结果的可重复性不高，需要进行多次检测。另外，若抗原及酶结合物浓度低，最后吸光度值太小，易出现假阴性。
5.免疫印迹法：特异性较高，有一定的应用价值，但操作比较复杂，一般实验室不易做到。
6.聚合酶链式反应(PCR)：是敏感特异的方法，但由于病人菌血症时间短且不规则，在临床实验室诊断中有其根本的局限性，与PCR在诊断其他病院微生物方面一样，也具有明显的误导作用，目前仍处于实验室研究阶段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒，采用荧光素酶免疫共沉淀法，根据荧光强度可以用于检测莱姆病及其发病时期，该方法快速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒，包含以下组分：(1)样本稀释液；(2)海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物。
本试剂盒用于检测哺乳动物中莱姆病的发病状况。原理为：将荧光素酶基因与抗原基因重组为融合载体，然后利用细胞转化技术，将融合载体导入哺乳细胞系统中，进行荧光素酶-抗原融合蛋白的表达；裂解基因重组细胞，获得荧光素酶-抗原融合蛋白；然后利用免疫沉淀反应，将荧光素酶-抗原融合蛋白稀释液与病人血清混合进行特异性结合，测定针对伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi)表膜蛋白OspC抗体。加入荧光素酶底物(含有肠腔素)，检测荧光强度。根据荧光强度可以用于检测莱姆病及其发病时期，该方法快速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
作为优选，所述样本稀释液组成如下：20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM MgCl2，1％Triton X-100，水余量。
作为优选，所述海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白的氨基酸序列选自以下之一：
(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(2)与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。
作为优选，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以OspC抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得OspC抗原基因片段；
b、将获得的OspC抗原基因片段与带海肾荧光素酶基因的pREN2载体质粒分别进行BamH 1和Xbal 1双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒(PlasmidPlus Midi Kit，Qiagen，货号：12943)提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量(条带无拖尾现象，条带大小正确)，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度(OD260/OD280＝1.8～2.0时纯度高，质粒浓度ng/ml＝OD260×50ng/ml×稀释倍数)；
f、在10cm2细胞培养皿中培养293T细胞，当细胞铺板率达到80-90％时，以脂质体核酸转染试剂(lipofectamine 2000，invitrogen，货号：11668-019)：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48-72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
融合蛋白液是稀释后的融合蛋白，这个稀释液也就是细胞裂解液，只是在细胞裂解之前要要保证融合蛋白的浓度，所以用量少。裂解后再调整至使用浓度，调整浓度后的融合蛋白液再放置试剂盒中，这样试剂盒检测过程就方便了(不需要再去检测蛋白的浓度)。
作为优选，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-GAGGGATCCATGAAAAAGAATACA-3'(SEQ ID No.3)，
下游引物：5'-GAGCTCGAGTTAAGGGTTTTTTGGACTTTCT-3'(SEQ ID No.4)。
作为优选，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度，
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h，
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
作为优选，所述洗涤液配制方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加水定容至1L，灭菌。
本发明的有益效果是：采用荧光素酶免疫共沉淀法，根据荧光强度可以用于检测莱姆病及其发病时期，该方法快速简便、高灵敏度、高信噪比，测量值稳定可靠。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒，包含以下组分：(1)样本稀释液；(2)海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物；(6)底物稀释液。其中(5)荧光素酶底物、(6)底物稀释液均来自海肾荧光素酶报告基因检测试剂盒(Renilla LuciferaseAssay Systerm，普洛麦格生物技术有限公司)，货号E2810。
所述样本稀释液组成如下：20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM MgCl2，1％TritonX-100，水余量。
所述洗涤液配制方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO40.24g，加水定容至1L，灭菌。
所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以OspC抗原基因序列(SEQ ID No.2)为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得OspC抗原基因片段；PCR扩增的引物为：
上游引物：5'-GAGGGATCCATGAAAAAGAATACA-3'，
下游引物：5'-GAGCTCGAGTTAAGGGTTTTTTGGACTTTCT-3'。
b、将获得的OspC抗原基因片段与带海肾荧光素酶基因的pREN2载体质粒分别进行BamH 1和Xbal 1双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；带海肾荧光素酶基因的pREN2载体质粒参见论文：Burbelo PD,Goldman R,Mattson TL.A simplifiedimmunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses inclinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferaseantigenfusion proteins.BMC Biotechnol 5:22,2005。
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌。
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒(PlasmidPlus Midi Kit，Qiagen，货号：12943)提取重组质粒。
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量(条带无拖尾现象，条带大小正确)，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度(OD260/OD280＝1.8～2.0时纯度高，质粒浓度ng/ml＝OD260×50ng/ml×稀释倍数)。
f、在10cm2细胞培养皿中培养293T细胞，当细胞铺板率达到80-90％时，以脂质体核酸转染试剂(lipofectamine 2000，invitrogen，货号：11668-019)：步骤d所得重组质粒按照3μL:1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48-72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
proteinA/G包被的酶标板的制备：
a、proteinA/G(Pierce Recombinant Protein A/G，Thermo，货号：77677)用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度，
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h，
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST(0.01M、pH7.4)洗3次，自然晾干4℃保存。
检测操作步骤：
a、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡10分钟后使用。
b、样本稀释：取一份血清样本用样本稀释液稀释10倍后，得到稀释后的血清样本。
c、底物稀释：荧光素酶底物用底物稀释液稀释100倍。
d、加样：将稀释好的待检测样品及对照血清(阴性血清3份、阳性血清1份)，按顺序在各proteinA/G包被酶标板的反应孔中加入80μl样本稀释液，分别在相应的孔中加入待检血清样本和阴、阳性对照各10μl，每个微孔中分别加入10μl融合蛋白液。
e、孵育：在反应板上加盖封板膜，置37℃温箱或水浴锅中，100转震荡反应60分钟。
f、洗板：将孔内液体甩干，在各反应孔中注满稀释后的洗涤液，静置10秒钟，甩弃洗涤液；如此洗涤5遍，最后一次扣干反应板。
g、加底物并检测：加稀释好的底物Renilla Luciferase Assay每孔100μl，置于Berthold LB960 Luminometer发光检测仪中检测荧光值，并记录。
h、结果判定：当待检血清样本检测值≥阴性检测平均值+3SD是，判断为阳性。
本发明的试剂盒采用了基因工程制备荧光素酶融合抗原Renilla Luciferace-OspC，proteinA/G包被96孔板，底物为肠腔素，采用先进的样品稀释液配方，使其稳定性好特异性强，适合批量检测，可供临床检验科或实验室诊断及莱姆病研究，本试剂盒于4℃保存，有效期暂定为6个月，试剂盒敏感性77.6％，特异性97％，阳性判断值≥阴性检测平均值+3SD。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州京北生物科技有限公司
<120> 一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫共沉淀试剂盒
<130> 2017.01
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Lys Asn Thr Leu Ser Ala Ile Leu Met Thr Leu Phe Leu Phe
1 5 10 15
Ile Ser Cys Asn Asn Ser Gly Lys Asp Gly Asn Thr Ser Ala Asn Ser
20 25 30
Ala Asp Glu Ser Val Lys Gly Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys
35 40 45
Ile Thr Glu Ser Asn Ala Val Val Leu Ala Val Lys Glu Ile Glu Thr
50 55 60
Leu Leu Ala Ser Ile Asp Glu Leu Ala Thr Lys Ala Ile Gly Lys Lys
65 70 75 80
Ile Gln Gln Asn Gly Gly Leu Ala Val Glu Ala Gly His Asn Gly Thr
85 90 95
Leu Leu Ala Gly Ala Tyr Thr Ile Ser Lys Leu Ile Thr Gln Lys Leu
100 105 110
Asp Gly Leu Lys Asn Ser Glu Lys Leu Lys Glu Lys Ile Glu Asn Ala
115 120 125
Lys Lys Cys Ser Glu Asp Phe Thr Lys Lys Leu Glu Gly Glu His Ala
130 135 140
Gln Leu Gly Ile Glu Asn Val Thr Asp Glu Asn Ala Lys Lys Ala Ile
145 150 155 160
Leu Ile Thr Asp Ala Ala Lys Asp Lys Gly Ala Ala Glu Leu Glu Lys
165 170 175
Leu Phe Lys Ala Val Glu Asn Leu Ala Lys Ala Ala Lys Glu Met Leu
180 185 190
Ala Asn Ser Val Lys Glu Leu Thr Ser Pro Ile Val Ala Glu Ser Pro
195 200 205
Lys Asn Pro
210
<210> 2
<211> 636
<212> DNA
<213> 伯氏疏螺旋体
<400> 2
atgaaaaaga atacattaag tgcaatatta atgactttat ttttatttat atcttgtaat 60
aattcaggaa aagatgggaa tacatctgca aattctgctg atgagtctgt taaagggcct 120
aatcttacag aaataagtaa aaaaattaca gaatctaacg cagttgttct ggctgtgaaa 180
gaaattgaaa ctttgcttgc atctatagat gaacttgcta ctaaagctat tggtaaaaaa 240
atacaacaaa atggtggttt agctgtcgaa gcggggcata atggaacatt gttagcaggt 300
gcttatacaa tatcaaaact aataacacaa aaattagatg gattgaaaaa ttcagaaaaa 360
ttaaaggaaa aaattgaaaa tgctaagaaa tgttctgaag attttactaa aaaactagaa 420
ggagaacatg cgcaacttgg aattgaaaat gttactgatg agaatgcaaa aaaagctatt 480
ttaataacag atgcagctaa agataagggc gctgcagagc ttgaaaagct atttaaagca 540
gtagaaaact tggcaaaagc agctaaagag atgcttgcta attcagttaa agagcttaca 600
agtcctattg tggcagaaag tccaaaaaac ccttaa 636
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagggatcca tgaaaaagaa taca 24
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagctcgagt taagggtttt ttggactttc t 31

Claims (6)

1.一种用于检测哺乳动物莱姆病的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，包含以下组分：(1)样本稀释液；(2)海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白液；(3)proteinA/G包被的酶标板；(4)洗涤液；(5)荧光素酶底物；
所述海肾荧光素酶和伯氏疏螺旋体表膜蛋白OspC抗原组成的融合蛋白的氨基酸序列选自以下之一：
(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
(2)与SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液组成如下：20mM Tris pH7.5，150mM NaCl，5mM MgCl2，1％Triton X-100，水余量。
3.根据权利要求1所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述融合蛋白液通过以下方法制备而成：
a、以OspC抗原基因序列为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经凝胶电泳及核酸纯化获得OspC抗原基因片段；
b、将获得的OspC抗原基因片段与带海肾荧光素酶基因的pREN2载体质粒分别进行BamH1和Xbal 1双酶切，并使用T4连接酶将酶切产物连接得到重组质粒；
c、将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，通过菌液PCR筛选转基因阳性菌；
d、在200ml LB液体培养基中扩繁转基因阳性菌，并用质粒提取试剂盒提取重组质粒；
e、通过琼脂糖凝胶电泳验证步骤d提取重组质粒的质量，通过紫外分光光度计检测提取重组质粒的纯度和浓度；
f、在10cm2细胞培养皿中培养293T细胞，当细胞铺板率达到80-90％时，以脂质体核酸转染试剂：步骤d所得重组质粒按照3μL∶1μg的比例进行转染，37℃、5％CO2培养箱中培养48-72h，弃细胞培养液，并加入5ml 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液用细胞刮刀将细胞收集至15ml离心管中，最后将细胞收集液在冰浴中超声处理15～30min得细胞裂解液，然后将细胞裂解液于4℃，12000rpm离心15～45min，弃沉淀，收集上清液即为融合蛋白；
g、将上述所得融合蛋白用0.01M、pH7.4的PBS磷酸盐缓冲液稀释得融合蛋白液，要求融合蛋白液每10μL中有107个荧光单位，-20℃保存备用。
4.根据权利要求3所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，步骤a中，PCR扩增的引物为：
上游引物：5′-GAGGGATCCATGAAAAAGAATACA-3′，
下游引物：5′-GAGCTCGAGTTAAGGGTTTTTTGGACTTTCT-3′。
5.根据权利要求1或2所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述proteinA/G包被的酶标板的制备方法：
a、proteinA/G用0.01M、pH7.4PBS溶解为1μg/mL的浓度，
b、按照100μL/孔将上述proteinA/G溶液加入酶标板中，酶标板覆膜，4℃孵育12～16h，
c、弃proteinA/G溶液，300μL/孔用0.1％PBST洗3次，4℃保存。
6.根据权利要求1或2所述的荧光素酶免疫试剂盒，其特征在于，所述洗涤液配制方法为：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KH2PO4 0.24g，加水定容至1L，灭菌。
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